ĐỀ CƯƠNG bài GIẢNG THỰC HÀNH hóa SINH THỰC PHẨM

MỤC LỤCNội dung 1: Định tính, định lượng axit amin và protein Nội dung 2: Xác định hoạt độ enzyme glucoamylase Nội dung 3: Định tính, định lượng glucid Nội dung 4: Xác định một số chỉ số

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ

Bộ môn Công nghệ thực phẩm

………&………

ĐỀ CƯƠNG BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HÓA SINH THỰC PHẨM

Giảng viên biên soạn: Đỗ Thị Hạnh, Đặng Thị Hường

Hà Nội, năm 2021

FORM VIẾT BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Bìa viết báo cáo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ

BÁO CÁO THỰC TẬP

MÔN:

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên:

Lớp:

Hà Nội, tháng … năm ….

2 Nội dung báo cáo

2.1 Dụng cụ, hoá chất

Trình bày các hoá chất sử dụng dưới dạng bảng biểu

2.2 Quy trình phân tích

Viết quy trình phân tích dưới dạng sơ đồ

2.3 Trả lời câu hỏi

Trả lời các câu hỏi có trong đề cương thực hành

2.4 Kết quả phân tích và nhận xét

- Tổng hợp kết quả phân tích dưới dạng bảng biểu

- Nhận xét kết quả (độ chính xác của kết quả, so sánh với các nhóm khác, so sánh với tiêu chuẩn (nếu có))

MỤC LỤC

Nội dung 1: Định tính, định lượng axit amin và protein

Nội dung 2: Xác định hoạt độ enzyme glucoamylase

Nội dung 3: Định tính, định lượng glucid

Nội dung 4: Xác định một số chỉ số đánh giá chất lượng của chất béo

NỘI DUNG 1: ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

A Phản ứng Biure

I Lý thuyết:

Cơ sở lý thuyết phản ứng biure: Đây là phản ứng dùng để phát hiện liên kết peptit

(CO-NH-) Phản ứng xảy ra đối với các chất chứa từ hai liên kết peptit trở lên

Tùy thuộc vào R1, R2, Rn mà màu phản ứng có thể là xanh tím, tím hoặc hồng

Trong môi trường kiềm, các chất có chứa từ hai liên kết -CO-NH- trở lên phản ứng với ion Cu2+, tạo thành phức chất có màu xanh Phân tử chứa nhiều liên kết peptid -CO-NH-cũng

tạo thành phức chất màu xanh với ion Cu2+ trong môi trường kiềm, ví dụ như protein Người

ta gọi phản ứng này là phản ứng biure vì biure có chứa liên kết -CO-NH- Cơ chế của phản

ứng này được biểu diễn qua 2 giai đoạn:

+ Phản ứng thứ nhất: là phản ứng tạo biure.

Biure được tạo thành từ ure trong điều kiện nhiệt độ cao

C=NH NHH

NH

NH

2

2

biure (dang xeto) biure (dang enol)

+ Phản ứng thứ hai: là tạo phức màu với Cu2+ và Na+

Hai phân tử Biure liên kết với một ion Cu2+ và hai Na+ để tạo thành phức hợp có màu theo phản ứng sau:

OH C=NH NHH

+ Cu(OH) 2 +2 NaOH

C=NH OH

H O

2

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com moi nhat

Cường độ màu của phức hợp phụ thuộc vào độ dài của mạch peptid (số lượng liên kết peptid) có trong dung dịch

Vì cường độ màu phụ thuộc vào mạch polypeptid dài hay ngắn nên phản ứng biure được sử dụng để định lượng protein bằng phương pháp so màu

II Thực hành

1 Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất:

- Albumin (dung dịch 1%);

- Giá để ống nghiệm: 1 cái

- Lọ có nắp công tơ hút chứa CuSO4 1%: 1 lọ

- Lần lượt cho vào 3 ống nghiệm khô sạch:

+ Ống 1: một ít Ure tinh thể, đun nhẹ tới nóng chảy, khô cứng tạo thành biure khi có NH3

bay hơi, nhận biết bằng mùi hoặc thử bằng giấy quỳ hay giấy đo pH Để nguội

+ Ống 3: 1ml Gelatin 1%;

- Thêm vào mỗi ống 1ml NaOH 10% và 2 đến 3 giọt CuSO4 1% (không nên cho quá nhiều CuSO4 vì màu xanh của Cu(OH)2 có thể lấn át màu của phản ứng biure);

- Lắc đều, quan sát, so sánh, ghi màu, và viết phương trình phản ứng

B Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford

I Lý thuyết

1 Định nghĩa

Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford là protein tan trong dung dịch Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein Hàm lượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng hòa tan của protein trong dung môi trích ly)

2 Nguyên tắc

Nguyên tắc: Khi thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G 250 kết hợp với protein

trong dung dịch axit, thuốc nhuộm sẽ thay đổi màu từ hơi đỏ sang xanh và hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm Sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 595nm tương ứng với nồng độ protein

có trong mẫu

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên cần xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA) Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

II Thực hành

1 Dụng cụ - hóa chất a) Dụng cụ

6

- Máy đo quang phổ

- Pipette 5ml, 1ml (có thể thay bằng pipetteman)

- Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 1 ml nước

cất, lắc đều cho tan Giữ ở -200 C Khi dùng pha loãng ra 100 lần, được dung dịch có nồng độ

0,1 mg/ml

- Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 1 lít như sau:

Coomassie Brilliant Blue: 0,05g Ethanol: 50 ml

Phosphoric acid 85%: 100 ml Cân 0,1 g Coomasie Brilliant Blue và hòa tan trong 50 ml ethanol, pha loãng với nước cất thành 500 ml để dược dung dịch (1) đựng trong chai màu tối có nắp, 100 ml H3PO4 85%

pha loãng thành 500 ml được dung dịch (2) Khi cần sử dụng hòa 1 V (1) và 1V (2) rồi lọc

lấy dịch trong

2 Cách tiến hành:

- Chuẩn bị dịch chiết protein

+ Dịch 1 (Mẫu 1): dịch chiết 1 có sẵn

+ Dịch 2 (Mẫu 2): dịch chiết 2 có sẵn - Xây dưng đường chuẩn:

Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 20, 40, 60, 80, 100µg/ml

+ Lập một dãy các ống nghiệm gồm 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 thêm vào các chất

theo bảng sau

chuẩn (µl)

(ml) Trộn đều bằng vortex, để yên 20 phút rồi đo độ hấp thụ tại bước sóng 595nm với mẫu

đối chứng là mẫu trong ống nghiệm số 0

7

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Tính giá trị trung bình 3 lần lặp lại thí nghiệm Vẽ biểu đồ đường chuẩn BSA thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595nm

- Định lượng protein có trong mẫu

Hàm lượng protein có trong mẫu cũng được tiến hành đo đồng thời với việc dựng đường chuẩn Lấy 500µl mẫu và cho thêm 2.5 ml thuốc thử

Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình của 3 ống Từ phương trình đường chuẩn suy ra được hàm lượng protein trong dung dịch đo

- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595

- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích

III Bài nộp

1 Vẽ đường chuẩn protein theo Bradford

2 Tìm phương trình đường chuẩn y = ax +b

3 Tính R2

4 Xác định hàm lượng protein trong mẫu X1, X2

IV Câu hỏi

1 Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford áp dụng đối với protein như thế nào? Phương pháp này cho phép định lượng chính xác nồng độ protein trong khoảng bao nhiêu?

2 Hãy trình bày các phương pháp khác để định lượng protein?

NỘI DUNG 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE

(Theo phương pháp DNS)

I Cơ sở lý thuyết

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme glucoamylase có trong chế phẩm nghiên cứu Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ enzyme

Lượng glucose được xác định trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) trong môi trường kiềm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ

lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS như sau:

Acid dinitrosalicylic 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid

Đơn vị hoạt độ glucoamylase được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết trong thời gian

1 giờ ở 30oC tác dụng lên dung dịch tinh bột tan giải phóng được 1 mg glucose

II Thực hành

1 Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ

Dung dịch glucose gốc: 0,5 mg/ml Nước cất

Thuốc thử DNS: Cách pha: Hòa tan hoàn toàn 5g DNS và 300ml nước cất ở 50o C cùng 50ml NaOH 4N (Tức 8g NaOH tinh thể), 150g muối Tartat kép, 4g Na2S205, và định mức lên thể tích 500ml bằng nước cất, sau 1 đến 2 ngày lọc cặn lấy dịch trong Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HCl 0,1N với chất chỉ thị phenolphtalein, nếu hết 6ml HCl là được

- Dụng cụ: Ống nghiệm thủy tinh; Bếp điện; Máy đo OD.

Chuẩn bị dãy glucose chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5mg/ml Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm sạch (6 ống) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Hòa lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau:

Ống nghiệm I II III IV V

gốc (ml)

Chuẩn bị các ống nghiệm (sạch, khô) Thực hiện phản ứng:

Ci mg/ml (ml)

Trộn đều, đun sôi cách thủy đúng 5 phút (khi nồi cách thủy sôi mới cho mẫu vào), làm lạnh nhanh trong nước lạnh

Trộn đều bằng vortex đo độ hấp phụ tại bước sóng 540nm với mẫu trắng là nước cất

Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chuẩn

Nồng độ glucose (mg/ml)

OD540 nm

Distillase (Genenco) do PTN cung cấp Cơ chất: dung dịch hồ tinh bột 1%

Xác định hoạt độ (Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng)

Các bước tiến Ống nghiệm 1 (mẫu thí nghiệm) Ống nghiệm 2 (mẫu kiểm

Bước 1: phản - 0,5 ml dịch enzyme phân tích (ở - 0,5 ml dịch enzyme phân tích ứng xúc tác nhiệt độ phòng) - 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột của enzyme - 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1% 1%, Trộn đều (không ủ mà

- Trộn đều và để phản ứng đúng

10 phút ở nhiệt độ phòng Bước 2: định - Bổ sung 3 ml DNS - 3 ml DNS lượng sản - Đun sôi cách thuỷ 5 phút (khi - Đun sôi cách thuỷ 5 phút (khi phẩm tạo nồi cách thủy sôi mới cho mẫu nồi cách thủy sôi mới cho

- Làm nguội nhanh - Làm nguội nhanh

- Đo mật độ quang ( =540 nm)

10

đối ngược với mẫu kiểm chứng Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Sinh viên sử dụng đường chuẩn glucose đã dựng để tính toán hoạt độ glucoamylase Hoạt độ glucoamylase được tính bằng số đơn vị hoạt độ/ml chế phẩm (U/ml chế phẩm)

A =

A: Hoạt độ glucoamylase (U/ml chế phẩm)

a: Số mg glucose tạo thành sau thủy phân 60: Hệ số chuyển đổi thành giờ

t: Thời gian phản ứng (10 phút) V: Thể tích enzyme (ml)

1 Vẽ đường chuẩn glucose cho phương pháp DNS

2 Tìm phương trình đường chuẩn y = ax +b

4 Tính hoạt độ glucoamylase theo phương pháp DNS

NỘI DUNG 3: ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG GLUCID

1. Phản ứng màu của tinh bột với Iod Cơ sở lý thuyết

Tinh bột là polysaccharide bao gồm amylose và amylopectin Amylose là chuỗi mạch thẳng của các phân tử α-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết (1-4) glucozid Chuỗi mạch thẳng này cuộn lại thành hình xoắn lò xo nên có khả năng hấp thụ các phân tử của các chất khác vào trong lòng của vòng xoắn để tạo nên các dạng phức đặc biệt Khi phân tử tinh bột hấp thụ vào vòng xoắn của amylose, phân tử Iod sẽ tạo nên phức chất có màu xanh đen đặc trưng Đây là phản ứng đặc trưng của tinh bột thường dùng để phát hiện sự có mặt của tinh bột trong các đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu, Hóa chất Tinh bột 1%;

Thuốc thử Lugol Hòa tan 2,5g KI trong 20ml nước cất, thêm 1g iod, lắc cho tan hết, thêm nước cất đến 100ml

Nước cất

Trang thiết bị, dụng

cụ Cân điện tử

Ống nghiệm Đèn cồn

Các dụng cụ khác như: Kẹp gỗ; Pipet loại 5ml, 10ml; Giá đựng (ống nghiệm, pipet).

Các bước tiến hành

- Cho vào ống nghiệm 1ml tinh bột 1% và thêm vào đó vài giọt dung dịch lugol;

- Đun sôi dung dịch trong ống nghiệm, quan sát sự mất màu của dung dịch;

- Để nguội, quan sát hiện tượng và ghi lại kết quả thí nghiệm

Kết quả và nhận xét

Giải thích hiện tượng, nhận xét, đánh giá kết quả thu được

Trong môi trường kiềm các đường khử khử oxit đồng (II) thành oxit đồng I (Cu2+ thành Cu 1+) Kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch

Nguyên liệu, Hóa chất

Glucose 1%

Sacarose 1%

Thuốc thử Fehling: Cách pha Fehling A: 40 g CuSO4 hòa tan trong 1l nước cất

12

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com moi nhat

Fehling B: Hòa tan 200g muối Seignet, 100g NaOH hòa tan đến 1l Trước khi dùng trộn Fehling A với Fehling B theo tỷ lệ 1:1

Trang thiết bị, dụng cụ

Ống nghiệm Giá đựng ống nghiệm Pipet 5ml

Các bước tiến hành

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống 1: 1ml glucose 1%, ống 2: 1ml sacarose 1% Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử Fehling, đun sôi 3 phút Quan sát, so sánh kết quả và giải thích

3. Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand Cơ sở lý thuyết

Trong môi trường kiềm các đường khử khử oxit đồng (II) thành oxit đồng I (Cu2+ thành Cu 1+) Kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch Định lượng Cu2O bằng KMnO4 1/30N, sau khi

đã cho Cu2O phản ứng với Fe2(SO4)3

Dung dịch Fehling là hỗn hợp của Fehling A với Fehling B theo tỷ lệ 1:1 Khi trộn Fehling A

và Fehling B, đầu tiên tạo thành Cu(OH)2 có màu xanh da trời

CuSO4 + 2NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối phức hòa tan, dung dịch có màu xanh thẫm

Như vậy muối Seignet giữ cho ion Cu+ trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH)2 Muối phức này không bền, vì vậy các đường có chứa nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử Cu2+ thành Cu+, tạo kết tủa oxit đồng (Cu2O) có màu đỏ

Để định lượng Cu2O được tạo thành, trước hết oxi hóa nó bằng sunfat sắt III trong môi trường axit sunfuric, Cu+ sẽ bị oxi hóa trở lại thành Cu2+, còn Fe3+ bị khử thành Fe2+

Cu2O + Fe2(SO4)3 + 2H2SO4 = 2CuSO4 + FeSO4 + H2O Tiếp đó lượng Fe2+ tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nó bằng dung dịch KMnO4

chuẩn độ trong môi trường axit

13

10FeSO4 + 2 KMnO4 + 8H2SO4 = 5Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO4 + H2O

Từ lượng KMnO4 0,1N tiêu tốn chuẩn độ đem nhân với 6,36 ta sẽ được lượng mg Cu, sau đó tra bảng Bertrand (phụ lục 12, 13 Giáo trình các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men) ta sẽ biết được lượng đường khử chứa trong mẫu

Nguyên liệu, Hóa chất

Quả chín (Xoài, hồng xiêm…)

Na2SO4 bão hòa Pb(CH3COO)2 10%

Dung dịch Fehling A Dung dịch Fehling B Dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: Hòa tan 50g Fe2(SO4)3 và 108ml H2SO4 đậm đặc trong nước cất, định mức tới 1l

KMnO4 0,1N: cân 3,16g KMnO4, hòa tan trong 1l nước cất, đun nóng Nồng độ KMnO4

xác định bằng axit oxalic ít nhất một ngày sau khi pha

Trang thiết bị, dụng cụ

Cân phân tích Buret loại 25ml Chày cối sứ Bình tam giác 50ml, 250ml Bình định mức 100ml Pipet 10ml, 25ml Ống đong 50ml Cốc thủy tinh có mỏ 100ml, 250ml Đũa thủy tinh

Bếp điện

Bể ổn nhiệt

Các bước tiến hành Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm

Nguyên liệu không chứa nhiều tinh bột hoặc inulin

Cân 1 - 2 g mẫu nếu là nguyên liệu khô (cây, lá hoặc quả khô) hoặc 5 - 10 g nếu là nguyên liệu tươi có hàm ẩm cao (rau, quả tươi); sau đó, cho mẫu vào cối sứ và nghiền thật nhỏ với bột thủy tinh hoặc cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 - 80oC Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 100ml Đun cách thủy 70-80oC trong 35-40 phút, kết tủa protein bằng dung dịch chì axetat 10% Tránh dùng dư chì axetat (dùng 2-5 ml chì axetat) Loại bỏ chì dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút Thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc Dịch lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm

Nguyên liệu chứa nhiều tinh bột hay inulin (khoai lang, sắn, khoai tây)

Trích ly đường bằng ethanol 70 - 80oC; đun cách thủy hỗn hợp trong bình có lắp ống sinh hàn không khí; trong trường hợp này không cần kết tủa protein vì lượng protein chuyển vào dung dịch không đáng kể

Nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ (cà chua, dứa, chanh, khế,…)

Trong quá trình trích ly đường, sucrose có thể bị thủy phân một phần do sự có mặt của acid hữu cơ có sẵn trong nguyên liệu, do đó khi cần xác định riêng đường khử hoặc đường sucrose Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid hữu cơ bằng dung dịch NaOH 5% hay Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4-7

Nghiền nhỏ nguyên liệu trong cối chày sứ với một ít nước cất Nhỏ 3 giọt chỉ thị methyl red

và cho từ từ từng giọt NaOH 5% đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Tiếp tục trích ly nhiều lần bằng nước nóng 70 – 80oC, lọc bỏ phần bã và phần nước lọc thu được là dịch đường khử cần định lượng

Tiến hành thí nghiệm

- Lấy 10 ml dung dịch thí nghiệm có chứa khoảng 0,8-40mg đường cho vào bình tam giác 250 ml

- Thêm 10ml dung dịch fehling Đậy bình bằng đĩa đồng hồ

- Đun sôi hỗn hợp trong 3 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên) Sau khi đun sôi, dung dịch vẫn còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một lớp kết tủa Cu2O màu đỏ gạch là được Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vào không đủ để oxy hóa hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm Trường hợp đó phải làm lại thí nghiệm với lượng dung dịch đường ít hơn hoặc pha loãng dung dịch đường Ngược lại, nếu không có lớp kết tủa Cu2O màu đỏ gạch thì phải tăng lượng dung dịch

đường

- Để lắng kêt tủa, lọc vào bình lọc chân không Buchner (qua phễu lọc xốp G4 chuyên dùng

để định lượng đường)

- Rửa bình và phễu lọc bằng nước cất nóng 3-4 lần Cần chú ý sao cho kết tủa Cu2O trên phễu lọc luôn được phủ bởi một lớp nước nóng

- Hòa tan kết tủa Cu2O vào bình tam giác 50 ml bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml) dung dịch Fe2(SO4)3 trong môi trường H2SO4 và dùng đũa thủy tinh khuấy thật cẩn thận để hòa tan hoàn toàn kết tủa Cu2O trên phễu lọc

- Tráng phễu lọc 3-4 lần bằng nước cất nóng

- Chuẩn độ dung dịch thu được bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 20-30 giây

- Biết được lượng KMnO4 dùng trong định phân, tra bảng để suy ra lượng đường có trong

mẫu Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất

Tính kết quả

Hàm lượng đường khử tính theo công thức sau