nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether của cây chỉ thiên (clerodendrum indicum (l.) o. ktze)

Bằng phương phap sac ky cot KG 60 Fos, silica gel kết hợp với sắc ký lớp mỏng, chúng tôi phân lập ra được một chất sạch từ loài cây này... e Hiệu quả của phương pháp: phương pháp này đò

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG DAI HOC CAN THO KHOA CONG NGHE

LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC

TRONG CAO PETROLEUM ETHER

CUA CAY CHi THIEN

(Clerodendrum indicum (L.) O Ktze)

TS Lê Thanh Phước Trần Thị Trà Mi

MSSV: 2063981

Ngành: Công Nghệ Hóa Học-Khóa 32

Tháng 11/2010

Sau gân 5 tháng làm luận văn vất vả và đầy thú vị, cuối cùng em đã đạt được những thành công nhất định Đề đạt được những điều ấy, đầu tiên em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy Lê Thanh Phước, cán bộ hướng dẫn đề tài luận văn của em Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài Thầy đã giúp em có thêm được những kiến thức mới về chuyên ngành Hóa Học Hợp Chất Thiên Nhiên, từ đó giúp

em thêm yêu nghề mình đã chọn

Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô của bộ môn Hóa, khoa Công nghệ

đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt hơn bốn năm học tập tại trường và đã

tạo mọi điều kiện tốt nhất ø1úp chúng em hoàn thành tốt luận văn này

Em cũng xin được gửi lời cám ơn đến cô Bùi Thị Bửu Huê và các thầy cô trong bộ

môn Hóa học, khoa Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện cho em được làm việc tốt nhất

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến anh Bành Nguyễn Anh Hào, học viên cao học

khóa 16 đã giúp đỡ tận tình, và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt

quá trình thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn các bạn Công nghệ hóa học và các bạn Cử nhân hóa học đã nhiệt

tình giúp đỡ em trong suốt thời gian em làm việc tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cả về vật chất lẫn tinh thần giúp em vượt qua mọi khó khăn thử thách

Xin chan thành cảm ơn!!!

Cần Thơ, tháng 11 năm 2010

Trần Thị Trà Mi

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công Nghệ Độc lập - Tư do - Hạnh phúc

Bộ môn: Công nghệ hóa học Cần Thơ ngày tháng năm 2010

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: 7s Lê Thanh Phước

2 Tên để tài:

“Nghiên cứu thành phân hóa học trong cao petroleum ether của cây Chỉ thiên

(Clerodendrum indicum (L.) O Ktze)”

3 Sinh viên thực hiện: Trần Thị Trà Mi MSSV: 2063981

Lớp Công Nghệ Hóa Học — Khóa 32

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

e Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: .-. - 5-5-5555 sss£xrsrzcee

Cần Thơ,ngày tháng năm 2010

Cán bộ hướng dẫn

il

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công Nghệ Độc lập - Tư do - Hạnh phúc

Bộ môn: Công nghệ hóa học Cần Thơ,ngày tháng năm 2010

NHAN XET VA DANH GIA CUA CAN BO PHAN BIEN

1 Cán bộ hướng dẫn: 7s Lê Thanh Phước

2 Tên để tài:

“Nghiên cứu thành phân hóa học trong cao petroleum ether cia cay Chi thiên

(Clerodendrum indicum (L.) O Ktze)”

3 Sinh vién thue hién: Tran Thi Tra Mi MSSV: 2063981

Lớp Công Nghệ Hóa Học — Khóa 32

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

e Đánh giá nội dung thực hiện để tÀi: Q n TH ng ng ng ng reereed

Cần Thơ ngày tháng năm 2010

Cán bộ phản biện

11

TÓM TẮT LUẬN VĂN

000

Cây Chỉ thiên có tên khoa hoc 1a Clerodendrum indicum (L.) O Ktze Ở Việt

Nam, cây Chỉ thiên mọc nhiều ở các tỉnh miền Tây, thường mọc hoang ở ven đường, đôi khi được trồng làm cây cảnh trong gia đình Các bộ phận của cây được dùng để chữa bệnh viêm xoang mũi dị ứng, bệnh cảm sốt, hen suyễn, trừ giun, Trong đề tài này, tôi xác

định thành phan hóa học của các hợp chất ít phân cực từ các bộ phận thân, lá và hoa của

cây Chỉ thiên

Bằng phương phap sac ky cot KG 60 Fos, (silica gel) kết hợp với sắc ký lớp mỏng,

chúng tôi phân lập ra được một chất sạch từ loài cây này

1V

DANH MỤC HÌNH S252 S333 E32 E13 313 1213 13311111 EErkrrrrred viii

DANH MỤC BẢNG ¿S613 1 1 E915 3151313131113 3111111111111 1 111.1 xe ix

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮTT ¿5-2 ++E+E+s+EzxzEzezezszed X

PHAN I TỐNG QUAN SG 33x33 33v 5 11T SH Tnhh ren 1

1 KHÁI QUÁT VÉ NGUYÊN LIỆU - + ¿6 + EE+E£E£ESESESESEEEEEEEEEsrersrees 2 1.1 Khái niệm về cây Chỉ thiên” Ể 2 2s S E33 3SEEE3EEEE5 515151113151 xe 2 1.1.1 Đặc điểm cây Chỉ thiên G + + S333 S3 T13 3 3 3 5 11x rêc 2 1.1.2 Vùng phân bố . - + E2 E2 5 31321 1 1131111 EEEEEEEEEEELrerkrkrkie 3

1.1.3 Bộ phận dùng - - - G 5S 10 S0 00 0v và 3 1.2 M6t s6 bai thuéc y hoc cé truyén cé str dung cdy Chi thién 77779 3 1.3 Thanh phan hoa hoc? ccccccccscscsessscscsscscsescsescscscssscsvsvscssavsvsssssescsesssvscesscesaves 4

2 CÁC KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH THÔNG DỤNG . - 2 55555555 5s£sc52 6

2.1 Kỹ thuật chiết lỏng — lỏng . - - sẻ S3 5E E1 1k3 HH 1xx x errei 6 2.2 Kỹ thuật chiết rắn — lỏng . - + SE S* S2 2 EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrkrskerd 8

2.2.1 Kỹ thuật chiết ngắm kiỆt G5 S333 S TS 3 5 3 xxx rec 8

2.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm . - ¿E133 SE SE EEEEEEEEkrkrkrrree 8

3 GIÓI THIỆU CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ”””” -cccrcsrerverree 8

3.1 Phương pháp sắc ký cột hở -5:¿ Error! Bookmark not defined

3.1.1 Chon chat hap thu để nhồi cột Error! Bookmark not defined

3.1.2 Chọn hệ dung môi giải ly cột Error! Bookmark not defined 3.1.3 Kích thước cột và lượng chất hấp thu Error! Bookmark not defined 3.1.4 Nạp chất hấp thu vào cột - 5s: Error! Bookmark not defined

3.1.5 Nap mau vao AAU COt eeceececeseesecseeseesecseces Error! Bookmark not defined

3.1.6 Theo dõi quá trình giải ly cột Error! Bookmark not defined 3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Error! Bookmark not defined 3.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng Error! Bookmark not

defined

3.2.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng Error! Bookmark not defined 3.2.3 Công dụng của sắc ký lớp mỏng Error! Bookmark not defined

PHẨNII THỰC NGHIỆM G2 - s11 E E13 E9 913 v13 1 1 5 113 8s eo 16

1 CÁC PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 17

1.1 Phương tiện nghiên cứu - thiết bị hóa chất .- ¿+ 2 2 2 csxsesxrezesea 17

1.2 Các bước tiễn hành -:- 2+ ++x+xt+xt2rt2 SrSEEEEEErrkrrkrrkrrrrrrrrrrrrrrrrrkd 18

1.3 Quá trình thu hái và xử lý nguyên lIỆUu - - - << 5 + + + + 11111 ve eree 18 1.4 Định danh nguyên lIỆU G9999 9 nh 19

2 ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT CÓ TRONG CÂY -55-: 19

"IV \cjUUUỔ a.a 19

„XS |; (001 LoCƯiiiẢẢỶẢẦẢd 21 2.34 CÏYCOSI€ HT Họ mm 21

“N6 0 a 22

Vi

“` 0 ae 23

“ta 24

3 QUÁ TRÌNH TRICH LY, PHAN LAP, TINH CHE MAU CHAT TREN CAO

0:12 - dd 27 3.1 Quá trình điều chế thu CaO - - s3 119131115 981v 129 nh ngưng re 27

3.1.1 Điều chế cao EtOH + tt 2121121121111 re 27

3.1.2 Điều chế cao PE, cao EtOAc, cao Bu, -<cccscccnccsse2 27

3.2 Tiến hành phân lập và tinh chế các chất trên cao PE ¿+ 5 s+c+s+s¿ 30 3.3 Xác định cẫu trúc của hợp chất vừa phân lập được . - ¿5-5 se s+e+ses¿ 34

PHẨNII KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ, G- SE SE k3 St E83 Seo 36

I8 970000807.) 0000:4 Ô 37

"A?):0 (9.01 ỶẢ 37

TAI LIEU THAM KHẢO c- 2c 222 202211311331 131111111111 115115511511 ky sen 38

Vil

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng - 5: 5c S222 2EEESEEEEEEEEEEEEEEEErrsrrred 7 Minh họa phương pháp sắc ký cột hở .- - + - + + E2 E£sEzEeEsEzEeteerrred 9

Mẫu cây sau phơi khô 5c S2 S2 3233 3x3 3v xxx vn ren 18

Chiết ngâm dầm mẫu cây Chỉ thiên - + + 2 22k +2+s+s£££z£zEzEzEzezed 19

Định tính alkaÌO1d - +5 C21 20033030 01911305 19053 111v v35 20 Định tính ÍÏaVOfOId - 5c c -c +2 223 9n vn ng vn g2, 21 Định tính øÌyCOSI€ c9 ng ng re 22 Định tính SapOTITI 03 33111 11 9 ng ng gà 23 '93)811801/1/8-05ã90 0 PE007Ẽ7Ẽ7 — 24 Định tính ÍÏaVOfOId - 5c c -c +2 223 9n vn ng vn g2, 25

Hình 21 Cấu trúc MI0I (Stigmasta-5,22E,25-trien-3/0-o]) - 7+ 55c ccccscsceccez 35

Các hóa chất sử dụng thực hiện đề tài - 2s +x£sEeEekrererersrerreee 17

Kết quả định tính một số nhóm hợp chất hữu cơ - + 2 2 s5: 25 Kết quả sắc ký cột trên cao PE + + + s2 E312 EEEEEEErkrkrkrersree 31 Kết quả sắc ký cột phân đoạn P2 - + + 2 E2 EkeEeEeEeErErkrkrersrsree 32 Kết quả sắc ký cột phân đoạn P2.3 + s xxx cv sErkrkrkrerersrreee 33

So sánh số liệu phố 'H-NMR đo được với số liệu được công bố 35

1X

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

Doublet (NMR) Triplet (NMR) Singlet (NMR)

Thin Layer Chromatography

Ethanol Petroleum ether (60-90°)

Ethyl] acetate

n-Butanol Methanol

Parts per milion Retention factor High-performance liquid chromatography

LỜI MỞ ĐẦU

000

Tu ngan xua, khi nén khoa hoc kỹ thuật chưa phát triển, những lúc đau yếu, con

người thường sử dụng những vị thuốc có nguồn gốc từ cây cỏ để chữa bệnh

Ngày nay, khi xã hội đã phát triển, sức khỏe con người được đảm bảo bởi những điều kiện sống tốt hơn, những phương pháp điều trị bệnh hiện đại và các loại dược phẩm tổng hợp Thế nhưng, con người vẫn không quên đi những vị thuốc kinh nghiệm của ông cha vì chúng ít gây ra các tác dụng phụ gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người

Vì thế, xu hướng của ngành dược hiện nay là hướng tới các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên và bằng chứng ngày càng có nhiều các chế phẩm được phẩm như thế được nhiêu người ưa chuộng

Một trong số những vị thuốc quý trong y học dân gian phải kế đến là cây Chỉ thiên Theo kinh nghiệm dân gian, cây Chỉ thiên thường mọc hoang, được hái về từ những bãi đất trồng, phơi khô rồi nấu lẫy nước uống để trị bệnh viêm xoang mũi dị ứng, bệnh cảm

sốt, hen suyễn, Tuy nhiên, đó chỉ là kinh nghiệm của người xưa để lại, chưa được

chứng thực bằng căn cứ khoa học Do đó, để góp phần giải thích bằng cơ sở khoa học

hiện đại về dược tính của loài cây này, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học

trong cao petroleum ether của cây Chỉ thiên” Qua đó còn nhằm tìm hiểu thêm về phương pháp cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây Chỉ thiên nói riêng và các loài thảo được nói chung

XI

PHAN I

TONG QUAN

1 KHÁI QUAT VE NGUYEN LIEU

1.1 Khái niệm về cây Chỉ thiên" ?

Tên thường dùng: Chỉ thiên, một số tài liệu còn gọi là Chỉ thiên giả, Ngọc nữ Ấn

Độ

Tên khoa học: Clerodendrum indicum (L.) O Ktze

Phan loai khoa hoc

Giới: Thực vật

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida Bộ: Lamiales Họ: Verbenaceae Chi: Clerodendrum Loai: C.indicum

Tên déng nghia: Tube-flowers, Turk’s Turban

1.1.1 Đặc điểm cây Chỉ thiên

Hinh1 Thân, lá và hoa của cây Chỉ thiên

Chỉ thiên là một loại tiểu mộc, cao 1-3.5 m, không nhánh hay có ít nhánh Lá

mọc chụm 3-5 lá, phiến lá hẹp dài đến 20 cm, không lông, cuống ngắn, ở mắt có một

hàng lông to nối liền cuống Hoa nằm ở ngọn hay nằm đơn độc ở nách lá Hoa có màu

trăng, đài hoa dài 1.5 cm, có tuyến ở trong, vành dài đến 19 cm, 5 tai đều, tiểu nhụy có chỉ đỏ, không lông Quả cứng, có màu lam đen

1.2 Một số bài thuốc y học cỗ truyền có sử dụng cây Chỉ thiên 121”:19:29

Theo y học dân gian thì cây có vị đắng, tính mát, có tác dụng bỗ đăng, thông khí,

hạ đờm, tiêu viêm, trừ giun

e Tri viém xoang mũi dị ứng

Toàn cây Viễn chí 12 g, lá hoặc quả Từ bi biển (viticis Rotundifoliae) 10 g, lá

cây Chỉ thiên (Clerodendrum indicum (L.)) 10 g Tất cả đem nẫu với 600 ml nước đến

khi sắc lại còn 200 ml chia 2 lần uống/ngày Don thuốc này dùng liên tục 7-10 ngày,

nghỉ 7 ngày rồi tiếp tục liệu trình

e_ Chữa viêm phế quản cấp tính

Tía tô 12 g, lá Hẹ, Kinh giới, mỗi vị 10 ø, Bạch chỉ, rễ Chỉ thiên, mỗi vị 8 g,

Xuyên khung, Trần bì, mỗi vị 6 g Sắc uống ngày một thang

e Chữa cảm mạo, sốt cao, ho

Ngày dùng 16-20 g cây khô, hoặc 50 g cây tươi sao vàng, sắc uống

e Chữa cảm sốt

Bài 1: Chỉ thiên, lá Cối xay mỗi vị 40 ø; Bạc hà, Cam thảo đất mỗi vị 20 ø, Gừng

3 lát Tất cả dùng tươi sắc uống

Bài 2: Chỉ thiên, Sắn dây, Rau má, lá Chanh, Cam thảo đất mỗi vị 30 g; nếu ra

nhiêu mô hôi thêm lá Tre 1 năm Sắc uông nguội

e_ Trị ho cho trẻ em khi thời tiết thay đỗi

Cây Sôi nước (Tinh lang), rễ cây Chỉ thiên, cây Tía tô, các vị trên phơi khô, sắc

uống

e Chữa đau lưng, đau khớp

Ớt chín 15 quả, lá Ðu đủ 3 lá, rễ Chỉ thiên 80 g, tất cả giã nhỏ ngâm côn với tỉ lệ

1⁄2, xoa bóp sẽ mau khỏi

e_ Ngoài ra cây Chỉ thiên còn được dùng đê chữa các bệnh như

Dùng làm thuôc chữa cảm gió, cam tâu mã, hen suyên Lá dùng làm thuôc trị

giun; còn dùng phôi hợp với Trang đỏ, tán bột cuôn như điêu thuôc lá đê hút trị mũi có

?

mu

e Ở Ấn Độ, người ta dùng rễ cây làm thuốc tri hen suyén, ho va bénh lao hach

Nhựa cây dùng trị bệnh thấp khớp do giang mai Dịch lá trộn với sữa lỏng đùng làm thuốc đắp trị phát ban do nắm và bệnh chốc lở (pemphigut) Lá cũng được dùng làm thuốc trừ giun

1.3 Thành phần hóa học”

Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chỉ CJerodendrum Thành

phân hóa học chủ yêu của ch1 nay gdm co phenolic, flavonoid, terpenoid va steroid Hiện nay, ở Việt Nam hiện vân chưa có tài liệu ngiên cứu nào vê Clerodendrum indicum (L.) Một sô nghiên cứu về loài cây này ở nước ngoài đã được công bô gôm

4

co:

e Năm 1997, TaIn và các cộng sự đã cô lập được nhóm chất cleroindicin A-F từ các phần trên mặt đất của cay Clerodendrum indicum (L.)

Nhóm chất cleroindicin A-F là nhóm có hoạt tính kháng ung thư, thuộc nhóm

phenolic Cây Clerodendrum indicum được chiết với cao cồn, sau đó loại béo bằng PE, phân còn lại sau khi loại béo được đem đi tiến hành sắc ký sẽ thu được Cleroindicin

e Nam 1973, Sankara Subramanian, Ramachandran Nair va nam 1993, Gunasegaran cùng với những cộng sự đã cô lập được một số chất thuộc nhém flavonoid gồm hispidulin, scutellarein, scutellarein-7-O-Ø-D-glucuronide từ hoa của cây Clerodendrum indicum (L.)

Hispidulin có đặc tính giảm chứng động kinh, an thần, chống oxy hóa, kháng

sinh Chiết cao EtOH bằng EtOAc Pha hữu cơ được hòa tan lại với EtOH, phần không

tan đem sắc ký pha đảo với hệ dung môi (chloroform/MeOH/n-propanol/nước) để thu

được hispidulin tinh khiết.

OH ⁄ ° a a |

on A

OH OH O

Scutellarein-7-O-f-D-glucuronide

2 CAC KY THUAT CHIET TACH THONG DUNG’

2.1 Kỹ thuật chiết lông-lồng

Cao alcol thô ban đầu chứa nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân

cực Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng được dùng để phân chia cao alcol thô thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ như PE, ) sẽ hòa tan tốt những hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình (ví dụ

như điethyl ether, chloroform, ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình,

dung môi phân cực mạnh (ví đụ như MeOH, ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính

phân cực mạnh

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện trong bình lóng, chiết lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực ví dụ như PE, ether ethyl, chloroform, EtOAc, ø-butanol, Với từng loại đung môi, tiến hành chiết đến khi nào không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với loại đung môi khác Việc chiết được

tiến hành nhiều lần, mỗi lần dùng một lượng nhỏ thẻ tích dung môi.

Hình2 Minh họa sự phân bố của chất tan vào các pha dung môi

1) Trước khi tiến hành lắc, pha nước và pha hữu cơ chưa phân bố vào nhau

2) Lắc bình lóng, khuấy trộn 2 pha

3) Sau khi lắc, để yên 1 thời gian sẽ xuất hiện hiện tượng phân chia pha, pha

có tỷ trọng cao nằm dưới, pha có tỷ trọng thấp nằm phía trên

Pha có tỷ trọng thấp

Hình3 Kj thuat chiét léng-léng

2.2 Kỹ thuật chiết răn-lỏng

2.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

e Dung cụ: gồm một bình ngắm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, đáy bình có

van khóa, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dịch chiết Phía trên bình ngắm kiệt là

bình lóng để chứa dung môi tỉnh khiết.

e Thuc hành: bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, còn mẫu nếu xay quá mịn hoặc có tính nhây nhụa hoặc có tính trương nở sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngắm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt lên trên lớp bông thủy tinh, đến gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bị thủy tinh để dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi vào bình đến khi đung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt

e_ Để yên một thời gian (thường là 12-24 giờ) Mở khóa bình ngắm cho dịch chiết

chảy ra, đồng thời mở khóa bình lóng dé dung môi chảy xuống bình ngẫm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi chảy vào bằng với vận tốc dịch chiết chảy ra khỏi bình ngầm

e Hiệu quả của phương pháp: phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn phương pháp ngâm dam, vi day 1a qua trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngẫm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ liên tục được thay thế bằng dung môi tỉnh khiết

2.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dâm

Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp nên có thể đễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm bột cây trong bình chứa thủy tinh có nắp đậy Dung môi tinh khiết được rót vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt

độ phòng trong 24 giờ, để dung môi thắm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Đem lọc dịch chiết và cô quay thu hồi dung môi, ta được cao chiết

Lặp lại quá trình trên cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Ngoài các phương pháp chiết cô điển trên, còn có những phương pháp chiết hiện đại khác như: chiết bằng máy chiết Soxhlet, máy chiết Kumagawa, chiết lôi cuốn theo hơi nước, chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn

3 GIỚI THIỆU CHUNG VẺ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ°”"

Sự sắc ký là một phương pháp vật ly để tách một hỗn hop gồm nhiều hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, đựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất

đó với một hệ thống gồm hai pha: một pha động va mot pha tinh

Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở đạng khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (Gas Chromatography- GC) và sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) Dua vao co ché trao

đổi của các chất giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc ký

thành các nhóm nhỏ hơn: sắc ký hấp thu, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel,

Có rất nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, tuy nhiên trong điều kiện phòng thí nghiệm, phương pháp sắc ký chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký cột hở và sắc ký lớp mỏng

3.1 Phương pháp sắc ký cột hở

Hinh4 Minh họa phương pháp sắc ký cột hở

Phương pháp này được tiễn hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh là những hạt hấp thu có kích thước 50-150 um được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được cho vào phía trên bề mặt chất hấp thu Dung môi giải ly được cho vào ở đầu cột, tiến hành quá trình rửa giải Phương pháp này có hiệu quả

tách chậm so với sắc ký lỏng hiệu nâng cao, tuy nhiên pha tĩnh sử dụng trong sắc ký

và dụng cụ thí nghiệm tương đối rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng lớn

mau chat

3.1.1 Chọn chất hấp thu đề nhồi cột

Tùy thuộc vào tính phân cực của mẫu chất cần phân tích mà ta chọn chất hấp thu

phù hợp Với những hợp chất rất phân cực, nên nên sử dụng sắc ký trao đôi ion hoặc

sắc ký lọc gel Còn bình thường thì sử dụng sắc ký hấp thu

3.1.2 Chọn hệ dung mồi giải ly cột

Trước khi tiến hành sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để đò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp

Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ (cao có chứa nhiều hợp chất có tính phân cực khác nhau) thì chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đây vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bảng mỏng là R;= 0.5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đây vết phân cực nhất của cao chiết lên vị trí Ry=

0.2

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột, tuy nhiên phải chỉnh tỷ lệ dung mội của sắc ký cột sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn vì chất hấp thu trên bản mỏng có độ chặt chẽ lớn hơn chất hấp thu trong cột

Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi giải ly nào, nhất thiết phải tăng chậm: thêm mỗi lần vài phân trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào

dung môi cũ đang sử dụng Ví dụ đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang benzene,

sé pha benzene vao hexan theo ty lé 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% và 100% benzene Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy các dung dịch với nồng độ 1%, 2%, 3%, 5%, 10% có tính phân cực tăng theo lượng dung môi phân cực cho thêm vao, con cdc dung dich 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% lai c6 tính phân cực tăng lên rất ít, gần như tương đương nhau Do đó việc giải ly với các nồng độ như thé rất mất thời gian

Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột Do alumin hay silisa gel khi trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này làm dung môi bốc hơi một cách cục bộ, tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột Cột gãy sẽ làm mất đi tính liên tục của chất hấp thu vì thế không tách tốt được

10

3.1.3 Kích thước cột và lượng chất hấp thu

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì tỷ lệ chiều cao chất hấp

thu : đường kính cột vào khoảng 10:1 Lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần

trọng lượng của mẫu cần sắc ký

3.1.4 Nạp chất hấp thu vào cột

Có hai cách nạp chất hấp thu vào cột: nạp sệt và nạp khô

e_ Nạp sệt: cho chất hấp thu ở đạng khô vào becher chứa một lượng dung môi gấp 5-10 lần lượng chất hấp thu, mỗi lần cho vào một ít, đồng thời khuấy đều Tránh

trường hợp cho vào một lúc lượng lớn chất hấp thu hay cho dung môi vào chất hấp

thu, vì điều này sẽ làm cho chất hấp thu trương nở nhanh, không đồng đều, sinh nhiệt

cục bộ, gây ra hiện tượng không đồng nhất trong cột, dẫn đến gãy cột, nứt cột

Chất hấp thu dạng sệt này được cho vào cột có sẵn dung môi Dung môi chảy ra

ở phía dưới cột sẽ được rót trả lại đầu cột Tiếp tục rót chất sệt vào đến hết, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong

A

cot

e Nap khé: cét duoc dé đầy dung môi, mở khóa cho dung môi chảy ra cham chậm bên dưới, đồng thời cho từng ít một chất hấp thu ở dạng bột vào đầu cột Cùng lúc đó dùng thanh cao su gõ nhẹ vào thân cột Khi chất hấp thu đạt chiều cao hợp lý thì ngưng không cho thêm vào nữa Sau đó cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần để

ổn định cột

3.1.5 Nạp mẫu vào đấu cột

Có hai cách nạp mẫu vào cột: nạp mẫu ở dạng dung dịch và nạp mẫu ở dạng bột

khô

e Nap mau chat 6 dạng dung dịch

Nếu mẫu ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp mẫu lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu ở

dạng rắn, hòa tan vào một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi khởi đầu cho sắc ký cột Cần lưu ý dung dịch mẫu có nồng độ càng đậm đặc càng tốt

Quá trình nạp mẫu tiến hành như sau: mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột Khi mức dung môi vừa sắt với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột thì khóa cột lại,

11

nạp ducng dịch mẫu vào đầu cột Sau đó mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột Cần chú ý không cho bề mặt chất hấp thu ở đầu cột bị khô Tiếp theo dùng pipette cho nhè nhẹ một lương dung môi

mới lên đầu cột Sau đó cho thêm lên mặt thoáng của cột một lớp cát, hay bông gòn,

bông thủy tinh, dé bao vệ mặt cột Cuối cùng cho dung môi vào cột để bắt đầu quá trình giải ly

e Nap mau chat 6 dạng bột khô

Nếu chất mẫu không tan trong dung méi loai dung môi lựa chọn để bắt đầu quá

trình giải ly cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong

dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô” Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (X g) được hòa tan

trong dung môi như EtOAc hoặc MeOH (50X g), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn

(10X g) Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ, mẫu cần sắc ký đã được tâm lên bề mặt của những hạt silica gel

Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn dé bat dau quá trình sắc ký cột), thấm ướt một phần bột silica gel Cho một lớp cát đầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột Cuối cùng cho dung môi vào đây cột để bắt đầu quá trình giải ly

3.1.6 Theo đõi quá trình giải Ìy cột

Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc ký khác nhau, đang tách xa nhau ra Theo dõi các dãy màu và hứng chúng, khi được giải ly ra khỏi cột Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo đõi bằng những cách khác nhau

Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh

số thứ tự Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau Nên pha một lượng lớn dung môi giải ly

để hạn chế sai lệch nồng độ trong mỗi lọ

Dung dịch trong những lọ hứng sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mong Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Đuổi dung môi các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó

12

3.2 Phương pháp sắc ký lớp móng

3.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp móng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ như silica gel,

hoặc oxyt nhôm Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tâm kiếng, tắm nhôm hoặc tắm plastic Do chất hấp thu được tráng thành

một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

e Bình sắc ký: một chậu, hủ, lọ bằng thủy tỉnh, hình dạng đa dạng có nắp đậy

e Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, ví dụ như silica gel, alumin được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tắm kiếng, tâm nhôm, hoặc tâm placstic Chất hấp thu trên tắm giá đỡ nhờ canxi sunfat khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ

e Mau can phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 ul dung dịch mẫu với nồng độ

loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía

trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

e Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyên chằm

chậm đọc theo tắm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi

lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phân của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi

vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc đi chuyển này tùy thuộc

vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh

(hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyên nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyên chậm

e®© Dung môi giải ly: nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có

độ tỉnh khiết cao, tránh có các vết kim loại Dung môi không được quá dễ bay hơi, ví

du nhu ethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xi 35°C, gan bang nhiệt độ của phòng thí nghiệm

vào mùa nóng (miền nam Việt Nam) Dung môi dễ bay hơi sẽ dễ dàng bay đi khỏi tắm

lớp mỏng sau khi giải ly

Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tý lệ phân phối của các hợp chất

13