nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether từ rễ cây bần chua (sonneratia caseolaris (l.) engl.) đỗ nguyễn tường vy

Hình 4: Lẫu chua được ché bién tir qua Ban 1.1.5 Tình hình nghiên cứu về cây Ban chua 1.1.5.1 Các công trình nghiên cứu trong nước “12 Năm 2010, Từ Minh Tỏ Khoa Khoa học tự nhiên, Trườ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÂN THƠ

ĐỖ NGUYÊN TƯỜNG VY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHÁN HÓA HỌC

TRONG CAO PETROLEUM ETHER

TU RE CAY BAN CHUA

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)

LUAN VAN DAI HOC Chuyén Nganh: CONG NGHE HOA HOC

Mã số: CN 262

CÂN THƠ - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÂN THƠ

ĐỒ NGUYÊN TƯỜNG VY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHÁN HÓA HỌC

TRONG CAO PETROLEUM ETHER

TU RE CAY BAN CHUA

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)

LUAN VAN DAI HOC Chuyén Nganh: CONG NGHE HOA HOC

Mã số: CN 262

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LỄ THANH PHƯỚC

CÂN THƠ - 2012

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa Sinh 3, Bộ môn Hóa, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ, khu II, đường 3/2, quận Ninh

Kiều, thành phố Cần Thơ Tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến:

TS Lê Thanh Phước, Phó Trưởng Khoa, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại Học Cần Thơ, người đã hết lòng tận tụy giảng dạy, giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn, đồng

thời tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này

Quý thầy cô của Bộ môn Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ, trường Đại Học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức, cho tôi trong suốt bốn năm học tập tại trường

Quý thầy cô của Bộ môn Hoá học, Khoa Khoa học Tự nhiện, trường Đại Học Cần Thơ đã tạo cho em điều kiện làm việc tốt nhất trong suốt thời gian thực hiện luận

văn

Anh Từ Minh Tỏ, chị Lâm Thúy Phương, Lê Hương Nhi học viên cao học khóa

17 và các bạn tại Phòng thí nghiệm Hóa Sinh, Bộ môn Hóa, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại Học Cần Thơ đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cả về vật chất lẫn

tỉnh thần giúp tôi vượt qua mọi khó khăn thử thách

Cần Thơ, tháng 4 năm 2012

Đỗ Nguyễn Tường Vy

1

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Cây Ban hay còn gọi là Thủy liễu (liễu nước), hải đồng, Bần chua, loài cây mà

đom đóm rất thích đậu trên lá vào ban đêm, tên khoa hoc 1a Sonneratia caseolaris (L.) Engl., thuộc họ Lythraceae Ö Việt Nam, Bần là một loại cây rất quen thuộc có mặt khắp nơi ven sông, ven biển, các bãi bồi Các bộ phận của cây bần được sử dụng trong dân gian như: hoa bằần chữa tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy, giải nhiệt cảm sốt, quả có thê dùng để nấu canh chua, có thể chữa bệnh bong gân, cam máu, Trong đề tài này, tôi nghiên cứu thành phần hóa học của cao petroleum ether từ

rễ cây Bản

Bằng phương pháp sắc ký cột KG 60 F¿sx (silica gel) kết hợp với sắc ký lớp mỏng, tôi phân lập ra được ba chất sạch từ cao petroleum ether Sử dụng các dữ liệu phố 'H-NMR đã xác định được một chất đó là: lupeol, các chất còn lai dang trong qua trình tìm hiểu

11

CHUONG 1: TỎNG QUAN - -G- (c1 S1 BH T1 Tưng Hưng người 1

1.1 Khai quat vé nguyén liu cece cccceecscsescsssescscscscsescscacececavscanavecavecavacscaeecseas 1

1.1.1 Gidi thiéu chung vé Cy BAN CRUG vescccccscscccsscscscscssssscssssssesssssssessessseesseseens 1

1.1.2 Đặc điểm vé cory BAN CHUA veececcccseccccseccsesescsescsvses cesses cecsescavavsvavscevaeecaescneas 1

1.1.4 Công dụng chữa bệnh của cây BâM S5 kSt St chgkrrrrkrei 4 1.1.5 Tình hình nghiên cứu về cây Bần CÌiA -. -G cEe kEkétrrkrkre, 5

CHUONG 2: CO SO LY THUYET 00.0.0 ccccccccscssssssssesneeeseesesecseeseeaneacesceseeseeseens 10

2.1 Cac ky thuat chiét tach thong dung ccccsecsseecccseecsesescsesescsesssanscatanes 10 2.1.1 Dung môi để tách chiết các hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu cây 10 2.1.2 Lựa chọn dung mồi l).1/287/131,RERRRRRRRRNNaaaa 10 2.1.3 Một số điều cẩn biết khi sử dụng dung môi chiết tách -c «+ 11

2.1.4 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng, - 5Á SÁCH HS HT HH 11 2.1.5 Kỹ thuật chiết rắn - ÏỎng - «5Á ST nreki 12

2.2_ Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký ¿ - ¿5S Set se creeed 13

2.2.1 Phương pháp sắc kỷ ÏÓP HHỎNG - - + SE Set rrkc 13

2.2.2 Phương pháp sắc ký cột hở - - «ke k HH HH TH ghi 15

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM - G1 2S SSY Hy HH HH HH ng 20

3.1 Phương tiện nghiên cứu - thiết bị hóa chất - ¿5 + ccEx‡k ke re: 20 3.1.1 Dụng CỤ QSQQ on TH HS KT kh 20

31.2 1 an e 20

3.2_ Các bước tiễn hành - -á- - Cn cha S S1 93 E1 12 158 13 1113 515 11511111 12E555 153158 1x2 21

3.3 Quá trình thu hái và xử lý nguyên liỆu - << << << 2s sssssssesess 21 3.3.1 Thu hái HgUHVÊN ÏÏỆM Ăn KH KH KH HH há 21

SƯ G11 216.a 22

3.4 Quá trình điều chế thu CaO -.-i- + Sẻ St S3 E18 cư cư gen nrro 23

3.4.1 Quá trình điều chế thu cao ethaHOl -¿ «SE ke kekekrersrkerd 23 3.4.2 Qud trinh diéu ché cdc cao petroleum ether (PE), cao dichloromethane (Di), cao Ethyl acetate (EA, EtOAc) và cao n-BUÍ@HỌ - «5S +s2 24 3.4.3 Cách phân lập các chất ít phân cực trong rễ Bần -c e5: 27 3.5 Quá trình phân lập và tinh chế các chất trên cao ¿ 2 2 ¿c2 exsessex¿ 27 3.5.1 Khảo sát cao PE bằng sắc ký bản mỏng , - 5c se ceserecsrerersrke 27 3.5.2 Khảo sát cao PE bằng sắc Ïý CỘP SÁCH HH, 28

3.6 Xác định các tính chất vật lý đặc trưng và cẫu trúc của hợp chất vừa phân lập

ƯỢC -c QQ Q0 C0 ĐT HH HH KH TK Họ KH nà Ki ĐK 00 088010 1E 37

3.6.1 Tính chất vật Ïý ckckStkEkSEE E1 HT T111 HH H niệu 37

3.6.2 Xác định cầu trúc của PHUOC-VY-01 cccc+cccccercere 37

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, - - 2: - cesses 40

AL K@t Quan na 40

A.2 Kién nghi ccc cccecccssscscssscesecsscscecscscsescesscscavsceesessessseseessecscstscsvseasesesess 40 TÀI LIỆU THAM KHHẢO À - Sẻ SE SE SE SE HH HT kh ru 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Cây Bần chua

Hình 2: Hoa Bần chua

Hinh 3: Qua Ban chua

Hình 4: Lâu chua được chế biến từ quả Bìn

Hình 5: Chiết ngâm dầm rễ cây Bần

Hình 11: Tinh thể và TLC của phân đoạn II trong cao PE

Hình 12: Bắt đầu xuất hiện chất sạch thứ I

Hinh 13: TLC va mau PHUOC-VY-01

Hình 14: Sắc ký cột phân đoạn VI

Hinh 15: TLC và mẫu của PHUOC-VY-02

Hinh 16: TLC và mẫu của PHUOC-VY-03

DANH MUC BANG

Trang Bang 1: Cac héa chat str dụng thực hiện đề tải 20 Bảng 2: Kết quả sắc ký cột cao PE 29

Vii

DANH MUC NHUNG TU VIET TAT

Doublet (NMR)

Triplet (NMR) Singlet (NMR) Thin Layer Chromatography Ethanol

Petroleum ether (60-90°) Dicloromethane

Methanol Ethyl] acetate Parts per milion Retention factor High-performance liquid chromatography

Vill

LỜI MỞ ĐẦU

Từ ngàn xưa, khi nền khoa học kỹ thuật chưa phát triển, những lúc đau yếu, ông cha ta thường sử dụng những vị thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên để chữa

bệnh

Vì thế, xu hướng hiện nay của ngành dược phẩm là hướng đến các sản phẩm

có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm như thế rất được ưa chuộng Một trong những vị thuốc trong y học dân gian thì cây Bần chua là một loài cây phố biến và

được biết đến với nhiều lợi ích Theo một số tài liệu về y học trên thế giới, vỏ cây,

lá và trái của loài này là nguồn được liệu có giá trị chữa bệnh Ngoài ra, những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây Bần chua

đã khăng định nó có khả năng chống ung thư và kháng oxi hóa

Do đó, để góp phần tìm hiểu và đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu phong

phú có tiềm năng quan trọng trong ngành được, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether từ rễ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engj)” Qua đó, nhằm tìm hiểu thêm về phương pháp cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây Bân chua nói riêng và các loài thảo dược nói chung

1X

CHUONG1: TÔNG QUAN

1.1 Khái quát về nguyên liệu °

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Ban chua

Tén Khoa Hoc: Sonneratia caseolaris (L.) Engl

Tén déng nghia : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris

Tén Viét Nam: Ban Chua

Tên khác: Hải đồng, Thủy Liễu

Loai : Sonneratia caseolaris (L)

1.1.2 Đặc điểm về cây Ban chua

Bản là loại cây gỗ phân cành nhiều, ưa sáng chịu được mặn nên thường thấy trên các vùng đất bùn nhão ở các cửa sông Để thích nghỉ với điều kiện đất bùn nhão và thường bị ngập nước nên cây có hệ thống rễ thở Nó thường mọc lẫn với các loài Kandelia candel, Aegiceras corniculata, Excoecaria agallocha, và các loài đước — Avicenna spp là những đại diện không thê thiếu, tạo nên quân thể rừng ngập mặn ven biển Việt Nam Cây còn được trồng thêm nhằm mục đích chắn sóng

va bảo vệ vùng đât ngập nước ở ven biên

Cây 20, thân cao 10-15 m hoặc cao hơn, luôn xanh Rễ thở tập trung thành khóm ở quanh gốc thân, mọc ngập sâu vào bùn Cành non có 4 cạnh nhẵn Để thích

nghi với điêu kiện đât bùn nhão và thường xuyên bị ngập nước, cây có hệ thông rẽ

thở mọc trồi lên khỏi mặt đất

Hình 1: Cay Ban chua

Lá mọc đôi, lá non hình mũi mác dài, lá già hình trái xoan, dài 5-10 cm, rộng 3,5-4,5 cm, gôc thuôn, đâu tù, phiên lá dài và dai, hơi mọng nước, rât giòn, gân lá

rõ, thường rụng vào mùa đông; cuông lã và phân gần chính ở gôc có màu đỏ

Hoa màu trang, mọc đơn độc ở ngọn thân hoặc kẽ lá, cuốn hoa ngắn và mập, đài có có 6 răng hình tam giác, dày hàn liền ở gốc tạo thành một ống dài 1,5 cm, mặt ngoài màu lục mặt trong màu tím hồng, tràng 6 cánh hình dải, đầu thuôn nhọn, nhị nhiều, chỉ nhị dài, mảnh, bầu hình cầu det Mùa hoa: tháng 3-5 Ban ra hoa hang năm, thụ phẫn nhờ gió, côn trùng và dơi Hoa Ban 1a nguén thitc 4n quan trong cua ong mật

1.1.3 Phân bố sinh thái

Chi sonneratia L.f gsm một sô đại diện là cây gỗ hay cây bụi, mọc ở các vùng đât ngập mặn ven biên Loài này cũng được phân bô rộng rãi ở An DO, Thai

Lan, Campuchia, Indonesia, Philippin, New Guinea, phần biển Đông Bắc Australia

va dao Salomon

Ở Việt Nam, chỉ này có 4-5 loài, trong đó Bần là cây gặp khá phố biến ở các vùng nước lợ và ven biển từ Thủy Nguyên (Hải Phòng) cho đến Rạch Giá (Hà Tiên) Nó thường được mọc chung với các loại cây khác như: Trang, Sú, Cóc cũng có khi mọc thành rừng gần như thuần loại như ở Hải Phòng, Nghệ An, Hà

Tĩnh Sự phong phú này tùy theo nước lợ và chế độ thủy triều

1.1.4 Công dụng chữa bệnh của cây Bần ° '°

Gô bân dung làm than, nút chai Trái thì làm các món ăn như canh chua bân, mam ban, lâu cá nâu bân Ngoài ra, cây Bân chua còn có thê làm dược liệu chữa được một sô bệnh cho con người

Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết Ta dùng lá giã ra, thêm tí muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng

giập và vết thương nhẹ Ở Malaixia, người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc đắp chữa

chứa trong địch quá hoặc là trị tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy thì giã nhỏ, ép lấy

dịch, cô thành cao mềm Lúc cao còn nóng phết lên giấy, khi dùng, hơ thuốc cho mềm rồi đắp lên chỗ đau, ngày làm một lần Ở Ấn Độ, quả Ban duoc dùng làm thuốc đắp ngoài chữa bong gân sưng tấy, dịch ép lên men từ quả có tác dụng cằm máu Ở Malaisia, quá già là thuốc điệt giun, còn nước ép từ quả xanh có vị chua, dùng làm tăng mùi vị cho bột cari, còn lúc chín có mùi vị giống bơ, có thể ăn tươi hoặc nâu chín

Hoa Bằn: ở Ấn Độ, dịch ép từ hoa là một thành phần trong bài thuốc chữa đái

ra mau

Hình 4: Lẫu chua được ché bién tir qua Ban

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về cây Ban chua

1.1.5.1 Các công trình nghiên cứu trong nước “12

Năm 2010, Từ Minh Tỏ ( Khoa Khoa học tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ)

đã phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất PHUOC-TO-01 là betulinaldehyde

trên cao petroleum ether từ vỏ rễ, phần nhô lên khỏi mặt đất, đường kính trung bình của môi rê khoảng 2 cm, chiêu cao khoảng 0,4 đên 0,8 m

Từ loại nguyên liệu có sẵn ở Đồng bằng Nam Bộ là rễ Bần, hai tác giả La Vũ

Thùy Linh và Trương Ngọc Đức (Trường Đại học Tôn Đức Thắng) đã nghiên cứu

sản xuất thành công than hoạt tính Các tác giả cho biết, công trình đã xác định được đặc trưng của rễ Bần và sản xuất thành công than hoạt tính với điều kiện than hóa ở 450°C trong 3 giờ và hoạt hóa bằng cách tâm muối cacbonat và nung trong môi trường CO; ở nhiệt độ 800°C trong khoảng 1 giờ Kết quả cho thấy than hoạt

tính từ rễ Bần có thê thay thế các loại than hoạt tính trên thị trường trong xử lý

nước, xử lý môi trường, hâp phụ, khử mùi và màu

1.1.5.2 Các công trình nghiên cứu trên thể giới ”Ẻ

Ngoài việc sử dụng cây Bần mà chủ yếu là các cao trích từ lá, thân, rễ để điều trị một số bệnh trong y học dân gian, ngày nay các nhà hóa học trên thế giới đã chiết xuất được nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng tir cay Ban như: flavonoid, steroid, terpenoid, iridoid,

Năm 2006, nhóm nghiên cứu gồm: Sadhu Samir Kumar (Khulna Univ., Khulna, Bgd) Sadhu Samir Kumar (Chiba Univ., Chiba, Jpn) Ahmed Firoj (Khulna Univ., Khulna, Bgd) Ohtsuki Takashi (Chiba Univ., Chiba, Jpn) Ishibashi Masami

(Chiba Univ., Chiba, Jpn) tai Nhat Ban dA nghién ctu vé flavonoids tir cây

Sonneratia caseolaris (L.) duoc dang bai viét trên tạp chí quốc gia bằng tiếng anh ở trang (264-265) Bài viết dựa trên công dụng theo dan gian cua Sonneratia caseolaris (L.) đã thử nghiệm trên các phần trích ra từ cây, thử khả năng kháng oxi

hóa sử dụng gốc 1,1-điphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) loại bỏ ảnh hưởng của tạp chất trên sắc ký lớp mỏng Kế theo nó định hướng khả năng tách rời hai chất

flavonoids 1a luteolin (1) va luteolin 7-O-Ø-glucoside (2) đã được phân lập va ca hai chat trên đều có hoạt tính kháng oxi hóa

Năm 1995, nghiên cứu về thành phần hóa học trên hoa cia cay Sonneratia caseolaris (L.) Tóm tắt bài nghiên cứu như sau: Hoa của cây Sonneratia caseolaris (L.) được làm khô Được chiết với hexane, dichlorometane, ethyl acetate va methanol Chiết phân đoạn bằng cột sắc ký đã phân lập được mười chất Tám chất

đã biết đặt tính và tính chất vật lý, TC với các mẫu đã chắc chắn, các phản ứng

hóa học và dữ liệu phổ Tám chất này là một hỗn hợp của một chuỗi dài sắp xếp

theo thứ tự các hydrocarbon (C›;-Ca;), một hỗn hợp các chuỗi dài các ester, một hỗn

hợp các chuỗi dài của alcohol (Cas,Czo,Caz), một hỗn hợp các steroid (B-sitosterol và stigmasterol), kaempferol, qrercetin, gallic acid và -sitosterol-3-O-B-D- glucopyranoside, hai chất còn lại đang trong quá trình nghiên cứu

Năm 2008, nhóm nghiên cứu Shi-Bao Wu, Xu-Wen L1, Yun Zhao va Jin-Feng

Hu thuộc bộ môn của Các Sản Phẩm Tự Nhiên Nghiên Cứu Về hóa Chất Di Truyền

và Ying Wen, Zheng Zhao thuộc bộ bộ môn Dược Lý và Độc Chất trường Đại Học

6

Chuẩn Phương Đông, Trung Quốc Họ đăng bài viết vào ngày 25 tháng 09 năm

2008 được chấp nhận ngày 18 tháng 01 năm 2009 và có tài khoản online ngày 20 tháng 02 năm 2009 Đề tài của họ là “Nghiên cứu thành phần hóa học trên quả của cay Sonneratia caseolaris (L.) va Sonneratia ovata (Sonneratiaceae)” va ho da cé duoc két qua nhu sau: chin chat (1-9) va bay chat (1-6,10) lần lượt được phân lập từ qua Sonneratia caseolaris va Sonneratia ovata Cac cau tric cua ching được xác định bởi sự so sánh đữ liệu MS và NMR của chúng tốt như các đặc tính vật lý có trong lý thuyết Tất cả các hợp chất được phân lập được sàn lọc thử nghiệm trên chuột đấy các tế bào C-6 sử dụng phương pháp thử nghiệm MTT; chỉ có hợp chất (-)-(R)-nyasol (1), (-)-(R)-4'-O-methylnyasol (2) va maslinic acid (6) được phát hiện

có biểu hiện khả năng giết chết tế bào

1.1.5.3 Một số hợp chất được phân lập từ cây Bẵn chua ”

1.1.5.3.1 Luteolin

+ Tén khac: Digitoflavone, flacitran, luteolol

+ Tén IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(3,4-dihydrophenyl)-4H-chromen-4-one + Cong thire phan ttt: C}5H190¢

+ Công thức cấu tao:

1.1.5.3.2 Luteolin 7-O-B-glucoside

+ Tén IUPAC:

7-((2S,3R,4S,5S,6R)-tetrahydro-3,4,5-trinydroxy-6-(hdroxymethyl)-2H-pyran- 2-yloxy)-5-hydroxy-2-(3,4-dihydroxypheny])-4H-chromen-4-one

+ Cong thitc phan tu: C41H9011

+ Công thức cấu tạo:

+ Công thức cấu tạo:

+ Công thức phân tử: C;oHagO;

+ Công thức cấu tạo:

CHƯƠNG2: CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.1.1 Dung môi để tách chiết các hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu cây

Do cấu tạo hóa học của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ Do đó, việc khảo sát hợp chất tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường, người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu

với mức độ phân cực khác nhau Tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất

có tính ái nước Vì vậy, việc chiết tách hợp chất thiên nhiên được thực hiện lần lượt

với từng loại dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất ra bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol, ethanol

Nguyên tắc tổng quát là tùy vào đặc tính các chất biến dưỡng thứ cấp có trong từng loại cây mà sự lựa chọn dung môi và qui trình phù hợp dé tach hợp chất ra

khỏi cây Do đó, trước khi làm thực nghiệm cần phải thu thập đầy đủ các tài liệu

tham khảo có liên quan trực tiếp đến loại cây cần khảo sát để chọn ra qui trình tách chiết phù hợp

Muốn tách chiết hợp chất ra khỏi cây cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ

thuật chiết ngâm dầm, chiết Soxhlet, Sau khi chiết, phần bã cây hoặc sinh khối

còn lại được lọc bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở

nhiệt độ thấp khoảng 30-40°C do nhiệt độ cao có thê làm hư hại một số hợp chất

kém bên nhiệt

2.1.2 Lựa chọn dung môi chiết tách

Dung môi tách chiết phải trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi tách chiết xong, dung môi có thể được loại bỏ

dễ dàng Hạn chế sử dung dung m6i d6éc nhu benzene hoac diethyl ether, carbon tetrachloride,

10

2.1.3 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi chiết tách

Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai lọ bằng thủy tỉnh do trong môi trường chứa một số tạp bấn, nhất là chất làm dẻo vì dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo

Methanol, chloroform thường chứa tạp chất đi(2-ethylexyl) thường bị nhằm

lẫn là hợp chất tự nhiên có trong cây cỏ khảo sát

Aceton có thé tao ra dan xuat acetonid nêu hợp chât chiệt có chứa nhóm cis- 1,2-diol hiện diện trong môi trường acid

Choloroform, đichlorometan có thé tao phản ứng với một vai loai alkaloid tạo thành alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác

Diethyl ether ít được sử dụng để chiết tách hợp chất vì có nhiệt độ sôi thấp dễ

cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxide

dễ gây nô

Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycoside (môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phần đường) hoặc cắt đứt nôi ester (môi trường kiêm) hoặc tạo ra sự chuyên vi

Sau khi chiết, dung môi có thể thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt

độ 30-40°C đề không làm hư hại một số hợp chất kém bên nhiệt

2.1.4 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành

những phân đoạn có tính phần cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum ether, ) sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo, ), dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichloromethane, ) hoà tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether -O-, aldehyde -CHO, cetone-CO-, ester -COO-, ) và dung môi phân

11

cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức -OH, -COOH, ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh

2.1.5 Kỹ thuật chiết rắn - lồng

2.1.5.1 Kỹ thuật chiết ngấm liệt

Dụng cụ: gồm một bình ngắm kiệt bằng thủy tỉnh, hình trụ đứng, đáy bình có

van khóa, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dịch chiết Phía trên bình ngắm kiệt

là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

Thực hành: bột cây được xay khô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Đáy của bình ngẫm kiệt được lót bằng bông thủy tỉnh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt lên trên lớp bông thủy tỉnh, đến gần đây bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc

và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tỉnh để dung môi không làm xáo trộn bề

mặt lớp bột Từ từ rót dung môi vào bình đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên

lớp mặt

Đề yên một thời gian thường là 12-24 giờ Mở khóa bình ngẫm kiệt cho dịch

chiết chảy ra, đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi chảy xuống bình ngẫm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi chảy vào bằng với vận tốc dịch chiết chảy ra khỏi bình ngẫm

Phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn nhưng hiệu quả lại cao hơn và

ít mất công hơn phương pháp ngâm dầm, vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngắm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ liên tục được thay thế bằng dung môi

tinh khiết

2.1.5.2 Kỹ thuật chiết ngâm dâm

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tỉnh hoặc bằng thép không gi, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất có chứa trong cây

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đều xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên

ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thắm vào

12

cấu trúc tế bảo thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rớt dung môi mới vào bình chứa mẫu cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một

số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

2.2 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách hỗn hợp gồm nhiều hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó với một hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh

Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở đạng lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (Gas Chromatography- GC) và sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) Dựa vào cơ

chế trao đổi giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc ký

thành các nhóm nhỏ hơn: sắc ký hấp thu, sắc ký trao đối ion, sắc ký lọc gel,

Có rất nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, tuy nhiên trong điều kiện phòng thí nghiệm, phương pháp sắc ký chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký cột

hở và sắc ký lớp mỏng

2.2.1 Phương pháp sắc ký lớp móng

2.2.1.1 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lóp mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (Planar Chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, đi chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silica gel, hoặc oxide nhôm Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ

lên một nền phẳng như tâm kiếng, tắm nhôm hoặc tâm plastic Do chất hấp thu

được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

e Binh sac ký: Một chậu, hũ, lọ, bằng thủy tính, hình dạng đa dạng, có nắp đậy

13

e = Pha tinh: Mot lép mong khoảng 0,25 mm của một loại chat hap thu, thi

du nhu silica gel, alumin, được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phăng như tắm kiếng, tắm nhôm hoặc tắm plastic Chất hấp thu trên tấm lá đỡ nhờ sulfate calci khan, hoặc tính bột, hặc một loại polymer hữu co

e _ Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều

chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 microlit (1uL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang

chứa trong bình

e Pha động: Dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, di chuyên cham cham dọc theo tắm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi sẽ di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quán Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các

lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện

tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di

chuyền nhanh và các hợp chất rất phân cực đi chuyển chậm

2.2.1.2 Uu điểm của sắc ký lớp mỏng

Chỉ cần một lượng mẫu rất ít để phân tích

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện

phân tích

Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tắm sắc ký lớp mỏng: trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc

ky đồ ở dạng một mũi hấp thụ rộng và dài, nên quan sát viên khó phân biệt được đó

là một mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp ban

2.2.1.3 Công dụng của sắc ký lớp mỏng

Đề công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập

14

Để kiểm tra lại hai hợp chất có giống nhau (xem chúng có phải cùng là một chất hay không)

Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát:

e _ Biết được số các hợp chất có trong hỗn hợp mẫu ban đầu

e _ Để kiểm tra độ tỉnh khiết của một hợp chất

e _ Biết được sơ bộ về thành phần phần trăm của các hợp chất có trong mẫu

ban dau

e - Biết sơ qua về tính phân cực của những thành phần hợp chất có trong

Đề chuẩn bị cho sắc ky cột:

e Tìm hệ dung môi để bắt đầu cho việc sắc ký cột

e Để theo dõi cho quá trình sắc ký cột

Để theo dõi tiến trình của một phản ứng hữu cơ

Đề kiểm tra một hợp chất kém bên

Để cô lập hợp chất

2.2.2 Phương pháp sắc ký cột hở

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyên Pha tĩnh thường

là những hạt silica gel có kích thước tương đối lớn (50-150 um) được nạp trong một cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha

tĩnh (có một lớp bông thủy tỉnh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa

dung môi giải ly được đặt phía trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột Hệ thống như thế thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả tách thấp so với HPLC Tuy vậy, sắc ký cột

hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẽ tiền, dễ kiếm; có thể triên khai với một lượng lớn mẫu chât

15

2.2.2.1 Chọn chất hấp thu dé nhoi cột

Tùy thuộc vào tính phân cực của mẫu cần phân tính mà ta chon chất hấp thu

phù hợp Với những hợp chất rất phân cực nên sử dụng sắc ký trao đôi ion hoặc sắc

ký lọc gel Còn bình thường sử dụng sắc ký hấp thu

2.2.2.2 Chọn hệ dung môi để giải ly cột

Trước khi tiến hành sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp

Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ (cao có chứa nhiều hợp chất phân

cực khác nhau) thì chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đây vết ít phân cực nhất của cao chiết trên vị trí ở bản mong la Ry= 0,5 va chon dung mdi chấm dit sắc ký cột là dung môi có thê đây vết phân cực nhất của cao chiết trên vị trí R¿= 0,2 Sau khi chọn hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc

ký cột, tuy nhiên phải chỉnh tỷ lệ dung môi của sắc ký cột sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn vì chất hấp thu trên bản mỏng có độ chặt chẽ lớn hơn chất hấp thu trong cột

Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi giải ly nào, nhất thiết phải tăng chậm: thêm mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cũ đang sử dụng Ví dụ, đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang benzene, sẽ pha benzene vào hexan theo tỉ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% va 100% benzene

Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột Do alumin hay silica gel khi trộn với bất kỳ loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này sẽ làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, tạo nên bọt khí làm nứt gay cột Cột gãy sẽ làm

mất đi tính liên tục của chất hấp thu vì thế không thể tách tốt được

ló