xác định phương pháp ly trích và ảnh hưởng của ph, nhiệt độ, chất hoạt hóa đến hoạt tính enzyme amylase tụy heo

46 3.7 _ Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến hoạt tính enzyme amylase trích từ tụy heo theo phương pháp trích có tủa bằng NH¿;SO¿ trích từ tụy heo theo phương pháp có tủa bằng côn...--...

| TRUONG DAI HOC CAN THO |

TRICH VA ANH HUONG CUA pH,

NHIET DO, CHAT HOAT HOA DEN

HOAT TINH ENZYME AMYLASE

CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN

Ngành Công nghệ hóa học - Khóa 30

Tháng 12/ 2008

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyên Minh Chơn là người đã trực tiếp hướng dan va tận tình chỉ bảo trong suốt quá trình thực hiện luận văn Tôi cũng xin gửi lời biết ơn chân thành đến thầy Phạm Phước Nhân đã rất nhiệt tình

giải đáp những thắc mắc, giúp đỡ trong thời gian thực hiện luận văn

Cùng với các bạn sinh viên nhóm luận văn, xin chân thành cảm ơn quý thầy

cô, các anh chị phòng thí nghiệm Sinh Hoá, Bộ môn Sinh Lý — Sinh Hoá, bộ môn Di Truyền, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ung Dung, đã tạo điêu kiện vật chất và

tỉnh thần cho tôi hoàn thành luận văn

Cùng với toàn thể sinh viên lớp Công Nghệ Hóa học khóa 30, xin gửi lời

Cảm ơn gia đình và những người thân yêu nhất đã luôn là chỗ dựa vững

`“ chấc, là nguồn động lực cho tôi vững bước

os ve

Cũng với lời cảm on chân thành và thân ái xin gửi về các bạn sinh viên trong tập thể Công Nghệ Hoá K30, những người bạn luôn luôn sẵn sàng chia sẻ, giúp đỡ tôi trong mọi lúc

Dù rất cô gắng nhưng trong luận văn cũng không tránh khỏi những thiếu sói, rất mong quý thây cô chỉ dẫn thêm

Công nghệ Hoá học Khoa Công Nghệ, Trường Đại Học Cần Thơ 57 trang

Cán bộ hướng dẫn: Ts Nguyễn Minh Chơn

TÓM LƯỢC

Enzyme amylase là hệ enzyme thủy phân được ứng dụng rộng rãi trong nhiễu lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học Enzyme này có nhiễu trong các hạt nảy mam, tụy tạng động vật và có thể ly trich, ung dung duoc Hién nay, đa số sản phẩm enzyme amylase phải nhập từ nước ngoài vào Việt Nam với giá thành cao Vì vậy việc tìm kiếm một nguôn nguyên liệu rẻ tiên, dễ tìm để trích enzyme amylase là điều rất cần thiết Đề tài “Xác định phương pháp ly trích và ảnh hưởng của pH, nhiệt đó, chất hoạt hóa đến hoạt tính enzyme amylase tuy heo” duoc thực hiện nhằm đáp ứng một phan nhu cấu cấp thiết trên Nhằm tìm ra phương pháp trích tốt nhất, đê tài này đã thực hiện ly trích enzyme amylase từ tụy heo theo

ba phương pháp khác nhau: dùng dung dich dém phosphate pH 7 dé ly trich roi

kết tủa protein sau đó mới đông khô mẫu và phương pháp dùng côn 96 độ để kết tủa protein thay vì dùng (NH„);SO„ Kết quả cho thấy việc trich enzyme bang dung dịch dém phosphate pH 7 rồi áp dụng biện pháp đông khô chân không để ly trích thu được tổng lượng protein cao nhất và có giá thành thấp nhất Hoạt tính của enzyme amylase trích được từ ba phương pháp là tương đương nhau ĐỀ tối uu hod diéu kiện xúc tác của enzyme amylase trích được, ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và chất

hoạt đã được khảo sát Kết quả cho thấy ở pH tu 7 đến 7,2 và nhiệt độ là 50°C thì

cho hiệu quả xúc tác tốt nhất Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy NaCl 1%o hoặc CaCl, 0,5%0 da lam tang hoat tinh enzyme amylase tuy heo thém 5 - 8% Enzyme amylase ly trich duoc từ tụy heo có giá thành rẻ và hoạt tính xúc tác tốt, vì vậy có thé ung dụng quy trình trích và sản phẩm enzyme amylase vao trong thuc tién va nghién cuu

IB 9s 8101985108089 4 Vil

962710005 Ô 1 9°1019))I€00909/9.9.4:7.\(0/.900i20005 2

1.2 Sơ lược về nguyên liệu - < + E kẻ SE E3 E33 E1 1103 11112, 3

1.3.2.1 œ-amylase (1,4-œ-glucan 4-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1) 8 1.3.2.2 B-amylase (1,4-a-glucan maltohydrolase) (EC 3.2.1.2) 11 1.3.2.3 y-amylase (glucoamylase hay a-1,4-glucan glucohydrolase)

(EC 3.2.1.3) 12

1.3.3.2 Nồng độ cơ chất -¿-:+cc+cz+k cv Ev21013 2111111111111 13 1.3.3.3 Anh hưởng của các chất kìm hãm - + 2-2 2 2 £k+s+Ee£z£xe se 13 1.3.3.4 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa -. -2- 2 2 +s+scx+E+zzezeced 13 1.3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ + - 2 + s2 +x+E£kvEEvsrkrrrerrerreee 13 1.3.3.6 Ảnh hưởng của pIH 2 + << 2 +E+ESEE£kEEEEEekeEkrkeErkrrerereerered 14

1.3.4.1 Trong công nghệ thực phẩm .- 2 + 5 2s s+v+Excezrxvrzcrsee 15

IS dù ago 18

1.3.5 Giới thiệu chế phẩm thương mại của enzyme amylase - 18

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Phurong tién nghién UU 20.0 19

2.1.1 Thoi gian va dia diém oo cccscssescssescscsecscsssesssesescssesessssnsessseneseens 19 2.1.2 NUyEn Vat GU oo 19

"No sa aaa37- 19

2.1.4 Thiết bị, dụng CỤ G- - + Set SE 1111111 T1 Hết 20 2.2 Bố trí thí nghiệm 5< SE S323 HT 11 1111151111110 e cu, 20 2.2.1 Thí nghiệm l1: Trích, đo hàm lượng protein hoà tan và xác định hoạt tinh enzyme có trong các mẫu enzyme ly trích và so sánh với mẫu chuẩn 20

2.2.2 Thí nghiệm 2 — Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme E0) 6L) s0sg[90 8900000 0n đi 32

2.2.3 Thí nghiệm 3 — Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến hoạt động của enzyme amylase trích được từ tụy heo Ă Ăn ng ngư 34 CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ - THẢO LUẬN . ¿2-52 << E+EE£e£Eersree, 36 3.1 Thí nghiệm 1: Trích, đo hàm lượng protein hoà tan và xác định hoạt tính enzyme có trong các mau enzyme ly trich va so sánh với mẫu chuẩn 36

3.2 Thí nghiệm 2 —- Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme amylase trich duc tir try NEO 0 43 3.3 Thi nghiém 3 — Khao sat anh huong cta chat hoat hoa dén hoat dong cua

CHUONG 4 KÉT LUẬN - KIÊN NGHỊ . +2 2 ©52 s©52 s2 2 cx+eszsecsd 53 TAI LIEU THAM KHẢO - 2-25 2E 2 SE E8 SE 3 EEESEEEEEEEEEESE SE 54 PHỤ LỤC

Danh mục bảng và hình

DANH MUC BANG

3.2 _ Bảng so sánh chị phí các phương pháp trích tính trên Ikg nguyên liệu 39

3.4 _ Ảnh hưởng của các mức pH ở các nhiệt độ đến hoạt tinh enzyme

amylase trích từ tụy heo theo phương pháp trích bằng dung

Q)99I24009)019)9)1211505s t7 44

từ tụy heo theo phương pháp A1 ở pH = 7 và pH = 8§ - 45 3.6 _ Ảnh hưởng của các mức pH, nhiệt độ đến hoat tinh enzyme amylase

trích từ tụy heo theo phương pháp trích có tủa bằng (NH¿)zSO¿ 46 3.7 _ Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến hoạt tính enzyme amylase

trích từ tụy heo theo phương pháp trích có tủa bằng (NH¿);SO¿

trích từ tụy heo theo phương pháp có tủa bằng côn 49

từ tụy heo theo phương pháp trích có tủa bằng cồn ở

1.8 Đường biểu diễn minh hoạ ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến

hoat tinh CnZyMEe PP 14

2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm l -¿- - £+©++<+k£EEE£keE+ktEEEkEkEerkrrxred 21

2.2 _ Sơ đồ tách chiết enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 22

dung dịch đệm phosphate pH 7 có tủa bằng (NH¿);SO¿, 23

2.5 _ Hệ thống thẩm tích - ° £ + <+kEESEkEkEEEEE tk ctErkgrrkg 26

nồng độ protein khác nhau . 2° 22+ 2£E+£E+EEE+££+x+£xvse se 27

Danh muc bang va hinh

Sự chuyên màu khi cho thuốc thử Folin vào dung dịch protein 28

Phản ứng màu của 1od với các nồng độ tinh bột khác nhau 29

Sơ đồ xác định hoạt tính enzyme amylase bằng phản ứng thủy phân

ti DOE oo 30

Sơ đồ bó trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ

Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của chất hoạt hoá

lên hoạt tính enzyme armyÏaSe .- << E411 9 1H HH re 35

Đồ thị so sánh hàm lượng protein trong các mẫu enzyme ly trích 38

Đồ thị so sánh hoạt tính 3 mẫu enzyme ly trích từ tụy heo và mẫu

enzyme đối chứng trích từ mầm lúa sau 5 ngày ủ - 40 Kết quá phân tích điện di theo phương pháp SDS — PAGE 42 Phản ứng màu của 1od với dung dịch tinh bột sau thủy phân

Đồ thị ánh hưởng của pH, nhiệt độ đến hoạt tính enzyme

amylase trich bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 .- 44

Đồ thị ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến hoạt tính enzyme

amylase trích bằng dung dịch đệm phosphate pH 7

có tủa bằng (NH¿)zSO(, - SH S111 1118111 111g creg 47

Đồ thị ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến hoạt tính enzyme

amylase trich bang dung dich dém phosphate pH 7 cé tua bang cén 49

DANH SACH CAC KY HIEU Tạ: nhiệt độ tối ưu

pHạy: pH tối ưu

SDS — PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

TEMED: N,N,N’,N’ Tetramethylethyl diamine

Tris: hydroxy amino methane

UV — Vis: Ultra Violet Visible

CV: coefficient of variation (hệ số biến động)

Danh muc phu luc

DANH MUC PHU LUC

8:0 Xil

bằng dung dịch đệm giữa các pH với cùng nhiệt độ 30°C XI

bằng phương pháp A1 giữa các pH với cùng nhiệt độ 50°C XI

bằng phương pháp A1 giữa các pH với cùng nhiệt độ 60°C xII

bằng phương pháp A1 giữa các pH với cùng nhiệt độ 70°C XIV

bằng phương pháp A1 giữa các pH với cùng nhiệt độ 80°C XIV

tủa bằng (NH);SO¿ giữa các pH với cùng nhiệt độ 30°C XIV

10 Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng (NH„);SO¿ giữa các pH với cùng nhiệt độ 40°C XV

tủa bằng (NH¿);SO¿ giữa các pH với cùng nhiệt độ 50°C XV

12 Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

14 Bang phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng cồn giữa các pH với cùng nhiệt độ 70°C . «¿ XVii Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tinh enzyme mau trich

bằng phương pháp A1 giữa các nhiệt độ với cùng mức pH = 7 XVii Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tinh enzyme mau trich

bằng phương pháp A1 giữa các nhiệt độ với cùng mức pH = 8 XVII Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng (NH¿);SO¿ giữa các nhiệt độ với cùng mức pH = 7 XVII Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng (NH¿);SO¿ giữa các nhiệt độ với cùng mức pH = 8 XVII Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng cồn giữa các nhiệt độ với cùng mức pH = 7 XVII Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng cồn giữa các nhiệt độ với cùng mức pH = 8 XIX Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích bằng

phương pháp A1 giữa các pH trong khoảng 7 đến 8 ở cùng

0051000001007 X1x

Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng (NH¿);SO¿ giữa các pH trong khoáng 7 đến 8 ở cùng

0110: n1 00 002 - XIX

Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme mẫu trích có

tủa bằng cồn giữa các pH trong khoảng 7 đến 8 ở cùng nhiệt độ 50°C xx

Bảng phân tích phương sai 2 nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng

đến hoạt tính enzyme mẫu trích bằng phương pháp A1 XX

Bang kiểm định 2 nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính

enzyme mẫu trích bằng phương pháp A1 theo phép thử Duncan xXI

Bảng phân tích phương sai 2 nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng

đến hoạt tinh enzyme mẫu trích có tủa bằng (NH„);SO¿, XXII

Danh muc phu luc

Bảng kiểm định 2 nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính

enzyme mẫu trích có tủa bằng (NH„);SO¿ theo phép thử Duncan XXIV Bảng phân tích phương sai 2 nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng

đến hoạt tính enzyme mẫu trích có tủa bằng côn . - XXV

Bảng kiểm định 2 nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính

enzyme mẫu trích có tủa bằng côn theo phép thử Duncan XXVI Bảng phân tích phương sai ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến

j6 2105101 05yÀ201 0P XXVII

HINH PHU LUC

00600 01 Ốồ xI

AI ở các mức nhiệt độ khác nhau với các mức pH thay đỗi XXIX

ở các mức nhiệt độ khác nhau với các mức pH thay đổi XXX

A1 ở các mức pH khác nhau với các mức nhiệt độ thay đôi XXXIH

các mức pH khác nhau với các mức nhiệt độ thay đối XXXIV

các mức pH khác nhau với các mức nhiệt độ thay đổi XXXV

1 — Cách pha hoá chất - 5 eSẻckckcErk ket rerree XXXViii

bột Enzyme này được trích từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật, vừa mang

nguồn gốc tự nhiên vừa không độc với con người nên rất được ưa chuộng và ngày càng được sử dụng rộng rãi

Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long, vựa lúa của cả nước nên lượng phụ phẩm

từ lúa phục vụ tốt cho nền nông nghiệp chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi heo Với hệ thống enzyme tiêu hóa rất tốt, heo có thê đạt 100 Kg sau từ 4 — 6 tháng nuôi Trong

đó, tụy là một trong những cơ quan quan trọng giữ vai trò tiết dịch tụy chứa các enzyme xúc tác sự thủy phân các đại phân tử có trong thức ăn Trong số các enzyme

ấy, amylase có nhiệm vụ thủy phân carbohydrate điển hình là tinh bột trong thức ăn Với nguồn nguyên liệu phố biến và ứng dụng của enzyme amylase rất rộng rãi nhưng cho đến nay tại Việt Nam vẫn còn rất ít đề tài nghiên cứu về cách ly trích enzyme amylase từ tụy heo cũng như những tính chất của chúng để đưa sản phẩm vào ứng dụng trong các ngành công nghiệp

Từ thực trạng đó, đề tài: “Xác định phương pháp ly trích và ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, chất hoạt hoá đến hoạt tính của enzyme amylase tụy heo” được thực hiện nhằm mục đích xác định phương pháp trích enzyme amylase từ tụy heo có hiệu quả và điều kiện sử dụng enzyme trích được sao cho hoạt tính enzyme là mạnh nhất Từ đó, có thể ứng dụng quy trình này để sản xuất enzyme amylase có giá

thành rẻ

CHUONG 1

LUQC KHAO TAI LIEU

Enzyme — chất xúc tác sinh học có vai trò quan trọng trong hầu hết các phản ứng hoá học của cơ thé song Vi vay, nhiéu nha nghiên cứu trong lĩnh vực hoá học, sinh học và các lĩnh vực có liên quan đều quan tâm đến việc nghiên cứu các vấn đề

về enzyme Các nghiên cứu xoay quanh các vẫn đề chiết tách, tinh sạch enzyme, các yếu tố tác động làm thay đổi hoạt tính enzyme, khả năng ứng dụng sản phẩm enzyme vào thực tế Chính vì thế mà công nghệ enzyme ngày càng phát triển

Amylase, một loại enzyme khá phổ biến, có cả ở thực vật lẫn động vật Amylase được tinh sạch từ malt vào năm 1835 bởi Anselme Payen và Jean Persoz Một số đặc tính của amylase cũng đã được tìm ra như trọng lượng phân tử của œ- amylase malt được xác định bởi Knim (1956) và Fisher cùng Stein (1960); vùng đăng điện của amylase được xác định năm 1951 với nghiên cứu của Bernfeld P; ảnh

hưởng của Ca”” trong sự hình thành và ổn định cấu trúc của enzyme theo nghiên

cứu của Modolova năm 1965 Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã nghiên cứu

sử dụng mam lia để ly trích amylase sử đụng với vai trò thuỷ phân tỉnh bột Năm

1996, Wang và cộng sự cũng có nghiên cứu liên quan đến enzyme amylase từ lúa Một số nghiên cứu về cẫu trúc của amylase phân lập từ vi sinh vật, ly trích, tỉnh sạch và ảnh hưởng chất ức chế œ-amylase từ lúa mì Cấu trúc cơ bản của œ-amylase được hoạt hoá bởi chloride, cấu trúc của amylase đậu nành, ảnh hưởng của các chất hoat hoa hoat tinh amylase

MOt s6 nghién ciru vé cau tric amylase tuy heo, cau trac trong phic hop véi chất ức chế, chất hoạt hoá cũng đã được thực hiện, trọng lượng phân tử œ-amylase tụy heo đã được xác định năm 1952 Ở nước ta các nghiên cứu về enzyme từ nguôn này vân còn rât hạn chê

Chương 1 Lugc khdo tài liệu

Tatrang Tuyến tụy |

Hình 1.2 Sơ đồ vị trí tụy trong Hình 1.3 Tụy heo

hệ thống tiêu hoá

(Nguon: http://www.vi.wikipedia.org)

*Cấu tạo: Tụy tang là ống dạng chùm, dài, lớn nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng, có màu trắng nhạt, một số có màu hồng nhạt (Hình 1.1) Bên trong có những vách ngăn chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ Tụy tạng được

cầu tạo từ hai loại tế bào gọi là tế bào ngoại tiết và tế bào nội tiết 98% tụy tạng

được cấu tạo từ tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến, 2% còn lại của tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào nội tiết Phần ngoại tiết gồm các ống tụy; phần nội tiết, các tế bào kết cụm lại với nhau thành một cẫu trúc gọi là tiểu đảo Langerhans Tụy tạng

của heo có cấu trúc dang ba nhánh như hình 1.3 Chiều dài mỗi nhánh khoảng

15cm, nguyên bộ tụy tạng nặng khoảng 8§0 — 150g

*Chức năng: tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết Chức năng ngoại tiệt: tụy sản xuât và bài tiệt các dịch tụy chứa các men tiêu hóa hay các enzyme tiêu hóa

Chức năng nội tiệt: tụy sản xuât và tiệt vào trong máu các nội tiệt tô hay hormon

Bộ máy tiêu hóa gôm ông tiêu hóa và các túi tiêu hoá, cung câp liên tục các chât dinh dưỡng cân thiệt cho cơ thê, thực hiện các chức năng: cơ học, hóa học, và hấp thu

Quá trình tiêu hóa diễn ra từ miệng, qua thực quản vào dạ dày tại đầy thức ăn được phả vỡ thành các mảnh nhỏ và được tiêu hóa một phân Thức ăn rời khỏi dạ dày, đi qua môn vị vào ruột non Đây là nơi mà hầu hết các hoạt động tiêu hóa và hấp thu xảy ra Đoạn đầu tiên của ruột non nối với dạ đày được gọi là tá tràng Theo sau là một đoạn rất dài, cuộn lại và nằm ở phần dưới của xoang bụng Khối vật liệu hữu cơ trong thức ăn có thể có protein, lipid, carbohydrate, acid nhân Mặc dù những đại phân tử này là những nguyên liệu thích hợp nhưng động vật không thê trực tiếp sử dụng chúng vì hai lý do Một là các đại phân tử quá lớn không thê đi qua màng để vào bên trong tế bào Hai là các đại phân tử câu trúc nên một động vật không giống với các đại phân tử trong thức ăn Tuy nhiên trong việc xây dựng các đại phân tử cho chính bản thân, tất cá các động vật đều sử dụng các đơn phân giống nhau Vì vậy, sự tiêu hóa sẽ cắt các đại phân tử thành các đơn phân mà động vật có thể sử dụng chúng để tạo ra các phân tử riêng cho mình Carbohydrate được thuỷ phân thành các đường đơn, lipid được tiêu hóa thanh glycerol va acid béo, protein bi thủy phân thành các acid amin và acid nhân bị thuỷ phân thành các nucleotide

Chương 1 Lugc khdo tài liệu

Khi một tế bào tổng hợp một đại phân tử bằng cách liên kết các đơn phân với

nhau, chúng thường phải tách một phân tử nước để thành lập một liên kết hóa trị

Sự tiêu hóa đi ngược lại quá trình nầy bằng cách bẻ gãy liên kết và thêm vào một phân tử nước Quá trình nầy được gọi là sự thủy phân và cần có sự tham gia của các enzyme Các enzyme thủy phân xúc tác cho sự tiêu hóa của tửng loại đại phần tử có trong thức ăn Sự tiêu hóa hóa học này thường xảy ra sau sự tiêu hóa cơ học Trong

sự tiêu hóa cơ học, thức ăn bị phá vỡ thành những mảnh nhỏ hơn làm tăng bề mặt tiếp xúc của chúng với dịch tiêu hóa có chứa các enzyme thủy phân Động vật phải tiêu hóa thức ăn trong một số ngăn đã được chuyên hóa để các enzyme thủy phân có thê tác kích vào các đại phân tử thức ăn mà không gây nguy hiểm cho các tế bào

Trong hệ tiêu hóa, khi thức ăn đi vào tá tràng, tụy tạng tiết ra một hỗn hợp của các enzyme đi qua ống tụy vào tá tràng (hình 1.2) Hỗn hợp này bao gồm các enzyme tiêu hóa tất cả ba loại thức ăn chính là carbohydrate, lipid, protein cũng như

một số có thê tiêu hóa acid nucleic Một trong các loại enzyme của tụy tạng là

amylase tụy tác động giống như amylase của nước bọt nghĩa là thuỷ phân tỉnh bột thành các phân tử đường maltose Chúng quan trọng hơn các amylase của nước bọt

vì chúng tiêu hóa phần lớn tỉnh bột

(Nguồn: Bùi Tấn Anh, Võ Văn Bé và Pham Thị Nga, 2002)

Bảng 1.1 Thành phần các enzyme trong dịch tụy

St Enzyme Luong enzyme tính theo phân trăm chất khô

của tuyên tụy (đã loại mỡ) (%)

13 Enzyme amylase

1.3.1 Giới thiệu chung về enzyme va enzyme amylase

Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến

1.000.000Da, được cấu tạo từ các L — a — acid amin két hợp với nhau bởi liên kết peptide

Enzyme amylase, một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại có vai trò xúc tác cho phản ứng thủy phân Enzyme amylase chủ yếu xúc tác cho phản

ứng thủy phân liên kết glucoside trong tỉnh bột và glycogen:

HO ——>OH" + Ht

Hình 1.4 Hoạt động phân cắt liên kết œ-1,4 glucoside của œ,B-amylase

Ht + OH “=— H,O

Hình 1.5 Hoạt động phân cắt liên kết œ-1,6 glucoside của y-amylase

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và cộng tác viên, 2004)

Vũ Thị Yến 6

Chương 1 Lugc khdo tài liệu

Cơ chất tác dụng của amylase 1A tinh bét va glycogen

* Tinh bột: là nhóm carbohydrate được tổng hợp tự nhiên trong thực vật có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì, lúa mì trong các loại ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát (C¿H;O¿)ạ Các phân tử tính bột được cấu tạo bởi các liên kết œ-1,4 và a-1,6-glucoside Vi tồn tại hai loại liên kết khác nhau nên tạo thành các phân tử tinh bột khác nhau Tĩnh bột từ mọi nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và amylopectin (Meyer, 1940) Các loại tinh bột đều có từ 20 — 30% amylose va 70 — 80% amylopectin

Amylose có trọng lượng phân tử 50.000 — 160.000đvC được cấu tạo từ 200 —

1.000 phân tử D — glucose nối với nhau bởi liên kết œ-1,4-glucoside tạo thành một

mạch xoắn dài không phân nhánh

Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000đvC đến hàng chục triệu, được

cau tạo từ 600 — 6.000 phân tử D — glucose, nối với nhau bởi liên kết œ-1,4 và œ-

1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tính bột bị đun nóng (60 — 85°C) thi tinh bét sé bi hồ hóa va gol

là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đường hóa Kết quả của dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm sẽ là maltose và glucose

* Glycogen: là một loại carbohydrate dự trữ ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thê chuyển hóa để sử dụng từ từ Amylase có vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vat Glycogen cau tao

từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết œ-1,4-glucoside Ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết œ-1,6-glucoside Glycogen có số mạch

nhánh nhiều hơn tinh bột Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu — 3 triệu đvC

1.3.2 Phân loại và cơ chế tác dụng của enzyme amylase

Hiện nay, người ta biết có 6 loại amylase, trong đó œ-amylase, B-amylase, y-amylase (hay glucoamylase) thủy phân các liên kết œ-1,4-glucoside của tinh bột,

glycogen va cdc polysaccharide déng loai Cac amylase con lai: dextrin-6- glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase va oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết œ-1,6-glucoside Sáu loại enzyme này được xếp thành 2 nhóm: endoamylase (thuỷ phân các liên kết bên trong), exoamylase (thuỷ phân tỉnh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide)

1.3.2.1 a-amylase (1,4-a-glucan 4-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)

œ-amylase có trong nước bọt, hạt hòa thảo nảy mam, tuy tang, trong nim mốc, vi khuân œ-amylase có khả năng phân cắt các liên kết œ-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là endoenzyme œ-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tỉnh bột nguyên vẹn œ-amylase trong tụy của heo, chuột có độ đồng nhất cao trong mạch amino acid

* Cơ chế tác dụng của œ-amylase

Sự thủy phân tinh bột của œ-amylase trải qua nhiều giai đoạn:

Giai đoạn dextrin hóa: enzyme phân cắt một số liên kết trong tỉnh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp

Giai đoạn đường hóa: các dextrin bị phân hủy để tạo ra maltose và glucose, amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6-7 gốc glucose), maltotetrose, maltotriose, maltose San phdm cua qua trinh thuy phan amylose la 13% glucose va 87% maltose

Tác dụng của œ-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có dextrin phân tử thấp

va 1somaltose (8%) do œ-amylase không thé cat được liên kết 1,6-glucoside 6 mach nhanh cua phan tir amylopectin

*Dac tinh cua a-amylase

œ-amylase từ các nguôn khác nhau có thành phân amino acid khác nhau, môi loại œ-amylase có một tô hợp amino acid đặc hiệu riêng œ-amylase là một protein giau tyrosine, tryptophan, glutamic va aspartic acid Cac glutamic acid, aspartic acid

Chuong 1 Lugc khao tài liệu

chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cầu thành nên phân tử enzyme Cấu trúc

tinh thể của œ-amylase tụy heo được xử lý ở độ phân giải 2.9 Ả bằng phương pháp tinh thể học tia X Mạch polypeptide của œ-amylase tụy heo được mô tả ở hình 1.6 Trước đây cấu trúc được mô tả là sự tập hợp của 2 vùng (Buisson et al.,1984) Tuy nhiên khi so sánh với những protein (œ/B)s, câu trúc này được miêu tả cụ thể hơn là

gồm 3 phần riêng biệt Trước tiên là vùng đầu N (1 - 410 đơn vị) được chia thành vùng A và vùng B Vùng A lớn nhất với 330 đơn vị (1 — 100 và 169 — 407) và cuốn

thành ống (œ/B); đặc trưng (Hình 1.6) Vùng B (101 — 168) (hình 1.7) được thêm vào giữa bờ B thứ 3 và mạch xoắn thứ 3 của vùng A 2 nhóm thiol tự do (Cys 103, Cys 119) nằm dọc theo vùng B rất gần trong không gian, điều này giải thích tại sao chúng có thể tạo thành cầu nối S-Hg-S rất linh động

Hình 1.6 Hình mô tả mạch a-amylase tuy heo bang những dải rắn, dùng phần mềm của M.Carson (1987) Vùng A với cấu trúc ống (œ/B); được biểu thị bằng màu xanh dương đậm (dạng xoắn) và màu xanh dương nhạt (dạng ñ-tắm và cuộn ngẫu nhiên), vùng B màu vàng và vùng C màu xanh lá cây Mũi tên chỉ vùng hoạt động giữa

vùng A và B (Nguôn: G.Buisson, E.Duée, R.Haser and F.Payan, 1987)

Hình 1.7 Biểu thị mối quan hệ cấu trúc giữa vùng B (đơn vị 101 — 168, bên tay trái)

và vùng A trong œ-amylase tụy heo Vùng B được ổn định trong mối tương quan với vùng A bởi cầu nối disulfñde Cys 70 — Cys 115 và bởi tương tác Ca”” - protein

biểu diễn (Nguồn: GŒ.Buisson, È.Duée, R.Haser and F.Payan, 1987)

œ-amylase tụy heo có trọng lượng phân tử khoảng 50.000 Da (Cadwell, et al,

J Am Chem Soc, 74, 4033, 1952) Trọng lượng phân tử ơ-amylase nói chung khoảng 45.000 — 59.000 Da (Nguồn: Sách tra cứu hoá sinh (1987) trích bởi Đoàn Thị Kim Hoàn, 2008) Trọng lượng phần tử của œ-amylase malt là 59.000 Da (Knin,1956; Fisher, Stein, 1960) (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và cộng tác viên,

2004)

œ-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng

Có tính acid yếu và có tính chất của globuline

Điểm đắng điện nằm trong vùng pH 4,2 — 5,7 (Bernfeld P, 1951)

œ-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử œ-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol œ-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác, đặc tính này có liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử

- Điều kiện hoạt động của œ-amylase từ các nguồn khác nhau thường không

giống nhau Biên độ pH tối thích cho hoạt động của œ-amylase từ malt khác với œ-

amylase tur vi sinh vật

Vũ Thị Yến 10

Chương 1 Lugc khao tai liệu

- Độ bền của œ-amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH Ở 0°C và pH 3,6,

œ-amylase của malt hoàn toàn bị mắt hoạt tính œ-amylase của mầm thóc va malt

hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 58 - 60°C

1.3.2.2 B-amylase (1,4-a-glucan maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)

B-amylase có nhiều ở hạt nảy mầm Nó xúc tác sự thủy phân các liên kết œ- 1,4-glucan trong tỉnh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose

từ đầu không khử của mạch

* Co ché tac dung cua B-amylase

B-amylase là một exoenzyme Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng của cơ chat B-amylase phân cắt các liên kết œ-1,4 glucoside nhưng khi gặp liên kết a-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết œ-1,6 ølucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử

lớn có chứa rất nhiều liên kết œ-1,6 glucoside và được gọi là B-dextrin

Tác dụng của B-amylase lên tinh bột như sau:

Tinh bot > maltose (54-58%) + B-dextrin (42-46%)

(glucogen)

Nếu tỉnh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả œ và P-amylase thì lượng tỉnh bột bị thủy phân đến 959%

Sự khác nhau giữa œ và P-amylase khi xúc tác thủy phân tỉnh bột:

— B-amylase hầu như không thủy phân các hạt tỉnh bột nguyên vẹn nhưng nó

phân hủy hồ tỉnh bột rất mạnh

— -amylase phân giải 100% amylose thanh maltose

— -amylase phân giai 54 - 58% amylopectin thanh maltose

* Đặc tính của B-amylase:

vé B-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm —SH, nhóm —

COOH va vòng 1midazol của các gôc histidine và là exoenzyme

vB-amylase bị kìm hãm béi Cu’*, Hg”, urea, iodoacetamide, iodine, OZON

Y B-amylase chiu nhiệt kém hơn œ-amylase nhưng bền với acid hơn B- amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70°C Nhiệt độ hoạt động tối thích của B-amylase là 55°C, pH 5,1-5,5 (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và cộng tác viên, 2004)

Dạng B bị ức chế bởi Ag', Hg””, Cu”, pH tối thích 4-5, pI = 4,7-4,8

(Nguôn: Sách tra cứu hoá sinh (1987), trích bởi Đoàn Thị Kim Hoàn (2008))

1.3.2.3 yamylase (glucoamylase hay a-1,4-glucan glucohydrolase)

(EC 3.2.1.3)

Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết œ-1,4 lẫn œ-1,6 glucoside Khi thủy phân liên kết œ-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose, được gọi là exoenzyme

Ngoài các liên kết œ-1,4 và œ-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết œ-1,2 và œ-1,3-glucoside

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tính bột, glucogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có

sự tham gia của các loại amylase khác Glucoamylase thủy giải các polysaccharide

có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polysaccharide có

nhánh như amylopectin, ølucogen, B-dextrin bị ølucoamylase thủy phân khá nhanh

Đa số ølucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vung pH 3,5 — 5,5 va nhiệt độ 50°C Nó

bền với acid hơn œ-amylase nhưng kém bên hơn trong rượu, aceton

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của của enzyme

1.3.3.1 Ảnh hưởng của nông dé enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme

V=kx [E],

Chuong 1 Lugc khao tài liệu

Cố định nồng độ enzyme thì vận tốc phản ứng tăng tuyến tính theo nồng độ

cơ chất nhưng khi đã đạt đến nồng độ cơ chất cực đại nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chat thì tốc độ phản ứng không đổi

1.3.3.3 Ảnh hướng của các chat kim ham

Các chất làm giảm hoạt độ enzyme nhưng không bị chuyên hóa bởi enzyme được gọi là các chất kìm hãm hoặc các chất ức chế Các chất này có thể là những

1on, các phân tử vô cơ, hữu cơ kê cả các protein

1.3.3.4 Ảnh hướng của các chất hoạt hóa

Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động hoặc hoạt động yếu trở nên hoạt động mạnh hơn Chúng có thể là các anion, các ion kim loại nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của bảng tuần hoàn Mendelef hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyên hydro hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi những nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

1.3.3.5 Anh hướng của nhiệt độ

Vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn chưa bị biến tính

Nhiệt độ giới hạn tương ứng với hoạt độ enzyme cao nhất gọi là nhiệt độ tối

ưu (top) Đa số enzyme có tạp: vào khoảng 40 - 50C Tuy nhiên top; của một enzyme

không cố định mà có thê thay đổi tùy cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng Nhiệt độ mà enzyme bị mắt hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn

thường vào khoảng trên 70°C Ở nhiệt độ tới hạn enzyme bị biến tính, ít khi có khả

năng hồi phục lại được hoạt độ Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0”°C hoạt độ enzyme tuy

bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường Độ bền của mỗi

enzyme thường tăng lên khi có cơ chất, coenzyme, Ca””

1.3.3.6 Ảnh hưởng của pH

pH môi trường ảnh hưởng đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức

độ ion hóa cơ chất, enzyme và ánh hưởng đến độ bền protein enzyme

Đa số enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 - 9 Độ bền của enzyme có thê

tăng lên khi có cơ chất, coenzyme, Ca””

pH tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme lớn nhất gọi là pH tối ưu (pHap) pHạp cho hoạt động của nhiều enzyme vào khoảng 7 Tuy nhiên cũng có một số enzyme có pH rất thấp hoặc khá cao (pHopt > 10) pHop: cua mot enzyme cting

không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như cơ chất, tinh chat dung dịch đệm, nhiệt độ

Chương 1 Lugc khdo tài liệu

1.3.4 Ung dung cia enzyme amylase

1.3.4.1 Trong công nghệ thực phẩm

Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzyme amylase có trong mầm đại mạch Sử dụng enzyme amylase trong quá trình dịch hoá thuỷ phân

sơ bộ tinh bột trong khối bột ở nhiệt độ cao Enzyme cũng có tác đụng làm giảm độ nhớt nguyên liệu, làm tăng quá trình đường hoá và lên men sau này Amylase cũng được sử dụng trong quá trình đường hoá, trong đó lượng đường được tạo thành sẽ quyết định khả năng lên men và chất lượng bia sau này Các enzyme cho vào trong

giai đoạn này yêu cầu phải là những enzyme chịu nhiệt

Việc bổ sung enzyme amylase cho vào quá trình sản xuất bia làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn Khi sử dụng enzyme chúng ta có khả năng sản xuất bia không có các dextrin dư thừa và do đó chứa ít năng lượng hơn các loại b1a thông thường Các enzyme sau khi tham gia vào quá trình đường hoá sẽ còn sót lại và lẫn vào dịch lên men Hoạt tính còn sót lại này không ảnh hưởng gì đến chất lượng bia,

mà ngược lại chất lượng bia sau này thường tốt hơn Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: giảm tốn thất tinh bột, tiết kiệm

lượng malt cần thiết trong sản xuất bia Mặt khác, chất lượng dịch đường hoá được

tăng lên, các chất thải bỏ theo bã sẽ ít đi

Côn được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp lên men Amylase được thêm

vào làm tác nhân đường hoá để chuyển hoá tinh bột thành đường có khả năng lên

men Quá trình đường hoá đóng vai trò quyết định đến khả năng lên men và hiệu suất cồn thu được Vai trò cơ bản của œ-amylase trong sản xuất rượu là làm dịch hoá nhanh ở giai doan nấu và cả ở giai doan đầu của sự đường hoá, dextrin hoá và tích tụ đường

c Ïronø công nghệ san xuat bánh mì

Bánh mì là một loại lương thực phẩm quen thuộc Trong bánh mì, enzyme được xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh

mì Enzyme được đưa vào nhằm giải quyết các vấn đề: tăng nhanh thể tích bánh, màu sắc của bánh đẹp hơn và làm tăng mùi thơm cho bánh

Trong sản xuất bánh mì người ta sử dụng cả œ-amylase và B-amylase Cac enzyme nay tham gia thủy phân tỉnh bột để tạo thành đường Nhờ đó, nắm men Saccharomyces cerevisase sé dé dang chuyén hóa chúng thành côn, CO; làm tăng thể tích bánh, tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh Việc sử dụng amylase cho

phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giám bớt tới 50%

đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt

Mục đích của việc sử đụng enzyme vào sản xuất bánh kẹo là làm tăng mùi và

vị Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa

tinh bột sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột xâu để sản xuất bánh

Do đó người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử

và acid amin Đường khử và acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa — khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi,

Vi va mau sac hap dan

Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng enzyme phát triển rất mạnh Theo phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO, va vi khuan lactic dé hat tinh b6t mém ra va enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan vào nước Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một

lượng nhỏ ơ-amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy

khét Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa rất dễ dàng Tăng hiệu suất

Chương 1 Lugc khao tài liệu

thu hồi sản phẩm Enzyme sử dụng trong công nghệ sản xuất siro fructose phai 1a những enzyme chịu nhiệt

1.3.4.2 Trong công nghiệp

a Cong nghé san xuất các chát tây rửa

Mục đích của tây rửa (hoặc giặt quần áo) là loại bỏ đất và các loại chất vô cơ,

hữu cơ bám vào quần áo Trong đó nhiều chất rất khó làm sạch như protein, tanin, carbohydrate và những chất màu

Enzyme amylase cũng được ứng dụng trong công nghệ sản xuất các chất tây rửa và ở đây sử dụng chủ yếu là enzyme amylase của vi khuẩn vì những enzyme này với các thành phần khác của các chất tây rửa sẽ làm tăng khả năng phân giải các vét ban do carbohydrate trong quan áo, tăng khả năng tây rửa

b Trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, amylase hay các chế phẩm của nó dùng để rũ hồ

(khử tỉnh bột) vải sợi bông, sợi hỗn hợp trước khi tây trắng hay nhuộm Xử lý vải sợi bằng amylase hay chế phẩm là tốt hơn cả vì giữ được độ bên, độ dai Việc sử

dụng amylase không những làm tăng năng suất mà còn cải thiện phẩm chất vải do

độ mao dẫn và tính hấp phụ của vải tăng lên, vái để tây trắng hơn Quá trình hòa tan

và khử tinh bột trong dung dịch amylase loãng xảy ra rất nhanh trong 10 phút, do vậy mà khả năng rũ hồ xảy ra liên tục

1.3.4.3 Trong chăn nuôi

Người ta sử dụng amylase trong chăn nuôi gia súc bằng hai cách: hoặc trộn thắng vào thức ăn trước khi cho gia súc ăn hoặc xử lý sơ bộ thức ăn trước bằng enzyme amylase Có lẽ xử lý thức ăn bằng enzyme trước tốt hơn vì trong trường hợp này dé chon điều kiện tối thích cho tác dụng enzyme lên thức ăn Do vậy mà

giá trị dinh đưỡng, độ hắp phụ của thức ăn cũng tiêu tốn ít enzyme amylase hơn

Enzyme amylase còn được dùng để phối hợp với các enzyme thủy phân khác

đê sản xuât thức ăn tông hợp cho gia suc, gia cam

1.3.4.4 Trong y học

Amylase thường được phối hợp với các enzyme thủy phân khác để điều trị

các chứng bệnh có liên quan đến đường tiêu hóa Ngoài ra enzyme amylase còn được dùng tăng cường và cải thiện các quá trình tiêu hóa thường được sản xuất ở dạng viên

Amylase còn được dùng để điều trị các chứng bệnh về tim, hệ thần kinh,

amylase còn dùng điều chế các môi trường dinh dưỡng chuẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau giúp cho công tác nghiên cứu vi sinh vật học trong các viện và phòng thí nghiệm

(Nguồn: Nguyên Đức Lượng và cộng tác viên, 2004)

1.3.5 Giới thiệu chế phẩm thương mại của enzyme amylase

Một số chế phẩm của enzyme amylase được bán trên thị trường: các loại thuốc tiêu hóa nhu amylase concentrate-HP 90 caps, enzymedica Glutenease 60 Capsules, enzymedica Digest 180 capsules, Phyto Opti — Zymes va neopeptine là loại thuốc tiêu hóa sử dụng tốt cho người; thuốc xử lý nền đáy trong nuôi tôm

Hình 1.9 Chế pham enzyme amylase thuong mai

Vũ Thị Yến 18

Chương 2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: tháng 08 năm 2008 đến tháng 11 năm 2008

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ

- Thùng lạnh bảo quản nguyên liệu

- Cối nghiền: nghiên tụy heo đề phá vỡ tế bào giải phóng enzyme

- Máy ly tâm lạnh: tách kết tủa trong điều kiện lạnh

- Phéu loc

- Tdi thdm tich seamless cellulose 36/32 (Viskase Companies, Inc.) ding dé loai

muối và các phân tử nhỏ khỏi hỗn hợp protein

- Ông nghiệm: thực hiện các phản ứng thí nghiệm

- Micropipette: lầy mẫu với hàm lượng rất nhỏ

- Máy khuấy từ: khuấy trộn dung dịch

- Máy đông khô: tách loại nước, làm khô sản phẩm trong điều kiện lạnh

- Máy đo quang phố UV -— Vis (He^ios œ): xác định độ hấp thụ của dung dịch

2.2.1 Thí nghiệm 1: Trích, đo hàm lượng protein hoà tan và xác định hoạt

tính enzyme có trong các mầu enzyme ly trích và so sánh với mẫu chuân

*Muc dich: thuc hién ly trich enzyme amylase réi so sánh khả năng trích của các phương pháp này thông qua việc xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme tương ứng trong các mẫu

Chương 2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Các nghiệm thức là các phương pháp trích enzyme được đặt như sau:

A¡: Phương pháp trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7

Az: Trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 có tủa bằng muối amonium sulphate

A;: Trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 có tủa bằng cồn 96 độ Ao: Mẫu đối chứng là mẫu enzyme amylase trich từ mầm lúa 5 ngày tuôi (Đoàn Thị

Kứm Hoàn, 2006)

Trong đó các phương pháp A, A;, As được thực hiện theo sơ đồ hình 2.2, 2.3, 2.4

Chương 2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

«—————— LTẬy phần trong

Tủa bằng (NH¿);SO¿ 60%

Nguyên liệu

y

Ly tâm (9500 rpm, 4°C, 30 phút)

Giai đoạn đầu của cả 3 phương pháp này đều giống nhau:

Nguyên liệu: mỗi lần trích tương ứng với mỗi phương pháp cần chuẩn bị 300g tụy heo, sau khi được làm sạch, xắt nhỏ cho vào cối nghiền

Nghiên: thực hiện nghiền trong điều kiện lạnh với dung dich dém phosphate

pH = 7 theo tỉ lệ khối lượng 1 tụy heo : 2 dung dịch đệm để trích enzyme ra khỏi tế

bào

Chương 2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Ly tâm: đề tách lẫy phần dung dịch chứa enzyme ở 4°C với số vòng quay

9500 vòng/phút trong 30 phút để tách lẫy phần dung dịch chứa enzyme ở bên trên

và loại bỏ phần xác răn

Sau đó tùy theo từng phương pháp sẽ có cách tiến hành khác nhau:

Đối với phương pháp trích bằng dung dịch dém phosphate pH 7: dung dich đem đông khô để loại bớt nước thu được chế phẩm dạng bội

Đối với phương pháp có kết túa bằng (NH,¿);SO¿:

Kết tuả bằng (NH,);SO¿: phần dung dịch thu được sau ly tâm tiến hành kết

tủa bằng dung dịch (NHạ);SO¿ 60% bão hòa theo tỉ lệ Idung dịch enzyme :1 muối

Ở nồng độ muối này, đa số enzyme sẽ bị kết tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính Sau đó, phần kết tủa sẽ được tách khỏi dung dịch bằng cách ly tâm lạnh trong điều kiện 4°C ở 11500 vòng/phút Sau 30 phút ly tâm, thu được phần protein kết tủa

Thẩm tích: phần kết tủa được đem đi thâm tích đề loại bỏ muối (NH¿);SO¿ và các chất phi protein có kích thước nhỏ hơn bằng túi thâm tích Seamless Cellulose Tubing 36/32 (Viskase Companies, Inc) (Hình 2.5) Kết tủa chứa enzyme và một ít

dung dịch đệm được cho vào túi thấm tích Túi này được chuẩn bị bằng cách trước

khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên và được đặt trong beaker có dung dịch đệm phosphate không được chứa chất hòa tan cần loại bỏ theo

tỉ lệ 1 dịch trích enzyme: 4 dung dịch đệm Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng độ Ở trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hòa tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau do đó phải đùng một thể tích lớn dung

dịch đệm và thỉnh thoảng phải thay dung dịch đệm mới để loại hết muối ra khỏi dung dịch (15 phút x 4 lần, 30 phút x 2 lần, 60 phút x 1 lần, và để qua đêm) Dung

dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ, cá hệ thống được đặt trong tủ lạnh dé đảm bảo hoạt tính enzyme

Đông khô: phần dung dịch sau khi thâm tích được cho vào tủ đông để mẫu dong ran lại sau đó sẽ được đông khô trong 3 ngày để loại bỏ nước thu được enzyme amylase bán thô dạng bột

Dịch trích enzyme

Hình 2.5 Hệ thông thẩm tích Đối với phương pháp trích có tủa bằng côn:

Phần dung dịch trong sau ly tâm ở giai đoạn đầu được tiến hành kết tủa với côn 96 độ theo tỉ lệ 1 dung dịch : 4 côn Sau đó, tiễn hành ly tâm 30 phút thu kết tủa

ở 4°C ở 11500 vòng/phút Kết tủa thu được đông đá, chuẩn bị đông khô Thực hiện đông khô trong 3 ngày để loại nước thu được mẫu enzyme bán thô dạng bột

* Thí nghiệm xác định hàm lượng protein:

Đường chuẩn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ theo nồng độ dung dịch protein chuẩn được xây dựng với dãy nồng độ dung dịch protein gốc (BSA 1mg/ml NaCl

0,9%): 0; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 va 0,4 (mg/ml) Ding thuốc thử Folin

cho thấy sự đôi màu của các dung dịch, dung dịch có màu càng đậm càng chứa hàm lượng protein cao Do độ hấp thụ của từng dung dịch trên máy quang phố và vẽ đường chuẩn về sự phụ thuộc của độ hấp thu A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn

Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 — 0,4 mg/ml tir dung dich protein géc (BSA 1 mg/ml NaC] 0,9%) sau do cho thém các hoá chất vào 9 ống nghiệm theo bảng sau (Bảng 2.1)

Chương 2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Thé tich dung dich kiém

Hình 2.6 Màu của thuốc thử Folin trong các dung dịch tương ứng với

nông độ protein khác nhau

Xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích: lẫy 0,5ml dung dịch cần xác định hàm lượng protein (1 mg/ml NaOH 0,1N) cho vao ống nghiệm, cho thêm 5,5 mi dung dịch C (xem phụ lục) Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút Tiếp tục

cho thêm 0,5 ml thuốc thử Folin 0,5N rồi lắc đều, dung dịch protein sẽ chuyên từ

màu vàng sang màu xanh biển do phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin (hình 2.7), để yên 30 phút và đo độ hấp thụ của dung dịch trên máy đo quang phố ở

Vũ Thị Yến 27