ly trích và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme amylase từ hột sen

Do đó đề tài “Ly trích và khảo sát các yếu tố ảnh hướng đến hoạt tính của enzyme amylase từ hột sen” được thực hiện nhằm đánh giá hoạt động của enzyme amylase trong hột sen và khả năng ứ

TRUONG DAI HOC CAN THO

KHOA CONG NGHE

BQ MON CONG NGHE HOA HOC

eK Ke EK KH HK

LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC

LY TRICH VA KHAO SAT CAC

YEU TO ANH HUONG DEN

HOAT TINH CUA ENZYME

AMYLASE TU HOT SEN

CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN

TS Nguyén Minh Chon Lé Van Toan

Mssv: 2041681 Ngành Công nghệ hóa học - Khóa 30

Cần Thơ, tháng 12 năm 2008

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC see aR aR

Can Tho, ngay tháng năm 2008

PHIEU DE NGHI DE TAI LUAN VAN TOT NGHIEP

Năm học: 2008 - 2009

1 Họ và tên sinh viên thực hiện: Lê Văn Toản MSSV: 2041681

Ngành: Công nghệ Hóa học Khóa: 30

2 Tên đề tài thực hiện: Ly trích và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính

enzyme amylase từ hột sen

3 Địa điểm, thời gian thực hiện:

- _ Thời gian: tháng 08/2008 - thang 11/2008

- _ Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ

4 Họ và tên cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Chơn

5 Mục tiêu của đề tài:

Mục tiêu của đề tài nhằm tìm ra nhiệt độ, pH và các điện kiện cần thiết cho việc thủy phân tỉnh bột và xác định ở thời gian nào trích sẽ mang lại hiệu quả cao điều kiện sử dụng tốt nhất đối với chế phẩm enzyme trích được

6 Các nội dung chính và giới hạn của đề tài:

a Các nội dung chính của đề tài:

Chương l1: Giới thiệu

Chương 2: Lược khảo tài liệu

Chương 3: Phương tiện và phương pháp thí nghiệm

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

b Giới hạn của đề tài

Có nhiều phương pháp để trích ly và nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt

tính của enzyme amylase nhưng do thời gian và trang thiết bị có hạn nên đề tại chỉ chọn khảo sát các phương pháp phô biến cũng như các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme này

Lê Văn Toản

Ý KIÊN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Y KIEN CUA BO MON Y KIEN CUA HOI DONG LUAN VAN

Cần Thơ, ngày tháng năm 2008

Ký tên

TS Nguyễn Minh Chơn.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2008

| Ký tên

CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1 CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2

Chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Minh Chơn đã nhiệt tình hướng dẫn tôi

trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp

Thành thật biết ơn các Thầy, Cô cùng các anh, chị trong phòng thí nghiệm

Sinh Lý — Sinh Hóa đã giúp đỡ tôi và tạo điều kiện tốt cho tôi thực tập tại phòng thí

Thành thật biết ơn anh Lê Đức Phú Ấp AB, xã An Hội, huyện Cao Lãnh,

Đồng Tháp đã cung cấp hột sen cho tôi trong suốt thời gian tôi làm luận văn

Chân thành cảm ơn tập thể anh, em lớp Công Nghệ Hóa K30 đã động viên

và giúp đỡ tôi mỗi khi tôi gặp phải khó khăn trong suốt thời gian tôi học tập và

nghiên cứu tại trường

Tôi rất mang ơn cha mẹ đã nuôi dạy tôi nên người, động viên và tạo mọi

điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Sau cùng gởi lời cảm ơn đến tất cả những người bạn đã giúp tôi trong suốt quá

trình làm luận văn

Lê Văn Toản

enzyme amylase từ hột sen” Luận văn đại học nghành Công Nghệ Hóa, Khoa Công Nghệ, Trường Đại Học Cần Thơ, 58 trang

Cán bộ hướng dẫn TS Nguyễn Minh Chơn

TÓM LƯỢC

Enzyme amylase là hệ enzyme thủy phân rất phố biến trong thế giới sinh vật

Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng

trong nhiều lãnh vực công nghiệp, nông nghiệp, hóa học

Hiện nay, sản phẩm enzyme amylase chủ yếu là nhập khẩu nên giá thành rất cao Vì vậy, việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ tìm là vấn đề rất cần thiết

trong việc sản xuất enzyme này trong tương lai nhằm hạ giá thành sản phẩm và tăng

hiệu quả kinh té Enzyme amylase có trong tuyến tụy, vỉ sinh vật, hạt nảy mầm Cây

sen được trồng khá nhiều ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, hột sen chứa tỉnh bột và nảy

mầm nhanh nên khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase có thể sẽ cao, đó là tiền đề cho nghiên cứu này Do đó đề tài “Ly trích và khảo sát các yếu tố ảnh hướng đến hoạt tính của enzyme amylase từ hột sen” được thực hiện nhằm đánh giá hoạt động của

enzyme amylase trong hột sen và khả năng ứng dụng trong tương lai Hột sen thương

phẩm (25 ngày sau khi rụng cánh hóa) được lột vỏ không ngâm ủ, ngâm trong nước 2 ngày và 4 ngày để trích enzyme amylase Mẫu sau khi trích được đo nông độ protein hòa tan theo phương pháp Eolin-Lowry và khảo sát hoạt tính Kết quả cho thấy hột sen được ngâm 2 ngày đã nảy mầm và cho nồng độ protein dễ tan cao nhất là

0,501mg/ml va hoạt tính của enzyme amylase cũng tốt nhất so với các mẫu khác, kết

quả phân tích điện di protein bằng phương SDS-PAGE từ hột sen cho thấy có chứa ơ

amylase như mẫu chuẩn Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme amylase như: nhiệt độ, pH, chất hoạt hóa cũng được khảo sát Kết quả cho thấy nhiệt độ và

pH tối thích của enzyme amylase từ hột sen là 50”C và pH = 6,6 Chất hoạt hóa dé hoạt hóa enzyme amylase từ hột sen là CaCl; ở nồng độ 6%o đã làm tăng khả năng

xúc tác của nó lên 55%.

MỤC LỤC PHIẾU ĐỀ NGHỊ ĐẺ TÀI

LỜI CẢM TẠ

19/005 0NNHHỜdỐỐÕ 1 DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH . 52: 52t x22 2tr iv 69) 009/9 9115 .A ,ƠỎ vii (962700015 1 CHƯƠNG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU -2 52©55t+2++2£YEt2EYEtEExterrtrerkrrrrkrrrrtrrrrvee 3 1.1 Giới thiệu về Enzym Amyla§e .- ¿2-2 5+ S652 SE93SE#ESEESEEEEEEEEECESEkvrerkrrerree 4

1.1.1 œ-amylase (1,4- ơ-D-Glucan glucanohydrolase) s se 5 1.1.2 PB-amylase (œ-1,4-glucan maltohydroÏas€) - - + << S322 sssssseez 6

1.2 Các yếu tơ ảnh hưởng đến hoạt động của enZyme - +2 25+ s52 +ssss set 8

1.2.1 Anh huong cua néng dd enzyme dén phan img enzyme cesses 8 1.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng enzyme . - 5-5-5 +: 8 1.2.3 Ảnh hưởng bởi nhiét d6 dén phan tng enzyme 0 eee cece esesseseeseeeseeeeeeeseees 8

1.2.4 Anh hung cla pHo e.cececcecccsessseesesssscssssssesscsessessssssscsesscsesssssesesscsesssssscscsessceseass 9

1.2.5 Anh hung cla cdc chat hoat hOa c.ccccsccsessessesesseseesesseseessssesesseseesssssseseesesseeeans 9 1.2.6 Anh hung cia chat kim 4M cccceccsescsessessessssesesesseseessssesesscsessssesseseesesseeeeans 9

1.3 Ung dung ctia enzyme amylase c.cccscccscscsscessscssesesesscsesscssssessscssesesesnsessesseseens 10 1.3.1 Trong cơng nghệ thực phẩm - ¿+ << <+E£EEE+E£k£ESEEEEEEEEEEkEkrEerrkrerree 10 ISVAM)ui vi i13) 9011077 14

2.1.2 MAU VAt csccccccccsssscssscsssscscsesssscscscsssscscsssssscscsssssecscsssesesecscsnsssscacscsencaceeseesees 16

"5h nh 16

“P.0 17 2.2 xo» 0 17 2.2.1 Thí Nghiệm 1: Trích và đo hàm lượng protein có trong mẫu với hột sen không ngâm, ngâm 2 và ngầm 4 ngày .- - cv ve 18

a Chuẩn bị đấy dung dịch protein chuẫn + 2 + s+s££z£E£Sz+£E£Ezcx+zsrxred 20

b Chuẩn bị dung dịch phân tích - + k kẻ + EEEEE£EEEEEkeEeEEEkrkekererkred 21

2.2.2 Thí nghiệm 2: So sánh hoạt tính của enzyme amylase trích từ hột sen không

1121908811521 84132)03000:15 00000077 22 2.2.3 Thí Nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của 0IVYA41115E:000) 4E; s8n69i010i1018- 20 P007 25

a Khao sat sự ảnh hưởng của nhiệt độ ở pH=7 đến hoạt tính của enzyme b1104LL)s8ip[(i0nì 01008: 001772710707 .5 25

b Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ ở pH=7 đến hoạt tính của enzyme b1104LL)s8ip[(i0nì 01008: 001772710707 .5 27 2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme b1104LL)s8ip[(i0nì 01008: 001772710707 .5 27

a Khảo pH=3 đến pH= - - se SE EEEEEEE E113 111511511111 E.eU 27

b Khao sat pH=6 đến pH=7 - ¿SE S233 3 1111111311 11311 111311 te 29

2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ chất hoạt hóa CaCl, va NaCl đến hoạt tính của enzyme amylase trích từ hột sen - + - 2 2s ££+£z£s£x+£e£zcxd 30

a Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chất hoạt hóa CaC]; - + +scs+s ve szszczsxz 30

b Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất hoạt hóa NaCl -2-2- 2 s2 xs+serced 31

CHƯƠNG II KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN . - 5-2552 2E +E£E+EEEEEEEEEEEEErrerkrrerkereee 32

3.1 Thí Nghiệm 1: Trích và đo hàm lượng protein có trong mẫu với hột sen không ngâm, ngâm 2 và ngâm 4 ngày - - - -Ă G1 ngọn re 32

3.2 Thí nghiệm 2: So sánh hoạt tinh cua enzyme amylase trich từ hột sen không

ngầm, ngâm 2 ngày và ngâm 4 ngày - S1 n9 ng ng xu 35

3.3 Thí Nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

51104 L)s8ip(i0nì 010082: 000101787 41

a Khảo pH=3 đến pH=1 - << +s+t+k£EEE+k*EEEEESEE E13 11151151111 cxe 41

b Khảo sát pH=6 đến pHH=/ - + Sẻ 8 SEEkEEE E331 3131110111111 1kg 43 3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ánh hưởng nồng độ chất hoạt hóa CaCl, va NaCl

đến hoạt tính của enzyme amylase trích từ hột sen +2 - + 2 £s+££z+kex+esrscxd 44

a Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chất hoạt hóa CaC]; - 2-2 2 se se +: 44

b Khảo sát ánh hưởng nồng độ chất hoạt hóa NaCl - +5 2 se cscxở 46

CHƯƠNG IV KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 2-2 2 222 E£Ez+E+zEcEereerzceee 47 {5 DDnD 47

TAI LIEU THAM KHẢO + 6 2 SE SE Sư SE ST E311 115131 11111111 cve 48

2si0806/ 0 Vii

DE CUONG

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Trang 1.1 Giông sen hông Đông Tháp 3

2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19

2.2 Quy trình ly trích enzyme amylase từ hột sen 20

2.3 Quy trình hoạt động của túi thâm tích trên máy khuấy từ 21

2.4 Hột sen sau khi ngầm 2 ngày và 4 ngày 22 2.5 Màu xanh biến của dung dịch protein trong thuốc thử Folin 23 2.6 Sơ đồ so sánh hoạt tính enzyme amylase bằng phản ứng thủy phân

tình bột 24 2.7 Mau cua iod với tỉnh bột trong thí nghiệm 3 28

2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 28 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 30

2.10 Màu của lod với tinh bột trong thí nghiệm 4 31

2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát chất hoạt hóa 33

3.1 Đường chuẩn của protein chuẩn với thuốc thử Folin ở bước sóng

750nm 31 3.2 Chế phẩm enzyme trích từ hột sen 35 3.3 Nông độ protein của ba mẫu enzyme trích từ hột sen 36 3.4 Đường chuẩn của tinh bột hiện màu với iodine 10 mM nồng độ từ

3.5 Kết quả của chạy điện đi theo phương pháp SDS-PAGE 39 3.6 Hoạt tính của 3 mẫu enzyme trích được ở 30, 60, 90 giây 40 3.7 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme

amylase trích từ hột sen pH=7 42 3.8 Hình 3.8 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính

enzyme amylase trích từ hột sen pH=6 44

3.0 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính

của enzyme amylase trích từ hột sen ở pH=6 và pH=7 45 3.10 — Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme

amylase trích từ hột sen 47 3.11 Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của pH=ó,0 đến pH=7,0 dén hoat

tính của enzyme amylase trích từ hột sen 49

3.12 Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ chất hoạt hóa CaCl; đến phản ứng

thủy phân tính bột của enzyme amylase trích từ hột sen 51

3.13 Đồ thị so sánh hai chất hoạt hóa CaCl, va NaCl trong phan tmg

thủy phan tinh bột của enzyme amylase trích từ hột sen 53

PLI1 Máy đo quang phố xI PL2 Máy ly tâm lạnh tốc độ cao xI PL3 Máy khuấy từ xiI PL4 Máy đông khô Xl PL5 Máy đo pH Xili

DANH MỤC BANG

Bảng Nội dung Trang 2.1 Bảng xây dựng đường chuẩn theo phương pháp Folin - Lowry 22 3.1 Hàm lượng protein hòa tan có trong mẫu enzyme thé ly trich tir sen

(mg/ml) theo phuong phap Folin — Lowry 36 3.2 Chi phi dé trich enzyme amylase tir hét sen (500g) theo phương

pháp kết tủa bằng (NHa);SO¿ 37

3.3 Hoạt tính xúc tác của 3 mẫu enzyme amylase ở 30, 60, 90 giây 39

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ở pH=7 đến hoạt tinh cla enzyme amylase

trích từ hột sen ở các mức thời gian 30, 60, 90 giây 41 3.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

amylase trích từ hột sen ở các mức thời gian 30, 60, 90 giây pH=6 44 3.6 Ảnh hưởng của pH đến lượng tỉnh bột bị thủy phân với xúc tác

enzyme amylase trích từ hột sen (từ pH=3 đến pH=10) 46

3.7 Ảnh hưởng của pH từ pH=ó,0 đến pH=7,0 đến lượng tỉnh bột bị

thủy phân của enzyme amylase trích từ hột sen qua các mức thời

gian 48

3.8 Ảnh hưởng của nông độ chất hoạt hóa CaCl; đến quá trình hoạt hóa

enzyme amylase trích từ hột sen 51 3.9 Lượng tinh bột bị thủy phân (92) với xúc tác enzyme amylase, ảnh

hưởng của dãy nồng độ chất hoạt hóa NaCl 53

MỞ ĐẦU Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tỉnh bột

từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tỉnh bột chủ yếu Trong chế biến tỉnh bột và đường, công đoạn quan trọng

nhất là thuỷ phân tỉnh bột về các đường đơn giản Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường

đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản pham quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid

Quá trình thủy phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá

và giai đoạn đường hoá Đề thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực

tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: thuỷ phân tỉnh bột bằng acid và bằng enzyme

Dé thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCI và H2SQ, Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Do vậy, việc thay thế và ứng dung enzyme đề thủy phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển

Enzyme amylase được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công

nghiệp chế biến thực phẩm, nông nghiệp Enzyme amylase có thê tìm thấy ở

nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và vi sinh vật Enzyme amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chang hạn amylase trích từ vi sinh vật, cu thể là các chủng

vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng Ngoài ra, amylase còn

có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tỉnh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chỉ phí cho quá trình tinh sạch dịch đường

Nguồn amylase có thể lấy từ mầm lúa, mầm đại mach (malt), hat bap nảy mầm, từ nắm mốc, hay từ hột sen Nhưng đối với hột sen khi hột chưa nảy mam

thì mầm đã hình thành sẵn, đây là nguồn nguyên liệu để tìm, rẻ tiền có thể tim thay

dễ dàng ở nước ta, là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh cho việc trích enzyme

từ nguôn nguyên liệu này, do đó đề tài: “Ly trích và khảo sát các yêu tô ảnh

hưởng đến hoạt tính enzyme amylase từ hột sen” được thực hiện

Là sản phẩm của tự nhiên, enzyme có bản chất protein có câu trúc phân tử rất

phức tạp, do đó enzyme có hoạt lực xúc tắc rất mạnh và có tính chọn lọc cao Song

khi trích nó ra thì hoạt tính xúc tác của nó có thể giảm hoặc mất đi khi điều kiện trích không thích hợp cũng như phản ứng không được duy trì như ở trong tế bào Nhu vậy bằng cách nào để trích được enzyme amylase từ hột sen mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất mà hoạt tính enzyme vẫn đảm bảo, từ đó đưa nó vào trong sản xuất

để góp phần nâng cao giá trị của cây sen và enzyme amylase Đây chính là nội dung cân nghiên cứu và cũng là mục tiêu chính mà đê tài mong muôn đạt được

CHUONG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

s* Sơ lược về cây sen:

- Cay sen (Nelumbo nucifera Gaertn hay Nelumbium speciosum WIIId) có

nguồn gốc ở châu Á, xuất phát từ Ân Độ (Makino, 1979 trích dẫn bởi Nguyễn

Hoàng Thịnh, 2007), sau đó lan sang Trung Quốc và vùng đông bắc Úc châu Cây sen là loài thuỷ sinh được tiêu thụ mạnh khắp châu Á, lá, hoa, hạt và củ đều là những bộ phận có thé str dụng, còn hoa được sử dụng trong nhiều lễ hội ở các nước châu Á Tại Châu Á, hoa sen cũng là biểu tượng sâu đậm của văn hoá Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam và Nhật Bản Hàng ngàn năm trước hoa sen là biểu tượng chính của nhiêu tôn giáo ở châu Á như đạo phật xem hoa sen là biêu tượng cao nhât của

sự tỉnh khiết, hoà bình, từ bi và vĩnh hằng

Hình 1.1 Giống sen hồng Đồng Tháp

- Cây sen rải rác ở khắp các tỉnh, mọi người đều biết đến hình ảnh của nó và

xem “cây sen là một loại hoa tiêu biểu cho đồng ruộng Việt Nam, không chỉ là biểu tượng thê hiện lòng tin son sắt về Đảng, vào Bác Hồ của người dân trong những năm kháng chiến và hiện nay cây sen còn được xem là cây trồng giúp xóa đói giảm nghèo” (www.vieflinh.com.vr) Hãng hàng không Việt Nam cũng chọn cây sen làm biểu tượng Ở Việt Nam, cây sen được trồng và khai thác trên bốn phương diện chính là trồng để lấy củ, lấy hột, lẫy ngó và lẫy hoa Hiện nay cây sen được trồng luân canh hoặc thay thế cho cây lúa trên những vùng đất sản xuất lúa kém hiệu quả

Lê Văn Toản 3

- Hiện nay ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, diện tích sen được trồng nhiều để lẫy hột có chiều hướng tăng ở tỉnh Đồng Tháp và mới xuất hiện ở Vĩnh Long, An

Giang Còn hình thức lẫy củ (Sóc Trăng) và lấy ngó (Sóc Trăng, rải rác ở các tỉnh)

còn ở mức độ thấp, hai loại hình sản phẩm này chưa được phô biến trên thị trường cho nên diện tích còn nhỏ

- Hột sen đính vào phần cuối của cuốn hoa, nằm trong gương sen Lúc đầu hột có màu xanh sau chuyển sang màu nâu tím trước khi phía trong phôi nhũ trở nên khô cứng Phía trong vỏ quả lúc đầu chứa nước và không khí, sau đó phôi nhũ bắt đầu tăng trưởng Shen-miller & ctv (1995) bởi Nguyễn Hoàng Thịnh, 2007 đã phát hiện hột sen có sức sống trên 1000 năm Tâm sen chứa 2 mm chồi màu xanh có chứa clorophyl giúp cây có thê quang hợp ngay khi vừa mới nảy mầm (Eseau,1965

trích dẫn bởi Nguyễn Hoàng Thịnh, 2007) Đối với các hạt khác thì khi bắt đầu nảy

mầm mới tổng hợp enzyme amylase nhưng đối với hột sen thì trong hột nó đã có nhị sẵn nên enzyme amylase đã có khi chưa nảy mầm Nên vấn đề trích ly enzyme

amylase từ hột sen là một lợi thế rất lớn

1.1 Giới thiệu về Enzym Amylase

Enzyme Amylase là một hệ enzyme rất phô biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

R.R’ + H-OH > RH + R’OH

Amylase được tìm thấy trong tuyến nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người

và của động vật, trong hạt nảy mầm, trong sản phẩm trao đổi chất của nắm mốc, nắm men và vi khuẩn Trong đó amylase được thu nhận từ malt với sỐ lượng nhiều nhất

Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, nghĩa là sản phẩm của dự phân giải enzyme này hoàn toàn chỉ gồm những acid amin Vi vay chúng thuộc loại enzyme đơn giản (đơn cấu tử)

Hiện nay người ta biết có 6 loại amylase được xếp thành hai nhóm:

-Endoamylase (enzyme nội phân): gồm có ơ-amylase và nhóm enzyme khử nhánh (dextrin-6-gluanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6- ølucanhydrolase)

-Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm B-amylase va y- amylase

1.1.1 ơ-amylase (1,4- g-D-Glucan glucanohydrolase)

a-amylase c6 trong nudc bot, hat hoa thao nay mam, tuy tang, trong nam

mốc, vi khuẩn œ-amylase phân giải các liên kết 1,4-glucoside ở giữa chuỗi mach

polysaccharide giải phóng glucose, maltose, các dextrin với kích thước phân tử (KTPT) khác nhau vì vậy được coi là “endo-amylase” Do đó dưới tác dụng của enzyme nay dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch 1od và bị giảm độ nhớt mạnh (Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng, 1992) a- amylase không chỉ có khả năng thủy phân hồ tỉnh bột mà thủy phân cả hạt tỉnh bột còn nguyên vẹn (Nguyễn Đức Lượng và ctv 2004)

> Cơ chế tác dụng của ơ-amylase

Dưới tác dụng của enzyme dơ-amylase, amylose phân giải khá nhanh Sau thời gian thủy phân amylose, sản phẩm bao gồm 87% maltose, 13%glucose

Dưới tác dụng của ơ-amylase, amylopectin bị phân giải khá nhanh nhưng vì

ø-amylase không cắt được liên kết 1,6-glucoside nên dù kéo dài thời gian thủy phân

nhưng sau cùng chỉ có khoảng 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử và 8%

izomaltose

> Đặc tính ơ-amylase

M - 45000-59000 (Sách tra cứu hóa sinh, 1978) Trọng lượng phân tử của a- amylase từ malt là 59 kDa (Eischer và Stein, 1960 trích dẫn bởi Doan Thi Kim Hoàn, 2008), từ nắm mốc là 45-50 kDa

Dạng œ được hoạt hóa bởi CT pH (tối thích) 6,9 (động vật); 4,7—-5,4 (mạch nha) pI 5,2- 4,6 (động vật); 5,7 (mạch nha) (Sách tra cứu hóa sinh, 1978 )

ơ-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

Điểm đăng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7 (Bernfeld, 1951 trích dẫn bởi Đoàn Thị Kim Hoàn, 2008)

œ-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử œ-amylase đều chứa 1-30 nguyên tử gam Ca”'/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol œ-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionine

Protein của ơ-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline Vì vậy

nó kém bền trong môi trường acid nhưng khá bên nhiệt (bền nhất trong hệ enzyme amylase) Điều kiện hoạt động của œ-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau Biên độ nhiệt độ, pH tối thích cho hoạt động của ơ-amylase từ đại mạch nảy mam khác với vi sinh vật pH tối thích cho hoạt động của ơ-amylase

từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong khoảng pH

4.7-5,4) Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của ơ-amylase từ mầm thóc và mầm

đại mạch là 58-60°C Ở 0°C va pH 3,6 œ-amylase của đại mạch nảy mầm hoàn toàn

bị bất hoạt

1.1.2 B-amylase (ơ-1,4-glucan maltohydrolase)

B-amylase (EC3.2.1.2) có nhiều ở hạt, củ thực vật Nó xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết 1,4-glucoside bắt đầu từ đầu không khử tạo thành chủ yếu maltose và dextrin phân tử lớn

B-amylase chỉ phổ biến trong thực vật đặc biệt trong hạt nảy mầm Trong vi khuẩn không có B-amylase Su tén tai cua B—amylase trong nắm mốc đến nay van

chưa được xác định (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

B-amylase được phát hiện thấy trong hạt ở tất cả các giai đoạn phát triển và nảy mầm của hột Hoạt độ của chúng tương đối cao và ít liên quan đến sự chuyển hóa của tinh bột trong quá trình nảy mầm (Adams C A và ctv, 1981 trích dẫn bởi Đoàn Thị Kim Hoàn, 2008)

> Cơ chế tác dụng của B-amylase

B-amylase là một enzyme ngoại phân Tiến hành phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng của cơ chất ÿ-amylase cắt liên kết a-1,4- glucoside nhung khi gặp liên kết œ-1,4-glucoside đứng kế cận ơ-1,6-glucoside thì

nó ngưng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết và được gọi là B-dextrin

B-amylase phân giải 100% amylose thành maltose Phân giải 54-58% amylopectin thành maltose

Tinh bot “ “7X”, waltose (54-58%) + B-dextrin (42-46%)

Nếu tế bào bị thủy phân đồng thời bởi œ- và -amylase thì lượng tinh bột sẽ

bị thuỷ phân 95% (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

> Đặc tính B-amylase

Dạng § bị ức chế bởi iotazobenzoat, Ag", Hg”*, Cu””, pH (tối thích) 4-5,

pl = 4,7- 4,8 (Sách tra cứu hóa sinh, 1978 bởi Đoàn Thị Kim Hoàn, 2008)

B-amylase là một loại albumin Tâm xúc tác của nó chứa gốc —SH, -COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin

B-amylase rất bền khi không có ion Ca”*, bi kim him bởi ion Cu”, Hg””,

ure, iod, ozon B-amylase bị vô hoạt ở 70°C nhưng bền với acid hơn ơ-amylase

1.2 Các yếu tô ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme

1.2.1 Ảnh hướng của nồng độ enzyme đến phản ứng enzyme

Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc phản ứng của enzyme tỉ lệ thuận với nồng

độ enzyme Nhưng nếu vượt quá nồng độ tối thích của nó sẽ ức chế trở lại hoạt tính Của enzyme

1.2.2 Ánh hưởng của nông độ cơ chất đến phản ứng enzyme

Khi cố định nồng độ enzyme thì vận tốc phán ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất Nhưng khi đạt đến nồng độ cực đại thì hầu như tốc độ phản ứng không đối

1.2.3 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ đến phản ứng enzyme

Nhiệt độ có anh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản

ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng

enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu Bản chất của enzyme là protein nên nó không bên đối với tác dụng nhiệt, đa SỐ enzyme bị mat hoat tinh 6 70°C (Pham Thu Cúc, 2002) Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là

nhiệt độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40-50°C Nhiệt độ

tối ưu của những enzyme khác nhau thì khác nhau Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối thích, hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm và không có khả năng phục hồi

lại Ngược lại, ở nhiệt độ hoạt động thấp (0C) enyme bị Ức chế hoạt động Nhiệt độ

tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH

và các chât bảo vệ

1.2.4 Ảnh hưởng của pH

pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và đặc biệt

ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến

phản ứng của enzyme

pH tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme lớn nhất gọi là pH tối ưu pH tối

ưu của enzyme có thể ở vùng trung tính, vùng kiềm và vùng acid pH tối ưu cũng phụ thuộc vào nhiệt độ, khi tăng nhiệt độ phản ứng thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch về phía pH lớn hơn

1.2.5 Ánh hướng của các chất hoạt hóa

Chất hoạt hoá là những chất có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không

hoạt động hoặc hoạt động yếu trở nên mạnh hơn Chúng có thể là các anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ phức tạp Các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng hoạt hoá ở

một nồng độ nhất định, vượt quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của

enzyme

1.2.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Các chất kìm hãm là chất có mặt trong các phản ứng enzyme làm yếu hoặc chấm đứt hoàn toàn tác dụng của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đôi tính chất hoá học, cầu tạo hoá học và tính chất vật ly cua chung

Các chât kìm hãm có thê là các ion kim loại, các phân tử vô cơ, các chât hữu

co va protein

1.3 Ứng dung ciia enzyme amylase

Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme cac loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme ban trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ

tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng đụng Chế phẩm enzyme không chỉ

được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công

14

nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử"

Theo thời gian, enzyme công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzyme ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase, và một sỐ enzyme đặc biêt khác đã thu được rất nhiều lợi nhuận

từ ngành này Dưới đây là một vài ứng dụng thực tế

1.3.1 Trong công nghệ thực phẩm

a Trong sản xuât rượu (côn)

Người ta dùng enzyme amylase làm tác nhân đường hóa trong công nghiệp

sản xuất rượu cho phép tiết kiệm được hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt,

rút ngắn quá trình sản xuất, tiết kiệm được sản xuất, bởi enzyme amylase thuỷ phân

sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong thời gian ngắn Amylase không những quan trọng ở giai đoạn đường hoá mà còn ở cả giai đoạn xử lý nước nhiệt nguyên liệu nữa Việc sử dụng amylase để dịch hóa tinh bột khi nấu ở nhiệt độ 85-90°C cho phép có thể chỉ hoàn toàn dùng hơi thứ cấp cho đun sơ bộ và làm dịu chế độ nấu

Điều này làm giảm chỉ phí hơi trong gia nhiệt và giảm bớt tốn thất tinh bột Vì vậy

làm cho hiệu quả sản xuất tăng Ngoài ra việc ứng dụng enzyme amylase trong các hạt thóc nảy mầm để tạo ra các sản phẩm giàu dinh dưỡng, ứng dụng công nghệ lên men hai giai đoạn băng vi khuân lactic đề nâng cao chât lượng rượu vang

Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau Ví dụ: ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazil lại sử dụng khoai mì, các nước khác sử dụng gạo hoặc tắm từ gạo Quá trình sản xuất côn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu hóa

Giai đọan đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzyme amylase (không thể sử dụng phương pháp thủy phân tỉnh bột bằng acid) Người Nhật đã biết

sử dụng enzyme của nắm mốc trong quá trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nắm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu cách đây 4000 năm Còn người Việt Nam đã biét san xuât rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm

b Trong san xuat bia

Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzyme amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tỉnh bột có trong mầm đại mạch Nguyên liệu

chính là đại mạch nảy mầm loại tốt Khác với rượu ở dãy mức độ đường hoá chứa

trong nguyên liệu thấp hơn Cần có các dextrin chưa đường hoá làm cho bia có

hương vị Việc chuyến hoá tỉnh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do các

enzyme amylase đảm nhiệm Do đó trong quá trình dịch hoá và đường hoá thì enzyme amylase có ý nghĩa và vai trò quan trọng bậc nhất

Việc bố sung enzyme amylase vào trong quá trình sản xuất bia làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: giảm tôn thất tinh bột và các chất hoà tan khi cho hạt nảy mầm, làm tăng hiệu suất chất hoà tan lên 0,6% (tức tiết kiệm được 0,9% đại mạch); giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như gao, bắp những nguyên liệu không nảy mầm; giảm chỉ phí lao động cho sản xuất malt,

tăng hiệu suất lao động

Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nắm men Saccharomyces sp Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm Như vậy việc đường hóa tỉnh bột trong hạt nhờ enzyme của chính nó Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ để phân hủy lượng tỉnh bột có trong hạt Như

thế cần rất nhiều mầm đại mạch đề sản xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chỉ phí cao

cho sản xuất và sản phẩm Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không sử dụng hoàn tòan 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có

sự pha trộn theo một công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tỉnh bột cho quá trình lên men Lý do là một phần dé tao huong vi cho bia, mau sắc, độ cồn phù hợp cho người tiêu dùng và một phân là làm giảm giá thành cho sản phẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho bia Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột Enzyme này có ý nghĩa rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiỆp

c Trong công nghệ sản xuât bánh mì

Bánh mì là một loại lương thực phẩm quen thuộc Trong bánh mì, enzyme được xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh

mì Enzyme được đưa vào nhằm giải quyết các vấn đề sau: tăng nhanh thể tích bánh, màu sắc của bánh đẹp hơn và làm tăng mùi thơm cho bánh

Trong sản xuất bánh mì người ta sử dụng cả œ-amylase và B-amylase Cac enzyme này tham gia thuỷ phân tinh bột để tạo thành đường Nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisase sé dé dang chuyển hoá chúng thành cồn, CO; làm tăng thê tích bánh tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh Việc sử dụng amylase cho phép

sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt

c Trong sản xuât bánh kẹo

Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hoá từ tinh bột sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột xấu đề sản xuất bánh Do đó người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và acid amin Đường khử và acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hoá-khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho

bánh có mùi, vị và màu hâp dân

d Trong sản xuât siro và các sản phầm chứa đường

Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển rất mạnh Theo phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO; và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hoà tan vào nước

Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ œ-amylase vào để dịch tỉnh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hoá rất dễ dàng Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm

1.3.2 Trong công nghiệp

a Công nghệ sản xuât các chât tây rửa

Mục đích của tây rửa (hoặc giặt quân áo) là loại bỏ đât và các loại chât vô cơ, hữu cơ bám vào quân áo Trong đó nhiêu chât rât khó làm sạch như protein, tannin, carbohydrate và những chất màu

Enzyme amylase cũng được ứng dụng trong công nghệ sản xuất các chất tây rửa và ở đây sử dụng chủ yếu là enzyme amylase của vi khuẩn vì những enzyme

này bền pH kiềm và nhiệt độ cao trong thời gian dài Khi phối trộn enzyme này với

các thành phần khác của các chất tây rửa Nó sẽ làm tăng khả năng phân giải các vết

ban do carbohydrate trong quan ao, tang kha nang tay rita

b Trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, amylase hay các chế phẩm của nó dùng để rũ hồ

(khử tinh bột) vải sợi bông, sợi hỗn hợp trước khi tây trắng hay nhuộm Xử lý vải

SỢI bằng amylase hay chế phẩm là tốt hơn cả vì giữ được độ bền, độ đai Việc sử dụng amylase không những làm tăng năng suất mà còn cái thiện phẩm chất vải do

độ mao dan va tinh hap phu cua vai tăng lên, vải dễ tây trắng hơn Quá trình hoà tan

và khử tinh bột trong dung dịch amylase loãng xảy ra rất nhanh trong 10 phút, do vậy mà khả năng rũ hồ xảy ra liên tục

Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzyme amylase của vi khuẩn để tây tinh bột và làm cho vải mềm Trong vải thô thường chứa khoảng 5% tỉnh bột và các tạp chất khác Do đó, khi sử dụng chế phẩm enzyme amylase của vi khuẩn vải sẽ tốt hơn Người ta thường sử dụng lượng chế phẩm amylase khoảng 0,3-0,6 g/l dung dich va thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 90°C

Tuy nhiên ngoài chế phẩm enzyme amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn, hiện nay người ta đã quan tâm đến việc sử dụng amylase từ nắm sợi và các hạt nảy mâm Cho đến nay có rất nhiều nước đã sử dụng enzyme trong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi Các nước sử dụng lượng enzyme amylase

nhiều nhất trong lĩnh vực này là Mỹ, Nhật, Pháp, Đan Mạch

1.3.3 Trong chăn nuôi

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng

rất lớn Trong khối lượng này, thành phân tỉnh bột rất cao Đề tăng hiệu suất sử

dụng năng lượng từ nguồn tỉnh bột, người ta thường cho thém enzyme amylase vao Enzyme amylase sé tham gia phân giải tính bột tạo thành đường, giúp cho quá trình

chuyên hóa tỉnh bột tốt hơn

Người ta sử dụng amylase trong chăn nuôi gia súc bằng hai cách: trộn thắng

vào thức ăn trước khi cho gia súc ăn hoặc xử lý sơ bộ thức ăn trước bằng enzyme

amylase Có lẽ xử lý thức ăn bằng enzyme trước tốt hơn vì trong trường hợp này dễ chọn điều kiện tối thích cho tác dụng enzyme lên thức ăn Do vậy mà giá trị dinh dưỡng, độ hắp phụ của thức ăn cũng tiêu tốn it enzyme amylase hon

Enzyme amylase còn được dùng để phối hợp với các enzyme thủy phân khác

đê sản xuât thức ăn tong hop cho gia suc, gia cam

1.3.4 Trong y hoc

Amylase thường được phối hợp với các enzyme thuỷ phân khác để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến đường tiêu hoá Ngoài ra enzyme amylase còn được dùng để tăng cường và cải thiện các quá trình tiêu hoá thường được sản xuất ở dạng viên

Amylase còn dùng để điều trị các chứng bệnh về tim, hệ thần kinh, amylase

còn dùng đê điêu chê các môi trường dinh dưỡng chuân đoán và điêu trị nhiêu loại

bệnh khác nhau giúp cho công tác nghiên cứu vi sinh vật học trong các viện va phòng thí nghiệm

CHƯƠNG II

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Phương tiện

2.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: từ tháng 08 năm 2008 đến tháng 12 năm 2008

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm sinh hóa (tầng 2, tòa nhà 2), Bộ môn Sinh Lý- Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ 2.1.2 Mẫu vật

-Hột sen được lẫy từ mẫu thí nghiệm ở Đồng Tháp với giống sen hồng 2.1.3 Hóa chất

- Canxi Clorua CaCl, (0, 2, 4, 6, 8, 10%o)

- Enzyme amylase chuan (Meck), BSA

2.1.4 Dung cu

- Máy ly tâm lạnh

- Máy khuấy từ

- Túi thâm tích Seamless Cellulose Tubing 36/32 (Viskase Companies, Inc)

- Máy đông khô

- Máy do quang phé (Thermospectronic HeAios a)

- Đối với enzyme Amylase việc trích ra khỏi nguyên liệu là một việc làm

tương đối đơn giản bởi nó triệu được nhiệt độ cao mà không làm mắt hoạt tính cũng

như các đặc tính khác nên việc áp dụng phương pháp trích cũng tương đối dễ ta có 3 phương pháp được sử dụng chủ yếu: Trích và tủa bằng cồn, tủa bằng muối amoni sulphat và trích enzyme thô Chọn một trong ba phương pháp trích trên để đạt hiệu quả cao, đơn giản mà không làm mất hoạt tính của enzyme là vấn đề cần thiết Do

đó đề tài chọn phương pháp trích và tủa bằng muối (NH¿);SO;¿ vì tính lợi ích của

phương pháp mang lại

2.2.1 Thí Nghiệm 1: Trích và đo hàm lượng protein có trong mẫu với hột sen không ngâm, ngâm 2 và ngâm 4 ngày

Mục đích: Thông thường thì enzyme Amylase chỉ xuất hiện khi các hạt nảy mâm nhưng với hột sen thì mầm đã hình thành sẵn trong hột đo đó enzyme cũng có

khi hột chưa nảy mầm nhưng khi nó nảy mầm thì enzyme này sẽ được tông hợp

càng nhiêu Vì vậy cân so sánh giữa hột chưa nảy mâm, nảy mâm 2 và 4 ngày Từ

đó xác định xem vào ngày nào enzyme sẽ cho hoạt tính tốt nhất để việc trích ly enzyme cho hiệu quả tốt hơn

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 1 Ghi chú:

E1: Enzyme trích từ hột sen không ngầm

E2: Enzyme trích từ hột sen ngầm 2 ngày

E3: Enzyme trích từ hột sen ngầm 4 ngày

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lập lại, 3 nghiệm thức với

3 mốc thời gian 30, 60, 90 giây Số đơn vị thí nghiệm là: 3 x 3 x 3= 27 Mỗi enzyme

trích từ hột sen qua các ngày ngâm là một nghiệm thức

Hột sen đã lột vỏ và nhị (500g) nghiền mịn bằng máy quay sinh tố

{ <— Dung dich dém phosphate, pH=7

Ly tam (9500 rpm, 4°C, 30 phút)

{ <— Lay phan trong

Loc

{<— Lay phan trong

Tua bang (NH,).SO, 60%

v

-Cân hột sen 500g đã lột bỏ vỏ và nhị sau đó cho vào máy quay sinh tố cùng với dung dịch đệm phosphate có pH=?7 theo tỉ lệ 1:1,5 để nghiền mịn thành những

hạt nhỏ nhằm phá vỡ cdc enzyme nam trong tế bào Sau đó tiến hành ly tâm để tách

lấy phần dung dịch chứa enzyme ở 4C với số vòng quay 9500 vòng /phút trong 30

phút đề tách lấy phần dung dịch chứa enzyme ở bên trên và bỏ phân xác bả rắn kết

tủa Tiến hành kết tủa enzyme bằng dung dịch (NH¿);SOx 60% theo tỷ lệ 1:1 Ở

nồng độ muối này, đa số enzyme sẽ bị kết tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính

Sau đó, phần kết tủa sẽ được tách khỏi dung dịch bằng cách ly tâm lạnh trong điều

kiện 4C ở 11500 vòng/phút Sau 30 phút ly tâm, thu được phần enzyme kết tủa và

đem hòa tan trong dung dich dém phosphate pH=7 réi đem đi thấm tích để loại bỏ muối (NH/);SO;¿ và các chất phi protein có kích thước nhỏ hơn bằng túi thấm tích Seamless Cellulose Tubing 36/32 (Viskase Companies, Inc) (Hinh 3.3) Dung dich enzyme được chứa trong túi thâm tích Túi này được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được ngâm vào nước nóng ở nhiệt độ 55°C sau khi ngâm được 10 phút lấy ra tráng đầy bằng dung dịch đệm và đặt trong beaker có dung dịch đệm phosphate không được chứa chất hòa tan cần loại bỏ theo tỉ lệ 1 dịch trích enzyme: 3,5 dung dịch đệm Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng độ Ở trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hòa tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ

bằng nhau do đó phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm và thỉnh thoảng phải

thay dung dịch đệm mới để loại hết muối ra khỏi dung dịch Dung dịch đệm phía

ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ Phần dung dịch sau khi thâm tích sẽ được đông khô để thu được enzyme amylase bán thô dạng bột 5 : Dich trich enzyme

trong túi thâm tích

Máy khuấy từ

Hình 2.3 Quy trình hoạt động của túi thâm tích trên máy khuấy từ

se Hột sen lột xong ngầm trong nước 2 và 4 ngày:

Hình 2.4 Hột sen nầy mầm sau khi ngâm -Qui trình hoàn toàn giống với qui trình trên nhưng chỉ khác là chúng ta lột hột sen và ngâm nó trong nước 2 ngày và 4 ngày sau đó tiến hành trích

> Đo hàm lượng protein tổng số bằng phương phap Folin— Lowry: nhằm xác định lượng chế phẩm enzyme cần thiết để thu được các dịch trích enzyme

có nông độ bằng nhau

a Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn:

Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 — 0,4 mg/ml tir dung dich protein géc (BSA 1 mg/ml NaCl 0,9%) sau d6 cho thém các hoá chất vào 7 ống nghiệm theo bảng sau (Bảng 3.1)

Bảng 2.1 Bảng xây dựng đường chuẩn theo phương pháp Folin - Lowry

Ông nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nong dé dung dich (mg/ml) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,30 0,35 0,40 Thé tich dd protein chuan (ul) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Thé tich dd NaOH 0,01N (ul) 1000 950 900 850 800 750 700 650 600 Thé tich dd kiém (C) (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 05 05 05 05 05 05 05 05 0,5

b Chuẩn bị dung dịch phân tích:

Lay 0,5ml dung dịch enzyme amylase thô trích được (pha nồng độ 1 mg/ml

trong NaOH 0,01N) cho vào ống nghiệm, cho thêm 5,5ml dung dịch C Lắc đều, dé

ở nhiệt độ phòng 10 phút Tiếp tục cho thêm 0,5ml thuốc thử Folin 0,5N rồi lắc đều,

dung dịch chứa protein sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh biến (Hình 2.5) , dé

yên 30 phút và đo trên máy quang phô ở bước sóng 750nm

Hình 2.5 Màu xanh biến của dung dịch protein trong thuốc thử Folin

e Ghi nhận kết quả:

- Ghi nhận khối lượng enzyme trích được

- Ghi nhận giá trị độ hấp thu của dung dịch phân tích, từ đó suy ra nồng độ protein trong mẫu phân tích đựa vào đường chuẩn

- Từ kết quả đọc được trên máy, ta xác định được nồng độ protein có trong các chế phẩm enzyme phân tích, qua đó pha được các dịch trích enzyme có nồng độ bằng nhau

- Số liệu ghi nhận được thống kê bằng phần mềm MSTATC, phân tích

phương sai theo ANOVA, kiểm định bang Duncan

2.2.2 Thí nghiệm 2: So sánh hoạt tính của enzyme amylase trích từ hột sen không ngâm, ngâm 2 và ngâm 4 ngày

* Mục đích: Nhằm tìm ra 1 enzyme vừa trích trong 3 enzyme amylase trích

từ hột sen xem enzyme amylase nào có hoạt tính cao nhất từ đó áp đụng qui trình trích và sử dụng enzyme tốt nhất sử dụng để làm thí nghiệm tiếp theo, đánh giá enzyme amylase trích từ hột sen ở ngày thứ mấy sẽ có hình thành enzyme nhiều nhất

t=30°C Phản ứng thủy phân hô tính bột f—— Hô tính bột 1%

Sau 30, 60, 90 giây cho 1ml HCl 0,25M

Hình 2.6 Sơ đồ so sánh hoạt tính enzyme amylase

băng phản ứng thủy phân tỉnh bột

- Lay cae wiau uicu ue Cau sau uv Ue DIá Ong HƯỚC 11uời NaC] 0,99%

với nồng độ 1mg/ml Ta có các enzyme có nồng độ 1mg/ml làm chuẩn, để pha nhỏ nồng độ tiếp theo Sau khi chuẩn bị mẫu enzyme tiếp tục lấy 11 ống nghiệm và các

hóa chất như: HCI 0,25M, nước cất, dung dịch đệm pH=7 Sau đó tiến hành thí

nghiệm

Các nghiệm thức là chế phẩm enzyme trích từ hột sen với hột sen tươi

thương phẩm (sau khi rụng cánh hoa 25 ngày) không ngâm, ngâm 2 ngày và ngâm 4

ngày Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại, 3 nghiệm thức,

số đơn vị thí nghiệm = 3 x 3 = 9 đơn vị thí nghiệm

Phản ứng thủy phân được thực hiện bằng cách lần lượt cho vào ống nghiệm 1,15ml dung dịch đệm pH=7, thêm vào 200uml hồ tỉnh bột nồng độ (1mg/ml 152) Tiến hành thủy phân tinh bột bằng 1ml enzyme amylase (1 mg/ml, NaCl 0,9%) 6

nhiệt độ phòng (30°C) Sau thời gian 30, 60, 90 giây thì thêm 1ml HCI 0,25M để dừng phản ứng Cho vào dung dịch trên 20uml dung dịch iodine 10mM, lắc kĩ trên máy lắc rồi để yên 10 phút Tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 570nm Mẫu chuẩn để chỉnh máy quang phố được đo bằng cách cho vào cuvette 1,25 ml dung dịch đệm pH=7 và 0,25 ml HO Hoạt tính của enzyme được tính bằng tốc độ thủy phân tinh bột bằng cách so sánh với đường chuẩn

Đường chuẩn thê hiện quá trình thủy phân tinh bột xây dựng với dãy nồng độ tinh bột: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 va 1 (mg/ml) Cho vao ống nghiệm 1,15 ml dung dich

đệm pH=7, thêm 200u1 hồ tỉnh bột với nồng độ tương ứng, thêm 1ml nước và 1ml

HCI 0,25M để có lượng thể tích tương đương khi thực hiện phản ứng thủy phân Sau d6 20ul dung dich iodine 10mM dugc thêm vào để tạo màu xanh, lắc kỹ trên máy lắc rồi để yên 10 phút Cho mẫu vào cuvetfte và tiến hành đo độ hấp thụ ở bước

sóng 570nm Sử dụng mẫu chuẩn để chính máy đo quang phô với 1,25 ml dung dịch

đệm pH=7 và 0,25 ml nước cất

e Ghỉ nhận kết quả:

- Độ hấp thụ của dung dịch trong ống nghiệm so với đường chuẩn, tính nồng

độ tinh bột bị thủy phân

- So sánh hoạt tính giữa các mẫu enzyme trích được

- Số liệu ghi nhận được thống kê bằng phần mềm MSTATC, phân tích

phương sai theo ANOVA, kiểm định bằng Duncan

“ SDS-PAGE (gel polyacrylamide):

Nguyên tắc hoạt động của SDS-PAGE: SDS-PAGE là kỹ thuật điện di trên

gel polyacrylamide khi có sự hiện diện Sodium DodecylSulfate (SDS), đây là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa mercaptoethanol hay dithithreiol (DTT) sẽ khử

các cầu nối đisulfite Điều đó có nghĩa là các tiêu đơn vị protein trong hỗn hợp

protein có cùng mật độ điện tích và cùng chạy trong một điện trường như nhau Như vậy tốc độ di chuyển trong điện trường của protein phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử thành phần và độ sạch của các chế phẩm protein sau quá trình tinh sạch trong thực tế để xác định trọng lượng phân tử của một protein người ta thường

so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, đây là hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau mà ta đã biết

Gel điện di gồm hai lớp

Lớp gel tập trung (Stacking gel): nằm ở trên giúp tập trung protein lại tạo thành một băng, lớp gel tập trung này có kích thước lỗ rất lớn (4% acrylamide) cho phép protein di chuyển nhanh và tập trung lại dưới tác động của điện trường

Lớp gel phân tích (Separating gel) nằm ở đưới giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử

Trong quá trình điện di ta sẽ thấy vạch màu xanh đó chính là màu của

bromophenol chất này có trọng lượng phân tử rất nhỏ (500Da), được xem như là

chất chỉ thị cho biết điểm dừng của quá trình điện di Và để thấy được các vạch

protein được phân tách thì ta phải nhuộm bằng chất nhuộm Coomassie brilliant blue

2.2.3 Thi Nghiém 3: Khao sat sy ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của

enzyme amylase trích từ hột sen

e Mục đích:

Thí nghiệm nhằm tìm ra nhiệt độ mà enzyme amylase sẽ hoạt động mạnh

nhất, để thủy phân lượng tỉnh bột có trong chế phẩm nhiều nhất Thí nghiệm cũng

nhằm kiểm tra xem enzyme amylase trích từ hột sen sẽ hoạt động mạnh nhất ở nhiệt

độ nào và có khác gì với các mẫu enzyme trích từ nguyên liệu khác Từ đó rút ra nhiệt độ tối thích cho enzyme trích từ hột sen

- Thí nghiệm được thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại, mỗi mức

nhiệt độ là một nghiệm thức qua 3 mốc thời gian 30, 60, 90 giây Số đơn vị thí

nghiệm = 3 x 6 x 3 x 2 = 108

a Khao sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ ở pH=7 đến hoạt tinh cia enzyme

amylase trich tir hot sen

- Phản ứng thủy phân được thực hiện bằng cách lần lượt cho vào ống nghiệm

1,15ml dung dịch đệm pH=7, thêm vào 200uml hồ tinh bột nồng độ 1mg/ml (1%) Tiến hành thủy phân tinh bột bằng 1ml enzyme amylase (1mg/ml, NaCl 0,9 %) theo cdc nhiét dd 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C Sau thdi gian 30, 60, 90 gidy thi

thêm 1ml HCI 0,25M để dừng phản ứng Cho vào dung dịch trên 20uml dung dịch

iodine 10mM, lắc kĩ trên máy lắc rồi để yên 10 phút Tiến hành đo độ hấp thu ở

bước sóng 570nm Mẫu chuẩn để chỉnh máy quang phố được đo bằng cách cho vào cuvette 1,25 ml dung dịch đệm pH=7 và 0,25ml HO Hoạt tính của enzyme được tính bằng tốc độ thủy phân tinh bột bằng cách so sánh với đường chuẩn tính lượng

tỉnh bột bị thủy phân

Hình 2.7 Màu của ïiod

wii tinh hat trang

30, 60, 90 giây

{

Đo ở bướcc sóng 570nm, so với đường chuẩn

để xác định lượng tỉnh bột bị thủy phân

Độ hap thụ của các dung dịch phân tích tương ứng với các nhiệt độ được

khảo sát Từ đó tính nồng độ tinh bột bị thủy phân (%)

Chọn nhiệt độ tối thích đề tiến hành thí nghiệm tiếp theo

Số liệu ghi nhận được thống kê bằng phần mềm MSTATC, phân tích phương

sai theo ANOVA, kiểm định bằng Duncan