bước đầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật và ly trích enzyme để chuyển hóa lipid

Vào những năm 1960, tổng enzyme bán được chỉ có vài triệu đô la hàng năm, nhưng đến nay thị trường đã phát triển ngoạn mục do những hiểu biết về sản xuất chất xúc tác sinh học và quá trì

BO GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG ĐẠI HỌC CÂN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYEN NGANH CONG NGHỆ HÓA HOC

DE TAI:

BUOC DAU NGHIEN CUU NUOI CAY VI SINH

VAT VA LY TRICH ENZYME DE CHUYEN HOA

LIPID

ThS NGUYÊN THỊ PHI OANH MSSV: 2041670

LÊ THỊ THÙY LINH MSSV: 2041638

CÀN THƠ, THÁNG 12 NĂM 2008

@

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin chân thành gửi lời cảm tạ và lòng biết ơn sâu sắc đến:

Thầy Lê Thanh Phước đã hướng dẫn, truyền thụ kinh nghiệm và những tri thức khoa học, tạo điều kiện tốt giúp em hòan thành luận văn tốt nghiệp

Cô Nguyễn Thị Phi Oanh đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức ban đầu

về đề tài và tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Chúng em xin chân thành cám ơn các thay, cô ở bộ môn Hóa và bộ môn Sinh, khoa Khoa Học, trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ chúng em về phương tiện nghiên

cứu cũng như kiến thức

Chân thành cám ơn thầy Chon, anh chi 6 b6 mon Sinh - Hoa, khoa Nông Nghiệp, trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng em hoàn thành luận văn

Chúng em xin cảm ơn cô Thoa và các anh, chị học viên cao học đang làm việc tại

phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, khoa Khoa Học đã giúp đỡ chúng em trong quá

trình thực hiện đề tài

Và người mà chúng em ngàn lần biết ơn đó là cha mẹ, người luôn sát cánh động viên

và tạo mọi điêu kiện thuận lợi cho chúng em hoàn thành luận văn

Cần Thơ, Ngày 27 tháng 11 năm 2008

Đào Thị Phương Thảo Lê Thị Thùy Linh

LOI CAM TA

MUC LUC

DANH SACH BANG

DANH SÁCH HÌNH

TÓM LƯỢC

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐIỀ - G11 T111 TT T11 T1 HT cưng Tàn 1

Chuong 2: LUQC KHAO TALI LIEU .ccccssecssessssessseesseesseeeseeeseeeseecueeeseecneeeseeeseeeneen 3

T GiG1 thi@u lipase 3

IÑẽ mm 3

L2 Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân với lipase - 4

I.3 Phương pháp tách và làm sạch lipase trong nghiên cứu 4

I.4 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzym . - 7

i8mión 8

II.1 Khái niệm - CS net 8 TT.2 Phan 1oat cccccccccccccccccccccccceecccccccccccecescccceuueucccccceceeeesescceeuuuacccccceeeeeeseeeeaaas 8 IL.3 Tính chất vật lý và hóa học của lipid ¿- - < s+s+x+k+eerreeeererereee 9 II Nguyên liệu sản xuất một số lipase quan trọng 2 s-s+c+s+s+zsxxrxee 15 iiNNEI g1 — 17

i88 acc 18

iIiENiôtu ¿8a , n 18

IV Ứng dụng của lipase - S111 E111 HH1 11T 011 1x, 23 IV.1 Lipase trong công nghiệp chất tây rửa - set ckeEerrkerererkee 23 IV.2 Lipase trong công nghiệp thực phẩm . - + 2 2 s+szxxzszxxzszxd 23 IV.3 Lipase trong công nghiệp giấy . -5- 2s rrkererrerrrereee 23 IV.4 Lipase trong tong hợp hữu CƠ - + k‡EsEx+kEESEEkEESEkrkeEerkrkrrererkee 24

IÑ 30 cii-án i83 4n 1-0 — 25 L1 Địa điểm thu mẫu và thời gian thí nghiệm 2 2s 2+s+szxszsxx2 25 I.2 Nguyên lIỆU - - Ă S SH HH HH vn 25

I3 Dụng cụ và thiết bị, - 5 sex EE TT EE TT ckrrrkrkee 27

II.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu - 2- <2 s+2zEE+E£EeEE+EeEerererrsrereee 28 II.2 Nuôi cấy vi sinh vật đất - c1 HT 1H11 rkeg 30 II.3 Khảo sát sự chuyển hóa của lipid với xúc tác lipase -s- 38 II.4 Kết tủa lipase thôÔ - sESkSkEESk SE EETkEEEE TT HT TH TH re rrep 39

Chương 4: KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 2 ©5< 2S SEEESEEEErEerrkrrersees 41

I Kiểm tra chất lượng nguyên liệu - ktsTtckEE SE tr re rkeg 41

II Sự hiện diện của vi sinh vật thủy phân dầu trong đẤT, SG c cu 43

II.1 Sự sinh trưởng của vi sinh đất trong môi trường lỏng khi có hoặc không có

jxẽ 43

IL2.Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường agar có hoặc không có dầu

HH TH nọ nọ cọ c1 c9 c0 91 90 ĐT c9 9 90 c8 47 II3 Định lượng acid sinh ra do sự thủy phân dầu từ lipase của vi sinh vật .49

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ, - 5< SEEE SE EEEEEEEEEEErEEExrkrkerxrereerrved 66

0 66

II ĐỀ nghị, - -G- HxT1E1 1 11111111 111 TT TT TT HH TT net 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO

- 000 -

Bang 1: M6t sé ngu6n enzym va enzym quan tTỌng +2 2s 2+s+s+x+Ezxzzxzzszxez 16 Bảng 2: Kết quả dùng KOH để trung hòa acid béo tự do trong đầu . -s-s¿ 41 Bảng 3: Thể tích HCI 0.1 M để trung hòa KOH 0.1 N thừa - 5-55 scssrsrexerred 41 Bảng 4: Thể tích Na;SzO; 0.01N dùng đề chuẩn độ lượng lod thừa -. 42

Bảng 5: Tổng hợp chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa và chỉ số lod của các loại đầu 42

Bảng 6: Lượng lipase sinh ra ở các mẫu sau 24 và 48 giờ ¿5< cscsksEsEsEzerkrered 51 Bang 7: Hoat d6 cua lipase do VSV tao ra (U/ ml) khi nuôi cấy trong môi trường có dầu và không dầu sau 24 và 48 giờ oooceccceccsccccsccsssscesssssesscsesscecsecenssceesscstsssetsssstsssensesetsssenseeesees 53 Bang 8: Mat s6 VSV theo thời gian (OD 600 nm)) - +ss+x+E+E+x+xerrkreererereerxred 55 Bảng 9: Hoạt độ của enzyme trong phản ứng thủy phân sau 30 phút - - 56

Bang 10: Thể tích NaOH 0,05 M dùng đề chuẩn độ các mẫu nuôi cây với các loại dầu S089 0089011 0110077 57

Bảng I1: Hoạt độ của enzyme trong phản ứng thủy phân sau 60 phút - - - - 57

Bang 12: Thé tich NaOH 0.05 M dung để chuẩn độ các loại dầu và hoạt độ của lipase ngoại bào sau 30 phÚ - - - -Ă Ăn no nọ HH 58 Bảng 13: Họat tính của lipase ngoại bào theo thời gian được định lượng bằng NaOH 00 59

Bảng 14: Họat độ lipase ngoại bào theo thời Ø1an - - - - -S cv nsseersseeeerre 59 Bang 15 : Giá trị R; của các vết châm của dầu 1 ở các thời điểm khảo sát 62

Bang 16 : Giá trị R; của các vết chấm của dầu 1b ở các thời điểm khảo sát 62

Bang 17 : Giá trị R; của các vết chấm của dầu 2 ở các thời điểm khảo sát 63

Bảng 18 : Giá trị R; của các vét cham của dầu 4 ở các thời điểm khảo sát 63 Bang 19: Ham lượng lipase ngoại bào thô thu được ở các mẫu -. 2 2 2s se: 64 Bảng 20: Hoạt độ của lipase thô ngoại bào sau 30 phúTt - 5c Ăn esirsrrss 64

DANH SACH HINH ANH

Hình 2: Sự sinh trưởng của VSV ở đất chưa nhiễm dầu ở Côn Âu, Cần Thơ khi nuôi trong

môi trường có các loại dầu đã sử dụng - «+ sx+kEkEk SE EEEEEEEEkEEEErkrkererkrkerered 44 Hình 3: Sự sinh trưởng của VSV ở các mẫu đất Bến Tre khi nuôi trong môi trường dầu

Hình 4: Sự sinh trưởng của VSV ở mẫu đất chưa nhiễm dầu . 2 2 s2 s++s+se¿ 46 Hình 5: sự sinh trưởng của VSV ở các mẫu đất đã nhiễm dầu qua sử dụng trên môi trường

có và không bồ sung dầu đã sử dụng sau 24 giỜ -¿- - 2 5e +kxEEEeEEEEerkrkerkrrred 47 Hình 6: Sự sinh trưởng của VSV đất Côn Âu, Cần Thơ trên môi trường có và không bố sung dầu đã sử dụng sau 244 BÏỜ - «k1 T11 T91 1111131111111 101111 ngưng 48

Hình 7: Sự sinh trưởng của VSV ở các mẫu đất đã nhiễm dầu chưa sử dụng trên môi

trường có và không bố sung dầu đã sử dụng sau 24 giỜ - 52s rEcxersrreereee 49 Hình 8: Màu đối chứng của acid với chất chỉ thị màu heliantin - 2-5 2 s¿¿ 50 Hình 9: Sự chuyển màu trên bề mặt môi trường nuôi cẫy VSV trong các mẫu đất ở Cần

Thơ khi có hoặc không có sự hiện điện của dầu với chất chỉ thị heliantin 51

Hình 10: Sự chuyển màu trên bê mặt môi trường nuôi cây VSV trong các mẫu đất ở Bến

Tre khi có hoặc không có sự hiện diện của dầu với chất chỉ thị heliantin 51

Hình 11: Họat độ của lipase ngoại bào theo thời gian đối với dầu chưa sử dụng 60 Hình 12: Họat độ của lipase ngoai bao theo thời gian đối với dầu đã sử dụng 60 Hình 13: Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng của mẫu nuôi cấy từ dầu chưa sử dụng (dầu

Bước đầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật từ những mẫu đất nhiễm dầu, đầu mỡ

đã qua sử dụng và chưa sử dụng ở hai tỉnh Cần Thơ và Bến Tre để ly trích lipase thô nhằm thực hiện chuyên hóa lipid, chúng tôi nhận thấy hệ vi sinh vật trong các mẫu đất khảo sát có khả năng thủy phân các loại đầu này Tuy nhiên,

hệ vi sinh vật trong các mẫu đất đã nhiễm dầu có khả năng thủy phân dầu cao

hơn hệ vi sinh vật trong các mẫu đất đối chứng Vi sinh vật trong các mẫu đất

có mật sô cao ở 72 giờ khi được nuôi cây trong môi trường có bô sung dâu Trong các mẫu khảo sát, nhìn chung, lipase do vi sinh vật trong các mẫu đất đã nhiễm dầu tông hợp có hoạt tính cao sau 24 giờ nuôi cấy Lipase do vi sinh vật được nuôi trong môi trường có bổ sung dầu tổng hợp vẫn hiện diện trong tế bào (lipase nội bào), một phần được tiết ra môi trường nuôi cấy tham gia vào quá trình thủy phân lipid (lipase ngoại bào) Hàm lượng lipase thô ngoại bào thu được là 20, 29, 24 và 16 mg/ml tương ứng với hoạt độ 56.7, 94,5, 65.0 và 94,5 U/ml khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường có các mẫu dau 1,

4, 2 và Ib, theo thứ tự

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRUONG DAI HOC CAN THO

Chuong 1: DAT VAN DE

Chất xúc tác sinh học - enzyme là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao Với bản chất là protein, enzyme xúc tác các phản ứng đến cùng tạo ra 100% sản phẩm, đồng thời không tạo ra sản phẩm phụ, tốn ít năng lượng nhất và thân thiện với môi trường Ngày nay, gần 4000 enzyme đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó khoảng

200 loại được sử dụng trên thị trường Phần lớn enzyme trong công nghiệp có nguồn gốc

từ vi sinh vật Vào những năm 1960, tổng enzyme bán được chỉ có vài triệu đô la hàng năm, nhưng đến nay thị trường đã phát triển ngoạn mục do những hiểu biết về sản xuất chất xúc tác sinh học và quá trình lên men, các phương pháp ly trích được cải tiễn và nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng cao Hơn nữa, đặc tính xúc tác enzyme không giống nhau,

do đó số enzyme hiện nay có mặt trên thị trường cũng tăng gấp nhiều lần [17]

Trên thế giới, khoảng 60% trong số enzyme công nghiệp được sản xuất ở Châu Âu trong đó 75% của tổng enzyme công nghiệp (gồm cả lipase) có hoạt tính thủy phân [17]

Ở Việt Nam, việc ứng đụng enzyme làm chất xúc tác trong công nghiệp vẫn còn rất mới Trước đây các enzyme thường được trích từ động vật và thực vật nên quy trình sản xuất còn gặp nhiều khó khăn và giá thành khá đắt Trong 30 năm gần đây, các nhà khoa học đã và đang quan tâm đến nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền là enzyme từ vi sinh vật Nguồn enzyme này có những ưu điểm như: vi sinh vật tổng hợp enzyme có tốc

độ sinh trưởng nhanh, enzyme ly trích có hoạt tính cao, nguyên liệu dùng để sản xuất rẻ tiền, dễ kiếm, nuôi cây v1 sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết và có thể thực hiện ở qui

mô công nghiệp

Lipase là một nhóm của enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân của tripglycerol và xúc tác một số phản ứng của transeter hóa dưới những điều kiện nhất định [8] Lipase cũng tham gia vào chu trình hòa tan các chất hữu cơ không hòa tan trong tự nhiên và tổng hợp được những sản phẩm có giá trị cao, có lợi thế hơn những sản phẩm truyền thống Chu kỳ của những vật liệu này gọi là “công nghệ làm sạch”, là những vật liệu tổng hợp sử dụng và tái sử dụng đã và đang mang lại sự gia tăng rất lớn những sản

phẩm dự trữ cần thiết cho những hoạt động của con người Nhóm lipase này tham gia vào

sự chuyển hóa sinh học của những cơ chất ky nước tạo thành những sản phẩm hữu ích Sử dụng những lipase tạo ra từ vi sinh vật để xử lí và phân hủy chất béo và dầu ở dạng thô, được xem là một chiến lược rất thú vị, những sản phẩm mới này có ưu thế trong ứng dụng công nghiệp, nó có khả năng phân hủy mỡ và dầu trong nước thải và khử quá trình xử lí

sơ bộ [18]

Trong những năm gần đây, lipase được sử dụng nhiều trong công nghiệp như: bột

giặt, công nghiệp giấy, tổng hợp chất hữu cơ Trong tương lai, triển vọng ứng dụng các thuộc tính vốn có của lipase sẽ được phát huy xa hơn nhờ vào thành tựu của công nghệ sinh học và công nghệ hóa học

Lipase có nguồn ốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật, tuy nhiên phần lớn các lipase thương mại thì có nguồn gốc tir vi sinh vat (R.Sharma et al, 2001) Cac vi sinh vat tổng hợp lipase hiện diện trong nước thải công nghiệp, trong đất ở những nơi sản xuất đầu

ăn, đất nhiễm dau (Sztajer et a/., 1998) Trong môi trường đất, vi sinh vật có khả năng tổng hợp lipase rất phô biến (W.H Ko, LT.Wang & P.J Ann, 2005), đây là nguồn nguyên

liệu rẻ tiền và dễ tìm

Với những ưu điểm và khả năng ứng dụng của lipase, mục tiêu của đề tài là: “Bước

đầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật đất dé ly trích lipase và thực hiện chuyển hóa lipiđ”

Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Chọn lọc và gia tăng mật số vi sinh vật phân hủy dầu từ những nguồn đất nhiễm dầu - dầu mỡ đã qua sử dụng và chưa sử dụng

- Xác dinh thoi gian nuôi cây đạt mật số vi sinh vật cao nhất

- Xác định lipase do vi sinh vật tổng hợp đề thủy phân chất béo là lipase nội bào hay

ngoại bào

- Khảo sát phản ứng thủy phân từ nguồn lipase thu được

- Ly trích lipase thô từ nguồn vi sinh vật đã nuôi cây

- Thực hiện sự chuyển hóa lipid từ chế phẩm lipase thô thu được

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

L Giới thiệu lipase

1.1 Lipase

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase) 14 nhom enzyme xúc tác phản ứng thủy phân

triacylglycerols thành diacylglycerols, monoacylglycerols, các acid béo và glycerol ở bề

mặt phân cách pha giữa nước và lipid Lipase xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết ester trong phân tử mà không cắt đứt cả ba liên kết ester cùng một lúc Một vài lipase không có tính đặc hiệu, chúng xúc tác phản ứng ở tất cả các vị trí trong

triacylglycerols Phần lớn lipases có tính đặc hiệu và tính chọn lọc, các enzyme này xúc

tác phản ứng bằng cách bám vào các vị trí đặc biệt trên phân tử [7]

Phản ứng thủy phân với xúc tác lipase có thể làm dịch chuyển phản ứng thủy phân của liên kết glycerol ester và tổng hợp những glycerol ester Phản ứng được minh họa như sau: [8]

Lipase Esterification

———— Oo R,COOH + R,0H —ˆ^ R,COOR, + H,0O

Lipase có thể xúc tác phản ứng thuận nghịch để hình thành các sản phẩm khác nhau

Hiểu được cơ chế hoạt động của lipase giúp chúng ta có thê kiếm soát được sản phẩm tạo

ra đê đạt hiệu suất cao nhất

1.2 Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân với lipase [6]

a Ưu điểm

- Do lipase có tính đặc hiệu cao nên không tạo thành sản phẩm phụ, dịch thủy phân thu được có độ thuần khiết cao

- Phản ứng thủy phân bởi enzyme tiến hành ở nhiệt độ thấp và pH cao, nghĩa là ở

điều kiện tạo thành rất ít tạp chất Do đó vừa giảm được yêu cầu về độ thuần khiết của

nguyên liệu, vừa có hiệu xuất cao

- Khi thủy phân bằng enzyme còn cho phép điều chỉnh được thành phần hóa học

của sản phẩm

- Lipase cé thé thủy phân trong điều kiện nồng độ cơ chất rất cao do đó giảm được

chi phi hoi

b Nhược điểm

- Thời gian thủy phân của lipase dài hơn so với acid

- Dung địch do lipase thủy phân thường khó lọc hơn khi thủy phân bằng acid, do

có chu kỳ sản xuất kéo dài

- Muốn có hiệu suất cao và chất lượng sản phẩm tốt phải có chế phẩm enzyme tinh

khiết

1.3 Phương pháp tách và làm sạch lipase trong nghiên cứu [19]

Enzyme là một loại protein tông hợp trong tế bào Phần lớn chúng tồn tại trong tế

bào do các enzyme thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào Ly trích enzyme ra khỏi tế bảo rất khó bởi vì: Hàm lượng enzyme trong tế bào sinh vật không

lớn so với các thành phần khác Do đó việc tách để thu nhận thành phân nhỏ này là điều

rất khó Hơn nữa enzyme là chất hữu cơ không bên, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, pH Do bản chất là protein, enzyme thường liên kết với những loại protein khác không có thuộc tính của một enzyme nhưng các protein này lại có đặc tính lý hóa tương tự enzyme

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

Như vậy việc ly trích enzyme là làm sao loại được các protein không phải enzyme,

nước, và các thành phần khác của tế bào ra khỏi enzyme Một trong những phương pháp tinh sạch enzyme hiện nay được sử dụng:

a Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH, làm biến tính chọn lọc các

loại protein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt Ở điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp, enzyme sẽ bị biến tính Sau đó bằng phương pháp ly

tâm hoặc phương pháp lọc ta có thê loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta

mong muốn

b Phương pháp kết tủa phân đoạn

Trong các phương pháp tinh sạch enzyme, phương pháp kết tủa là hữu đụng nhất

và phù hợp với các qui mô sản xuất lớn và nhỏ Phương pháp kết tủa gồm có 4 loại: kết tủa bằng các dung dịch muối, kết tủa bằng dung môi hữu cơ, kết tủa với sự thay đổi pH,

và kết tủa bằng dung môi nước polymer

% Kết tủa bằng dung dịch muối

Ở nồng độ muối thích hợp, tính tan trong nước của các phân tử kích thước lớn tương

tự các protein tăng Hơn nữa, khi tăng nồng độ muối sẽ làm kết tủa protein

Dung dịch muối phụ thuộc vào pH và nhiệt độ Các enzyme hòa tan ít nhất quanh điểm đẳng điện của chúng và một ít hòa tan thấp hơn trong dung dịch đệm, nói cách khác

là trong sự có mặt của muối Về nhiệt độ, các protein nhìn chung kết tủa ở nhiệt độ cao trong dung dịch đệm

Các muối được dùng để kết tủa enzyme như: (NHạ)sSO¿; NazSOx; K;SOa;

MpgSO¿ .sự hòa tan của các loại muối này phụ thuộc vào nhiệt độ và các loại muối không ảnh hưởng đến thuộc tính tự nhiên của enzyme

Dựa vào khả năng kết tủa của các enzyme ở các nồng độ muối khác nhau, người ta thường sử dụng (NH„);SO¿ để kết tủa phân đoạn enzyme Ngoải ra một số dung môi hữu

cơ được sử dụng để kết tủa enzyme Phương pháp kết tủa này thường làm enzyme biến tính rất nhanh Vì thế trước khi tiễn hành kết tủa, người ta phải làm sạch các chất kết tủa

va ca dung dịch enzyme (NH¿);SO¿ có hiệu quả nhất cho quá trình kết tủa do chúng có

thé hoa tan 6 bat ky nhiét d6 nado va gid thanh lai thap (NH,)2SO, ciing hitu ich cho tinh

bền cdc enzyme

Quá trình kết tủa bằng dung môi

Nước có thể hòa tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, isopropanol và acetone

Sự hòa tan của các enzyme kết tủa là do sự kết tủa của các dung môi nước chứa chất không dẫn điện và nói cách khác nước hình thành quanh các protein Các dung môi hữu

cơ có thể làm dịch chuyền các lipid lân cận đến một protein Quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ bị ảnh bởi nhiệt độ, liên kết ion và pH của dung dịch đệm

Các protein phố biến được kết tủa khoảng 40% trong rượu, nhưng protein với bề mặt

ky nước như lipase thì tan với ở những điều kiện sau: Nồng độ rượu từ 80 — 90% là cần thiết cho quá trình kết tủa lipase Nồng độ protein cao hơn 1 mg/ml va dung dịch đệm

thấp hơn 50 mM Dung dịch và dung môi hữu cơ được giữ ẫm và hỗn hợp được giữ dưới

0°C trong quá trình thêm dung môi hữu cơ

* Quá trình kết tủa bằng cách thay đổi pH

Có hai cách kết tủa bởi sự thay đổi pH, kết tủa ở điểm đắng điện và kết tủa thuộc

tính acid Tuy nhiên, kết tủa thuộc tính acid chỉ thích hợp cho những protein bên, các protein thô thì không bền trong giới hạn acid

* Quá trình kết tủa bằng dung dịch nước polymer

Quá trình kết tủa bằng dung địch nước polymer là một phương pháp đơn giản cho sự kết tủa và sự kết dính của protein Nhiều protein dễ kết tủa khi có sự hiện diện của các dung dich nudc polymer khéng ion nhu polyethylene glycerol (PEG 2000, 4000, 6000),

methyl celluso, polyvinyl alcohol (PVA) va dextrans (DEX)

Các dung môi nước polymer có khả năng lấy nước từ xung quanh các protein Các

protein liên kết với các polymer bằng liên kết hydro, và sau đó hỗn hợp kết tủa như một

chất răn hoặc đôi khi là một chất sên sệt

c Phương pháp hấp thụ chọn lọc

Chất hấp thụ có thể được cho trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho dung dịch enzyme chạy qua một cột có chứa chất hấp thụ Chất hấp thụ thường sử dụng là hydroxyapatie Bằng phương pháp này, có thể hoặc hấp thụ enzyme hoặc hấp thụ protein

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

Nhựa trao đổi ion Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose,

dietylamino-etyl-cellulose (DEAE -— cellulose) Hoặc Sephadex, dẫn xuất của polysaccaride dextran

Hiện nay chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme Do đó việc làm sạch enzyme chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn

các phương pháp riêng, kết hợp với nhau, tạo ra một hệ thống gồm các phương pháp nối

tiếp nhau hài hòa nhất

1.4 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ của chúng Enzyme không thể được định lượng trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian

phản ứng Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phương pháp

sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme:

- Tiến hành đo lượng cơ chat bi mat di hay lugng san pham duoc tao thanh sau mot thời gian nhất định và lượng enzyme được xác định trước Phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác

- Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất

định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định

- Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biên đôi nhât định về cơ chât hay sản phâm

II Lipid

II.1 Khái niệm

Lipid hay chất béo là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phố biến trong tế bào động vật và thực vật Các lipid có thành phần hóa học và cấu tạo khác nhau nhưng chúng có những đặc tính chung là không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ (ete, cloroform, bezen, toluen ) Lipid là một trong những thành phân cấu tạo quan trọng của màng tế bào cũng như các bảo quan trong tế bào Ngoài ra, lipid còn là nguồn cung cấp năng lượng, nguồn cung cấp vitamin A, D, E, K và F cho cơ thể [6]

H2 Phân loại

Dựa vào thành phần cấu tạo, có thê chia lipid thành hai nhóm [6]

H.2.1 Lipid đơn giản: là ester của rượu với acid béo

H.2.1.1 Gjycerid: Là ester của rượu glycerol và acid béo, là mỡ dự trữ phố biến ở động vật và thực vật

Glycerol: 1a triol không màu, vị ngọt, và nhờn Khi đốt glycerol hay lipid có chứa

glycerol với chất hút nước sẽ tạo acrolein có mùi khét

Acid béo: acid béo thường gặp là những acid béo có số carbon chăn, mạch thắng, có thể no hay không no và chuỗi C xếp theo hình chữ chỉ

Tuy nhiên cũng có những acid béo ngoài nhóm chức acid còn chứa những nhóm chức

khác như rượu, cetone, mạch carbon có vòng hay nhánh

1I.2.1.2 Cerid: là ester của rượu và acid béo, nhiệt độ thường ở thê rắn, có ở

động thực vật, ở thực vật nó thường tạo thành một lớp mỏng phủ lên lá, thân, quả của cây

Cerid có công thức tổng quát là: R - O — C - O—R

Rượu trong cerid là rượu cao phân tử, chỉ chứa một nhóm OH, mạnh C không phân nhánh, rất ít khi mạch C có vòng (Rượu cetol)

Sap ong, sap ca voi (spermaceti) la ester của rượu cetol và palmitic acid

Ngoài ra trong sáp ong va sap ca voi còn có rượu tự do, acid béo tự do va

hydrocarbon

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

11.2.1.3 Sterid: 1a ester cua rugu sterol và acid béo Rượu sterol có vòng và trọng

lượng phân tử rất lớn, sterol tiêu biểu là cholesterol, acid mật Acid béo thường là palmitic, oleic, ricinoleic

11.2.2 Lipid phire tap:

Trong phân tử lipid phức tạp ngoài acid béo và rượu còn có các thành phần khác như acid phosphoric, bazơ, nitơ, đường Một số lipid phức tạp gồm: glycerophospholipid (phosphatid), sphingophospholipid, glycolipid

11.3 Tinh chat vat ly va hoa hoc cia lipid [6]

c Tinh hoa tan

Trong nước, acid béo có chuối C ngắn (4,6,8) dễ tan, C¡ọ khó tan, C¡› không tan Nếu acid béo ở dạng muối thi dé héa tan hon

Trong các dung môi hữu không phân cực như benzen, ether, ether đầu hoả acid béo

dễ tan Tuy nhiên trong dung môi hữu cơ phân cực như aceton, acid béo khó hoà tan hay hoà tan rất ít

Có thé ding phan img nay dé xác định số nối đôi trong phân tử acid béo Phản ứng

dễ dàng hay khó xảy ra tuỳ thuộc vào vị trí nối đôi đối với nhóm carboxyl, nối đôi càng gần nhóm carboxyl phản ứng càng khó xảy ra

Đề xác định số nối đôi người ta căn cứ vào chỉ số Iod

Chi sé Iod: là số gam lod cần thiết để tác dụng lên 100 gam chất béo Do đó chỉ sỗ

lod càng lớn thì số nối đôi càng nhiều

c Sự thuỷ phân:

Ester khi thuỷ phân sẽ tạo thành rượu glycerol và acid béo Tác nhân thủy phân là acid, kiềm, nước hay enzyme

* Thủy phân bằng nước cần nhiệt độ và áp suất cao

* Thủy phân bằng kiềm: NaOH hay KOH

Chỉ số xà phòng hoá: là số mg KOH cân để trung hoà 1 g chất béo Chỉ số xà phòng càng lớn thì độ dai mạch càng ngăn, nên được dùng để xác định độ dài của mạch C Ngoài ra để xác định tính chất của chất béo người ta còn căn cứ vào một số chỉ số khác như chỉ số acid

Chỉ số acid: là số mg KOH dùng để trung hoà tất cả acid béo tự do có trong 1 g chất béo

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRUONG DAI HOC CAN THG

H.3.3 Sự chuyển hóa của lipid dưới xúc tác lipase

H.3.3.1 Phan ứng thủy phan

1 Ý nghĩa của phản ứng thủy phân

Phản ứng thủy phân là phán ứng rất phố biến và rất quan trọng trong bảo quản và

sản xuất thực phẩm Do phản ứng thủy phân mà chất lượng các sản phẩm thực phẩm bi

giảm đi, tuy nhiên phản ứng thủy phân cũng làm tăng phẩm chất cho thành phẩm Qua

phản ứng thủy phân, không những chỉ các tính chất cảm quan mà các tính chất hóa học của sản phẩm cũng có thê bị biến đổi

- Phản ứng thủy phân thường mở đầu cho một loạt các phản ứng khác tiếp diễn Các phản ứng khác có thể xảy ra khi phản ứng thủy phân đã kết thúc

- Về mặt sinh học, phản ứng thủy phân thường đặc trưng cho giai đoạn phân giải, là giai đoạn kết cùng của một quá trình sinh học

- Trong sản xuất thực phẩm, phản ứng thủy phân có vai trò rất quan trọng Đề giảm bớt sự tổn thất phẩm chất thực phẩm, người ta phải tìm những biện pháp kỹ thuật tương ứng để ngăn ngừa và hạn chế các phản ứng thủy phân Trái lại, qua phản ứng thủy phân

mà chất lượng thành phẩm tăng lên thì người ta phải tạo điều kiện cho các phản ứng xảy

ra đến tận cùng [6]

2 Đặc điểm của các cơ chất bị enzyme thủy phân

- Các cơ chất được enzyme thủy phân thường là chất đạm (protein), tỉnh bột

(glucid), chat béo (lipid), v.v

- Theo Bernard Pullman va Alberte Pullman, dic diém chung của những cơ chất này

là có “ liên kết bị thủy phân” do các nguyên tử tích điện đương tạo nên Người ta gọi liên

kết này là “ liên kết nhị đương”

- Sự thủy phân bởi enzyme sẽ càng dễ dàng khi sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân càng lớn [6]

3 Đặc điểm chung của tâm hoạt động của enzyme thủy phân

- Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại Như vậy bắt buộc tâm hoạt động của chúng phải có các gốc acid amine đặc hiệu

- Tâm hoạt động của enzyme hydrolase thường chứa nhóm 1midazol của histidin và

nhóm hydroxyl của một trong sô các gôc serIn

- Do cấu trúc bậc ba của phân tử protein —- enzym mà nhĩm hydroxyl của serin và

vịng imiđazol của histidin gần gũi nhau Khi đĩ giữa nhĩm hydroxyl của serin và nguyên

tử nitơ bậc ba của imidazol tạo thành liên kết hidro Nhờ thế oxy của nhĩm hydroxyl thu

được tính chất ái nhân và cĩ thể tương tác được với liên kết nhị dương của các cơ chất

[6]

4 Co ché tac dung ciia enzyme hydrolase

- Tâm ái nhân của enzyme sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai nguyên tử tích

điện đương của liên kết bị thủy phân

- Enzyme làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đĩ, bằng cách tạo thành

liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần với liên kết bị thủy phân

- Do cấu trúc bậc ba của phân tử protein-enzyme mà nhĩm hydroxyl của serin và vịng imidazol của histidin gần nhau Khi đĩ giữa nhĩm hydroxyl của serin và nguyên tử nitơ bậc ba của nhân imidazol tạo thành liên kết hydro và oxy của nhĩm hydroxyl thu được tính chất ái nhân và cĩ thể tương tác được với liên kết nhị dương của các cơ chất.[6]

5 Một số đặc điểm của phản ứng do enzyme xúc tác

Cochắ + nướ —— > saơ pha

Sơ đồ phản ứng cho thấy phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng lưỡng phân Nhưng vì nồng độ của nước rất lớn coi như khơng thay đổi trong suốt thời gian phản ứng,

do đĩ vận tốc của phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất Như vậy, phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng đơn phân và bậc nhất

b Yếu tố điều chỉnh

- Đối với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước khơng những là mơi trường để

khuếch tán enzyme và cơ chất mà cịn là tác nhân tham gia vào phản ứng

- Nước khơng những ảnh hưởng đến vận tốc mà cá chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Do đĩ nước được dùng để tăng cường hay kiềm hãm các phản ứng thủy

phân cĩ xúc tác enzyme

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

- Nhiệt độ và pH cũng có thể điều chỉnh các phản ứng thủy phân bởi enzyme Mỗi

enzyme thủy phân có một nhiệt độ và pH tối ưu riêng do đó chiều của phản ứng thủy phân

có thể kiểm soát được bởi nhiệt độ và pH [6]

H.3.3.2 Phản ứng biến đối dầu và mỡ động, thực vật

1 Ester hóa

- Enzyme xúc tác phản ứng ester hóa đã được ứng dụng phô biến trong công nghiệp như cải biến chất lượng dầu mỡ động, thực vật đáp ứng nhu cầu sản phẩm tinh sạch, ít hóa chất phục vụ cho con người Tương tự những chất xúc tác khác, enzym cũng ảnh hưởng đến chiều phản ứng, và được xác định bằng nhiệt động học của phản ứng Ví dụ cân băng của phán ứng đưới xúc tác nhóm hydrolase khi thay đổi nồng độ tác nhân và lượng nước thì cân bằng cũng thay đổi theo

- Vai ester quan trong la glycerides c6 mat trong dầu mỡ động, thực vật được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và những ngành công nghiệp khác Enzymes, đặc biệt

là lipase, có nhiều mục đích sử dụng trong việc xử lí và chế biến dầu mỡ động, thực vật Những thuận lợi gần đây trong nghiên cứu thực phẩm, quan trọng nhất là các acid béo không bão hòa và nguy cơ bị isomer hóa dạng cis thành trans trong quá trình hydro hóa dầu thực vật thúc đây các quá trình sinh học phát triển cắt đứt mạch dầu thực vật Sự thay đối một số acid béo của triglycerides từ những loại đầu khác nhau, nhằm biến tính chất lý- hóa và dinh dưỡng, vị ngon của nguyên liệu Ví dụ việc chọn những lipase cho vị trí 1 và

3 trên mạch glycerol thì rất thuận lợi, vì hầu hết những triglycerides quan trọng có trong

bơ cocoa chứa các acid palmitic hoặc strearic 6 vi tri 1 va 3, va acid oleic 6 vi tri 2, va phản ứng ester hóa giữa các phân tử bằng xúc tác hóa học không thê thực hiện được Nó chỉ thực hiện xúc tác tồn tại dưới dạng mono- và diplycerides, có thể sử dụng những enzyme đặc biệt này để di chuyên nhóm acyl và có thể sản xuất triglycerides từ glycerol

và các acid béo tự do str dung lipase đặc hiệu cho vi tri 1, 3

- Phản ứng ester hóa bằng xúc tác lipase được ứng dụng đề tổng hợp một số ester từ dầu và acid béo tương ứng, như tổng hợp ester sáp được sử dụng trong sản xuất mỹ phẩm

[13]

R,-C-O-R, + R;-C-O-R, ———> R,-C-O-R; + R, - È—O-R®

- Các phản ứng đều tạo thành hợp chất trung gian acyl-enzyme bằng sự tác kích ái nhân Sự khác nhau lớn nhất giữa phản ứng acidolysis và interesterification là phản ứng

thủy phân phải thay đôi vị trí ái nhân đầu tiên, sau đó tác kích vào acyl-enzyme tạo thành

một phần acyl của ester mới [13]

- Trong điều chế tổng hợp nhiên liệu sinh học, biodiezel Lipase được sử dụng như chất xúc tác cho phản ứng transester hóa dầu mỡ động, thực vật Lipase xúc tác tổng hợp

những ester đơn giản từ những nguồn lipid khác nhau đưới điều kiện có hoặc không có

dung môi hữu cơ Trước đây việc sản xuất những ankyl ester này là sử đụng chất xúc tác hóa học như acid, base Nhưng các phương pháp này tồn tại nhiều hạn chế như sự phục héi glycerin và loại bỏ xúc tác rất khó khăn, và phá hủy một số sản phẩm phụ có giá trị nhu tocopherol, tocotrienol va nhttng lipid nhay cam khác như DHA (Docosahexaenoic acid), EPA, acid linoleic Cho nén chất xúc tác sinh học, lipase, đã được ứng dụng vào công nghiệp với qui mô lớn để sản xuất những ankyl ester này bằng phương pháp transester hóa [15]

* Các yêu tổ ảnh hưởng đến quá trình transester hóa bằng xúc tác lipase

- Nguồn alkyl có vai trò quan trọng trong động học phản ứng khi sử dụng enzyme

làm xúc tác

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRUONG DAI HOC CAN THG

- Nước có vai trò rất khác nhau trong môi trường phản ứng cũng như đóng vai trò rất quan trọng trong câu trúc không gian của protein, và hòa tan tốt chất răn Sự hiện điện của nước rất quan trọng cho cả độ bền nhiệt và hoạt tính của enzyme, làm tăng tính dẻo và

hoạt tính của enzyme Lượng nước có mặt trong môi trường phản ứng phải có một giới

[15]

III Nguyên liệu sản xuất một số lipase quan trong

Enzyme có ban chất là protein và chúng chỉ được tổng hợp bằng con đường sinh học Do đó, muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận chúng từ cơ thể sinh vật Tất cả các tế bào của động vật, thực vật và vi sinh vật có enzyme nhưng mức

độ enzyme ở từng loại thì khác nhau cho từng loại tế bảo

Có những sinh vật tổng hợp ra một loại enzyme rất mạnh, sinh vật khác có khả năng tong hop enzyme đó yếu nhưng có khả năng tông hợp enzyme khác rất mạnh Ngay trong một cơ thể đa bào cũng có những cơ quan tổng hợp ra những enzyme khác nhau Do đó việc xác định loài sinh vật và cơ quan tổng hợp ra một loại enzyme mà ta đang cần cho những mục đích ứng dụng cụ thể là điều rất cần thiết

Bán chất của enzyme là protein có hoạt tính xúc tác sinh học và được sinh vật tổng hợp Động vật, thực vật và vi sinh vật là những giới sinh vật đều có khả năng tổng hợp

enzyme va déu là nguồn cung cap enzyme Tuy nhiên giữa chúng có điêm khác biệt rât

Mã sô Nguôn Nội bào, | dé

enzyme enzyme ngoại bào | sản

xuât Nguôn động vật

1 Catalase 1.11.1.6 Gan động vật | Nội bào - Thực phâm

2 Chymotrypsin | 3.4.21.1 Tuy tang Ngoại bào - Thuộc da

3 Lipase 3.1.1.3 Tuy tang Ngoại bào - Thực phẩm

4 Rennet 3.4.23.4 Da múi khế | Ngoại bào + Phô mai

độngvật

5 Trypsin 3.4.21.4 Tuy tang Ngoai bao + | Thudc da

Nguôn thực vật

6 Actinidin 3.4.22.14 | Trai Kiwi Ngoại bào - Thực phâm

7 œ-Amylase 3.2.1.1 Malt Ngoại bào | +++|[ Bia

8 B-Amylase 3.2.1.2 Malt Ngoai bao | +++) Bia

9 Bromelin 3.4.22.4 Dịch dứa Ngoại bào - Bia

10 B-Glucanase 3.2.1.6 Malt Ngoại bào ++ | Bia

11 Ficin 3.4.22.3 Mu sung Ngoại bảo - Bia

12 1.13.11.2 | Đậu nành Nội bào - Thực phẩm

LV TOT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÂN THƠ

13 Lipoxygenase | 3.4.22.2 Mu du du Ngoai bao | ++ | Thit

Papain

Nguôn vi khuan

14 œ-Amylase 3.2.11 Bacillus sp Ngoai bao | +++ | Tinh bột

15 B-Amylase 3.2.1.2 Bacilius sp Ngoại bảo + Tình bột

16 Asparaginase 3.5.1.1 E.coli Nội bào - Sức khỏe

17 Glucose 5.3.1.1 Bacillus sp Nội bào ++ | Sirofruco

somerase

18 | Penecillin 3.5.1.11 Bacillus sp Nội bào - Dược

amidase

19 | Protontin 3.4.21.14 | Bacillus sp Ngoại bào | +++ | Chat tay rửa

20 Pollulanase 3.2.1.41 Klobalolla Ngoại bào - Tinh bot

Hiện nay người ta ly trích va tinh sach lipase tir ba nguồn co ban:

HI.1 Nguồn lipase từ động vật

Ở động vật, không phải tế bảo nào cũng có khả năng tạo ra những enzyme mà ta

mong muốn

Hiện nay, người ta chỉ mới ly trích enzyme từ các tuyến dịch hoặc những cơ quan trực tiếp, hoặc gián tiếp vào quá trình tiêu hóa của động vật Enzyme được khai thác chủ yếu là nhóm protease, có hoạt tính khá cao và ôn định Mặc dù có hoạt tính cao nhưng

việc ly trích rất khó khăn

- Do mục tiêu của chăn nuôi là lay thịt, sữa, da và do việc lay enzyme chi la phu

nên không thê có trường hợp chăn nuôi chỉ lẫy enzyme Enzyme chỉ chiếm một lượng nhỏ

trong sản phẩm của ngành chăn nuôi

-_ Hiện nay, chưa có một nghiên cứu tạo giống động vật nào nhằm vào mục tiêu tạo enzyme protease mạnh dùng trong công nghiệp thực phẩm Người ta coi enzyme như là một phần đương nhiên trong thu nhận sinh khối từ chăn nuôi

HI.2 Nguồn lipase từ thực vật

Ta có thể khai thác và thu nhận enzyme amilaza từ mầm lúa, papain từ nhựa quả đu

đủ hoặc bromelin từ khóm

HIL.3 Nguồn lipase tir vi sinh vat (VSV)

Trong ba nguồn sinh vật có thể li trich enzyme thi VSV được sử dụng nhiều nhất

Hiện nay, các enzyme được trích từ VSV đã và đang được ứng dụng rất nhiều trong đời sống và sản xuất

VSV có nhiều đặc điểm khác cơ thể động vật và thực vật Điểm khác lớn nhất ở cơ thé VSV la chúng thuộc cơ thể đơn bào Chính vì chúng được cầu tạo từ một tế bào nên chúng có những tính chất chuyên biệt Ví dụ, sự trao đối chất giữa tế bào VSV và môi trường xung quanh là trao đổi trực tiếp Do đó VSV thường có khả năng thích ứng nhanh với sự thay đôi của môi trường sông

HI.3.1 Điều kiện sinh trưởng và phát triển VSV

3.1.1 Điều kiện sinh trướng

Môi trường dinh đưỡng của VSV bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết khác nhau Thành phần các chất đinh dưỡng này tùy thuộc vào nhu cầu cân thiết của từng loại VSV, từng yêu cầu nghiên cứu Nhìn chung các nguyên tố không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của VSV là C, H, N và các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu,

Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I

- Nguôn nỉtơ: VSV cần nitơ ở nhiều dạng khác nhau Một số VSV cố định đạm có khả năng nhận nitơ từ không khí nên chúng không cần cung cấp nitơ trong quá trình nuôi cấy Phần lớn VSV trong tự nhiên không có khả năng này do đó khi nuôi cẫy các VSV này, chúng ta cần cung cấp nitơ vào môi trường nuôi cấy

- Nguồn carbon:

VSV rất cần carbon đề tổng hợp các chất khác nhau cho tế bào

- Nguồn khoáng và các chất sinh trưởng:

Các chất khoáng vi lượng cần thiết với số lượng rất nhỏ Tuy số lượng ít nhưng các chất khoáng rất quan trọng vì chúng đóng vai trò giữ pH môi trường ổn định

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

s% Độ ấm

Ngoài các nguồn trên, VSV cũng có nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh

lý, sinh hóa của tế bào, bao gồm: hàm lượng nước của sản phẩm và độ âm tương

đối của không khí

Nước trong sản phẩm bao gồm phần nước liên kết và phần nước không liên kết (nước tự do) VSV chỉ sử dụng được phân nước tự đo có trong sản phẩm và cũng chỉ phần nước này thực hiện sự trao đổi qua lại với nước có trong không khí

Độ ẩm không khí là tỉ lệ phần trăm hơi nước của không khí ở nhiệt độ nhất

định với lượng hơi nước bảo hòa của không khí ở nhiệt độ đó

Nhiệt độ

Khả năng hấp thụ hay thoát hơi nước của sản phẩm đều có liên quan đến nhiệt

độ của môi trường phần lớn VSV có khoảng nhiệt độ thích hợp là 15 — 30°C [4]

II.3.2 Quá trình trao đối chất của VSV

Trong quá trình trao đổi chất với môi trường bên ngoài, VSV biểu hiện quá trình đồng hóa và dị hóa rõ hơn ở động vật và thực vật Để thực hiện quá trình đồng hóa và đị hóa đó, VSV sẽ tổng hợp ra những enzyme tương ứng:

- Các enzyme đồng hóa được tổng hợp trong tế bào và chỉ thực hiện các hoạt động đồng hóa xảy ra trong tế bảo

- Cac enzyme đị hóa được tông hợp trong tế bào nhưng có thể hoạt động trong tế bào và ngoài tế bào gọi là enzyme nội bảo (endoenzyme) hay ngoại bào (exoenzyme)

Enzyme nội bào còn bao hàm cả các loại enzyme tham gia tổng hợp, enzyme

tham gia quá trình oxy hóa và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất trong tế

bào

Phân lớn những enzyme ngoại bảo thuộc enzyme cảm ứng Do đó việc điều

khiến sinh tổng hợp enzyme này ta áp dụng quy luật cảm ứng sẽ thu được kết quả như mong muôn

HI.3.3 Ưu điểm của VSV so với động vật

So với nguồn khai thác enzyme từ động vật thực vật, nguồn enzyme từ VSV có nhiều ưu điểm quan trọng sau

e VSV có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn Do đó, cường độ các phản ứng sinh hóa xảy ra rất mạnh, nghĩa là độ sinh tổng hợp enzyme và hoạt tính của các enzyme rất mạnh Cường độ phản ứng của các enzyme từ VSV vượt xa rất nhiều so với cường độ phản ứng của các enzyme từ các nguồn sinh vật khác Ví dụ, trong 24 giờ, VSV có thể chuyển hóa một thức ăn gấp 30 — 40 lần so với trọng lượng tế bảo của chúng Trong khi

đó hệ enzyme tiêu hóa của con lợn trong một ngày chỉ chuyên hóa được 3 — 4 kg thức ăn

e Hé enzyme cia VSV vô cùng phong phú Cùng một lúc ta có thể khai thác nhiều loại enzyme khác nhau và cũng có thể thu được một số enzyme chuyên biệt

e_ Việc cải tạo giống VSV, để tạo ra được những chủng có khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme theo ý muốn có thê được thực hiện trong một thời gian ngăn Trong khi việc cai tao gidng động vật và thực vật đòi hỏi một thời gian dài

e_ Khi sinh vật có cường độ sinh sản mạnh, trong một thời gian ngắn ta có thể thu nhận được một lượng sinh khối lớn Do đó, với một quy mô nhất định và trong một thời gian ngắn ta có thể thu nhận được một lượng enzyme rất lớn Trong một số trường hợp ta

có thể dùng sinh khối như là một nguồn enzyme dùng cho sản xuất mà không cần qua tinh

chế

e VSV không đòi hỏi nghiêm ngặt do đó ta có thé dé dang tim kiém nguyên liệu dùng

để sản xuất chế pham enzyme tir VSV Trong rất nhiều trường hợp, nguồn nguyên liệu

dùng để nuôi cây VSV thu nhận enzyme hòan toàn không phải là nguyên liệu thực phẩm cho người, thậm chí dùng cả phế liệu trong nông nghiệp, công nghiệp để sản xuất enzyme

từ VSV Điều này giúp ta thu nhận được nguồn lợi lớn trong sản xuất

Sản xuất enzyme từ VSV hoàn toàn có thể thực hiện theo qui mô công nghiệp Khi

enzyme tham gia vào phản ứng phân giải một cơ chất nào đó thì khi có sự hiện diện của

cơ chất trong môi trường nuôi cấy, lượng enzyme này được tổng hợp cao rất nhiều lần so với độ trung bình khi không có cơ chất, được gọi là enzyme cảm ứng Chúng thuộc loại

nhóm enzyme thủy phân và enzyme di hóa Những chất được đưa vào môi trường để

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

kích thích quá trình tổng hợp ra enzyme cảm ứng gọi là cơ chất cảm ứng Muốn điều

khiển quá trình sinh tong hop enzyme bằng cơ chất cảm ứng phải chú ý đến hai điểm sau:

+ Muốn thu nhận enzyme cảm ứng nào thi phải cho cơ chất cảm ứng của enzyme

đó vào môi trường Ví dụ như muốn nhận lipase thì cho lipid (chất béo), muốn nhận

protease thi phai cho protein,

+ Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao khi ở một liều lượng nhất định nào đó

e Công nghệ sản xuất enzyme từ VSV có thê tiễn hành tự động hóa và cơ giới hóa [1]

HI.3.4 Cơ chế hoạt động của enzyme VSV

Gen điều khiển Gen tổng hợp 1 2 3 4

Sơ đô1: Quá trình điều khiển sinh tong hop enzyme cam ing

Khi không có cơ chất, chất ức chế có trong tế bào sẽ tương tác với gen điều khiến, toàn bộ quá trình tổng hợp enzyme sẽ không hoạt động

Khi cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất ức chế, gen điều khiển thoát khỏi sự ức chế của chất ức chế và do đó gen tổng hợp enzyme tương ứng với cơ chất sẽ hoạt động, enzyme được tổng hợp sẽ phân hủy cơ chất Đến khi cơ chất bị enzyme phân hủy hết, chất ức chế sẽ không bị bất hoạt và trở lại tương tác, kết quả là gen tổng hợp enzyme không hoạt động, quá trình tổng hợp bị ngưng trệ Như vậy, muốn

enzyme được tổng hợp ta phải luôn cho vào môi trường lên men cơ chất cảm ứng với liều

lượng phù hợp Đồng thời pH môi trường, nhiệt độ, hoạt tính của nước và nhu cầu oxygen cũng phải được điều chỉnh và bổ xung hợp lý

Ở động vật và thực vật, việc thu enzyme phụ thuộc vào các cơ quan có chứa enzyme Ngược lại, ở VSV người ta có thé thu enzyme ở dạng thô lỏng (từ quá trình nuôi cây chìm) Dịch nuôi cây chủ yêu chứa enzyme ngoại bào và có thê thu chê phâm enzyme

Trang 21

thô dạng răn (từ nuôi cây bề mặt trên môi trường bán rắn) Chế phẩm này không chỉ chứa

enzyme ngoại bào mà còn chứa cá enzyme nội bào Sau khi thu được chế phẩm enzyme dạng thô (dạng lỏng hay dạng rắn), người ta tiến hành tinh chế chúng và thu được enzyme

ở dạng tinh khiết hơn Tùy theo mục đích sử dụng ma ngudi ta str dung enzyme ở đạng

Nguôn enzyme Chế phẩm Nguôn enzyme

tir thire vat —— enzyme thé thu <——~ thđộng vật

> nhận ————*_ Ứng dụng chế

Kết quả pham enzyme

Thu hae kếtquả —> Ungdung

enzyme enzyme thô

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

IV Ung dung cia lipase [17]

Lipase duoc st dung rong rai trong qua trinh ché bién dau mé, chất tây rửa và chất khử dầu mỡ, chế biến thực phẩm, tổng hợp các chất hóa học và dược phẩm, sản xuất giấy, và sản xuất mỹ phẩm (Rubin & Dennis, 1997a, b; Kazkauskas & Bornscheuer,

1998)

IV.1 Lipase trong công nghiệp chất tây rửa

Do khả năng của chúng là thủy phân các chất béo, lipase được ứng dụng như là chất phụ gia trong công nghiệp bột giặt và các bột giặt ở hộ gia đình Các lipase được chọn lọc đặc biệt theo yêu cầu: (1) một cơ chất đặc biệt thấp, có khả năng thủy phân chất béo của các hợp chất khác nhau; (2) có khả năng chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt tương đối quá trình giặt (pH 10- 11, 30 — 60°C); (3) khả năng chống lại các chất hoạt động bề mặt có hại và các enzyme, là các chất có thành phân quan trọng của công thức bột giặt

IV.2 Lipase trong công nghiệp thực phẩm

Dâu mỡ là thành phần quan trọng của thực phẩm Giá trị dinh dưỡng, cảm quan và các thuộc tính vật lý của triglycerides bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố như: vị trí của acid béo trong mạch chính của glycerol, chiều dài chuỗi của acid béo, và độ chưa bão

Tính chất của lipid có thể được thay đối băng cách thay đổi vị trí của các chuỗi acid béo

trong glycerol

IV.3 Lipase trong công nghiệp giấy

“Hắc ín” hoặc những thành phần ky nước của gỗ (chủ yếu là các triplycerides và sáp); là nguyên nhân của các vẫn đề bột giấy và sản xuất giẫy Lipase được dùng để loại

bỏ hắc ín trong bột giấy để sản xuất giấy Công ty Nippan, Nhật Bản đã phát triển một phương pháp điều khiển hắc ín là việc sử dụng lipase từ nẫm Cønđida rugosa đã thủy phân đến 90% các triglycerides trong gỗ

IV.4 Lipase trong tong hop hiru co

Việc sử dụng các lipase trong tổng hợp các chất hữu cơ trở nên ngày một quan trọng Lĩnh vực chính của lipase được dùng để xúc tác trong hóa hữu cơ có nguồn gốc từ VSV Những enzyme này hoạt động ở bề mặt ưa nước — ky nước và các dung môi hữu

cơ không bị phản ứng trong phản ứng hóa học Việc sử dụng lipase trong tổng hợp các

hợp chất đã được khảo sát bởi Berglund & Hutt (2000)

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

Chuong 3: PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP

NGHIEN CUU

I Phuong tién nghién ciru

I 1 Địa điểm — thời gian

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, bộ môn Sinh Học, khoa Khoa Học, trường Đại Học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện: 15/08/08 — 31/10/08

L2 Nguyên liệu

1 Lipid (dầu)

Thí nghiệm trên 3 loại dầu

- Dầu olive mua ở các siêu thị, kí hiệu: (2)

- Dầu dừa có nguồn gốc ở Bến Tre

Dau dira được lấy ở 2 cơ sở khác nhau:

> Cơ sở ở phường 7- khu phố 2, kí hiệu: (1a)

> Cơ sở ở phường 7- khu phố 3, kí hiệu: (1b)

- Dầu đã qua sử dụng được mua ở Cần Thơ

Có 3 loại dầu đã qua sử dụng:

> Dâu chiên cá ở nhà ăn sinh viên Dai Hoc Can Thơ, kí hiệu:(1)

> Dâu chiên chuối ở cổng C Dai Học Cần Thơ, và đường 3/2, kí hiệu: (2), (3)

> Dâu chiên vịt ở đường Trần Văn Hoài, kí hiệu: (4)

> Mỗi điểm lây ở 3 vị trí

- _ Nơi tiếp xúc với đầu nhiều

- _ Cách nơi tiếp xúc khoảng 30 — 50 cm

- Cách nơi tiếp xúc dầu 3 m

> Cho đất vào mâm trộn đều (để đất khô tự nhiên trong bóng tối nếu đất còn

+ Ký hiệu đất nhiễm dầu từng vị trí

Dầu

STT Địa điểm thu mẫu Nhiễm Không Ký hiệu mẫu

nhiễm

1: dầu nhà ăn Đại Học Cần Thơ

2: dầu chiên chuối công C Đại Học Cần Thơ

3: dầu chiên chuối đường 3/2

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

4: dầu chiên vịt đường Trần Văn Hoài

la: dầu dừa ở khu phố 2, Bến Tre

1b: dầu dừa ở khu phố 3, Bến Tre

2: dầu olive

I.3 Dụng cụ và trang thiết bị

= Tu cay vo tring (Laminar flow, Viét Nam )

" Nồi khử trùng nhiệt ướt (t = 120°C; P = 1 bar) HVE — 50

= May ly tam (Centrifuge model, Trung Quốc)

" Máy ly tâm lạnh (Hettich zentaifuge D 78532 Tuttlingen, Đức)

= Tu say (Memmer, Đức)

" Tủ ủ(Memmer, Đức)

" Micropipette 20, 100, 200, 1000, 5000 kl

= Tim hut

= May do pH (Thermo election corporation, My)

= May nghiền tế bào băng sóng siêu âm (Branson Sonifier 150, Đức)

= May do quang phé (Pharmacia LKB- Ultrospec Plus Spectrophotometer, M¥)

" Cân phân tich (Mettler Toler, Switzerland)

= May loc ap suat thap

" Thiết bị đông khô (ILSHIN, Hàn Quốc)

" Ông chuẩn buret

= May khuay tir (Magnetic stirrer SM1, UK)

= May lac

= Ong mao quan

1.4 Héa chat

- (NH,),SO,, K,HPO,, MgSO,.7H,O, nam men, CaCO;, agar (Prolabo, EC),

chat chong nam Cycloheximide, Sigma

- Tween 80, NaOH 0.05 N, KOH 0.05 N, dung dich I, 0.1 N trong alcol 95°, NayS»03 0.1 N, HCl 0.1 N, acid oxalic, ethanol, diethyl ete, ete dầu hỏa, H,SO, dam dac,

acid acetic, CaCl

- Chat chi thi mau: Heliantin, phenolphtalein

- Nuédc cat, gidy loc, gidy sac ky ban mong (Merck)

H Phương pháp nghiên cứu

-_ ILI Kiểm tra chất lượng nguyên liệu

Dùng một bình tam giác 100 ml cho vào 5 ml alcol tuyệt đối và 5 ml eter (theo ti 1é

1:1) cho thêm vào bình này 2 — 3 giot phenolphthalein va ding dung dich KOH 0.05 N trong alcol dé trung hòa hỗn hợp đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Sau đó thêm vào hỗn hợp vừa trung hòa 0.3 g dầu tương ứng Trung hòa hỗn hợp này bằng dung dịch KOH 0.05 N trong alcol cho tới khi có màu hồng bền vững sau 30 phút

LV TOT NGHIEP DAI HOC TRƯỜNG DAI HOC CAN THƠ

Lắc đều và để yên trong tối 30 phút, sau đó chuân độ bằng Na;SzO; 0.01 N đến khi

có màu hồng vàng sậm, thêm I- 2 giọt tinh bột 1% Nếu có màu xanh xuất hiện thì tiếp tục chuẩn độ cho tới khi xuất hiện màu vàng rơm rất nhạt

Cho chất cần thử kết hợp với một lượng KOH thừa để xà phòng hóa tất cả các chất

béo Phần KOH thừa được định lượng bằng một dung dịch acid chuẩn, với

phenolphthalein làm chất chỉ thị

% Tiến hành

Bình tam giác 1: 0.3 g đầu tương ứng + 8 ml dd KOH 0.1 N trong alcol

Bình tam giác 2: 0.3 g nuéc + 8 ml dd KOH 0.1 N trong alcol

Tiến hành đun cách thủy 2 bình trong 30 phút Khi dung dịch trong suốt, để nguội, thêm vào mỗi bình 2 ml nước và 2 giọt phenolphthalein, dung dịch sẽ có màu hồng, sau

đó chuân độ dung dịch với HCI 0.1 N đến khi dung dịch mất màu, ta xác địng được thể

tích HCI đã sử dụng

+ Kết quả được tính theo công thức:

1 ml KOH 0.1N tuong tmg 5.6 mg KOH

a : thể tích dung địch HCI 0.1N (ml) dùng để chuẩn độ bình thử không

b: thể tích dung dịch HCI 0.1N (ml) dùng để chuẩn độ bình thử thật

m: khối lượng chất béo (ø)

H.2 Nuôi cay VSV

1 Môi trường nuôi cấy lỏng

% Nguyên liệu

e (NH, )aSOa 0.5%