xây dựng phương pháp xác định hàm lượng glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y

Chính vì vậy, đề tài “ Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y ” được thực hiện.. Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phâ

BQ GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HQC CAN THO KHOA CONG NGHE

wee LUD ee ex

LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLUATARALDEHYDE TRONG NGUYEN LIEU

VA THANH PHAM THUOC THU Y

CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN

Ths NGUYÊN PHƯƠNG HAI DANG MINH THANH

MSSV: 2082237 LOP CONG NGHE HOA K34

Sant: ho, thang 5 nam 2012

WHS

Qua quá trình thực hiện luận văn này, tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và những kỹ năng thực hành rất bổ ích Đó chính là nhờ sự giúp đỡ nhiệt tình của gia đình, thầy cô và bạn bè Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Chú Nguyễn Phương Hải đã động viên, giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện tốt nhất cả về vật chất lẫn tinh thần giúp tôi hoàn thành luận văn này

Các anh chị phòng thí nghiệm hoá lý, Công ty Vemedim đã luôn động viên, giúp đỡ, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống cũng như trong học tập

Tất cả quỷ thầy cô bộ môn Công nghệ Hoá, khoa Công nghệ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức vô cùng bồ ích trong học tập và nghiên cứu

Gia đình đã luôn ủng hộ, động viên và chăm lo cho tôi cá về vật chất lẫn tinh

thần

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Hóa Học K34

đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cần Thơ, tháng 5 năm 2012

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Cần Thơ, Ngày .Tháng Năm

Giáo Viên Hướng Dần

Can Thơ, Ngày Thang Nam

Giao Vién Phan Bién

TOM TAT DE TAI

WHog

Glutaraldehyde được rất nhiều công ty về lĩnh vực chăn nuôi thú y sử dụng cho các chế phẩm thuốc sát trùng, đặc biệt là dùng vệ sinh chuồng trại và tiêu diệt vi khuẩn Gluataraldehyde có khả năng giết chết tế bảo rất nhanh, có khả năng diệt

khuẩn phổ rộng Vì vậy việc định lượng glutaraldehyde là rất cần thiết Có nhiều

phương pháp định lượng glutaraldehyde, trong đó phương pháp quang phố với ưu

điểm đơn giản, chi phí thấp phù hợp với phòng thí nghiệm sẽ là việc lựa chọn thích

hợp

Mục tiêu của đề tài này là xây dựng phương pháp xác định hàm lượng

Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y, bằng phương pháp quang phố UV-vis Đánh giá và so sánh với các phương pháp định lượng khác đã được công bố

Sau một thời gian thực hiện đề tài kết quả thu được như sau:

È Xây dựng được phương pháp định lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu

và trong thành phẩm bằng phương pháp quang phô UV-Vis Đáp ứng được yêu cầu: đối với nguyên liệu có sai số < 5,0%, Đối với thành phẩm có sai số < 10%

$ Nội dung phương pháp đã xây dựng

e Chuẩn bị dung dịch :

- Dung dich phenol 10% (5g Phenol + ethanol vd 50ml)

- DD acid sulfuric: acid H,SO.dd 98%

- Ethanol nguyén chat

- DD d/c (Glu 0,04%): Lay 1ml Glutaraldehyde chuẩn (100%) + ethanol

vả 50ml Pha loãng 1/50 với cùng dung môi (400mg/L)

e Chuẩn bị mẫu:

Dự đoán sơ bộ hàm lượng Glutaraldehyde trong mau thir dé pha

loảng mẫu sao cho dd mẫu thử có nồng độ ~ 400mg/L

Lay 1ml DD mẫu thử + 3ml DD phenol 10% + 37ml dd acid sulfuric

+ HạO vở 50ml

© Đo phổ:

Set-ref = 482nm, cốc so sánh: mẫu trắng Quét phổ từ 190 — 1100nm

° Doc két qua:

% Tham định lại phương pháp đã xây dựng:

s Độ chọn lọc:

Trung bình Pp chỉ thực hiện được trên những mẫu chỉ có

Glutaraldehyde hay chỉ có các chất không tham gia phản ứng với hỗn hợp

Phenol + acid HạSO„đả

° D6 lap lại: Rất cao RSD = 0.562939%

e Độ đúng: đạt yêu cầu Hệ số tìm lại: Rc = 95,37%

e© Độ tuyến tính: rất cao

+ Hệ số tương quan tuyến tính: R= 0,9990 :

+ Phương trình tương quan tuyến tính: Abs = 0.2014*Cœ¡y + 0.0269

(Co : nồng độ Glutaraldehyde tính theo mol/l)

- Giới hạn phát hiện: rất thấp (Pp rất nhạy)

LOD = 0,45178.10° mol/L hay 0,45mg/L Glutaraldehyde

- Giới hạn định lượng: rất thấp (Pp rất tinh)

LLOQ = 0,53047.10” mol/L > 0,53mg/L Glutaraldehyde

HLOQ = 12.10° mol/L hay > 12mg/L Glutaraldehyde

MUC LUC Vil

DANH MỤC BẢNG - 5+ St 1 1 3 1115111111 01111111 0101121101017 T Hay xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU . - - + sS£SzE£S+E£E+E£z£ezz£: xii

PHAN 1: MO DAU

CHUONG 1: MO DAU .ccssssssssssssssssssssssssssssesosossssssssssssssscscesoroserovessesssssssssececors 1 1.1 DAC VAN DE Luu eececccecccesccccccccscsssesescsssscscscscscscscsessesssssescscscscacececscessssesesseeeseacaes 1 1.2 MUC TIEU YEU CÂU 2-2 S2 E2 S555 EEEEEEEEEEEEEEEE21125E1 11x rsred 2 1.3 ĐỊA ĐIỄM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN . - - - 2 2 2 £s£z£<£s£szs2 2

PHAN 2: TONG QUAN

CHUONG 2: KHÁI QUÁT VÉ GLUTARALDEHYDE 5-5-s-ses 3 2.1 GIỚI THIIỆU .- - ¿2E SE 2E E SE E33 S3 3 313 5151117171111 1 1xx 3

2.3 TÍNH CHẤTT -¿- + +EE S21 192515 1111151511 21E11115 1111111111111 1111211111 xe 6 2.3.1 Tính chất vật lý - + - s3 S333 TT T11 0113031071111 11 11181 6 2.3.2 Tính chất hóa học -. ¿- - SE 5E 1311151111111 1111111151111 111111 xck 6 2.4 ĐIÊU CHÉ GLUTARALDEHYDE 2 - - SES+E£E+E£EeESEEEEEEEEcErkrkrked 10

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GLUTARALDEHYDE 13 3.1 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH . - (2 2E SESEEx SE ExSEEEEEEEErrrrvee 13

Vii

3.1.3 Sắc ký lỏng đầu dò UV (UV-HPL(C) .- + + 255cc +xceceeeree 15 3.1.4 Sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang 2s +s+s+z£s+s£z+s£z£vzzczcee 16 3.2 PHUONG PHAP ĐỊNH LƯỢNG - ¿+ << 2z SEEeESEEEeErErkrkrkrereee 17

3.2.1 Phương pháp Chuẩn độ, .- ¿+ ¿- ¿2® k£E#E£E£E#ESEEEEEEEErkrkrkrered 17

3.2.2 Phương pháp Quang phổ . ¿-¿- - 2 2 2E SE SE SE+E2EEEEcErEvrees 18 3.2.3 Sắc ký lỏng đầu dò UV -Vis - 2< ct S33 131v HH ưc 19 CHƯƠNG 4: THÂM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 21 4.1 GIỚI THIỆU . ©© 2 +6+ẻ 2 % % EẺ EềE4E EES SE E38 E111 311 313 13 tre 21

4.1.1 Mục đích - -c CS HS 00 HH nu ng vv re 21

4.1.2 Nội dungg - + + 2e S4 4 311323 111211711515 1111 1111111111111 1305 01x cx re 21

4.2 PHƯƠNG PHÁP THUC HIEN . 5-5 2222123 SE x22 E22 z zEzrerrred 22

4.2.1 Tính đặc hiệu - ¿E113 SE Ề E3 3 111 1 1 111111111511 1xx rk 22 4.2.2 Độ đúng - Sàn 1112111131101 11 1101111 T1 117111100 23

“E689? vi a 24

4.2.4 Độ tuyến tính - - s3 9H13 3 15151105111 11 1111 rưg 26

4.2.5 Giới hạn phân tích — Khoảng áp dụng Ăn nhe 27

4.2.5.1 Giới hạn phân tíchh - - - << << 5661333114111 3 1 99930 1 1n ng k 27 4.2.5.2 Khoảng áp dụng .- - - - - << SH HH HH ng kà 27

PHẢN 3: THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG 5: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM 5 5 5 5s seseseses 28 5.1 PHƯƠNG PHÁP TIỀN HÀNH . + ©©- + 2 2+8 £E£EeESEE££EzEeErxrkrrrree 28

5.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN - ¿+52 52 S2 2+2 2 2E 2ESESEEErErErsrererereee 28

5.2.1 Hóa chất, thuốc thử . - - + << SE SE S3SESEEEEEEEEEEEESEEEE 11k Ekrkrkred 28 5.2.2 Thiết bị đụng Cụ - << SE E1 1111111 rec 28 5.3 HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM - ¿22 252 S2 2 2 2EvEeEeESErErErkrkrrreerreee 29

Vill

5.3.1 Thí nghiệm về phương pháp quang phô - +22 2 s+s+szszszs¿ 29

5.3.2 Thí nghiệm về nội dung thâm định .- + 2 252 55+e+££z+esecsee 33

5.3.3 Thí nghiệm về đánh giá so sánh phương pháp . 5-5-5 55+ 36

CHƯƠNG 6: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUÁẢ 5-5 5 <cseseses 39 6.1 THÍ NGHIỆM VỀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHÔ 39 6.2 THÍ NGHIỆM VÉ NỘI DUNG THÂM ĐỊNH . 7+ 2 scscxsse2 49 6.3 THÍ NGHIỆM VÉ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIIÁ . 2 5555: 55

37.0 8.9 007) 111777 62 A-KẾT LUẬN - + CS S13 9 1v 3919132111171 1111111511111 1111 111111111111 crrre 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO - Ă <6 SE +3 E SE E8 SE E*ESE SE SE SE sec recep 64

PHU LUC .À G5 2E E922 3915 3 3913211315 1215132111711 1115 1111311120111 1 012 66 PHỤ LỤC 2 ¿G5 S111 E5 1 313 311151111511 21 1111115110111 1511011011111 68

1X

Trang

Hình 2.1: Glutaraldehyde trong thùng 250kg S1 sa 3 Hình 2.2 : chế phẩm VIME-PROTEX của công ty Vemedim 5- -5¿ 4 Hình 2.3: Glutaraldehyde trên thị trường .- - S222 1 121 1335555555111 re 6

Hình 2.4 :Chế phẩm VIME-PROTEX của Vemedim- Việt Nam 11

Hình 2.5 :Chế phẩm VBK của công ty ViBo- Việt Nam + - xxx: 12 Hình 4.1: So sánh độ nhạy của phương pháp bằng đồ thị - 5 5-5-5 5¿ 26 Hình 6.1: Sự phụ thuộc của độ hấp thu (Abs) theo bước sóng (^) 39 Hình 6.2: Sự phụ thuộc của Abs mẫu trắng theo bước sóng (^A) 40 Hình 6.3: Sự phụ thuộc của Abs phức Glu-Phe theo À -« 55s: 41 Hình 6.4: Sự phụ thuộc của Abs phức theo nồng độ % acid H;SO¿, 43 Hình 6.5: Sự phụ thuộc của Abs phức theo nồng độ Phenol - 5-5-5: 44 Hình 6.6: Sự phụ thuộc của Abs phức theo thời gian đo phổ - 5-5-5 45 Hình 6.7: Sự phụ thuộc của Abs phức theo nồng độ Glutaraldehyde 47 Hình 6.8 : Khoảng tuyến tính của nồng độ Glutaraldehyde -.-. ¿- 5-5 5¿ 52 Hình 6.9: LLOQ của Glutaraldehyde trong pp Quang phổ ¿- 55-552 54

Hình 6.10: Kết quả khảo sát mẫu 1 nguyên liệu s2 s£E+ zx£Ezxzxcxrzc: 56

Hình 6.11: Thành phẩm Vime-Protex của công ty vemedim - 5-5-5: 58

Hình 6.12: Kết quả đo mẫu 1 thành phẩm + 2-2-5 S2 S2 S2 E2 £EzEcxd 59

DANH MUC BANG

GICB YC ROC

Bảng 6.1: Kết quả khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo nông độ acid H;SO/, 42

Bảng 6.2: Kết quả khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo nông độ Phenol 44

Bảng 6.3: Kết quả khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo thời gian 45

Bảng 6.4 : Kết quá khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo nông độ Giu 46

Bảng 6.5: Kết quả sự khảo sát độ chọn lọc của phức Glu-Phe - 49

Bảng 6.6: Kết quả sự khảo sát độ lặp lại của phức Glu-Phe .-. - 50

Bảng 6.7: Kết quả sự khảo sát độ đúng của phức Glu-Phe -. 5-5-5 55¿ 51 Bảng 6.8: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phức Glu-Phe - 5s 5£: 52 Bang 6.9: Két quả sự khảo sát độ lặp lại của phức Glu-Phe - 5-55: 53 Bảng 6.10: Kết quả định lượng Glu bằng phương pháp quang phổ 56

Bảng 6.11: Kết quả định lượng nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ 57

Bảng 6.12: Kết quả định lượng thành phẩm bằng phương pháp quang phô 60

Bảng 6.13: Kết quả định lượng thành phẩm bằng phương pháp chuẩn độ 60

Bảng 6.14: So sánh kết quả của 2 pp trên nguyên liệu và thành phẩm 61

XI

VN:OH Thể tích dung dịch NaOH

LOD Giới hạn phát hién- Limit of Quantitation

LLOQ Gidi han dinh lugng dudéi — LLOQ (Low Limit of Quantitation)i

HLOQ Giới hạn định lượng trên

Dd Dam dac

PTN Phong thi nghiém

XI

Phan I: Mở Đầu Chương I: Mở Đầu

Nhưng hiện nay trên thị trường Việt Nam có rất nhiều loại thuốc sát trùng, mỗi loại có tính năng khác nhau, có loại công hiệu với vi sinh vật này mà thuốc khác thì không Một trong những thành phần chính của thuốc sát trùng là Glutaraldehyde

Glutaraldehyde (CzHạO;), với công thức cấu tạo là OHC-CH>-CH,-CH,- CHO, một hợp chất di-dehyde 5 carbon bão hòa, không màu, có mùi cay nông, tan trong dung môi như là nước, ether, cồn, benzen Glutaraldehyde có nhiều tên gọi khác nhau như: 1,5-pentanedial, glutaral, glutardialdehyde

Gluataraldehyde có khả năng giết chết tế bảo rất nhanh, có khả năng diệt khuẩn phổ rộng Trong lĩnh vực chăn nuôi thú y, glutaraldehyde được sử dụng làm thuốc sát trùng phổ rộng, tiêu diệt virus, vi khuẩn nắm gây bệnh cho gia súc, gia cam Dung dịch glutaraldehyde 10—15% được sử dụng trong xử lý nước, khống chế

sự phát triển của vi khuẩn gram âm (-) và gram dương (+), tảo, nắm và cả vi-rút trong nước Ngoài ra, nó còn được sử dụng như là chất cố định bộ phận trong phân tích tế bào dưới kính hiển vi điện tử Nó cũng thường được sử dụng trong ứng dụng sinh hóa thông qua liên kết chéo (crosslinking) và alkyl hoá (alkylating) làm bất hoạt tế bào

Từ những ứng dụng nêu trên, việc định lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y là rất quan trọng Nó giúp cho chúng ta có một cách

sử đụng hợp lý hơn về glutaraldehyde Chính vì vậy, đề tài “ Xây dựng phương

pháp xác định hàm lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y ” được thực hiện

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 1

1.2 MỤC ĐÍCH YÊU CÂU

Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y, bằng phương pháp quang phố UV-vis Danh gia va

so sánh với các phương pháp định lượng khác đã được công bó

1.3 DIA DIEM VA THỜI GIAN THỰC HIỆN

Địa điểm: Phòng thí nghiệm QC thuộc công ty Vemedim, số 7 đường 30/4, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ

Thời gian thực hiện: Từ ngày 13/01/2012 — 13/04/2012

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 2

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khải quát về Giutaraldehyde

Glutaraldehyde sau đó được rất nhiều công ty sử dụng cho các chế phẩm thuốc

sát trùng Đặc biệt là dùng vệ sinh chuông trại và tiêu điệt vi khuẩn

® Sản lượng, quy mô sản xuât

Glutaraldehyde được sản xuất trong nhiều ngành

công nghiệp như:chăn nuôi, thú y, công nghệ ướp xác

Nước sản xuất Glutaraldehyde nhiều nhất là Trung Quốc

với trên 50.000 tắn Chỉ tính riêng sản lượng của Công ty

TNHH Hóa LAOHEKOU Jinghong đã là 5.000 tắn/ năm

Glutaraldehyde

trong thùng 250kg

e Tầm quan trọng

Gluataraldehyde có khả năng giết chết tế bào tất

nhanh, có khả năng diệt khuẩn phô rộng Trong lĩnh vực

chăn nuôi thú y, glutaraldehyde được sử dụng làm thuốc sát trùng phổ rộng, tiêu điệt virus, vi khuân nắm gây bệnh cho gia súc, gia cầm Dung địch glutaraldehyde 10-15% được sử dụng trong xử lý nước, khống chế sự phát triển của vi khuẩn gram

am (-) va gram dương (+), táo, nẫm và cá vi-rút trong nước

Glutaraldehyde còn được sử dụng như là chất cố định bộ phận trong phân tích

tế bào dưới kính hiển vi điện tử Nó cũng thường được sử dụng trong ứng dụng sinh hóa thông qua lién két chéo (crosslinking) va alkyl hoa (alkylating) làm bắt hoạt tế bao

Trong công nghệ làm phim x-ray, glutaraldehyde duoc sir dung lam chất làm cứng để rút ngắn chu kỳ làm khô của phim

Trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy, glutaraldehyde 10-50% được sử dụng làm giảm hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật trong bột giấy

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 3

Trong công nghiệp thuộc đa, gluataraldehyde được sử dụng để làm mềm da và tăng cường khả năng chịu kiềm, nước và nắm mốc Da được ngâm trong dung dịch chứa glutaraldehyde 0,5-2%

Trong công nghiệp mỹ phẩm, glutaraldehyde được sử dụng làm chất bảo quản trong mỹ phẩm ở châu Âu ở nồng độ lên đến 0,1% Nó không được sử đụng trong

các bĩnh xịt và thuốc xịt

Trong lĩnh vực y tế, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng virus HIV, viên gan B (HBV) sẽ dị tiêu diệt hoặc bất hoạt khi bị xử lý glutarldehyde 2% trong 5 phút Trong xử lý nước sinh hoạt, sau nửa giờ xử lý, 99% vi khuẩn Legionella bị tiêu diét

ở nông độ 100 mg/L

Công ty Vemedim Vietnam đã sử dụng

Alkyldimethylbenzylammonium chloride dé tao thanh

chế phẩm dang dung dich VIME-PROTEX rat hiéu qua

trong chăn nuôi gia súc gia cầm Hình 2.2 : chê phâm

VIME-PROTEX của công ty Vemedim

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 4

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khải quát về Giutaraldehyde

se Công thức cầu tạo: H~I.~Í-Ha]a~ _;—H

e© Khối lượng phân tử: 100,12 đvC ñ

s Thành phân nguyên tô:

C: 59,98%; H: 8,05%; O: 31,97%

* Danh pháp IUPAC 1,5-pentancdial

s Tên khác: 1,5-pentanedial, slutaral,

2.3 TINH CHAT [7], [8], [12], [19], [20], [23] = =

- Chat long mau vang - > ™,

Tính chất hóa học của Gilutaraldehyde do

nhóm chức aldehyde quyết định

Tính chất của nhóm aldehyde

Các phản ứng đặc trưng của aldehye gồm:

L/ Tác dung với AgNOVNH; tạo thành muối dạng Amoni.(phản ứng trang gương)

2/ Tac dung voi O2 tao thành acid tương ứng

3/ Tác dụng với Cu(OH)./NaOH tao thanh muối dạng Natri

4/ Tac dung voi KMnO,

5/ Tac dung voi bisulfite

6/ Sự khứ tạo thành nhóm hydrocacbon

Ngoài ra có một số phản ứng của Aldehyde với các thuốc thử đặc biệt, gồm: 7/ Thuốc thử : 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH)

8/ Thuốc thử : 3-nethylbenzonthiazolin-2-one hydrazone

9/ Thuốc thử Hantzsch: điethyl acetonedicarboxylate and ammonia

10/ Thuốc thử : 3,5-điaminobenzonic acid

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khải quát về Giutaraldehyde

Cụ thể các phản ứng như sau:

1) Tac dung với AgNOVNH; tạo thành muối dạng Amoni (phản ứng tráng

Sương)

R-CHO + 2[Ag(NHa);]JOH — R-COONH¿ + 2Ag + 3NH; + HạO

2) Tác dụng với O2 tao thành acid tương ứng :

R-CHO + 1⁄2 O¿ —> R-COOH

3) Tác dụng với Cu(OH)z/NaOH tạo thành mudi dang Natri :

Phản ứng xảy ra trong moi trường kiềm, tạo thành muối Natri

RCHO + 2Cu(OH); + NaOH = RCOONa + Cu,0 + 3H,O

4) Tac dung voi KMnO, :

RCHO + KMnO, — RCOOK + MnO, + H,O

3) Tac dung voi bisulfite :

„=o + Na'HSOy ———* —C{ —S§OsNa” + H;O

6) Sự khử tạo thành nhóm hydrocacbon

> C—H Zn(Hg),Conc.HCl |

7) Tác dụng với thuốc thử2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH)

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid, tạo thành hợp chất glutaral 2,4- dinitrophenylhydrazone, có màu vàng cam Có thể sử dụng phản ứng này cho phuong phap so mau (Colorimetry, Amax = 412 nm)

oe Nims SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 7

8) Tác dụng với Thuốc thử : 3-methylbenzonthiazolin-2-one hydrazone:

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid ở nhiệt độ phòng trong 10 — 30 phút, tạo thành hợp chất có màu xanh

Có thể sử đụng phản ứng này cho phương pháp so mau (Colorimetry, Amax =

— “CHp=COsCoHe HrC2O2C-H,C“ 'NỈ "CH7CO„C

HgC2OyC-HC MHs CHÒ CO ca6 FS2O27“Hv - bạ 2-CO2C2Hs

10) Tác dụng với thuốc thứ : 3,5-diaminobenzonic acid :

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid, đun 50°C trong 30 phút, tạo thành dẫn

xuất với 3,5-điaminobenzonic acid có vàng- xanh

Có thê sử dụng phản ứng này cho phương pháp so mau (Colorimetry, Amax = 405- 495 nm)

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khải quát về Giutaraldehyde

12) Tác dụng thuốc thử : phenol va acid sunfuric

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid mạnh, tạo thành dẫn xuất có màu vàng

Có thể sử dụng phản ứng này cho phương pháp so màu

2.4 ĐIÊU CHẾ GLUTARALDEHYDE [16]

Trong công nghiệp và trong phòng thí nghiệm glutaraldehyde được điều chế

qua 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Từ acrolein kết hợp với vinylethyl ether theo đạng phản ứng Diels-Alder tạo thành 2-ethoxy-3, 4-dihydro-2H-pyran

CHạ = CH - CHO + CHạ = CHOCH;ạCHy ————>

Giai đoạn 2: thủy phân 2-ethoxy-3, 4-dihydro-2H-pyran tạo thành

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khải quát về Giutaraldehyde

Công ty Vemedim — Việt Nam

- Vi khuẩn : E coli, Salmonella, Pasteurella,

mycoplasma, Pseudomonas

- Virus : Bệnh cúm (influenza), Lở mồm long

móng (F.M.D), Gumboro, Dịch tả , Bệnh dại,

* Dùng sát trùng :

- Trại chăn nuôi ( trâu bò, heo, gà, vỊt)

- Dụng cụ chuyên chở gia súc, lò giết mỗ

- Tây trùng thiết bị, dụng cụ đùng trong chăn nuôi

° CÁCH DÙNG:

Liều chung : 1lít pha với 200-500 lít nước

Chai 250ml pha với 50 - 125 lít nước

- Sát trùng trại chăn nuôi : 1:200, phun sương khắp trại hay phương tiện chuyên chở

- Tây trùng thiết bị : 1:500, ngâm dụng cụ

Làm sạch dụng cụ, sau đó dùng thuốc đã pha loãng phun, xịt hoặc ngâm dụng cụ

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 11

e Chế phẩm VBK Công ty ViBo - Việt Nam

Thành phân: Trong 1000ml có:

-Glutaraldehyde 200g

-Alkyldimethylbenzylammonium chloride 150g

se Công dụng:

+ Tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh : Đỏ thân, phát

sáng, mòn đuôi, cụt râu, đôm đen

+ Diệt nắm và các nguyên sinh động vật gây bệnh

cho tôm

+ Ngăn ngừa sự phát triển của các virus gây bệnh:

Đốm trang, dau vang, teo gan

e Cách dùng:

Hình 2.5 : Chế phẩm

VBK của công ty ViBo- Việt Nam

+ Sử dụng: 1 lít VBK/ 5.000-6.000 mỶ nước Dùng tốt nhất khoảng 8- 10 giờ

sáng

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

1/ Nung một khối lượng chính xác (a gam) hợp chất hữu cơ chứa các nguyên

tô C,H,N,O đã được trộn đều với bột CuO

2/ Hấp thụ hơi HạO và khí CO; sinh ra lần lượt bằng H;SO;¿ đặc va KOH Độ

tăng khối lượng của mỗi bình chính là khối lượng HạO và CO; tương ứng

%O = 100% — (%C + %H)

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 13

3.1.2 Phản ứng hóa học

Các phản ứng hóa học đặc trưng của Glutaraldehyde chủ yếu do các

nhóm Aldehyde thê hiện

2/ Tác dụng với Ö; tạo thành acid tương ứng

3/ Tác dụng với Cu(OH);/NaOH tạo thành muối đạng Natri

8/ Thuốc thử : 3-methylbenzonthiazolin-2-one hydrazone

9/ Thuốc thử Hantzsch: diethyl acetonedicarboxylate and ammonia

10/ Thuốc thử : 3,5-điaminobenzonic acid

11/ Thuốc thử : p-aminophenol

12/ Thuốc thử : phenol và acid sunfuric

Điều kiện thực hiện và phương trình phản ứng đã được trình bày ở chương 1

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 14

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

3.1.3 Sắc ký lỏng đầu dò UV (HPLC-UV)

e Nguyên tắc:

(Xem chỉ tiết ở : Lý thuyết HPLC)

- HPLC-UV dựa trên các nguyên tắc sau:

i) Các chất trong mẫu thử hấp phụ lên cột và giải hấp phụ khỏi cột bằng pha động có tính chọn lọc nên thứ tự các chất đi ra khỏi cột khác nhau (tách rời nhau)

ii) Dau đò UV phát hiện các chất có nối đôi liên hợp, vẽ thành các peak theo

thứ tự ra khỏi cột và độ lớn của peak (diện tích peak) tỷ lệ thuận với nồng độ các chất

- Glutaraldehyde không có nối đôi liên hợp nên không thể phát hiện bởi đầu

do UV Do đó phải tạo dẫn xuất với chất có nối đôi liên hợp Việc tạo dẫn xuất dựa

trên phản ứng của nhóm aldehyde với các thuốc thử đặc hiệu

e Các chất tạo dẫn xuất với Glutaraldehyde để chạy được HPLC-UV là: 1) DNPH( 2,4-dinitrophenylhydrazin)

3.1.4 Sắc ký lỏng đầu dò Huỳnh quang

e Nguyên tắc:

(Xem chỉ tiết ở : Lý thuyết HPLC)

- HPLC-FL dựa trên các nguyên tắc sau:

1) Các chất trong mẫu thử hấp phụ lên cột và giải hắp phụ khỏi cột bằng pha động có tính chọn lọc nên thứ tự các chất đi ra khỏi cột khác nhau (tách rời nhau) 2) Đầu đò FL phát hiện các chất có tính phát huỳnh quang, vẽ thành các peak

theo thứ tự ra khỏi cột và độ lớn của peak (diện tích peak) tỷ lệ thuận với nồng độ

các chất

- Glutaraldehyde không có tính phát huỳnh quang, do đó phải tạo dẫn xuất với chất có tính phát huỳnh quang

*® Các chất có tính phát huỳnh quang tạo dẫn xuất được với

Glutaraldehyde để có thể chạy HPLC-EL là:

Diethyl acetonedicarboxylate and ammonia

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 16

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

chất khử, khử nhóm aldehyde về một hợp chất oxime.Số oxi hóa của C giảm.Khi

kết hợp với nhóm aldehyde, nó giải phóng HCI đồng thời dùng NaOH đề chuẩn HCI

sinh ra trong phản ứng

H H

HCl + NaOH — NaCl + H,O

e Thực hiện:

Lấy 4ml mẫu thử vào 100ml Hydroxylamin HCI 7% ( đã được trung hòa

trước đó NH3 đậm đặc với chỉ thị là Bromophenol xanh) Để yên trong 30 phút Thêm 20ml ether dầu hỏa ( có phân đoạn sôi 40 — 60°C) Chuan d6 bang dung dich NaOH 1M cho đến khi màu của lớp nước tương đương với màu của dung dich Hydroxylamin HCI 7% đã được trung hòa trước đó

1ml dd NaOH TẤM x 50,05mg Glutaraldehyde (CzHsO;)

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 17

3.2.2 Phương pháp Quang phố

Trong công thức phân tử Glutaraldehyde không có nối đôi liên hợp nên không

có hấp thu cực đại trong vùng bước sóng UV-Vis hay phát huỳnh quang

Để có thê định lượng được bằng phương pháp quang phổ cần phải tạo dẫn xuất của Glutaraldehyde với các chất có nhiều nối đôi liên hợp Tùy theo tính chất của

các dẫn xuất này mà ta có phương pháp quang phô UV-Vis hay phương pháp quang phổ huỳnh quang

Đại lượng đặc trưng cho phương pháp này là độ hấp thu A Độ hấp thu A được

tính bằng logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền suốt T khi cho ánh sáng đơn sắc đi qua Nó được biểu thị bằng phương trình:

1 I

A =lg—=lg—

T I

Trong do:

+ 1: cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dich

+ lo: cường độ ánh sáng đơn sắc tới

+ T: đô truyên quang

Độ hấp thu A tỷ lệ với độ đài quang trình 1 (cm) của ánh sáng truyền qua dung

dịch (bề dày lớp dung dịch) và nồng độ C (mol/l) của dung địch Sự phụ thuộc này được biểu thị bằng phương trình dưới đây Trong đó e là độ hấp thu mol đặc trưng

cho mỗi chất

A=e.LC Trong đó

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

se Thực hiện:

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo phức Glutaraldehyde -Phenol (Giu-Phe) gồm:

- Độ hấp thu của Phenol

- Bước sóng của phức Glu-Phe

Glutaraldehyde được tạo phức với DNPH trước khi chạy HPLC

Do sử dụng lượng dư DNPH nên trong SK đồ của mẫu ngoài peak chính là phức Glu-DNPH còn có peak phụ của DNPH

Thực hiện đồng thời mẫu thử và chất chuẩn Butafosfan để có thể định tính và định lượng dựa trên nguyên tắc sau:

- Định tính: là dương tính khi trong SK đồ DD thử có peak có thời gian lưu thời gian lưu của peak trong SK đồ DD chuẩn

(Cho phép sai lệch < 3,0% giá trị thời gian lưu)

- Định lượng:

+ Lập dãy nồng độ chuẩn Glutaraldehyde ti chất chuẩn có hàm lượng xác định (Phép định lượng chỉ được chấp nhận khi hệ số tương quan tuyến tính >

0,999) Vẽ đồ thị hàm số: S,„ = a.Cœ„ + b

+ Chạy HPLC đối với DD mẫu thử Ghi nhận trị số điện tích peak tương ứng

với peak trong SK đồ DD chuẩn

+ Sử dụng phương trình S,.4 = a.Cpụ + b để tính nồng độ Glutaraldehyde có

trong DD mẫu thử Từ đó suy ra hàm lượng Glutaraldehyde có trong mẫu thử

SVTH: Dang Minh Thanh Trang: 19

e Thực hiện:

- Chuẩn bj mau: 1ml dd Glu + 10ml DNPH + Ethanol vd 100ml

( dd Glu = 1m! Glu + 100ml H,O)

- Chuong trinh HPLC co ban la:

+ Cot: (250-4,6)mm, loai RP-18 hat 5um (cot pha dao) + Pha d6ng: 50p Acetonitril : 50 dd dém acetate pH 5

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

a 2 og or ¬ Phân tích định lượng

Nội dung thâm định Phân tích định tính Hóa học Độc chất

Ví dụ: Trong mẫu thử có đồng thời các ion Ca”* và Mg””

(chẳng hạn như nước cứng)

- Phương pháp chuẩn độ phức chất (chelate) không thể xác định riêng lẻ nồng

độ của Ca” và Mg”” vì EDTA có thê tạo phức được với cả Ca”* và Mg”†

- Phương pháp Sắc ký lon có thể xác định chính xác từng ion Ca** va Mg”* Như vậy phương pháp sắc ký ion có tính đặc hiệu hơn phương pháp chuẩn độ phức

chất

Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích thường là yếu tố quyết định đối tượng áp dụng của phương pháp

b) Yêu cầu:

Sự khác biệt giữa giá trị tìm lại của thành phần khảo sát ở mẫu đơn (chỉ có

chất khảo sát) và mẫu đa thành phần phải nhỏ hơn 2 lần độ không đảm bảo đo (U)

của kết quả đo mẫu đơn Tức là:

¢ Pha dung dịch đa thành phần, gồm chất khảo sát (cùng nồng độ với dung

dịch chuẩn và các chất có khả năng gây nhiễu Thực hiện phương pháp phân tích để

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

Độ đúng là độ gần của kết quả phân tích của phương pháp đối với giá trị thực

(hoặc giá trị lý thuyết) của mẫu

Độ đúng thường được biểu diễn qua giá trị tìm lại như sau:

2/ Dùng Pp thêm chuẩn: Thêm lượng chất khảo sát vào mẫu thử đã biết nồng

độ Dùng Pp phân tích để xác định nồng độ của dung dịch mới Tính toán lượng chất thêm vào, so sánh với trị số lý thuyết

3/ Dùng Pp mẫu trắng: Thêm lượng chất khảo sát vào mẫu trắng Dùng Pp phân tích tìm lại nồng độ của mẫu sau khi thêm Tính toán giá trị chất khảo sát đã thêm vào

Trong đó:

X R.(%) = —`*°2 *100

Theôoy XRecovery = ÄsauT— Xtruse

XTneoy = lượng chất chuẩn thêm

4.2.3 DO chum (Precision)

a) Dinh nghia:

Độ chụm (hay độ lặp lại) diễn tá mức độ gần nhau của một dãy kết quả phân tích bởi cùng phương pháp

Độ chụm được biểu diễn bởi 2 giá trị sau:

e Độ lặp lại (repeatability): là độ lệch chuẩn của đấy kết quả đo của cùng một mẫu trong cùng điều kiện của phương pháp phân tích thực hiện trong khoảng thời gian liên tục

° Dé tai lap (reproducibility): là độ lệch chuẩn của đấy kết quả đo của cùng một mẫu trong cùng điều kiện của phương pháp phân tích thực hiện trong khoảng thời gian không liên tục (cách nhau nhiều ngày)

e Độ lệch chuẩn (SD - Standard Deviation):

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

c) Cách thực hiện:

Có thể xác định độ chụm theo trị số độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Tìm bằng Excel theo cách sau:

® Tìm trị sô trung bình (mean): o 1 6 trông muôn hién thi mean, go

=A verage(chọn dãy sô cân tìm mean), enter

e Tìm độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD): Ở 1 ô muốn hiến thị SD, gỏ

=STDEV(chon day sé can tim), enter 1

e Tìm độ lệch chuẩn tương đối (&) (RSD — Relative Standard Deviation): 616

muốn hiển thị gỏ = “ô SD”*100/“ô mean”, enter

4.2.4 Độ tuyến tính (Linearity)

Độ tuyến tính diễn tả sự tương quan giữa nồng độ chất khảo sát trong các dung dịch đo của mẫu thử với kết quả phân tích của phương pháp Sự tương quan tuân theo phương trình bậc 1 Y = fC) = ax+b

Độ tuyến tính thê hiện qua hệ số tương quan tuyến tính (R) R được tính bằng

Excel R càng gần 1 thì phương pháp thử có độ tuyến tính càng cao

Ngoài ra cũng cân xem xét cac gia tri a và b như sau:

a: (hệ số góc) thể hiện độ nhạy của phương pháp phân tích a càng lớn thì phương pháp càng nhạy

b: (tung độ góc) thể hiện độ nhiễu của phương pháp phân tích b càng nhỏ thì

phương pháp càng ít bị nhiễu

Phương pháp (1)

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

4.2.5 Giới hạn phân tích (Limit of analysis) — Khoang ap dung (Range) 4.2.5.1 Giới hạn phân tích

Giới hạn phân tích gồm các giá trị sau:

a) Giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection)

LOD là giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được (đảm bảo tính đặc hiệu)

b) Gidi han dinh luong (LOQ - Limit of Quantitation)

LOQ là giá trị nồng độ giới hạn của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương

pháp phân tích có thê xác định số lượng được (đảm bảo độ đúng và độ chụm)

LOQ được phân thành 2 loại:

e Giới hạn định lượng dưới — LLOQ (Low Limit of Quanfitation)

LLOQ là giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượng được

e Giới hạn định lượng trên - HLUOQ (High Limit of Quantitation)

HLOQ là giá trị nồng độ lớn nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượng được

4.2.5.2 Khoảng áp dụng (Range)

Khoảng áp dụng là khoảng nồng độ chất khảo sát có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể áp đụng được (đáp ứng các yêu cầu tính đặc hiệu, độ đúng, độ chum .)

se Đối với phương pháp phân tích định tính: khoảng áp đụng là từ LOD trở lên

© Đối với phương pháp phân tích định lượng: khoảng áp dụng là từ LLOQ đến HLOQ

Trong phạm vi luận văn này, các phương pháp xây dung được thực hiện thâm định với các nội dung:

CHƯƠNG 5: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM

— Khảo sát các thông số, chọn giá trị tối ưu để xây dựng phương pháp định

lượng Glutaraldehyde trên cơ sở một quá trình cơ bản được lập ra từ lý thuyết và tài liệu tham khảo

— Thực hiện các thí nghiệm để thắm định phương pháp đã xây dựng Gồm các thí nghiệm sau:

Thực hiện phương pháp đấy nồng độ Glutaraldehyde tăng dân

Vẽ đồ thị hàm số Y =a*x+b_ (với x: nồng độ Glutaraldehyde)

— Đánh giá, so sánh các phương pháp với nhau

5.2 PHUONG TIEN THUC HIEN