Cơ sở để lựa chọn một dung môi chiết xuất là tính phân cực của hợp chất chứa trong dược liệu và của dung môi.. Dung môi phân cực và không phân cực Quá trình hình thành một dung dịch là t
Trang 1BO GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HOC CAN THO
DO THI KIM CHI
NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC
TRONG CAO ETHYL ACETATE TU VO
CUA RE CAY BAN CHUA (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)
LUAN VAN DAI HOC
Chuyén Nganh: CONG NGHE HOA HOC
Mã số: CN 262
CAN THO — 2012
Trang 2TRUONG DAI HOC CAN THO
DO THI KIM CHI
NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC
TRONG CAO ETHYL ACETATE TU VO
CUA RE CAY BAN CHUA (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)
LUAN VAN DAI HOC Chuyén Nganh: CONG NGHE HOA HOC
Mã số: TN 262
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS LÊ THANH PHƯỚC
CÂN THƠ - 2012
Trang 3Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
Đề đạt được kết quả như ngày hôm nay, Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn chân
thành sâu sắc nhất đến TS Lê Thanh thây đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình làm luận văn, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu để tôi có thể
hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình đồng thời trang bị những kiến thức cho
công việc của tôi trong tương lai
Tôi xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Hóa Học, khoa
Công Nghệ và quý thầy cô trong bộ môn Hóa, khoa Khoa Học Tự Nhiên đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn
Xin gửi lời cảm ơn thân thương đến gia đình và những người thân luôn là chỗ
Trang 4TÓM TẮT LUẬN VĂN
000
Cây Bản là một loại cây rất quen thuộc có mặt khắp nơi ven sông, ven biển, các
bãi bôi, Các bộ phận của cây Bần được sử dụng làm vị thuốc chữa được nhiều bệnh
dân gian như: hoa Ban chữa tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tay, giai nhiét cam SỐt, .Quả
có thể dùng dé nấu canh chua, có thể chữa bệnh bong gân, cầm máu Trong đề tài luận văn này, tôi đã sử dụng vỏ của rễ cây Bần chua làm nguyên liệu, tiến hành xác định độ 4m của vỏ rễ cây Ban chua, ngâm vỏ với ethanol 96° sau đó điều chế các cao
từ không phân cực petroleum ether đến cao ethyl acetate từ cao ethanol tổng.Giới hạn của đề tài này, được nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của
rễ cây Bần chua
Bằng phương pháp sắc ký cột KG 60 Fysq (silica gel) két hop voi sac ky lép mỏng, tôi phân lập ra được chất sạch từ cao ethyl acetate Sử dụng các dữ liệu phổ NMR đã xác định được chất đó là: oleanolic acid
Trang 5
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN sec
1.1.1 Phan loai kha NOC .cccccsssssssssssscssssssssccccscssssssssssscssssesees 1 1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua -s- seo s sescsesessssesese 2
a Dac điểm thực vật về cây Bần chua 5-e-«-<eesssssssesseesssssesess 2
b Phân bố sinh thái s5 5s s5s% SE 5s S2 SESSS9S9E2ESS5E5555585 3859555652 3 1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bần chua ¬— 4
a Dung môi phân cực và không phân Cực .- << «se c5 S566565655% 5
b Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khỏi cây . s<- 6
c Lựa chọn dung môi tách chiẾt - << << csesesesessessesssesssesse 7
d Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để tách chiết hợp chất 7
e Sự hòa tan hợp chất vào dung môii 5-s- << essssssessssesssssesese §
1.2.3 Các kỹ thuật chiết tách ra khỏi cây 0096006809966 60906 606 0
a Kỹ thuật chiết rắn-löng -.«- «5s <2 ssesessssssssEsksEsesesssssesssssssse 9
Trang 6
b_ Kỹ thuật chiết lỗng- lồ ng, 5 2° 5s ssSs+se2949 603909020906 10
1.3 GIỚI THIỆU VẺ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ#“, 11
1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng -os-scso<s s=ses I1
a Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mồng -.- 11
b Ưu điểm sac ký bản mồng s-<- << << s=scsesssssessesesesesessseses 12
c Chất hấp thu sỉliCa #el - co s2 ssEseseEeEeEsEssssseseeesesee 12
d Dung môi gÏả Ìy 0o c5 555 9 9 9.96 969 06 06.0598 9688908980899909086.496066666 13
e Các công dụng của sắc ký lớp mồng . s-scsssssesssssesssseesse 14
1.3.2 Phương pháp sắc ký cột
a Giới thiệu về phương pháp sắc ký cột . -<c<cesesecsescsessses 14
b Lựa chọn dung môi để khởi đầu giải ly s-s-< << se ec<esse 14
c Kích thước cột và lượng chất hấp phụ s-s-s° s se sessss=sesese ses 15
d Nap chat hap thu dạng sệt vào cột -ss-< <cececscseeesesssesesee 16
e Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký -ss-sec«c«cec«eese 17
f Theo dõi quá trình giải ly CỘI ooo co co 0S 0 9 9996 06 0068 9489999966666686996 06 18
ø Khi nào thay đôi hệ dung môi giải ly cột 5s sss<s<sse 19
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .c 20
2.1 CÁC PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VÀ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNHÖÌ,, s-sss sssssssssesesesee 2Ù
2.1.1 Đặc điểm và thời gian nghiên cứu sasesscsscssessseceesees 20
2.1.2 Các phương tiện nghiền CỨu - << 55555 se s95 20
b Quá trình điều chế €aO - << s5 << se e se Sesesessss se s9 21
c Cách phân lập các chất trong rễ Bằần s-s- so s sceseessesecsse 25
Trang 7
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
2.2 QUA TRINH PHAN LAP VA TINH CHE CAC CHAT
TREN CAO THO? | ccccccsccecceccsccscscscecceccecceccecceccecsecsecsecsece 25
2.2.1 Quá trình phân lập và tỉnh chế các chất từ cao thô 25 2.2.2 Khảo sát cao EA bang sắc ký cột s-s-s-s-s-scscscscse 26
F1 g8 0a 11 26
b Theo dõi quá trình giải ly cột c 0s c Ă cĂS0015166611186688686866646 27
2.2.3 Khao sat phan đoạn 2 của cao EÁ ososeeeseesssssssssse 29
m1 0 29
b Theo dõi quá trình giải ly cột c 0s c Ă cĂS0015166611186688686866646 30
2.2.4 Xác định các tính chất vật lý đặc trưng và theo cấu trúc của
hợp chất vừa phân lập được c- sec s<cs sssssssesesesesssssssssee 31
a Các đặc tính của chất PHUOC-CHI-(1 <5 5s scssses 31
b Xác định cấu trúc của chất PHUOC-CHI-01 5 «5c s< 32 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 34 3.1 KT LUẬNN - << << 5% s2 <EsEsSs S9 95s e9 EsSseSsssE 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 5 5c se sesesseseseeseses« 35
Trang 8
Hình 7: Cao EA - - HH HH cọ HH KT TH vá 23
Hình 9: Sắc ký cột thường cao EA - + 52+ 3E E1 521111371521 521 21x ree, 27
Hình 10: Cột sắc ký phân đoạn 2 . 5 - + SE +*SEEx SE cv vn ch vưryt 29 Hình 11: TLC cột sắc ký phân đoạn 2 +2 52 2 z+E£E£x+E+EvErrerzrkee 29
Hình 12: TC của PHUOC-CHI-O1 - - 1v 39 re 31
Hình 13: Lọ gửi mẫu đi đo phÔ 5+ +56 SzSEEEE SE SE E2 E2 rkrerervee 31
Hình 14: Cấu trúc của PHUOC-CHI-01 (oleanolic acid) - -‹ 33
Trang 9
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
DANH MUC BANG
Bang 1: Quá trình sắc ký cột trên cao EA đường kính 7 mm - 28
Bang 2: Kết quả sắc ký cột phân đoạn 2 của cao EA -¿-5c<cecscsesree 30 Bảng 3: Số liệu thực nghiệm của PHUOC-CHI -01 với số liệu mô phỏng của oleanolic
Trang 10
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
Coupling constant Singlet (NMR) Doublet (NMR) Doublet of doublet Triplet (NMR) Multiplet Acetone Thin Layer Chromatography Petroleum ether (60-90°) Ethyl acetate
Parts per milion Retention factor High-performance liquid chromatography Dichloromethane
Methanol Ethanol
Trang 11
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
Ngày nay, khoa học kỹ thuật được phát triển con người đã đi sâu nghiên cứu để
có thê giải thích chính xác cho chúng ta biết được trong các loại cây, cỏ có chứa thành phân gì mà chúng có khả năng chữa bệnh
Không dừng ở đó, việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang trở thành một lĩnh vực quan trọng của ngành Hóa Học Hữu Cơ ở nước ta Phần lớn các hợp chất được phân lập từ thực vật hay động vật đều có hoạt tính sinh học, có khả năng chữa một số bệnh cho con người hoặc có tác dụng lên một số vi sinh vật có hại được dung trong nông nghiỆp,
Xu hướng hiện nay của ngành được phẩm là hướng đến các sản phẩm có nguồn
gốc từ thiên nhiên, vì chúng đem lại sức khỏe tốt cho con người và không gây phản
ứng phụ như các sản phẩm tổng hợp Từ nhu câu thực tế đó nên tôi đã chọn đề tài là
“Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của rễ cây Bần chua”
Trang 12
CHƯƠNG 1: TONG QUAN
1.1 GIOI THIEU VE CAY BAN CHUA”!
Cây Ban phân bố ở rừng ngập mặn Campuchia, Thái Lan, Inđônêxia, Philippin, Bắc châu đại dương, Ở Việt Nam cây mọc ở nước lợ gần các cửa sông ngập một mua trong năm Cây thường mọc chung với các loài cây khác như Trang, Sú, Giá, Cóc, Cũng có khi mọc thành rừng gần như thuần loại như ở Hải Phòng, Nghệ An,
Hà Tĩnh Sự phong phú của quân thụ này tùy theo mức nước lợ và chế độ thủy triều
Ở Việt Nam hiện nay họ Bần có khoảng 6 loài, trong đó hết 5 loài là gặp ở vùng rừng ngập mặn hoặc bờ sông có thủy triều, cây có rễ kí sinh thường dùng làm nút chai
1.1.1 Phân loại khoa học
Tên Khoa Hoc: Sonneratia caseolaris (L.) Engl
Tén déng nghia : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris
Tén Viét Nam: Ban Chua
Tên khác: Hải Đồng, Thủy Liễu
Trang 13Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua
a Đặc điểm thực vật của cây Bần chua Cây Ban thường gặp nhất ven sông, trái chín ăn được, rất chua Loài Dom dom thường hay đậu trên lá Bần ban đêm, chớp tắt trông rat đẹp như cây Thông Noel
ere
eee
Cây gỗ, thân cao 4-5 m hoặc hon, luôn xanh Ré thé tap trung thanh khém ở
quanh gốc thân, mọc ngập sâu vào bùn Cành non có 4 cạnh nhẫn Lá mọc đối, lá non hình mũi mắc dài, lá già hình trái xoan, dài 5-10 cm, rộng 3,5-4,5 cm, gốc thuôn, đầu
tù, phiến lá đài và dai, hơi mọng nước, rất giòn, gân lá rõ, thường rụng vào mùa đông: cuông lá và phân gân chính ở gôc có màu đỏ
Hinh 2: Hoa va qua Ban Hinh 3: Than va qua Ban
SVTH: Đỗ Thị Kim chi
Trang 14Hoa màu trang, moc đơn độc ở ngọn thân hoặc kẽ lá; cuốn hoa ngắn và mập; đài
có có 6 răng hình tam giác, dày găn liền ở gốc tạo thành một ống đài 1,5 cm, mặt ngoài màu lục mặt trong màu tím hồng, tràng 6 cánh hình dải, đầu thuôn nhọn; nhị nhiều, chỉ
nhị dài, mảnh; bầu hình cầu det
Qua mong, hinh cau det, đường kính 3 cm, có mũi thuôn nhọn ở đầu; hạt nhiều
b Phân bố sinh thái
Chi sonneratia gồm một số đại diện là cây gỗ hay cây bụi, mọc ở các vùng dat ngập mặn ven biển, ở Đông Phi, nhiệt đới châu Á và các đảo ở Thái Bình Dương Ở Việt Nam, chỉ này có 4-5 loài, trong đó Bần là cây gặp khá phố biến ở các vùng ven biển từ Thủy Nguyên (Hải Phòng) cho đến Rạch Giá (Hà Tiên) Loài này cũng được phân bồ rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Philipin, phần biên Đông
Bắc Australia và đảo solomon
Bắn là loại cây gỗ phân cành nhiều, ưa sáng chịu được mặn nên thường thấy trên các vùng đất bùn nhão ở các cửa sông Để thích nghi với điều kiện đất bùn nhão và
thường xuyên bị ngập nước, cây có hệ thống rễ thở mọc trồi lên khỏi mặt đất Bần ra
hoa hàng năm, thụ phấn nhờ gió, côn trùng va doi Hoa Ban là nguồn thức ăn quan trọng của ong mật Cây còn được trồng thêm nhằm chắn sóng và bảo vệ vùng đất ngập
nước ở ven biên
Trang 15
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
Quả Bân: ở Án Độ quả Bân được dùng làm thuôc đặp ngoài chữa bong gần sưng
tây, dịch ép lên men từ quả có tac dung cam máu
Malaysia, quả già là thuôc diệt giun, còn nước ép từ quả xanh có vị chua, dùng làm tăng mùi vị cho bột car1, còn lúc chín có mùi vị giông bơ, có thê ăn tươi hoặc nầu
chín
Hình 6: Quá Bần dùng làm món ăn Hoa Bắn: ở Ấn Độ, dịch ép từ hoa là một thành phân trong bài thuốc chữa đái ra máu
Giải nhiệt chữa cảm sôt: quả Bân rửa sạch, nhai với muôi, rồi nuôt nước
Câm máu nhật là chảy máu cam: quả Bân rửa sạch, giã nát, đắp vào vêt thương, máu sẽ cầm ngay Tác đụng này chính là do chất pectin chứa trong dịch quả
Tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tây: quả Bân giã nhỏ, ép lầy dịch, cô thành cao mêm Lúc cao còn nóng phết lên giây, khi dùng, hơ thuôc cho mêm rôi đắp lên chỗ đau ngày làm một lần
Sử dụng làm thuốc đắp vào chỗ viêm tấy vì bong gân Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết Ta dùng lá giã ra, thêm một ít muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ Ở Malayxia, người ta giã lá lần với cơm làm thuôc đặp chữa bí tiêu tiện
Trang 16
Gỗ Bản dùng đóng đồ nhỏ, vỏ chứa nhiều tanin có thể dùng thuộc đa
Ré Ban làm nút đóng chai
b Y học và hóa sinh hiện đại
Hiện nay cây Ban chi moi duoc str dung lam thuốc theo dân gian, chưa có nghiên cứu khoa học cu thé nao phục vụ trong y học hiện đại
Nếu nguyên liệu phải thu hái ở nơi xa, có thể bọc vào túi nhựa sẽ giữ được tươi
trong vài ngày Khi thu hái nguyên liệu phải chú ý loại bỏ sâu bệnh Đối với các bội
phận vỏ thân, rễ chú ý xem xét kỹ, tránh thu hái dược liệu có mang các sinh vật ký
sinh
1.2.2 Dung môi
Dung môi dùng để chiết xuất các hợp chất ra khỏi dược liệu Cơ sở để lựa chọn một dung môi chiết xuất là tính phân cực của hợp chất chứa trong dược liệu và của dung môi
a Dung môi phân cực và không phân cực
Quá trình hình thành một dung dịch là tùy thuộc vào đặc tính của chất tan và dung môi Để hình thành một dung dịch trước hết là phải có sự phá vỡ các dây nói liên
kết trong hợp chất tan và trong đung môi, để hình thành dây nối liên kết mới giữa chất
tan và dung môi
Để hiểu về tính phân cực của dung môi, ta có thể so sánh giữa hai dung môi petroleum ether và nước có 3 điêm khác nhau cơ bản:
Trang 17
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
e Hằng số điện môi của nước ở 20°C là 80,4 trong khi của petroleum ether là
4,34
e Nguyên tử H trong phân tử nước có khả năng liên kết với nguyên tử mang điện
âm của một hợp chất khác, hình thành dây nối liên kết hydro trong dung dịch nước, trong khi petroleum ether không có sự liên kết này Dây nối hydro hình thành ảnh hưởng lớn đến tính hòa tan của hợp chất đối với dung môi
e Nước có tác dụng như một acid vừa là một base, con petroleum ether chỉ là một base rât yêu
Do những đặc tính trên, nước được xem là một dung môi phân cực mạnh còn petroleum ether là một dung môi không không phân cực
b Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khói mẫu cây
Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu có phân tử lớn
(polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nâm mốc, thành tế bào vi sinh vật) tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất có trong lượng phân tử nhỏ
Thông thường người ta nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có tính ái dầu có mức độ ái cực khác nhau Tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có
tính ái nước Vì vậy, việc tách hợp chất thiên nhiên được thực hiện lần lượt với từng
loại dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lẫy tất cả các loại hợp chất
ra bằng sử dụng dung môi vạn năng methanol, ethanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)
Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách lấy Như ta đã biết, hợp chất tự nhiên có câu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số quy trình chiết tách đặc trưng, vì vậy, trước khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đây đủ các tài liệu tảm khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn được quy
trình phù hợp
Trang 18
Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần trộn dung môi phù hợp, sử đụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dam, bằng máy chiết Soxhlet, sau khi chiết phần
bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ khoảng 30-40°C
c Lựa chọn dung môi tách chiết
Chọn dung môi phải có đặc tính trung bình, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thê được loại
bỏ đễ dàng Hạn chế sử dụng các dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy do có nhiệt
độ sôi thấp nhu diethyl ether, carbon tetrachlorua,
Dung môi đùng đề chiết cần thỏa mãn các điều kiện sau:
= C6 nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì tốn thất dung môi sẽ lớn, để cháy nỗ
" Không tác dụng hóa học với các chất trong nguyên liệu và không bị thay đổi
tính chất khi sử đụng lại
= Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán
“= Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé đối với tạp chất
" Không tạo thành hỗn hợp đối với không khí, không được có những tạp chất
không bay hơi và khi bay hơn không được để lại các tạp chất có mùi lạ
=_ Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị Không gây mùi lạ đối với sản phẩm và
không độc hại đối với người sử dụng
= Dé tim va ré tién
d Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất
Các dung môi được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy tỉnh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp chất bản mà thường gặp nhất là chất dẻo hóa Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứa trong các thùng bằng nhựa dẻo
Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-ethylhexyl) và chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang
khảo sát
Trang 19
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
Chloroform, dichloromethane có thể tạo thành phản ứng với các loại alkaloid Để
tạo thành các alkaloid và một vài hợp chất giả tạo khác Tương tự, các vết HCI có thê
gây ra sự phân hủy, sự khử nước, sự đồng phân hóa cho vài hợp chất hữu cơ
Diethyl ether it được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp dễ cháy, độc có thé gây mê cho người sử đụng và khuynh hướng tạo thành peroxid dễ gây nỗ Peroxid này rất hoạt tính, có thể oxid hóa các hợp chất mang nhiều nối đôi liên hợp như carotenoid Acetone có thê tạo ra dân xuât acetonid nêu hop chât chiệt có chứ nhóm cis-1,2-diol hién diện trong môi trường acid
Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycosid (môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mắt đi phần đường) hoặc cắt đứt este (môi trường kiêm) hoặc tạo sự chuyên vỊ
Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30-40°C, chưng cất ở nhiệt độ cao có thê làm hư một số chất kém bèn nhiệt
e Sự hòa tan hợp chất vào dung môi
Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chât ta có thê dự đoán
sự có mặt của các chât trong mỗi phân đoạn chiết
Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể có các hydrocacbon béo và thơm (như triglyceride, alkane mạch cacbon dài, alcol béo, ester béo, acid béo, ), Các thành phần trong tính dầu (monoterpen, sesquiterpen, một vài diterpen bay hơi được), các sterol thuc vat (phytosterols), các chất màu thực vật như carotene,
Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: cé thé có các sesquiferpen, diterpen, coumarin, quinon, cdc aglycon do hop chat glycosid bị thủy giải, các monoglycosid (chi mang một phân tử đường), một số alkaloid loại base yếu
Trong cao methanol hoặc cao nước: có thể có các chất màu thực vật như clorophyl, các glycoside (saponin), các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp với các acid hữu cơ, các muối amine, các tannin, các hydrat cacbon có trọng lượng phân tử nhỏ như monosacarid, các protein thực vật, các muối vô cơ, một số polysacarid như: pectin, chất nhày, chất gôm,
Trang 20
1.2.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính lỏng-lỏng và rắn-lỏng
a Kỹ thuật chiết ran-léng
* Kỹ thuật chiết ngắm kiệt
Dụng cụ : gồm một bình ngẫm kiệt bình thủy tính, hình trụ đứng, dưới đáy bình
là một van khóa để của dung chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngắm kiệt là bình lóng để dung môi tinh khiết
Phương pháp thực hiện: bột cây được xay khô, lọc được qua lỗ rây 3 mm Đáy của bình ngẫm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt
vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bê mặt lớp bông bằng một
tờ giấy lọc và chặn trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm sáo
trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ
xấp xấp phía trên lớp mặt, có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội
Để yên một thời gian, thường là 12-24 giờ Mở van bình ngẫm kiệt cho đung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mới khóa bình lóng để dung môi tỉnh khiết
chảy xuống bình ngắm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào
bình ngắm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình
Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gi trên mặt
kiếng hay không, nếu không còn vết gì là chiết kiệt
* Kỹ thuật chiết ngâm dam
Kỹ thuật chiết ngâm đầm cũng tương tự kỹ thuật chiết ngâm kiệt nhưng không
đòi thiết bị phức tạp, vì thế có thê dễ đàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây
Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gi, hình trụ đứng, có nắp đậy
Phương pháp thực hiện: bột cây được đặt vào bình, rót dung môi tỉnh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm
Trang 21
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
hoặc một ngày để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hòa
tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc,
cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao Tiếp theo, rót đung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây
Có thể gia tăng thêm hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung môi dịch chiết bị làm bị trào ra ngoài)
Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng đung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể thêm
được nhiêu hơn nên có ngầm lâu cũng chỉ mât thời gian
Dung môi sau khi thu hôi được làm khan nước băng các chât khan khắc và được
tiêp tục sử dụng đê chiêt các lần sau
Trong thực nghiệm, việc chiêt rắn-lỏng được áp dụng nhiêu, gôm sự ngầm kiệt,
sự ngâm dâm, sự trích với máy chiêt Soxhlet, Ngoài ra, còn có sự chiêt với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn
b Kỹ thuật chiết lỏng-lồng
Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng thường được áp dụng để: chiết hợp chất cần quan tâm ra
khỏi đung dịch ban đầu, phân chia cao ethanol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp
chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực
khác nhau
Nguyên tắc của sự chiết là dung dung môi không phân cực (thí đụ petroleum ether) sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo, ), dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichloromethane, ) hòa tan tốt các hợp chất có tính cực trung bình (các nhóm chức ether -O-, aldehyde -CHO, cetone -O-, ester -COO, ) và dung môi phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức
-OH, -COOH )
Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện trong bình lóng trong đó có cao ethanol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ
Trang 22
trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ măm ở lớp trên hoặc năm ở lớp dưới so với pha nước
Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate,
Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng
nhỏ thể tích dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom
chung lại, làm khan với các chất làm khan như Na;SO¿, MpgSO¿, CaSQ,, duéi dung
môi ta thu duoc cao chiét
Dé kiểm tra xem các hợp chất nào được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp
chất còn lại ở trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký
lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được goi la hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong ph hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kiếng
Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên có nhiều thay đỗi
1.3 GIỚI THIỆU VÉ PHƯƠNG PHÁP SẮC KY°”
1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
a Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ trong
đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silica gel, hoặc nhôm oxid Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tắm kiếng, tắm nhôm hoặc tắm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng
+ Bình sắc ký: một chậu, lọ, băng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy
Trang 23
Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước
+ Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như
silica gel, alumin, được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như
tam kiếng, tắm nhôm Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ canxi sunfat khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polyme hữu cơ
+ Mẫu cân phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử đụng khoảng 1 microlit (uL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh,
ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình
+ Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển cham chậm đọc theo tắm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi
lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phân của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi
vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc đi chuyển này tùy thuộc
vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh
(hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ đi chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm
b Ưu điểm sắc ký bản mồng
Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm như sau:
- Chỉ cần một lượng ít mẫu để phân tích
- Có thê phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện
c Chất hấp thu silica gel
Silica gel là chất hấp thu được sử dụng thông dụng nhất Silica gel được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để