Điều hòa hoạt động gen ở vi khuẩn

CHƯƠNG II ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN Ở VI KHUẨN II 1 Khái quát cơ chế điều hòa hoạt động của của Operon đồng hóa, dị hóa ở vi khuẩn Bộ gen của vi khuẩn được tổ chức theo operon Một operon có một vùng điều.

CHƯƠNG II:

ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN Ở VI KHUẨN

II.1 Khái quát cơ chế điều hòa hoạt động của của Operon đồng hóa, dị hóa ở vi khuẩn

Bộ gen của vi khuẩn được tổ chức theo operon Một operon có một vùngđiều khiển và vùng mã hóa Vùng điều khiển bao gồm gen điều hoà, promoter vàđiểm điều hành (operator) Vùng mã hóa bao gồm một số gen cấu trúc nằm kềnhau, mỗi gen cấu trúc mã hóa cho một polypeptide Các prôtêin được mã hóatrong một operon thường có quan hệ mật thiết với nhau trong một quá trìnhchuyển hóa sinh hóa nào đó trong tế bào

Một operon có ít nhất một promoter, tuy nhiên, operon có thể có nhiềuhơn một promoter và ái lực của các promoter này đối với ARN-polymerase làkhác nhau Operator là trình tự ADN, nơi mà prôtêin ức chế (repressor prôtêin)gắn vào

Khái niệm về operon được F Jacob và các cộng sự của ông nêu ra năm

1961 khi nghiên cứu sự kiểm soát di truyền hấp thụ đường lactose ở E.coli Với

sự khám phá ra cơ chế điều hoà biểu hiện gen, ông đã nhận được giải thưởngNobel 1965

Cơ chế điều hòa di truyền của hệ thống lac (lac system) được giải thích

bằng mô hình operon của Francois Jacob và Jacque Monod (1960)

Hệ thống sử dụng lactose gồm 2 loại thành phần: gen cấu trúc mã hóaprotein cần thiết cho sự vận chuyển và chuyển hóa lactose và các yếu tố điều hòa

(gen ức chế lacI, promotor lac P và operator lacO).

Sản phẩm gen cấu trúc được mã hóa bởi một phân tử mRNA đa cistron(polycistronic) Gen Z mã hóa cho enzyme - galactosidase (thủy phân đườnglactose thành galactose và glucose), gen Y mã hóa cho enzyme permease (cầncho vận chuyển lactose qua màng), gen A mã hóa cho enzyme transacetylase (vaitrò chuyển hóa lactose chưa rõ)

Đột biến promotor (lacP -) làm mất khả năng tổng hợp mRNA.

Sản phẩm của gen lacI là chất ức chế, nó bám vào trình tự các base của

DNA cấu tạo operator Chất ức chế bám vào operator, ngăn cản sự khởi đầuphiên mã mRNA nhờ RNA polymerase Chất cảm ứng (lactose) kích thích sựsinh tổng hợp mRNA bằng cách kết hợp và làm bất hoạt chất ức chế Sự có mặtcủa chất cảm ứng làm chất ức chế không gắn vào operator, promotor cho phépkhởi đầu tổng hợp mRNA

Khi môi trường có lactose, lactose được chuyển vào tế bào nhờ permease.Khi vào trong tế bào một số lactose được chuyển thành allolactose nhờ β-galactosidase Allolactose là chất cảm ứng, nó gắn vào protein kìm hãm, gây biếnđổi cấu hình tạo phức hợp allolactose-repressor Phức hợp này mất khả năng gắnvào operator Lúc này operon mở ra, RNA polymerase bắt đầu phiên mã từ cácgen cấu trúc

Khi môi trường không có lactose, protein ức chế có hoạt tính gắn vàooperator, làm sự phiên mã của tất cả các gen cấu trúc của operon lac bị dừng

Sự điều hòa của operon yêu cầu promotor nằm chồng lên một phần hoặc

kề sát bên promotor của gen cấu trúc, vì nó gắn với chất ức chế ngăn cản phiên mã

II.1.2 Điều hòa operon tham gia con đường dị hóa ở vi khuẩn

II.1.2.1 Điều hòa âm tính Operon lactose ở E.coli

Vi khuẩn E.coli có khả năng sử dụng đường lactose như nguồn cacbon

chính để phát triển Lactose là một disacarit, nên khi có mặt lactose trong môitrường, vi khuẩn sản sinh ra enzym β-galactosidase để thuỷ phân lactose, tạothành các phân tử monosacarit là glucose và galactose thuận lợi cho quá trìnhchuyển hóa Ngoài β-galactosidase ra, tế bào vi khuẩn còn tổng hợp enzympermease làm nhiệm vụ vận chuyển lactose qua màng tế bào Khi nghiên cứu sựkiểm soát di truyền hấp thụ đường lactose, F Jacob đã phát hiện cơ chế tổng hợpcác enzym hấp thụ đường lactose Quá trình thí nghiệm có thể mô tả như sau

Khi nuôi vi khuẩn E.coli trên môi trường không có lactose, thì ta thấy

nồng độ enzym β-galactosidase và permease do vi khuẩn sinh ra rất thấp: khi đưa đường lactose vào môi trường nuôi thì nồng độ hai enzym này ở tế bào vi khuẩn tăng lên rất nhiều

Nhưng nếu nuôi vi khuẩn trên môi trường có đường glucose và lactose đồng thời thì nồng độ hai enzym nêu trên trong tế bào thấp hơn so với trường hợp chỉ có đường lactose Khi phân tích tổng nồng độ mARN có mặt trong tế bào trước và sau khi đưa lactose vào trong môi trường nuôi, thấy rằng: Khi không có mặt lactose trong môi trường thì không xuất hiện mARN mã hóa cho β-

galactosidase và permease Khi bổ sung lactose vào môi trường nuôi thì trong tế bào xuất hiện mARN mã hóa cho hai enzym nêu trên Từ kết quả thí nghiệm trên, cùng với những kết quả thu được về đột biến gen, F Jacob và J Monod đã đưa ra

mô hình điều khiển operon lactose như hình bên dưới

Cấu trúc của operon lactose gồm: gen điều hoà (R), promoter (P),operator (O) và ba gen cấu trúc là lacZ mã hóa cho enzym β-galactosidase, lacY

mã hóa cho enzym permease và lacA mã hóa cho enzym transacetylase

Khi không có mặt lactose trong môi trường, gen điều hoà thường xuyêntổng hợp prôtêin ức chế Prôtêin ức chế có ái lực với điểm điều hành (operator)nên nó gắn vào điểm điều hành, ngăn cản không cho enzym ARN- polymerasethực hiện phiên mã, mARN không thể tổng hợp được, operon đóng

Khi có mặt lactose trong môi trường, nhờ enzym permease có sẵn ở màng

tế bào chuyển một lượng rất ít vào trong tế bào Khi đã vào trong tế bào, lactosechuyển thành allolactose (có chứa liên kết β-1,6) Allolactose là chất cảm ứng, nóliên kết với prôtêin kìm hãm Phức hợp này không có ái lực với operator, nênkhông gắn lên operator được, lúc này, operon mở ARN- polymerase thực hiệnphiên mã các gen cấu trúc

Mô hình hoạt động của operon lactose

Phần lớn sự tổng hợp các enzym hoạt động trong các quá trình phân giải

ở tế bào được sự kiểm soát theo cơ chế của operon cảm

II.1.2.2 Điều hòa dương tính operon lactose

Chức năng của β-galactosidase trong chuyển hóa lactose để tạo ra glucosebằng cách cắt lactose (một sản phẩm cắt khác là galactose cũng có thể đượcchuyển thành glucose nhờ enzyme của operon galactose) Nếu cả glucose vàlactose có mặt trong môi trường sinh trưởng, không cần hoạt động của operon lac

Trong môi trường có glucose, enzyme - galactosidase không được tạo thành chođến khi glucose trong môi trường được sử sụng hết Sự có mặt của glucose làmmRNA không được tổng hợp, do đó không có sự tổng hợp β-galactosidase, vì sựthêm vào nhân tố cảm ứng làm bất hoạt chất kìm hãm Một yếu tố khác cần cho sựbắt đầu tổng hợp mRNA, hoạt tính của yếu tố này được điều hòa bởi nồng độglucose.

Glucose có ảnh hưởng ức chế gián tiếp lên sự biểu hiện của operon lac.Những phân tử nhỏ adenosine monophosphate vòng (cAMP) phân bố rộng rãitrong mô động vật và trong các cơ thể eukaryote đa bào, có vai trò quan trọng làm

chất trung gian hoạt động hormone Chất này cũng có trong tế bào E coli và nhiều

tế bào vi khuẩn khác với chức năng khác nhau cAMP được tổng hợp bởi enzymeadenyl cyclase, và nồng độ của cAMP được điều hòa gián tiếp qua trao đổi chấtglucose Khi vi khuẩn sinh trưởng ở môi trường chứa glucose, hàm lượng cAMPrất thấp Trong môi trường chứa glycerol hoặc các nguồn carbon không thể đi vàocon đường hóa sinh được sử dụng để trao đổi chất glucose (con đường glycolytic)hoặc khi vi khuẩn bị đói nguồn năng lượng, nồng độ cAMP cao Hàm lượngglucose giúp điều hòa nồng độ cAMP trong tế bào và cAMP lại điều hòa hoạt tínhcủa operon lac

E coli chứa protein nhận cAMP hay CRP (cyclic AMP receptor protein) còn được gọi là protein hoạt hóa dị hóa CAP (catabolite activator protein), được

mã hóa bởi gen crp Đột biến ở gen crp và gen adenyl cyclase làm ngăn cản sự tổng hợp của mRNA lac Điều này cho thấy chức năng của CRP vàcAMP cần thiết cho tổng hợp mRNA lac CRP và cAMP gắn vào một vị tríkhác tạo phức hợp cAMP-CRP được biểu hiện Phức hợp này là một yếu tố điều

hòa hoạt hóa ở hệ thống lac.

Tổng hợp của mRNA

Hình 7.4 Bốn trạng thái điều hòa của operon lac

Nhu cầu về cAMP-CRP phụ thuộc vào hệ thống ức chế lac, vì đột biến crp và adenyl cyclase không thể tạo mRNA lac ngay cả khi có mặt đột biến ở gen điều hòa (lacI - ) và gen chỉ huy (lacO -) Sở dĩ như vậy là vì phứchợp cAMP-CRP phải gắn vào trình tự base trên DNA ở vùng promotor đểxảy ra phiên mã (Hình 7.4) Khác với chất ức chế trong điều hòa âm tính,phức hợp cAMP-CRP là chất điều hòa dương tính Các thí nghiệm ở điều

kiện in vitro cho thấy: mRNA lac được tổng hợp chỉ khi có cAMP vòng và

không có chất ức chế

Khi vắng mặt phức hợp cAMP-CRP, RNA polymerase chỉ bám lỏnglẽo vào promotor Vì vậy hiếm khi dẫn đến phiên mã vì không có sự tươngtác đúng giữa RNA polymerase và promotor Nhưng RNA polymerase đượckích thích gắn vào promotor khi cAMP-CRP được gắn vào DNA

Những kết quả này giải thích chức năng lactose và glucose cùng

nhau tham gia điều hòa phiên mã operon lac như thế nào.

không Repressor

không Phức hợp

cAMP-CRP

Có Phiên mã

không

Khi trong môi trường có nhiều nguồn cácbon khác nhau, thông thường visinh vật sẽ sử dụng nguồn cácbon quen thuộc trước, sau khi cạn kiệt nguồn đó thì

vi sinh vật mới chuyển dần sang sử dụng nguồn cácbon kế tiếp

Ví dụ: Ở vi khuẩn E.coli nếu trong môi trường nuôi cấy có cả glucozơ và

lactozơ thì vi khuẩn sẽ sử dụng glucozơ trước, đến khi cạn dần glucozơ thì mớichuyển sang dùng nguồn cácbon còn lại Như vậy, có thể khẳng định rằng ở visinh vật, gen cơ định mã hóa các enzym chuyển hóa nguồn cácbon nào thì trongmôi trường có nhiều nguồn cácbon chúng sẽ sử dụng nguồn cácbon đó trước, vìtrong tế bào chúng luôn có sẵn enzym đó

Vậy bằng cách nào mà vi khuẩn cảm nhận được sự thay đổi nồng độcácbon đang sử dụng? Đó là nhờ một phân tử AMP vòng (CAMP), phân tử CAMP

sẽ được tích lũy dần khi nồng độ glucozơ giảm dần Mà prôtêin điều hòa hoạthóa operon Lac là prôtêin khi ở dạng tự do nó không hoạt động Khi CAMP liênkết với prôtêin hoạt hóa nó trở thành dạng hoạt động (CAP), khi CAP liên kếtvào vị trí điều hòa của operon nó sẽ làm tăng ái lực của promotor với ARNpolimeraza, dẫn đến gen tăng biểu hiện Khi tăng nồng độ glucozơ thì lượng

CAMP lại giảm đi Lượng phức hệ CAP giảm, ái lực của promotor với ARNpolimeraza giảm, gen phiên mã giảm đi

Do trình tự liên kết của chất ức chế lacI tại operator phủ lên promotor lacmột phần, nên khi lacI liên kết vào operator, nó ngăn cản sự liên kết của ARNpolimeraza vào promotor Còn đối với CAP, khi thiếu vắng prôtêin này, ARNpolimeraza chỉ liên kết được rất yếu vào promotor Bởi vì, promotor lac thiếu mộttrình tự UP, đồng thời trình tự liên ứng của nó không hoàn chỉnh

Ngược lại, prôtêin CAP khi liên kết vào operon lac lại có vai trò thúc đẩyoperon hoạt động Tuy vậy, CAP chỉ liên kết mạnh khi môi trường không cóglucozơ cAMP là phân tử kích ứng dị hình của CAP Nghĩa là, chỉ khi cAMPliên kết với CAP, thì prôtêin này mới có cấu hình phù hợp liên kết với ADN

Khi CAP liên kết vào vị trí này, nó đồng thời huy động và thúc đẩy ARNpolimeraza đính kết vào promotor CAP hoạt hóa operon Lac bằng việc huy độngenzym ARN polimeraza đến promotor

cAMP là phân tử kích ứng dị hình của CAP Nghĩa là, chỉ khi cAMP liênkết với CAP, thì prôtêin này mới có cấu hình phù hợp liên kết với ADN.

II.1.3 Điều hòa Operon đồng hóa ở vi khuẩn

II.1.3.1 Điều hòa Operon kìm hãm - Operon tryptophan ở E.coli

Operon tryptophan cũng có cấu trúc tương tự như operon lactose, nghĩa

là, bao gồm gen điều hoà (R), promoter (P), operator (O) và 5 gen cấu trúc Mỗigen cấu trúc mã hóa cho một enzym, xúc tác phản ứng tổng hợp tryptophan.Trong tế bào, tryptophan được tổng hợp bằng một chuỗi 5 phản ứng, mỗi phảnứng được xúc tác bằng một enzym mã hóa trong operon Năm gen cấu trúc mãhóa cho 5 enzym, lần lượt được ký hiệu là trpE, trpD, trpC, trpB và trpA GentrpE nằm ngay sau vùng điều hoà, được phiên mã đầu tiên

Mô hình hoạt động của operon tryptophan

Hoạt động của operon tryptophan khác với operon lactose ở chỗ làprôtêin kìm hãm, bản thân nó không có ái lực với operator nên khi đứng riêngmột mình, nó không thể gắn vào điểm điều hành, nên operon mở Ngược lại, khiprôtêin kìm hãm kết hợp với chất đồng kìm hãm (corepressor), thì sẽ có ái lựcvới operator nên dễ dàng gắn vào đó, làm operon đóng Hoạt động của operon cóthể mô tả như hình trên

Như vậy, khi lượng tryptophan dư, operon đóng, còn khi thiếu tryptophanthì operon mở

Nhìn chung, cách điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật procaryote chủ yếuđược thực hiện ở giai đoạn phiên mã.

Operon tryptophan (trp) của E.coli chứa các gen cấu trúc mã hóa cho các

enzyme tổng hợp amino acid tryptophan Operon này được điều hòa theo cáchsau: khi tryptophan có mặt đầy đủ trong môi trường sinh trưởng, sự phiên mã củaoperon bị ức chế Khi sự cung cấp tryptophan bị thiếu, sự phiên mã xảy ra Sựđiều hòa của operon lactose tương tự với operon lactose, vì sự tổng hợp mRNAđược điều hòa âm tính nhờ chất ức chế Tuy nhiên, khác với điều hòa ở operon

lac, tryptophan hoạt động như chất đồng kìm hãm, kích thích chất ức chế gắn

vào operator ngừng sự tổng hợp Operon tryptophan hoạt động theo kiểu ức chế,điều hòa âm tính

Tryptophan được tổng hợp qua các giai đoạn khá phức tạp, mỗi giai đoạn

có sự xúc tác của một enzyme đặc biệt Các gen mã hóa cho các enzyme này

nằm kề nhau trên nhiễm sắc thể của E.coli Đó là các gen trpE, trpD, trpC, trpB, trpA Các enzyme được dịch mã từ một phân tử mRNA đa cistron Vùng mã hóa gen E được dịch mã trước tiên Phía trước trpE về đầu 5' có promotor, operator

và 2 vùng xếp lần lượt là leader (trpL) và đoạn kìm hãm phiên mã attenuator(trpa, không phải là trpA) Gen ức chế trpR nằm xa operon, tổng hợp protein

aporepressor, là chất kìm hãm mà riêng nó không có hoạt tính Khi tryptophan

dư thừa, nó kết hợp với aporepressor tạo chất kìm hãm có hoạt tính, gắn vàooperator của operon tryptophan làm dừng phiên mã các gen cấu trúc Khi nồng

độ tryptophan thấp, nó tách khỏi phức hợp kìm hãm và aporepressor mất hoạttính Lúc này operator mở ra, RNA polymerase dịch mã 5 gen cấu trúc để tổnghợp 5 enzyme tham gia tổng hợp tryptophan

II.1.3.2 Điều hòa Operon phiên mã dở (Attenuation) Operon tryptophan ở

E.coli

Kiểu điều hòa thứ hai được phát hiện ở operon tryptophan được gọi

là attenuation Nó dùng sử dịch mã để điều khiển sự phiên mã Khi có mặttryptophan nội bào, ngay cả với nồng độ thấp, sự dịch mã một phần vùngleader của mRNA ngay khi vừa được tổng hợp, kết quả làm dừng sự phiên

mã trước khi gen cấu trúc đầu tiên của operon được sao chép.

(A) Sơ đồ phiên mã của leader trp;

(B) Chi tiết cấu trúc của 2 codon trp ở vòng 1-2

Phiên mã dở (attenuation) là kết quả sự tương tác giữa các trình tự DNAtrong vùng leader của bản phiên mã trp Ở tế bào kiểu dại, sự phiên mã operontrp thường được bắt đầu Tuy nhiên khi có mắt một lượng nhỏ tryptophan, hầuhết phân tử mRNA kết thúc ở vùng 28 base đặc biệt ở trong trình tự leader Kếtquả của sự kết thúc sớm này tạo phân tử mRNA chứa 140 nucleotide chấm dứtmột đoạn ngắn của các gen mã hóa cho các enzyme trp Vùng 28 base xảy ra sự

kết thúc phiên mã sớm như thế được gọi là attenuator Trình tự base của vùng

này thường có các tính chất điểm kết thúc, gồm dạng đoạn và vòng (stem-loop)trên mRNA theo sau là trình tự của 8 uridine

polypeptide Trình tự lặp lại ngắn này có ý nghĩa trọng điều hòa.

- Bốn đoạn của RNA leader là vùng 1, 2, 3 và 4 tạo thành do khả năngkết cặp của các base với nhau Các base ở vùng 1 kết cặp với vùng 2, vùng 3 kếtcặp với vùng 4

Khi sự kết cặp xảy ra ở dạng này, sự phiên mã kết thúc ở đoạn đi quauridine phía trước nucleotide 140 Kiểu kết cặp này xảy ra ở mRNA leader đượctinh sạch

- Một kiểu kết cặp biến đổi có thể xảy ra, trong đó các base vùng 2 kếtcặp với vùng 3 nhờ các cặp base ở 2 vùng này gần như bổ sung nhau Qua môhình kết cặp base biến đổi này (3-4 hoặc 2-3), sự tổ chức trình tự mRNA có thểđiều hòa phiên mã qua dịch mã của leader polypeptide Khi vùng leader đượcphiên mã, sự dịch mã leader polypeptid cũng bắt đầu Vì có 2 codon củatryptophan trong trình tự mã hóa, nên sự dịch mã nhạy cảm với số lượng tRNAtrp

đưa vào

Nếu môi trường cung cấp đầy đủ tryptophan, ribosome trượt qua codontryptophan và đi vào vùng 7.1 Sự có mặt của ribosome loại bỏ khả năng kết cặpcủa vùng khoảng 10 base ở mỗi phía của codon đang dịch mã Sự có mặt củaribosome ở vùng 2 ngăn cản nó kết cặp với vùng 3 Trong trường hợp này vùng 3kết cặp với vùng 4, tạo ra điểm kết thúc phiên mã Sự phiên mã kết thúc khi quacác uridine nằm phía sau vùng 4

Khi số lượng tRNAtrp không đủ, sự dịch mã leader polypeptide bị dừnglại đột ngột ở các codon tryptophan Sự dùng lại này ngăn cản ribosome tiến vàovùng 2, vì vậy vùng 2 được tự do sẽ kết cặp với vùng 3 làm cản trở sự hình thành

cấu trúc kết thúc Vì vậy phân tử trp mRNA hoàn chỉnh được tạo thành, chứa cả

trình tự mã hóa cho gen cấu trúc

Tóm lại, attenuation là cơ chế điều hòa tinh tế trên cơ sở điều hòa âmtính: Khi tRNAtrp đến đủ cung cấp cho sự dịch mã leader polypeptide, sự phiên

mã bị dừng, các trp enzyme không được tổng hợp Khi nồng độ tRNAtrp quá

thấp, sự phiên mã xảy ra cho đến hết, các trp enzyme được tạo nên.

Nhiều operon chịu trách nhiệm tổng hợp các amino acid khác (như