Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passiflora roetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế bằng dung môi hữu cơ phân cực

Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passiflora roetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế bằng dung môi hữu cơ phân cực tiến hành nhằm cung cấp thông tin về thành phần hóa học trong các cao chiết phân cực và hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passiflora roetida L.).

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HUỲNH THỊ TÝ

'VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BAO CUA CAY LAC TIEN

BẰNG DUNG MÔI HỮU CO PHAN CUC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60 44 01 44

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HOC

TS NGUYEN

Thira Thién Hué, nam 2016

LỜI CAM ĐOAN

“Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi,

các số liệu và kết quả nghiên cứu ghỉ trong luận văn là trung thực,

được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố

trong bắt kỳ một công trình nào khác

Họ tên tác giả

Huỳnh Thị Tý

Po

Lain van này đạc hoan thank tại phòng tí nghiệm hep chat te nbien 2“

tating Bai hoc su pham Hut

“Gái xin bay t6 long bidt on chan thank wa séu sae din TS Neguyin

Phi co là nguai đã lướng dân tan ten, chu do ra tao mei đu hien gin

Á ti: tong thoi gian thue hign ludn van

Ce xin chan thank cim on cde thay ob gido hoa Aéga nti chung va t6 Fea lưu ov nei tiếng da giip do mhiet tink dé toi hoan thank udm van

” Gat xin bay ti hinh thong tà côm m tá Ban Gm its, phng

Dav too Sau Dei hye, ting Dai ne Sue pham Hue da tow st hin

thuận (oi givin tei thực Hiện để tài

Xã ang lá xi dan đan căm on gin nh, ba be dae wi dong

vien dé tei 06 them nghi le wa say me nghien cit hhoa hoe

* Goi in ttn tong ci ox!

Cae gia luận săn

MỤC LỤC

Trang TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MUC LUC

DANH MUC CAC KY HIEU VA CHU VIET TA’

DANH MUC CAC BANG

2 Mục tiêu của đề tài

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4 Nội dung của đề tài

5 Phương pháp nghiên cứu

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

7 Cầu trúc của luận văn

1.1 Giới thiệu chung về họ Passifloraceae và chi Passiflora 8 1.1.1 Vai nét vé ho Passifloraceae 8

1.1.3 Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Passiflora " 1.2 Sơ lược về cây Lạc tiên (Passj/fora /oetida L.) 17

13.1 Cac sin phim ing dung cia mét sé loai thude chi Passiflora 22

1.3.2 Các sản phẩm ứng dụng của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.) 26

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu hái, định danh và xứ lý mẫu 31

2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 3

2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 33

2.4.2 Các dòng tế bào sai ¬ 33 2.4.3 Phuong phap

Chương 3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Định danh loài

3.3 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết .37

3.4.1 Phân lập chất từ cao chiết ethyl acetate 38

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TAT

Human hepatocellular Careinoma

Human epidermoid

carcinoma Human bronchogenic carcinoma

Human breast

adenocarcinoma Dimethyl sulfoxide Effective Concentration 50%

Effective Dose 50%

Inhibitory Concentration 50%

Retardation factor Thin Layer Chromatography Ultraviolet

Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

Phổ hồng ngoại

Hằng số tương tác tính bing Hz

Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu Ung thư gan

Ung thư biểu mô

Ung thư phổi

Ung thư vú

Nong d6 higu qua 50% Liều luong higu qua 50% Nang d6 tre ché 50%

'Yếu tố chậm trễ

ắc ký cột

Sắc ký lớp mỏng, Tài liệu tham khảo Tia tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Passiflora 6 Việt Nam "

Bảng 14 Hiệu quả gây độc tế bào của cao chiét ethanol loai Passiflora

Bảng 1.5 Hoạt tính kháng oxi hóa của Passj/lora edulis 14 Bảng 1.6 Các sản phẩm ứng dụng của một số loài thudc chi Passiflora 23 Bảng 1.7 Các sản phẩm tir cay Lac tién (Passiflora foetida L.) enn DT Bảng 3.1 Hàm lượng các cao chiết phần trên mặt đất cây Lạc tiên 37

Bang 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào các cao chiết phần trên mặt đất cây Lạc tiên 37

Bảng 33 Số liệu phổ NMR của hợp chất PFE2 (DMSO, 125/500 MHz) và

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Cảnh, lá và quả của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.) 35

Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất các cao chiết từ cây Lạc tién (Passiflora foetida L.) .36

Hình 3.3 SKLM của chất PFEI trong hệ dung môi dichlorometane:methanol [97:3] 40 Hình 3.4 SKLM của chất PEE2 trong hệ dung môi dichloromethane:methanol

Hinh 3.8 Phd 'H-NMR cua hop chat PFE2 sone hước ¬ 4

Hình 3.11 Cấu trúc của hợp chất PFE2 (daucosterol) 48

MỞ ĐÀU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, các sản phẩm từ thiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống, trong đó có y học Những năm gần đây, nhiều hợp chất thiên nhiên hoặc các sản phẩm được tổng hợp,

ban ting hop tir hop chất thiên nhiên được sử dụng hiệu quả trong việc phòng ngừa

và điều trị một số bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo

Tại Việt Nam, trong giai đoạn 2010-2015, mỗi năm có hơn 150.000 trường hợp mới mắc ung thư, trong đó có khoảng 75.000 trường hợp tử vong và con số này

có xu hướng tăng lên trong những năm tiếp theo [68] Các phương pháp điều trị ung thư thông thường như phẫu thuật, hóa trị và xa trị hay để lại tác dụng phụ Các tác dụng không mong muốn này gây ra nhiều khó chịu, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân Vì vậy, việc tìm ra các giải pháp mới trong điều trị ung thư là một yêu cầu cấp thiết

Hiện nay, cây Lạc tién (Passiflora foetida L.) dang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới Nghiên cứu ban đầu cho thấy Passiflora foetida có hoạt tính gây độc tế bào tiềm năng [ 10] Cao chiết ethanol tir la loài này thể hiện hoạt tính tốt trên dòng tế bào ung thư vú (SKBR3) với giá trị ICa, tương đối thấp [40] Bên cạnh đó, theo kinh nghiệm dân gian, Lạc tiên được sử dụng

để trị đau bụng, chữa ho, hồi hộp, mắt ngủ và suy nhược thần kinh [62], [67] [69] Vì vậy, Passi/lora foetida cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào để làm tăng giá trị của nó Đồng thời, để góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh từ loại dược liệu nảy, chúng tôi chọn đẻ tài “Nghiên cứu thành phan hoá học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passj/lora foetida L.)

ở tỉnh Thừa Thiên Huế bằng dung môi hữu cơ phân cực”

2 Mục tiêu của đề tài

Cung cấp thông tin về thành phần hóa học trong các cao chiết phân cực và

hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.),

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đắt của cây Lạc tiên (Pass/flora foetida L) ở tỉnh Thừa Thiên Huế

4 Nội dung của đề tài

~ Thu thập mẫu nguyên liệu và định danh loài

~ Xử lý mẫu, chiết xuất với các dung môi có độ phân cực tăng dần

~ Phân lập ít nhất một cấu tử từ cao chiết trong dung môi phân cực và xác định

cấu trúc hóa học cấu tử phân lập được

~ Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào tử các cao chiết

5 Phương pháp nghiên cứu

~ Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu

~ Phương pháp chiết xuất và phân lập

+ Phương pháp chiết rắn - lỏng

+ Phương pháp sắc ký cột hap thu

+ Phương pháp sắc ký lớp mỏng

~ Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được

+ Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

+ Phương pháp phô cộng hưởng từ nhân: 'H-NMR, '*C-NMR, DEPT

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Lần đầu tiên nghiên cứu để xác định thành phần hóa học các cao chiết trong dung môi phân cực và khảo sát hoạt tính gây độc tế bảo của Lạc tiên (Passjflora /oetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế nhằm giải thích kinh nghiệm sử dụng dược liệu của người dân địa phương

7 Cấu trúc của luận văn

Luận văn gồm 71 trang với 3 chương, 10 bảng, 13 hình, 75 tai liệu tham khảo

và 12 phụ lục Luận văn có bố cục như sau:

Mở đầu: 2 trang

Chương 1 Tổng quan: 22 trang

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 5 trang

Chương 3 Kết quả và thảo luận: 15 trang

Kết luận và khuyến nghị: 2 trang

Tài liệu tham khảo: 7 trang

Phu luc: 13 trang

Chương I

TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung vé ho Passifloraceae và chi Passiflora

1.1.1 Vai nét vé ho Passifloraceae

Ho Lac tién (Passifloraceae) la ho thy vật có hoa gồm khoảng 18 chỉ với hơn

630 loài, phân bố ở khu vực nhiệt đới, chủ yếu ở Nam Mỹ, Đông Nam Á, ở độ cao cách mực nước biển 3800 m Riêng ở khu vực Đông Nam Á, Campuchia có số lượng loài nhiều nhất với 167 loài, trong đó có 58 loài đặc hữu được tìm thấy cách mực nước biển 1500 ~ 2500 m, 22 loài có quả ăn được và 9 loài có giá trị thương mại [22]

Trong hệ thực vật Việt Nam, họ Lạc tiền có 2 chỉ: Passiflora, Adenia và 28 loài [3] Đây cũng là họ có số chỉ và loài đa dạng, phân bố khắp các địa phương trên

cả nước

Các loài thuộc họ Lạc tiên thuộc nhóm thực vật hai lá mầm, mọc ở dạng cây bụi, thân thảo hoặc thân leo với nhiều tua cuốn, lá nách Hoa đơn tính hoặc lưỡng

tính với ba đến năm lá đài, cánh hoa được xếp đối xứng, cấu trúc xoắn hình tua bao

quanh hoa Phần dưới nhụy hoa là bầu nhụy được nâng đỡ bởi cuống hoa, bầu nhụy

có từ ba đến năm lá noăn Các loài thuộc họ này có dạng quả nang hoặc quả hạch, mỗi quả có nhiều hạt nằm trong phần thịt quả và được bao quanh bởi áo hạt [37]

Các loài thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) ở Việt Nam được trình bày ở bảng 1.1

Băng 1.1 Danh mục các loài thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) ở Việt Nam [3]

srr Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bỗ

T Passiflora foetida L Nhãn lông

2 | Passi assiflora quandrangularis vdraneulars Dua gang tây,

mu Chùm bao dưa

3 Passiflora edulis Sims Chim bao tring

R Quảng Nam, Đà

4 Passiflora coerulea L "Nhãn lồng lam Ning, Sai Gon :

3 Passifiora laurifolia L Guỗi tây Sai Gần

© | Passiflora altebilobata HemLs | Nhan lông thuỳ cao

7 | Passifiora eberhardtii Gagn | Nhin Tong Eberhardt | Bắc Cạn

R Cao Nguyên,

8 Passiflora cupiformis Nhãn lồng hình ly Bạch Mã, Bà Nà

9 Passiflora perpera Mast Nhãn lông sai

Sa Pa, Bình Trị

10 | Passiflora wilsomi HemLs Nhãn lồng Wilson | Thiên, Quảng

‘Nam, Da Ning

1 Passiflora sumatrana Bl han Tong Sumatra Bạch Mã

1 Passifiora incarnata L Mắc mác, Lạc tiên | Hà Nội, Đà Lạt 1ã | Passiflora pertriloba Mer Nhãn Tong 3 thuy Ha Noi

14 Passjffora suberosa L Nhãn lông sube Sài Gòn

15 | Passiflora jugorum W.W.Sm Nhãn lông hợp

16 Passifiora moluccana Tổng đèn Quảng Trị

R Kon Tum, Bảo

17 Passiflora siamica 'Nhãn lồng Thái Lan Lộc, Biên Hoà

STT 'Tên khoa học Tên Việt Nam Phin bd

20 Adenia penangiana Thu digp 1a nho Biên Hoà

2 ‘Adenia poilanei Cusset Thu digp poilane

25 Adenia heterophylla Sơn, Phú Quốc <

oy | Mena ondata (Gaertn) de

wilde, + | Adenia pinnarisecta (Craib) Thu điệp xế

1.1.2 Vai nét vé chi Passiflora

Chỉ Passj/lora thuộc họ Lạc tiên là chỉ có số lượng loài lớn nhất và phô biến

nhất của hệ thực vật nhiệt đới, được tim béi Killip năm 1938 [32] Chi này có hơn

500 loài, phân bố nÌ

nơi trên thế giới như Mỹ, Đông A, Nam A, New Guinea,

Australia và New Zealand Hơn 350 loài được tìm thấy ở vùng nhiệt đới và rừng mưa Nam Mỹ, trong đó có 60 loài ăn được [49]

Chỉ Passj/lora có đặc điểm hình thái phức tạp Hầu hết các loài thuộc chỉ này

có tua cuốn, thân thảo và có dạng đây leo Lá so le, đơn hoặc kép, thủy lá giống,

hình bàn tay và một vài loài có lông mịn Một số loài có sự khác biệt giữa lá non và

lá trưởng thành về hình dáng và kích thước Các loài thuộc chi Passiflora c6 r8 moc

khá cạn, có thê quan sát thấy 60% rễ cách mặt đất 30 cm Hoa có thẻ đơn tính hoặc

lưỡng tính, màu sáng, có nhiều sợi hoặc hình khuyên phụ giữa tràng hoa và nhụy

hoa, những đặc điểm này làm hoa có hình đáng rất đa dạng Đài hoa gồm ba đến

năm lớp xếp đè lên nhau, nằm tự do hoặc ở trên lá đài, có ba đến năm nhụy dưới

bao hoa hoặc ở đầu noãn hoa Quá trình thu phan được thực hiện bởi côn tring, mau

10

sắc đẹp của hoa đóng vai trò quan trong trong việc thu hút côn trùng thụ phấn [22]

Theo Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam, Passj/lora có 19 loài, phân bố ở nhiều

vùng miễn trên cả nước: Bắc Cạn, Sải Gòn, Hà Nội, Quảng Tri, Kon Tum, Thanh

Hoá, Côn Sơn, Nha Trang, Phú Qui

ig 1.2 Các loài thuộc chỉ Passj/lora ở Việt Nam |3]

7 Passiflora foetida L Nhãn Tong

2 Passjffora quandrangularisL Đưa gan tây, Chùm bao đưa

3 Passifiora edulis Sims Chùm bao trứng

3 Passifiora coerulea L Nhãn lông lam

3 Passifiora laurifolia L Guỗi tây

6 Passifiora aliebilobata HemLs Nhãn lồng thuỳ cao

7 Passifiora eberhardiii Gagn Nhin Tong Eberhardt

8 Passiflora cupiformis Nhãn lông hình Ty

9 Passifiora perpera Mast Nhãn lông sai

10 Passifiora wilsonii HemLs Nhãn lông Wilson

1 Passifiora sumatrana BI Nhãn Tong Sumatra

12 Passifiora incarnata L Mặc mác, Lạc tiên 1B Passiflora pertriloba Mer Nhãn Tong 3 thuy

1 Passiflora suberosa L Nhãn Tong sube

15 Passiflora jugorum W.W Sm Nhãn lông hợp

16 Passiflora moluccana Tầng đèn

7 Passiflora siamica ‘han Tong Thai Lan

18 Passifiora kwantungensis Mert Nhãn lông Quảng Đông

1 Passifiora tonkinensis de Wilde Nhãn lông Bắc Bộ

1.1.3 Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Passiflora

“Theo nhiều công trình nghiên cứu trên thể giới, các chỉ trong họ Passifloraceae được sử dụng để làm thực phẩm hay làm thuốc tại nhiều nơi, trong dé chi Passiflora

, điển hình là nghiên cứu ở Án Độ, Brazil,

Trung Quốc và Việt Nam Trong y học, các loài thuộc chi Passiflora được dùng làm

được quan tâm trong vài nim gin dé

"

thuốc chữa một số bệnh như an thần, trị mắt ngủ, hồi hộp, hạ huyết áp, [69], [70]

Tuy là một chỉ có số lượng loài khá lớn nhưng chỉ mới có một số ít loài thuộc chỉ

Passiflora được các nhà khoa học nghiên cứu về hoạt tính sinh học Kết quả từ các

công trình nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Passiflora

7 Tri dai thao đường

Gây độc tếbảo | [41],2012

‘Khang oxi hoa

Kháng viêm

Trịđái tháo đường | [IS],2013

[15], 2013

Bão vệ dạ dây [8], 2015 Thin cây Khang nam 47}, 2012

7 |Passiflora bogotensis lá Trị đái tháo đường | [24], 2015

12

STT Bộ phận dùng | Hoat tinh sinh học | TLTK, nim

Hạ huyết áp (27), 2010 Giải lo âu

Kháng oxihóa | [20],2012 Kháng viêm

Quả và thân cây | Khángoxihoá | [44], 2009

[32], 2013 36], 2007

8 | Passiflora edulis Khang oxi boa) 56) 2011

[14], 2015 Giải lo âu [9], 2015

La

"¬ [16], 2013 Chống trằm cảm I9].2015

17, 2007 Khang viém B1) [14], 2015

9 | Passiflora tetrandra La Gây độc tế bào | [43], 1991

Kháng oxi hóa

10 | Passiflora ligularis | - Bột trái cây Kháng khuẩn [49], 2014

‘Tri dai thio đường

Từ bảng 1.3 kết hợp với tải liệu tham khảo, một số hoạt tính sinh học đáng chú

ý của các loài thuộc chỉ Pass/lora có thể kể đến như sau:

1.1.3.1 Hoạt tính gây độc tế bao

Nam 1991, Perry N B và các cộng sự tìm thay 4-hydroxy-2-cyclopentenone

từ cao chiét 1a loai Passiflora tetrandra Hop chat 4-hydroxy-2-cyclopentenone

được biết là có hoạt tính ức chế rất tốt cho dong tế bào ung thư máu (P-388) với giá

trị ICsạ thấp, nhỏ hơn | ug/mL [43]

Năm 2012, Nagineni S nghiên cứu in vro hoạt tính gây độc tế bào thực quản

(EAC) thir nghiệm trên chuột Nghiên cứu cho thấy cao chiét ethanol tir loai Passiflora incarnata L c6 khả năng tiêu diệt tế dòng bao ung thư này Kết quả được thể hiện ở bảng 1.4

13

Bang 1.4 Hiệu quả gây độc tế bào của cao chiết ethanol

loài Passiflora incarnata L v6i dong té bio EAC

‘Nong độ (ug/mL) | Tế bào sống sót Tếbàochết | % tế bào sống sót

Như vậy, hiệu quả gây độc tế bào phụ thuộc vào nồng độ cao chiết, nồng độ

càng lớn thì hiệu quả gây chết càng cao Khi nồng độ cao chiết ethanol đạt đến 1000

ug/mL thì sẽ tiêu diệt 100% tế bào ung thư thực quản [41]

1.1.3.2 Hoạt tính kháng oxi hóa

Nam 2010, Ingale A.G và công sự nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa từ bốn

cao chiết loai Passiflora edulis Két quả tông hợp ở bảng 1.5

Bang 1.5 Hoạt tính kháng oxi hóa của Passj/fora edulis

T_ | Cao chigt Id trong ether dau hoa 5888

2 | Cao chiết lá trong chloroform 5685

3 [ Cao chiết thân trong ether đầu hỏa 34,01

4ˆ [ Cao chiết thân trong chloroform 31,28

‘Tir bang 1.4 cho thay ca bin cao chiét déu thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa Tuy

nhiên, cao chiết chloroform tir thin loai Passiflora edulis c6 hoat tính kháng oxi hóa tốt

nhất với giá tri ICsp thấp nhất (51,28 g/mL), giá trị này cao hơn không đáng kể so với

chất chuẩn axit ascorbic (ICs = 43,04 ug/mL) Trong khi đó, cao chiết ether dau héa tir

lá có hoạt tính kháng oxi hóa thấp nhat (ICs = 58,88 g/mL) [27]

Năm 2014, Shanmugam S củng cộng sự nghiên cứu in viro trên bốn cao chiét: ether dầu hỏa, chloroform, acetone va methanol từ lá Pass/lorz subpeliara

Kết quả cho thấy ba cao chiết chloroform, acetone và methanol có hoạt tính kháng

14

oxi hóa, trong đó cao chiết acetone thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị ICzo là

27.90 ng/mL [48] Cùng năm đó, nhóm nghiên cứu của Shanmugam S.T.P tìm thấy

hoạt tính kháng oxi hóa trong hai cao chiét acetone và methanol từ bột qua

Passiflora ligularis Tuy nhiên, cao chiết acetone có hoạt tính tốt hơn cao chiết

methanol với giá trị ICạ lần lượt là 19,13 pg/mL va 23,71 mg/mL [52]

Năm 2015, André W và cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa bằng hai phương pháp DPPH và ORAC từ cao cẻ

tương ứng là 061,20 + 8,50 pg/mL va 1076 + 8S mol trolox/g Hợp chất rutin được tìm thấy trong loài nảy cũng cho giá tri ECso la 18,30 + 0,90 ug/mL khi thử

nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH [8]

Năm 2016, Shanmugam S và cộng sự thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa

ết loài Pass/flora alata có giá trị ECso

trên các loại cao chiết khác nhau từ loài Pass//lora lesehenaulrii Kết quả cho thấy cao chiết acetone từ lá cho giá trị ICs; thấp nhất (29,14 ug/mL) trong bốn cao chiết

Passiflora edulis và Passjflora mollissim Cao chiết của các loài này trong dung

dịch đệm phosphate (pH = 7) có tác dụng làm giảm sự phát triển của hai chủng nắm Trichophyton mentagrophytes và Candida albicans [27]

Nam 2014, Shanmugam S.T.P va céng su nghién ciu in vitro cao chiét

acetone từ bột cây loài Passj/lora ligularis Két quả cho biết cao chỉ:

này có khả

năng ức chế bốn chủng vi khuẩn: S parz/yphi (28 mm), S typhi A (31 mm), S typhi

8 2 mm) và K pneumonia (32 mm); kháng tốt hai chủng vi khuan C albicans

(14,85 mm) và 4 niger (13,91 mm) [52]

1.1.3.4 Hoạt tính giảm đau

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Shanmugam S cho kết quả cao chiết acetone

từ lá loài Passiflora subpeltata với liều lượng 200 và 400 mg/kg cho hiệu quả giảm

15

đau tương ứng là 50,65% và 82,73% Nghiên cứu nhận thấy cao chiết liều 400 mg/kg cho hiệu quả giảm đau đáng kể, thời gian phát huy tác dụng cũng diễn ra nhanh hơn [49] Hai năm sau, nhóm nghiên cứu này tiếp tục tìm hiểu cao chiết acetone từ lá loài assi/lora leschenauliii, kết quả cho thấy hiệu quả giảm đau 44,75

và §1,43% tương ứng với liều lượng thử nghiệm 200 và 400 mg/kg [51] Như vậy, cao chiết acetone từ lá loài Passjlora subpelrata sẽ có hiệu quả giảm đau tốt hơn Passiflora leschenaultit

1.1.3.5 Hoạt tính kháng viêm

Năm 2014, Shanmugam S nghiên cứu iw vizo trên cao chiết acetone từ lá loài

Passiflora subpeltata với liều lượng 200 và 400 mg/kg, hiệu quả kháng viêm lần lượt

là 47,08% và 81,54% Ở liễu lượng thử nghiệm 400 mg/kg, hiệu quả kháng viêm thấp hơn không đáng kể so với 10 mg/kg chất chuẩn indomethacin, 89,16% [48] Đến năm

2016, nhóm tác giả này nghiên cứu trên loài Passiflora leschenaultii, két qua là cao chiết acetone từ lá loài này cho hiệu quả kháng viêm 42,07% và 81,37%, tương ứng với liễu lượng 200 va 400 mg/kg [51]

1.1.3.6 Hoạt tính trị đái tháo đường

Việc điều trị đái tháo đường liên quan

Nam 2014, Shanmugam S.T.P cho biết cao chiét acetone tir bét qua Passiflora

su tte ché enzym a-glucosidase

ligularis cho hiệu quả ức chế tốt nhất, đạt tới 75,36%, gần tương đương với chất chuẩn acarbose (79,87%) Trước đó một năm, Montefusco-Pereira và công sự cho biết loài Pass//lora nitida ức chế ezym a-glucosidase với giá trị ICso la 6,78 + 0,31 ug/mL (72%) Như vậy, khi so sánh Passiflora ligularis va Passiflora nitida, Passiflora ligularis có khả năng ức chế enzym a-glucosidase tốt hơn, đồng nghĩa với việc loài này cho hiệu quả chữa trị đái tháo đường cao hơn [52]

1.1.3.7 Một số hoạt tính khác

Nam 2006, Ichimura và cộng sự cho biét cao chiét methanol tir loai Passiflora epalensis (10 mg/kg hoặc 50 mg/kg) hoặc lutcolin (50 mg/kg) có tác dụng hạ huyết

áp khi thử nghiệm trên chuột Phân tích định lượng bằng sắc ký lỏng - khối phổ

(LC-MS) cho thay cao chiết này chứa 20 yg/g luteolin va 41 ug/g luteolin-

glucoside Ngoài ra, cao chiết methanol còn chứa 2,40 mg/g axit 7-aminobutyric,

đây được biết là hợp chất hạ huyết áp hiệu quả [27]

16

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Hongwei L kết luận cao chiét ethanol loài

Passiflora edulis “edulis” không có tác dụng giải lo âu ở liều lượng thấp, hoạt tính này chỉ thể hiện ở liều lượng tương đối cao (> 400 mg/kg) Trong khi đó, Passiflora edulis “/lavicarpa” cho thấy hiệu quả giải lo âu đáng kế ở liều lượng 400 mg/kg, với liều lượng thấp hơn thì cao chiết này cũng không thấy hiệu quả [26]

Trong hai năm 2014 va 2016, Shanmugam S và các cộng sự đã nghiên cứ

cao chiét acetone tir la hai loai Passiflora subpeltata va Passiflora leschenaultii, két

qua cho thay Passiflora subpeltata cho higu qua ha sot tốt hơn Cụ thể như sau, với liều lượng thử nghiệm 200 va 400 mg/kg, trong 1 giờ, cao chiết loai Passiflora

subpeltata có tắc dụng giảm nhiệt độ lần lượt 0,14 va 0,38°C, trong 5 giờ, nhiệt độ

giảm 1,68 va 2,55°C [49] Đối với loài Passi/lora leschenaultii, véi liều lượng thử

nghiệm như trên, trong 1 giờ, nhiệt độ giảm lần lượt 0,14 và 0,34°C, giảm 1,05 và

Cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.) có vi trí phân loại như sau:

Ho Lac tién (Passifloraceae)

Chi Passiflora

Loài Passiflora foetida L

Passiflora foetida L 1a một loài thực vật có lá và quả ăn được trong họ Passifloraceae [4], [36]

1.2.2 Dac diém thye vat

Theo giáo sư Đỗ Tắt Lợi, cây Lạc tiên còn được gọi là cây lạc, nhãn lồng, lồng đèn, hồng liên, long châu quả, mắt mát (Đà Lạt) Lạc tiên có tên khoa học là Passiflora foetida L., thudc chi Passiflora, ho Lac tién (Passifloraceae) [4]

Lạc tiên là một loại cây mọc leo, thân mềm, trên thân có nhiều lông mềm Lá mọc so le, hình tim, dai 6 — 10 em, mép lá có nhiễu lông mịn, cuống lá dài 7 = 8 em

7

Đầu tua cuốn có dạng hình lò xo Hoa đơn, màu trắng hoặc tím nhạt với đường kính 5,5 em Lá đài màu trắng phía đưới có gân xanh và dưới lá đài có ba gân chính với nhiều gân phụ Một đĩa có hai tầng tua, mặt tua trên có màu tím trong vàng, trong cùng có lông mịn Cây ra hoa từ tháng 4 đến tháng 5, có quả trong khoảng thời gian tháng 5 đến tháng 7 Quả có dạng hình trứng có chiều dài 2 - 3 cm [2], [4]

'Passiflora foetida L có nguồn gốc từ Bắc Mỹ, sau đó chúng lan rộng ra nhiều

vùng nhiệt đới trên toàn thế giới, loài này phân bố ở độ cao 120 ~ 1000 m Ở Việt

Nam, Lạc tiên được tìm thấy ở nhiều vùng trên cả nước: Nam Bộ, Đà Lạt, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam [35]

14 16p chat chinh: gum, duéng, saponin, tannin, cardiac glycoside, alkaloid,

anthraquinon, steroid, flavonoid, phenol, cyanogenic, passifloricin, polyketide

và a-pyrone [10], [16], [19], [21]

Nam 2013, Patil A.S vi cOng su cho biét Passiflora foetida có tổng các axit bếo gồm axit linolenie (1) và axit linoleic (2) chiém tir 61,1 dén 74.8% Thém vao dé, tetraphyllin B (3) va tetraphyllin B sulphate (4) cũng được tìm thấy

trong hạt của loài này ở đảo Galapagous [11]

Axit linoleic (2) 18

Ở Việt Nam, năm 2014, Nguyễn Tắn Phát và cộng sự ở Viện Công nghệ Hoá học ~ Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết methanol từ phần trên mặt đắt cây Lạc tiên được thu hái ở tỉnh An Giang 'Từ cao chiết methanol đã phân lập được 3 hợp chất di vòng: axit indol-3-axetic (S), axit pyroglutamie (6), adenosine (7) va 1 polyol myo-inositol (8) [5]

‘Adenosine (7) Polyol myo-inositol (8)

Ở Thái Lan, năm 2015, Aussavashai S và cộng sự nghiên cứu hàm lượng

vitexin trong cao chiết ethanol từ lá loài Passjflora foetida Sự kết hợp sắc ký lớp

mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) xác định sự có mặt của

vitexin (9) trong cao chiết lá với hàm lượng từ 0,03% dén 0,31% [11]

19

đây, các công ty và bệnh viện y học cổ truyền ở Việt Nam thường thêm cồn vào Lạc tiên để pha chế thành thuốc nước ngọt Loại thuốc này có tác dụng an thần, chữa mắt ngủ và tim hồi hộp

Theo TLTK [73], quả Lạc tiên có vị ngọt, tính bình Do đó, nó có tác dung thanh nhiệt, giải độc, lợi thủy, chữa phù thũng, bạch trọe, giã đ

chữa ung nhọt 16 loét ở chân rất hiệu quả Nhờ vào những tác dụng dược lý tốt, một số bài thuốc chữa bệnh từ cây Lạc tiên được áp dụng theo kinh nghiệm dân gian:

Chữa bệnh da liễu: Lá Lạc tiên nẫu nước tắm rửa để chữa các bệnh ngoài da

Chữa bệnh kiết ly: Cây Lạc tiên rat tốt cho hệ tiêu hóa Khi bị kiết ly và tiêu

chảy có thể dùng 60 gam quả Lạc tiên, rửa sạch, sắc lấy nước, pha thêm đường, ngày uống hai lần trước bữa ăn

Chữa thần kinh suy nhược: Khi bị suy nhược thần kinh do căng thẳng, bệnh nhân có thể dùng 8 — 10 gam dây và lá Lạc tiên sắc uống Lạc tiên cũng có thê phối hợp với lá vông, lá dâu tằm, tâm sen, nấu thành cao lỏng uống, mỗi ngày dùng 2 — 5 gam, uống trước khi đi ngủ

20

Trợ tim, chữa mắt ngủ: Cây Lạc tiên được đánh giá là rất tốt cho hệ tuần hoàn,

tìm mạch Dùng day, lá Lạc tiên 20 gam, hat sen 12 gam, lá tre 10 gam, lá dâu tằm

10 gam, lá vông nem 12 gam, cam thảo 6 gam, xương bồ 6 gam, táo nhân 10 gam,

sắc nước

Ống trong ngày sẽ đem lại hiệu quả

Ngoài ra, quả Lạc tiên được dùng làm nước gidi khát do có tác dụng mat và

bổ Quả chín được bổ đôi, nạo hết ruột, ép và lọc lấy dịch quả Đường trắng 250

gam hòa với một lít nước đun sôi đề nguội, cho dịch quả vào nước đường rồi trộn

đều Nước quả Lạc tiên có mùi thơm đặc biệt, vị hơi chua, chứa nhiều vitamin, nhất

kháng khuẩn tốt hơn cao chiết quả [39]

Ở Ẩn Độ, năm 201 1, Sasikala V và cộng sự nghiên cứu hoạt tính giảm đau với cao chiét ethanol tir la Passiflora ƒoetida thử nghiệm trên chuột Liều lượng 200 mg/kg cho hiệu quả cao nhất [(13,83 + 0,48) min] ở phút 90, xắp xi với 5 mg/kg chất

chuẩn morphine sulphate [(14,67 + 0,21) min] Nghiên cứu cũng cho biết cao chiết này có hoạt tính kháng viêm, giá trị cao nhất là [(1,52 + 0,05) mL] ở liều lượng 100

mg/kg, tương đương với 10 mg/kg chất chuẩn indomatacin [46]

21

Nam 2013, Siriwardhene M.A và cộng sự nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết

từ cao chiết lá loài Passỹ/fora foetida Với liều lượng 433 mg/kg, sau 90 phút lượng

đường trong máu giảm tới giá trị trung bình 96,30 + 2,60 mg/dL, higu quả 34,4% Kết quả này tương đương với liều lượng 10 mg/kg chất chuẩn glipizide với hiệu quả đạt 34,55% [S3]

Năm 2014, Asadujjaman Md và cộng sự kết luận là cao chiết ethanol từ Passiflora foetida có hoat tinh giảm đau, hiệu quả 68,75% và 30,00% tương ứng với liều lượng 500 và 250 mg/kg Ở liều 500 mg/kg, hoạt tính này gần tương đương với liều lượng là 25 mg/kg chất chuẩn natri diclofenac, 72,50% Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho biết cao chiết này có khả năng trị tiêu chảy [10]

Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Aussavashai S tìm thấy sự có mặt của vitexin trong cao chiết lá loài Passjflora ƒoetida Vitexin được biết là hợp chất có

hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm, chống các bệnh về tuyến giáp, chống xơ cứng,

động mạch, hạ huyết áp và giải độc gan [1 1]

Theo các tài liệu tham khảo được, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nao về hoạt tính gây độc tế bào của loài Passj/lora foetida ở Việt Nam Vì vậy, dược liệu này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tinh gay độc tế bào để tìm ra các hoạt chất có tác dụng tốt

1.3 Các sản phẩm ứng dụng trên thị trường

1.3.1 Các sản phẩm ứng dụng của một số loài thuộc chỉ Passj/lora

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chi trong họ Passifloraceae được sử dụng làm

thực phẩm hay làm thuốc ở khắp nơi trên thế giới, trong đó các loài thuộc chỉ

Passifora được quan tâm trong vài năm gần đây, đáng chú ý là các nghiên cứu ở Án

Độ, Ý, Brazil [38], [42]

“Theo các tài liệu tìm hiểu được, đã có một số sản phẩm của các loài thuộc chỉ

Passiflora trên thị trường quốc tế nói chung và Việt Nam nói riêng Các sản phẩm

này đóng vai trò như thực phẩm chức năng giúp con người có cuộc sống khỏe mạnh hơn và hạnh phúc hơn Tùy theo mục đích sử dụng, các nhà sản xuất có thể tạo ra

chỉ với duy nhất một loài thuộc chỉ Pass//ora hoặc kết hợp với các

2

Passiflora „._ | Giảm lo âu và mất

Passiflora

9 incarnata vi | Dang vién| Giảm loâu

ngô

Passiflora incarnata, “Tạo cảm giác thư

10 ethanol va | P8 Dạng viên giãn MỊ ợ

nước

24

Dog { | Thue phim bé sung] Thé Nhĩ

"1 =3S& — - | (131%), nữ | Dạng viên | tang (7,29%), dinh đưỡng, Kì

Passiflora kinh va căng thing

Giảm căng thẳng,

14 incamata | Thế VIÊN | Làn đau đạ day va Dang vie Ý

Từ bảng 1.6 có thể thấy, mặc dù chỉ Passi/lora có rất nhiều loài, các nước lớn như Mỹ, Anh, Úc, chủ yếu khai thác, sản xuất và sử dụng các sản phẩm từ loài 'Passiflora incarnata Một điểm đáng chú ý nữa là các sản phẩm này hầu hết được điều chế ở dạng viên để thuận lợi cho quá trình đóng gói, bảo quản và vận chuyển 1.3.2 Các sản phẩm ứng dụng của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.)

Hiện nay, theo tài liệu tham khảo được, các sản phẩm từ loài Passiflora foetida

L chỉ được tim thấy ở thị trường Việt Nam và đã có 8 sản phẩm từ loài này, công dụng chủ yếu là giúp an thần và trị mắt ngủ Kết quả được tổng hợp ở bảng l7

26

Bảng 1.7 Các sản phẩm từ cây Lạc tiên (Passi/lora foetida L.)

Tri suy nhược thần kinh, tìm

Passiflora hồi hộp, hay nằm mơ, phụ nữ

1 foetida \ Dang cao hành kinh sớm, đau bung, ho

‘va mat nga

Passiflora

2 foetida L Dang tra Tri mắt ngủ

An thân, giải nhiệt, mát gan, trị

mắt ngủ, suy nhược thần

Passiflora

3 foetida L Dang cao |kinh, hay nằm mơ, phụ nữ hành

kinh sớm, đau bụng, ghẻ ngứa

va phi thang Trị chứng mắt ngủ, ngủ ha Passiflora mơ, phụ nữ hành kinh sớm, an ¬ foetida L., "¬

4 tim sen và ˆ_ | Dạng trà | thần, chống stress, căng thẳng

thần kinh, giúp ăn ngon bổ cam thảo đường và én định tỉnh thin R

Lá vông, lá Giảm căng thẳng than kinh, : senva | Dạngtrà | „ A

§ Pasiflora | túi lọc mắt ngủ, lo âu, mệt mỏi và hồi :

|/oerida L lá “Trị mắt ngũ, suy nhược than

6 vông, dâu Dạng cao kinh, tim hồi hộp và an thần R :

tim, nước

Passifiora foetida L., 'vông nem, lá Trị suy nhược thần kinh, hồi

7 dau, đường Dạng cao hộp và hay nim mo

BY tring, ethanol

và nước

suy nhược thân kinh, tìm hồi hộp, hay nằm mơ, phụ nữ Passiflora

8 foetida L Dạng trà | hành kinh sớm, đau bụng do :

nhiệt táo, ho do phế nhiệt, phi thũng và bạch trọc

Nhu vay, trên thị trường Việt Nam, các sản phẩm từ cây Lạc tiên khá đa dạng

về mẫu mã Các công ty chủ yếu điều chế Lạc tiên ở dạng cao để giúp người tiêu dùng dễ dàng sử dụng

1.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào [1]

Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp phương pháp MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)

và phương pháp SRB (Sulforhodamin B)

1.4.1 Phương pháp MTT

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phô biến Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmamn trên tạp chi Immunological Methods năm 1983 Theo tác giả, muối tetrazolium được ding

để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển

28

của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào tỉ thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát

O

oy triển và hoạt động của tế bào

Phuong pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào

pH do lượng dư amino axit của protein Dưới điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với lượng amino axit dư trên protein của các tế bào đã được có định bằng axit trichloroacetic (TCA) Sau đó, sử dụng bazơ yếu như tris-base (2-amino-2- hydroxymethyl-propane-I,3-diol) để hòa tan va đo mật độ quang của dịch chiết từ

tế bào một cách định lượng

29

Chương 2

ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

DOI TUQNG VA PE

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Lạc tiên (Passjflora

B Quả trưởng thành, C Quả chín

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

cột sắc ký: silica gel pha thường (Silica gel 60 cỡ hạt 0,040-0,063

mm, (230-400 mesh ASTM), Merck) Ngoai ra còn sử dụng sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC-Silieagel 60, Fass, Merck),

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

số AND GX 600, độ chính xác 0,001 gam

Cân phân tích hiện

Các dụng cụ thủy tình: cột sắc ký, pipet, đũa thủy tỉnh, cốc thủy tỉnh với nhiều thể tích khác nhau, bình chạy sắc ký

30

'Bếp điện, máy sấy, giá đỡ, máy cô đuôi dung môi RE-S2CS-I, bình chiết, máy

chiết siêu âm Amsco Relianee Sonic 550, đèn UV ở 2 bước sóng 254 nm va 365 nm

WFH-203 (Shanghai Jinghe Industrial, Trung Quéc)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu

3.3.1.1 Thu hái mẫu

~ Mẫu được thu hái tại xã Vinh Mỹ, huyện Phú Lộc, tinh Thừa Thiên Huế vào

tháng 1/2016

~ Bộ phận sử dụng: phần trên mặt đất của cây Lạc tiên

- Tiêu chuẩn lựa chọn:

+ Lá, thân và quả còn tươi

+ Loại bỏ những phần bị hư hỏng

2.3.1.2 Định danh

~ Cây Lạc tiên được thu hái đầy đủ các bộ phận như: thân, cành, lá, quả và

được xác định tên khoa học bởi nhà giáo ưu tú Đỗ Xuân Cẩm, nguyên giảng viên Phân loại học Thực vật, trường Đại học Nông lâm Huế

~ Ghi chép tắt cá những thông tin về loài nghiên cứu như: mô tả hình thái, màu sắc quả, nơi phân bố và môi trường sống, tình trạng của cây trong tự nhiên

~ Chụp ảnh cành mang quả, ảnh chụp riêng quả từ giai đoạn mới hình thành

đến khi chín Mẫu được sử dụng để phục vụ công tác xác định tên khoa học

2.3.1.3 Xứ lý mẫu

Phan trên mặt đất của cây Lạc tiên sau khi thu hái, tiến hành loại bỏ các phần

bị sâu bệnh, nắm mốc, vàng héo, úa dập cũng như các loài thực vật ký sinh khác

Sau đó rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50-60°C và xay thành bột thô để hành chiết xuất, phân lập các hợp chất

2.3.2 Phương pháp chiết xuất

Dược liệu sau khi đã xử lý

‘cue tang dan: n-hexane, dichlorometane, ethyl acetate va methanol Méi dung méi

hợp được chiết với các dung môi có độ phân

ngâm 5 lần, mỗi lần ngâm trong 24 giờ, 12 giờ khuấy 1 lần (dung môi ngâm chiết

31

phải ngập mẫu bột được liệu từ 3 em đến 5 em) Dịch chiết của từng dung môi sau

mỗi lần ngâm được gộp lại, lọc và cô đuôi dung môi để thu được các cao chiết tương ứng

'Hàm lượng tương đối các cao chiết được tính theo công thức sau:

Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột hắp thu với phương pháp

nhồi cột ướt Theo dõi quá trình rửa giải bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

2.3.3.1 Sắc ký cột hấp thu

Nguyên tắc: Sắc ký cột hắp thu dựa trên sự phân bồ khác nhau của các cấu tử

trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn Trong đó, pha động là chất lỏng chảy qua, pha tĩnh là những hạt rắn, nhuyễn mịn, có tính trơ được nhỏi trong cột thủy

tình Sự hấp thu xảy ra do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, tương

tác giữa những phân tử có mang các nhóm phân cực đối với pha tĩnh rắn là chất rất phân cực Nhờ vậy mà có thể triển khai dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đôi từ yếu đến mạnh [6]

32

Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử vanilin phun đều lên bản mỏng rồi sắy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi lên màu [6]

2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

'Việc xác định cấu trúc của hợp chất tỉnh khiết được thực hiện thông qua các tính chất hóa lý và phân tích dữ liệu các phổ

Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy FT-IR Prestige spectrometer (Shimazdu, Japan) tại khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Huế

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 'H-NMR, '”C-NMR, DEPT được đo trên máy Bruker AMS00 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hoá học, Viện Han lim Khoa hoc

và Công nghệ Việt Nam

Kết quả biện luận được khẳng định sau khi giải phổ và so sánh với tài liệu

trong các nghiên cứu đã được công,

2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào [23| |48|

Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành tại Phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học và phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp

chất thiên nhiên

2.4.1 Thiết bị nghiên cứu

Tủ ấm CO; (INNOVA CO-170); Tủ sấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm

(Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -25°C, -80°C; Buồng

đếm tế bảo (Fisher, Hoa Kỷ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo cquản tế bao và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.4.2 Các dòng tế bào

Các dòng tế bảo ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC (American Type

Culture Collection) gdm: KB (Human epidermic carcinoma) - ung thư biểu mộ, là dòng luôn được sử dụng trong các phép thứ độc tế bảo, Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma) ~ ung thy gan; LU (Human lung carcinama) ~ ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) — ung thư vú

2.4.3 Phương pháp

Phuong pháp thử độc tế bào ¿ vo được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

33

(NCD) xác nhận là phép thử độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ưng thư ở điều kiện in viro

Các dòng tế bảo ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần tần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO;; 37°C; độ âm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc và đặc tính của các dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển

cũng khác nhau Tế bảo phát triển ở pha lo sẽ được sử dụng để thứ độc tính

"Thử độc tế bào: 200 ul dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 10 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bảo Hep-

G2, MCF-7, KB, LU Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng

là 128 g/mL; 32 pg/mL; 8 pg/mL; 2 wgímL; 0,5 wg/mL Ù 372C, 5% CO; 3 ngày Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 gl dung dịch tế bào 3 x 10 tế bao/mL Elliipticine (sigma) được dùng làm chất tham khảo (đối chứng âm)

Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2 mg/mL ở 37°C trong 4 giờ; loại môi trường Thêm 100 wl DMSO lắc đều đọc kết quả với bước sóng 540 nm trên máy

spectrophotometter Genios TECAN

Phan trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán

dựa trên số liệu do mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

Giá trị ICạy được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát trién

của tế bào bằng phần mềm miy tinh table curve

34