Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu xác định NanoCurcumin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mục tiêu của đề tai Nghiên cứu xác định NanoCurcumin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là xây dựng quy trình phân tích định lượng NanoCurcumin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao, là phương pháp hiện đại, có độ nhạy cao

IÊN CỨU XÁC ĐỊNH NANO CURCUM

MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NANG BANG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TRONG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Thừa Thiên Huế, năm 2016

IÊN CỨU XÁC ĐỊNH NANO CURCUM

MỘT SÓ LOẠI THỰC PHAM CHỨC NANG BANG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

MA SO: 60440118

LUAN VAN THAC SI HOA HOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS NGÔ VĂN TỨ

Thừa Thiên Huế, năm 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng

và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác,

Tác giá

Nguyễn Thị Quỳnh Chỉ

và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Xin chân thành cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo Trường Đại học

Sư phạm Huế, phòng Đảo tạo Sau đại học đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học Cao học và thực hiện luận van,

Tôi xin bảy tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các anh chị tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt luận van nay

Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng, tôi xin được kính chúc quý thầy cô, gia đình, các anh chị và các bạn sức khỏe, thành công và hạnh phúc

Chân thành cảm ơn!

Tác giả

Nguyễn Thị Quỳnh Chỉ

MUC LUC Trang phu bia

Lời cam đoan

Lời cám ơn

MỤC LỤC =

DANH MUC CAC TU VIET TAT

DANH MUC CAC BIEU BANG "

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH =

MỠ ĐẦU

NOI DUNG

CHUONG 1 TONG QUAN LY THUYET

1.1.Tông quan về thực phẩm chức năng

1.1.1 Khái niệm

1.1.2 Phân loại

1.1.2.1 Phân loại theo phương thức chế biến

1.1.2.2 Phân loại theo dạng sản phâm

1.1.2.3 Phân loại theo chức năng tác dụng

1.1.2.4 Phân loại theo phương thức quản lý

1.1.2.5 Phân loại theo Nhật Bản

1.1.3 Vai trò và ứng dụng

1.1.3.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống

1.1.3.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc

2I 2

1.2.4 Tác dụng được lí

1.2.5 Nguồn cung cắp Curcumin

1.2.6 NanoCureumin

1.3 Một số nghiên cứu về định lượng Curcumin

1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ki long higu nang cao HPLC

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC

1.4.2 Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC

1.4.2.1 Giai đoạn tách —

1.4.2.2 Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích

1.4.3 Detector trong HPLC

1.4.4, Phương pháp định lượng trong HPLC

1.4.4.1 Diện tích và chiều cao peak

2.3, Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản

2.3.2 Xây dựng qui trình phân tích Curcumin

2.3.2.1 Xử lý mẫu phân tích

2.3.2.2 Khảo sát các điêu kién HPLC

2.3.3 Tham định phương pháp phân tích

2.3.3.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống HPLC

2.3.3.2 Tính đặc hiệu

2.3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính

2.3.3.4 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

2.3.4 Áp dụng phân tích Cureumin trong một số mẫu thực phâm chức năng,

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Al

3.1 Xây dựng qui trình phân tích Curcumin 42 3.1.1 Xử lý mẫu phân tích —_ ern AD

3.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc kí - „2

3.1.2.1 Chuẩn bị dung dịch phân ích ¬ - 42 3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH của dung dich đệm AB 3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pha động 45 3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 48 3.2 Thẩm định qui trình phân tích Curcumin 50 3.2.1 Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 50 3.2.2 Tính đặc hiệu của phương pháp SI 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 52 3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 33 3.2.5 Xác định độ lặp lại của phương pháp 2-22-2222 “4 3.2.6 Xác định đô đúng của phương pháp xây dựng 56 3.3 Xây dựng quy trình phân tích nnn 58

3.4.1 Áp dụng qui trình phân tích hàm lượng Nano Cureumin trong một số loại thực phẩm chức năng được bán trên thị trường Thừa Thiên Huế 59 3.4.2 Đánh giá kết quả phân tích hàm lượng NanoCurcumin trong một số loại

thực phẩm chức năng được bán trên thị trường Thừa Thiên Huế 63

KẾT LUẬN VÀ KIỀN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 2222122122110 de 68 PHY LUC PL

DANH MỤC CÁC TỪ VIET TAT

STT [ Ký hiệu "Tên tiếng anh "Tên tiếng việt

1 [ACN | Acetonitrile ‘Acetonitril

2 [AcOH | Acetyl hydroxit ‘Axit axetic

3_|CAS | Chemical Abstracts Service Hiệp hội hoa chat Hoa Ky

4 [DPL | Dilution Độ pha loãng

5 [BKSK— [Chromatographic conditions Điều kiện sắc ký

5 Yuppie | Hihpsfbrmaneehqud Sic ky long hiệu năng cao

chromatography

7 [LOD | Limit of detection GiGi han phát hiện

8 |TOQ | Limit of quantitation Giới hạn định lượng

MeOH | Methanol Methanol

10 [PDA | Detector photodiode array Detector mang diot phat

quang

TT [Ppb——[Panperbilion Phân tỉ

12 [Ppm |Panpermilion Phân triệu

13 [RSD | Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

14 | TPCN | Functional food "Thực phẩm chức năng

DANH MỤC CÁC BIEU BANG

2 | Bang 1.2 | Phân biệt TPCN và thực phẩm truyền thông 16

3 | BảngI.3 | Phân biệt TPCN và thuốc 7

Một số nghiên cứu định lượng Cureumim băng

4 | Bang 1.4 | phuong phap HPLCsir dung detector PDA vi UV-| 28

vis Bang 15_| Diện tích peak và nông độ 3

6 | Bảng3.1 | Cách pha các dung dịch chuẩn 4

Hệ số đổi xứng peak của các tỷ lệ hệ dung môi pha

7 | Bảng32 động ee ý x

8 | Bảng3.3 | Các thông số cơ bản ở tốc độ đồng khác nhau (n=3) | "49

9 | Bảng3.4 | Các thông số sắc ky cia peak Curcumin 50

Sự tương quan giữa diện tích peak và nông độ chất

10 | Bảng3.5 phan tich -_ pr k 53

TT | Bang3.6 | K& qua khảo sát độ lặp lại trên mẫu TPCN 35

12 | Bảng3.7 | Độ lặp lại của phương pháp phân tích 35

13 | Bang3.8 | Kếtquả diện tích peak khảo sát độ đúng 37

14 [ Bảng3.9 | Kết quả khảo sátđộ đúng trên mẫu TPCN (n=3) 5g

15 [ Bảng 3.10 | Thông tin về các mẫu TPCN 60

Kết quả phân tích hàm lượng Nano Cureumin trong,

16 | Bang 3.11 một số mẫu TPCN bằng phương pháp HPLC it : 61

Kết quả TB (5) so với hàm lượng ghỉ trên nhãn của

17 | Bảng3.12 10 miu TPCN l 6

Kết quả kiếm tra hàm lượng NanoCurcumin tron;

18 | Bảng3.13 mẫu TPCN ` , SH ø

ĐANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

STT[ Hình Tiêu đề Trang

1 Hình 1.L Thực phâm chức năng được sử dụng rộng rãi trên TG i

2 | Hình12 | Mỗi quan hệ giữa thực pham, TPCN va thudc 15

3 Hình 1.3 | Minh hoa cac dang sản phâm TPCN chứa Curcumin 19

4 | Hình14_ |Một số loại TPCN chỉ chứa Curcumin 20

3 | Hinh 1.5 | Một số loại TPCN chỉ chứa NanoCurcumin 20

Một số loại TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin

Một số TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin và các

8 | Hình1.8 | Cấu trúc hóa học của Curcumin 2I

9 Hình 1.9 | Dạng keto và cnol của Curcumin 2

10 [ Hình 1.10 | Tác dụng phòng và chỗng ung thư của Curcumin 2

Một số loại cũ nghệ

a Hinh 1.11 23

(từ trái sang: nghệ đỏ, nghệ vàng, nghệ đen )

Nano Curcumin điêu trị hiệu quả hâu hêt các bệnh

12 | Hình 1.12 24

mãn tính Tác dun; hòng và chông ung thư của Nano

Tính tan trong nước của Nano Curcumin va

15 [ Hình 1.15 [Minh họa độ hập thu tot ciia Nano Curcumin 26

Quy trình sản xuất Cumar Gold Nano Curcumin đâu

Minh hoa quá trình tách các chat A va B trong cot

22 | Hinh3.1 | Sơ đồ xử lý mẫu 42

Sắc ky đồ Khảo sát pH dung dich đệm:

(a) pH = 3; (b) pH = 3,5; (c) pH Sắc kỹ đồ khảo sát thành phân pha dong:

26 | Hinh 3.5 | Sắc ký đồ tính tương thích của hệ thống 51

2 | mahas |ŠtE kí đồ của Ômeumin trong mẫu ting (a) vi miu |

trắng thêm chuẩn nồng độ Ippm (b)

29 | Hinh 3.8 | Sic ky 43 LOD tai nông độ0,005 ppm s4

30 | Hinh 3.9 | Sắc ky đồ xác định độ lap lại của hệ thông, 35

Sắc kí đỗ xác định độ đúng của mẫu thử (a); mẫu

31 | Hình 3.10 | thêm chuẩn 8ppm (b); mẫu thêm chuẩn 10 ppm (); |_ 57

mẫu thêm chuẩn 12ppm (d)

32 | inn 3.11 [UY Hanh Phan ch Nano Curcumin tong TPCN |,

bing HPLC

33 | Minh 3.12 | Hàm lượng Nano Cureumin trong các mẫu TPCN @

truyền trong gia đình, chữa được nhiều bệnh khá:

làm cao dán nhọt; thoa chống vết thương tụ máu; làm mau lành sẹo; trị viêm gan; vàng da; bệnh loét dạ dày; loét ngoài da; bệnh hen suyễn; chữa bỏng [16]

Ngày nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nghệ còn có thể dùng

để hỗ trợ điều trị và ngăn ngừa nguy cơ ung thư Nghệ có nhiều đặc tính quý giá như vậy là nhờ thành phần hóa học của nó có chứa Curcumin|42], [43], [47]

Cureumin là thành phần chính của Curcuminoit ~ một chất trong củ nghệ Nó

là chất tạo màu vàng cho củ nghệ Curcumin là một trong những chất chống viêm, chống oxi hóa, chống lão hóa điên hình Nó cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn như virut HP, viêm gan B, C rất cao Đặc biệt, nó là chất có khả năng ngăn

chặn ung thư và loại bỏ các loại men gây ung thư trong thức ăn và nước uống

451147]

'Với những tác dụng sinh học quý giá, lại có nguồn gốc tự nhiên, an toàn nên

Cureumin ngày cảng được quan tâm và sử dụng rộng rải Tuy nhiên, theo Kawanishi et al (2005), Curcumin cũng giống như các chất chống oxy hóa khác, là

con dao hai lưỡi Các nghiên cứu lâm sàng trên người với 2-12g Curcumin cho thấy

các tác dụng phụ như buồn nôn, tiêu chảy, rồi loạn chuyển hóa sắt và chặn protein hepcidin, có khả năng gây ra thiếu sắt ở các bệnh nhân mẫn cam[43].Trong khi đó,Curcumin chỉ chiếm 0,3-1% về khối lượng của củ nghệ Để chữa được bệnh thì

'bệnh nhân phải uống liên tục tới 12-20g Curcumin, tương đương với 4-6 lạng bột

nghệ Đây là liều rất cao, Curcumin lại có hương vị hơi cay nóng, hơi đắng, có mùi

mù tạc nên gây khó chịu và kích ứng đường tiêu hóa Bên cạnh đó, độ tan và độ hấp

A GS TS Đào Văn Phan cho biết: “Curcumin tuy uống với

liều cao nhưng hàm lượng trong máu và nơi tác dụng lại vẫn thấp Do Curcumin không tan trong nước, dễ bị phá hủy ở ruột, để bị chuyển hóa và thải trừ ở gan, nên chỉ hấp thu vào máu được 2 đến 5%°42] Cho nên, để đạt được nồng độ trong máu

đủ để phát huy hiệu quả thì bệnh nhân phải sử dụng liều cao Curcumin hoặc phải sử

dụng các dạng bào chế công nghệ cao để tăng độ hắp thu vào máu Điều này đã dẫn đến sự ra đời và phát triển mạnh mẽ của các loại thực phẩm chức năng chứa

Curcumin 6 dang nano

Thực phẩm chức năng chứa Curcumin là các sản phẩm có nguồn gốc tự

nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm Curcumin Nó

được chế tạo ở dạng viên, chứa hàm lượng Curcumin cao, dễ uống, không gây khó

chịu và dễ hấp thu hơn Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại thực phẩm chức

năng chứa Cureumin như: CumarGold, Curcumin with Piperine; Curcucaroten, 'Viên Curcumin, Viên nang nghệ vàng Curcumin do các doanh nghiệp có thương hiệu và uy tín trên thị trường; được Bộ Y tế cắp phép đầy đủ

Thế nhưng, vẫn tồn tại nhiều loại thức phẩm chức năng chứa Curcuminchưa được kiểm định chất lượng, thậm chí là làm giả được quảng cáo rằm rộ và bán trên thị trường, gây nguy hiểm cho sức khỏe của người dùng

Vì vậy, phân tích và đánh giá hàm lượng Curcumin trong các loại thực phẩm

chức năng rất quan trọng Người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp trắc quang, sắc ký, hóa học Trong đó, phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có độ chính xác và độ nhạy cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp và dễ thực hiện

Trên thế giớiđã có nhiều công trình nghiên cứu về Curcuminbằng nhiều phương pháp, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho kết quả phân tích tốt và áp dụng trên nhiều đối tượng như:nghệ, trong sữa tươi, thuốc tự nhuộm

tự nhiên, gia vị, rượu nghệ, thuốc cổ truyền Trung Quốc trong huyết thanh của

người Ở Việt Nam lệc nghiên cứu xác định hảm lượng Curcumin con han

chế, chưa được quan tâm rộng rãi và chủ yếu mới áp dụng trên đối tượng nghệ và phẩm màu

Xuất phát từ những lí do trên, nhằm xác định hàm lượng Nano Curcumin để góp phần hiệu quả vào công tác kiểm tra chất lượng một số loại thực phẩm chức năng, chúng tôi thực hiện dé tai “Nghién cứu xác định NanoCurcumin trong một

số loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình phân tích định lượng NanoCurcumin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao, là phương pháp hiện

đại, có độ chính xác vả độ nhạy cao

2 Phân tích Nano Curcumin trong một số loại thực phẩm chức năng chứa Curcumin duge ban trén thị trường Thừa Thiên Huế

10

NỘI DUNG

CHUONG 1 TONG QUAN LY THUYET

1.1 Tổng quan về thực phẩm chức ning

“Thực phẩm không chỉ giúp duy trì sự sống, mà còn có khả năng tăng cường

sức khỏe và giảm thiểu các bệnh mãn tính do mắt cân bằng dinh dưỡng Do đó vấn

đề tìm hiểu và chế biến các loại thực phẩm có thành phần cấu tạo tác dụng tích cực

thoa giữa thực phẩm và thuốc nên nhiều khi người ta còn gọi là thực pl

Năm 1991, TPCN được đưa ra với ý nghĩ ban đầu là “những thực phẩm chế

biển chứa các hoạt chất có thể giúp một vài chức năng cơ thể hoàn thành nhiệm vụ

khả quan hơn ngoài công dụng dinh dưỡng ”

Cho đến nay, chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về TPCN, đã có nhiều hội nghị quốc tế và khu vực về TPCN Mặc dù chưa được định nghĩa thống nhất, nhưng thuật ngữ '“Thực phẩm chức năng” đã được sử dụng rộng

rãi ở nhiều nước trên thể giới.

~ Theo viện Y học Hoa Ky[45]:

“Thực phẩm chức năng là nhữnng thực phẩm có chứa các chất có khả năng

tốt cho sức khỏe Các thực phẩm này bao gầm bắt cứ thực phẩm chế biến hoặc

thành phần nào có thể cung cấp lợi ích cho sức khỏe ngoài giá trị dinh dưỡng cố

đượcchứng mình một cách khoa học là có thẻ cung cắp những lợi ích sinh học và có

khả năng giảm thiểu rủi ro mắc các bệnh mãn tính ”

~ Theo tổ chức y tế Hàn Quốc|39|:

“ Thực phẩm chức năng là các thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng và các chất khác đưới dạng cô đặc, có tác dụng nuôi sống hoặc sinh học với mục đích phụ

thêm cho thực phẩm tự nhiên ”

~ Theo hiệp hội thực phẩm sức khỏe và dinh dưỡng bộ y tế Nhật Bản 139]:

“Thực phẩm chức năng là thực phẩm bỏ sung một số thành phân có lợi hoặc loại bỏ một số thành phân bắt lợi, việc bồ sung hay loại bỏ phải được cân nhắc và

chứng minh một cách khoa học và đượcBộ Y tế cho phép xác định hiệu quả của

thực phẩm đối với sức khỏe "

~ Tại Việt Nam, theo thông tư số 08/TT-BYT ngày 23-08-2004 của Bộ Y 'Tế|45]:

“Thực phẩm chức năng là thực phẩm để hồ trợ các chức năng của các bộ

phận trong cơ thể, có tic dụng dinh dưỡng tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng, sức đề kháng và giảm bởi nguy cơ bệnh "

Một số tên thườn a thực phẩm chức năn:

~ Ở các nước Châu Á (Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản ) phổ

các tên gọi như TPCN (Funetional foods), thye phim bé sung (Food Supplement), sản phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Product), the phim dac biét (Food for Special use), sản phẩm dinh dưỡng y học (Medical Supplement)[41]

sit dung

~ Tại My, Châu Âu và cả Trung Quốc gần giống nhau khi chia thành thực phẩm bổ sung (Dietary Supplement), thue phim y hoc/diéu tri (Medical Supplement

~ tại Mỹ và Trung Quốc) hay thực phẩm thuốc (Nutraceuticals — tai Chau Au)[41] 1.1.2 Phan loại

Theo PGS.TS Trần Đáng- Chủ tịch Hiệp hội Thực phẩm chức năng Việt Nam: hiện nay, ở Việt Nam có 5 cách phân loại phân loại TPCN

1.1.2.1 Phân loại theo phương thức chế biến [41]

Trong phương pháp phân loại này, TPCN được chia thành bốn loại nhỏ hơn

là nhóm sản phẩm bổ sung vitamin, bổ sung khoáng chất, bổ sung hoạt chất sinh học và nhóm sản phẩm được bào chế từ thảo được

Béng 1.1 Các nhóm sản phẩm phân loại theo phương thức chế biến

Nhóm sản phẩm: Cúc sản phẩm thuộc nhóm

BO sung vitamin | - Các loại nước trái cây với những hương vị khác nhau cung

cắp nhu cẩu vitamin C, E, - caroten ở Anh

-Các dạng viên uống tiện dụng như One a day, Centrum cardio

Bỗ sung khoáng | ~Muổi bồ sung iot

chất ~ Các loại bánh kẹo được bỗ sung canxi, vitamin

~ Sữa bột được tăng thêm axit folic, vitamin, khoáng chất

~ Nước tăng lực bổ sung vitamin và khoáng chất

~ Các viên như canxi, magie, kẽm, sắt

Bồ sung sinh học | - Sữa hoặc thức ăn trẻ em có bô sung DHA, EPA,

Bảo chế từ thảo | - Viên tảo, linh chỉ, nhân sâm, đông trùng hạ thảo, trà Hà Thủ

1.1.2.2 Phân loại theo dạng sản phẩm [41]

“Theo cách phân loại này có 2 dạng:

+ Thực phẩm ~ thuốc (Food ~ Drug): có dạng viên (viên nén, viên nhộng, viên sủi, viên hoan ), dạng nước, dang bột, dạng trà, dạng rượu, dạng cao, dang kẹo, dạng thực phẩm cho mục dich đặc biệt

l3

+ Thức ăn - thuốc (thức ăn bổ đưỡng, món ăn thuốc, món ăn chữa bệnh )

eồm: cháo thuốc, món ăn thuốc, món ăn bổ dưỡng, canh thuốc, nước uống thuốc

1.1.2.3 Phân loại theo chức năng tác dụng [41J

“Theo cách phân loại nay chia TPCN thành 26 dạng khác nhau

Đó là các nhóm sản phẩm hỗ trợ chồng lão hóa; hỗ trợ tiêu hóa; hỗ trợ giảm

huyết áp; hỗ trợ giảm đái tháo đường; tăng cường sinh lực; bổ sung chất xơ; phòng ngừa rối loạn tuần hoàn não; hỗ trợ thần kinh; bổ dưỡng; tăng cường miễn dich; giảm béo; bổ sung canxi, ngăn ngừa loăng xương; phòng ngừa thoái hóa khớp; hỗ trợ làm đẹp; bổ mắt; giảm cholesterol; hỗ trợ điều trị ung thư; phòng chống bệnh Gout; giảm mệt mỏi, stress; hỗ trợ phòng và giải độc; hỗ trợ an thần, ngăn ngừa mắt ngủ; hỗ trợ phòng ngừa bệnh răng miệng; hỗ trợ phòng ngừa bệnh nội tiết; hỗ trợ tăng cường trí nhớ và khả năng tư duy; hỗ trợ phòng chống bệnh tai, mũi, họng và

hỗ trợ phòng chống bệnh về da

1.1.2.4 Phân loại theo phương thức quản lý [41]

'Cách phân loại này tùy thuộc sản phẩm có phải đăng ký hay không,

+ Các sản phẩm TPCN không phải đăng ký thì do cơ quan quản lý thực

phẩm ban hành

+ Các sản phẩm TPCN phải đăng kỷ và Cục An toàn vệ sinh thực phẩm (Bộ

Y tế) chứng nhận và cấp phép lưu hành thì do cơ quan quản lý thực phẩm trung

ương chịu trách nhiệm

1.1.2.5 Phân loại theo Nhật Bản [41]

“Theo cách phân loại phổ biến tại Nhật Bản thì TPCN được chia làm 2 nhóm: + Nhóm các sản phẩm công bố về sức khỏe, gồm:

* Loại 1 là hệ thống Foshu (food for special health use) - thực phẩm dùng cho mục đích đặc biệt

+ Loại thứ 2 là sản phẩm có khuyến cáo chức năng dinh dưỡng (FNFC) ~ nhóm sản phẩm nhằm cung cấp các chất dinh dưỡng (vitamin, khoáng chit) cin

thiết cho sự tăng trưởng lành mạnh và phát triển, duy trì sức khỏe

+ Nhóm thực phẩm đặc biệt, bao gồm: thực phẩm cho người ốm; sữa bột trẻ em; sữa bột cho phụ nữ có thai và cho con bú; thực phẩm cho người già nhai nuốt khó

* Ngoài ra, tùy theo hàm lượng chất dinh dưỡng được đưa vào mà TPCN có thể được phân chia ra làm các loại cơ bản sau đây|45]

~ Thực phẩm chức năng bổ sungvitamin và khoáng chất

~ Thực phẩm chức năng bổ sung chất xơ

~ Thực phẩm chức năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường tiêu hóa

~ Thực phẩm chức năng bổ sung các chất dinh dưỡng đặc biệt khác

~ Thực phâm chức năng loại bỏ bớt một số thành phân

~ Các thực phẩm cho nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt

~ Thực phẩm chức năng giảm cân

Tuy nhiên, TPCN không phải là thuốc, không thể thay thế thuốc chữa trị

'bệnh Thực phẩm chức năng được hiểu như là khoảng giao thoa giữa thực phẩm và

thuốc, nên còn gọi là thực phẩm thuốc (Food- Drug) Cho nên cần phải phân biệt TTPCN và thực phâm truyền thông; TPCN và thuốc

“Thực phẩm chức năng là sự kết hợp lữa thuốc và thực phẩm bổ sung Hình 1.2 Mối quan hệ giữa thực phẩm, thực phẩm chức năng và thuấc

15

1.1.3.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền tl

TT | Tiều chí ] Thực phẩm truyền thong Thực phẩm chức năng

T [Chức năng [Cung cấp các chất dinh | Cung cấp các chat dinh dường

dưỡng, Chức năng cảm quan

Thỏa mãn về nhu cầu cảm | Lợi ích vượt trội về sức khỏe (giảm quan cholesterol, giảm HA, chống táo

bón, cải thiện hệ VSV đường ruột )

2 | Chếbiến | Chế biển theo công thức | Chế biến theo công thức tỉnh (bỗ

thô (không loại bỏ được | sung thành phần có lợi, loại bỏ thành

chat bat lợi) phan bat lợi) được chứng minh khoa

học và cho phép của cơ quan có

thâm quyền

3 [ Tác dụng | Tạo ra năng lượng cao Ït tạo ra năng lượng

tạo năng

lượng

4| Liễu dùng | Số lượng lớn Số lượng rất nhỏ

5ƒ Đối tượng | Mọi đổi tượng Mọi đối tượng

người giả, trẻ em, phụ nữ man kinh

6 [Nguồn gốc | Nguyên liệu thô từ thực | Hoạt chất, chất chiết từ thực vật,

nguyên _ | vật, động vật (rau, củ, quả, | động vật (nguồn gốc tự nhiên)

liệu _ [thịt cá, trứng ) có nguồn

gốc tự nhiên

7 | Thời gian | Thường xuyên, suốt đời _ |Thường xuyên, suốt đời

phương |Khỏ sử dụng cho người | Có sản phẩm cho các đối tượng đặc

thức dùng | ốm, già, bệnh lý đặc biệt biệt

1.1.3.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc

Hiệp hội Thực phẩm chức năng Việt Nam cũng đã có những so sách hết sức

cụ thể giữa thực phẩm chức năng và thuốc, thể hiện 6 bang 1.3

Bang 1.3 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc [39J'

T | Dyavio |Tã sản phẩm đùng để hỗ trợ (phục | Tà chất hoặc hỗn hợp chất định nghĩa | hồi, tăng cường và duy trì) các | dùng cho người nhằm mục

chức năng của các bộ phận trong cơ | dích phòng bệnh, chữa

thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo | bệnh, chuẩn đoán bệnh

cho co thé tinh trạng thoải mái, | hoặc điêu chỉnh chức năng

tăng cường đề kháng và giảm bớt | sinh lý cơ thể, bao gồm nguy cơ bệnh tật thuốc thành phẩm, nguyên

liệu làm thuốc, vắc - xin, sinh phẩm y tế trừ TPCN

2 Công bô | Là TPCN Là thuộc

trên nhãn _ | (sản xuất theo luật thực phẩm) (vì sản xuất theo luật dược)

của nha SX

3 | Him Iugng | Khong quá 3 lan mire nhu cầu hàng | Cao

chất, hoạt | ngày của cơ thể

7 | Digukign | Ban Ig, siGu thi, truce tp, da cap | Tai hiệuthuốc có đượcsĩ

8 | Cách dùng |- Thường xuyên, liên tục ~ Từng đợt

- Không biến chứng, không hạn | - Nguy cơ biến chứng, tại

9 | Nguôn gốc, | Nguôn gốc tự nhiên ~ Nguôn gốc tự nhiên

'Trong thời kỳ công nghiệp hóa, đô thị hóa phát triển đã làm cho nhu cầu sống

đẹp, sống khỏe của con người ngày càng tăng Đồng thời, nó cũng dẫn tới 4 thay đổi

cơ bản là: phương thức làm việc, lối sống sinh hoạt, lối tiêu dùng thực phẩm (chủ

yếu là thực phẩm chế biến) và môi trường Các bệnh mãn tính phổ biến cũng từ đó

mà ra Đồng thời, do nguy cơ mắc bệnh với người cao tuổi lớn hơn nên sự già hóa

bệnh mãn tính không lây ngày càng phổ biến Điều này khiến cho nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng để có được sức khỏe và dân số cũng là nguyên nhân khiến c:

kéo dài tuôi thọ cũng tăng dần

Theo báo cáo “Nghiên cứu thị trường toàn cằu về TPCN: Thực phẩm bồ sung hoạt chất từ thảo được sẽ trở thành thị trưởng lớn nhất trong năm 2020° do Persistence công bố mới đây, thị trường TPCN toàn cầu đã đạt 109,8 tỷ USD trong năm 2013 Với tốc độ tăng trưởng dự kiến 7,4%/năm, đến năm 2020, thị trường TPCN toan cau sé dat giá trị dự kiến khoảng 180 tỷ USD

Không nằm ngoài xu thế chung của thể giới, thị trường TPCN Việt Nam đã

có bước tăng trưởng mạnh mẽ trong những năm gần đây Từ chỗ chỉ có vài sản phẩm cuối thế kỷ XX, đến nay số lượng TPCN trên thị trường đã đạt trên 7.000 sản phẩm với sự tham gia của khoảng 3500 doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh TPCN

Hiệp hội thực phẩm chức năng Việt Nam xác định, thị trường TPCN Việt Nam hoàn toàn có cơ hội đề phát triển thành một ngành kinh tế - y tế mũi nhọn với

18

những sản phẩm chất lượng, đám bảo an toàn và hiệu quả cao trong việc phòng ngừa, hỗ trợ điều trị bệnh tật cho người dân Việt Nam[38]

'Từ đó, Hiệp hội đã đặt ra các mục tiêu đến năm 2020 và tằm nhìn chiến lược

đến năm 2030 Trong các mục tiêu đến năm 2020, Hiệp hội xác định, chỉ tiêu quan

trọng nhất được đưa ra là nâng số người trưởng thành sử dụng TPCN thường xuyên

từ 43% như hiện nay lên khoảng 60% Về sản xuất, Hiệp hội sẽ phối hợp với các

bộ, ban, ngành và các doanh nghiệp liên quan để hình thành thêm nhiều vùng nguyên liệu chuyên canh 100% áp dụng GAP - TPCN Hiệp hội cũng đặt ra nhiều mục tiêu cho sự phát triển của ngành TPCN Việt Nam đến năm 2020

"Tầm nhìn đến năm 2030, sẽ có trên 90% các nhóm đối tượng liên quan “Hiểu đúng - Làm đúng - Dùng đúng” TPCN Tỷ lệ số người trưởng thành sử dụng TPCN thường xuyên lên 70% Sản xuất TPCN trong nước chiếm 75%, trong đó, tự túc nguyên liệu đạt 60%và xuất khẩu TPCN đạt 5 tỷ USD [38]

Để đạt được mục tiêu 2020 và tầm nhìn 2030, Hiệp hội TPCN Việt Nam đã

xác định việc nghiên cứu khoa học công nghệ mới để áp dụng vào sản xuất, quản lý

ngành sẽ là hướng đi mũi nhọn Các nghiên cứu về về quy hoạch nuôi trồng, di

thực, bảo tồn gen các loại được thảo có sẵn trong nước cũng là những nội dung

‘quan trọng của nghiên cứu nguyên liệu của TPCN

1.1.5 Một số loại thực phẩm chức năng chứa Curcumin

Dựa vào dạng sản phẩm, TPCN chứa Curcumincó thể chia thành dạng viên (nén, nang, nhộng, ); đạng nước; dang bột

phổ biến là dạng viên nang (cứng hoặc mềm)

Hinh 1.3 Minh họa một số dạng sản phẩm TPCN chứa Curcumin

Hạn chế của Curcumin là ít tan trong nước nên khó hắp thu được vào máu,

để nâng cao độ hòa tan và tăng nhanh được độ hấp thu của Curcumin vio mau bing

19

cách kết hợp Curcumin với các chất khác hoặc sử dụng công nghệ nano Do đó, dựa vào thành phần các chất có trong TPCN chứa Curcumin có thể chia thành:

~ TPCN chỉ chứa Curcumin (tỉnh bột nghệ)

GOL Hinh 14 Mét sé logi TPCN chi chiea Curcumin

~ TPCN chỉ chứa NanoCurcumin

Hình 1.5 Một 'số loại TPCN chỉ chứa NanoCurcumin'

~ TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin và piperin theo t lệ 1%: giúp tăng

độ hắp thu của Curcumin lên tới hơn 20 lần

Hình 1.6 Một số loại TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin với piperim

~ TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin với các loại hợp chất khác

vi SB

Hình 1.7 Một số TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin và các hóa chất khác

20

~ Khi đun Curcumin với kiềm tạo thành axit vanilicvà axit ferulic

~ Cureumin nóng chảy với kiểm cho axit protocatechuic ((OH);C¿HyCOOH)

~ Oxy hóa bằng pemanganat tạo thành vanilin

~ Tác dụng với hiđroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol

~ Hydro hóa dẫn xuất điaxetyl của Curcumin cho hỗn hợp dẫn xuất hexahidro

1.2.3 Tinh chat

1.2.3.1 Tính chất vật HỊ11],[16|

~ Cureumin dạng bột màu vàng, dang tỉnh thể nâu đỏ, ánh tím, không mùi

~ Nhiệt độ nóng chảy: 179-183°C; khối lượng riêng 0,93 g/cmỶ

21

~ Cureumin là chất gây nên màu vàng đặc trưng cho nghệ, có bước sóng trong vùng khả kiến A: 420 - 430 nm

~ Cureumin không tan trong nước

+ Tan trong dung môi hữu cơ như rượu, ete, clorofom tao ra dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục

+ Tan trong dung dich axit (do có nhóm metoxyÌ-OCH;) tạo ra dung dịch có

màu đỏ cam

+Tan trong dung dịch kiểm (do có nhóm hiđroxyl -OH trên nhân thơm) tạo

ra dung dịch màu đỏ máu ngả dần sang màu tím luc

+ Tan trong chất béo (dùng đề nhuộm các chất béo) pH = 7,4 - 8,6

~ Màu của Curcumin bên với nhiệt độ, không bền với ánh sáng và khi có sự hiện diện của SO› với nông độ > 10 ppm

1.2.3.2 Tính chất hóa học[11J,J16J

Cureumin có 2 nhóm C=O hoạt động hóa học mạnh, H của nhóm -CH¡- giữa

2 nhóm cacbonyl này có thé dễ đàng tham gia các phản ứng, kể cả phản ứng nội phân tử tạo thành các dang thủ hình khác nhau

Trong khi đó nhóm C=O trong môi trường kiểm có thể biến đổi thành C-OH

Hinh 1.9.Dang keto vé enol ctia Curcumin

Do đó, Curcumin có những tính chất hóa học sau:

~ Phản ứng phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng hoặc trong môi trường pH

thích hợp

- Phản ứng cộng với Hy

+2

~ Phản ứng tạo phức với kim loại

-Phản ứng của nhóm OH trên vòng benzen

~ Phản ứng isoxozol

1.24 Tác dụng dược 16401442], (43) [44 [47]

\g oxi hóa, khả năng phòng và chống ung thư

Curcumin c6 vai tro cl

Curcumin hign là một trong những chất phòng hóachồng khối u đang được đặc biệt quan tâm nghiên cứu Curcumin hoạt động như một chất tìm diệt gốc tự do gây ung thư, có khả năng giải độc gan, phòng chống xơ gan cổ trướng bảo vệ hồng cầu, ngăn cản vỉ trùng lao phát triển kháng khuẩn, kháng nắm, chống viêm và khả năng kháng

HIV mới được khám phá gần đây [42], [43]

Hình 1.10 Tác dụng phòng và chống ung thự của Curcumin

1.2.5 Nguồn cung cap Curcumin

'Củ nghệ có hàm lượng Curcumin cao nhất trong các loại dược liệu

Nghệ - curcuma là một chỉ thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Ở Việt Nam có chừng 18 loài nghệ: nghệ vàng, nghệ đen,nghệ trắng, nghệ xanh, nghệ rừng, nghệ mảnh, nghệ Quảng Tây, nghệ sen, nghệ nếp, nghệ té,

Hinh 1.11 Một số loại củ nghệ (từ trái sang: nghệ đó, nghệ vàng, nghệ đen )

23

“Trong đó củ nghệ vàng chứa nhiều Cureumin và được sử dụng rộng rãi nhất

Ngày nay ngoài nghệ tươi, Curcumin còn được cung cấp thông qua các sản

phẩm chế biến từ nghệ như: tỉnh bột nghệ hay các loại thực phẩm chức năng được

bào chế dưới dạng thuốc

1.2.6 NanoCurcumin [42],[43]

NanoCurcumin lé dang bào chế của tỉnh chất Curcumin chiết xuất từ củ nghệ vàng theo công nghệ Nano hiện đại, giúp cải thiện các vấn đẻ khó khăn, là rào cán hạn chế hiệu quả hỗ trợ điều tri cia Curcumin

Các phân tử Curcumin được cố định trong polymer, tạo thành các hạt

NanoCurcumin siêu nhỏ, mịn với kích thước chỉ khoảng 30 — 100 nm (Nano mét)

Bột đó được gọi là NanoCurcumin (hay gọi tắt là bào chế Curcumin bằng công

nghệ Nano )

Bản chất hóa học và tác dụng sinh học hoàn toàn đồng nhất với Curcumin:

nó có thể điều trị hẳu hết các loại bênh mạn tinh, bao gồm cả ung thư

Rồi loạn thần kinh

Hình 1.12 NanoCurcumin điều trị hiệu quả hầu hết các bệnh mãn tính

(Ngudn: The Centre for Knowledge Manangment of Nanoscience & Technology)

24

NA leat

Hình 1.13 Tác dụng phòng và chéng ung thw cia NanoCurcumin

Nhưng NanoCurcumin có điểm vượt trội

~ Với kích thước siêu nhỏ từ 30nm-100nm giúp NanoCurcumin phân tán tốt trong nước, độ tan 7,5%, tăng gắp 7.500 lan so với Curcumin (0,001%)

~ Các phân tử Curcumin được cố định trong chất liệu polymer để tạo thành

các hạt tiểu phân Nano, nên giúp NanoCurcumin bên vững, không bị phá hủy bởi dich vi da day

nhỏ giúp NanoCurcumin thẩm thé

chóng để phát huy hiệu quả hỗ trợ điều trị tại hầu hết các cơ quan khác nhau trong

cơ thể Độ hấp thu của NanoCurcumin đạt tới 95%, hiệu quả vượt trội so với Curcumin théng thường (Theo kết quả nghiên cứu của nhóm chuyên gia của trường Đại học Duge, bang Ohio, Hoa kỳ, thực hiện năm 2012 đăng trén Pubmed),

~ Với độ hấp thu qua đường uống lên tới 95%, theo tính toán của các chuyên

gia thì liều sử dụng hàng ngày để đạt hiệu quả hỗ trợ điều trị là 2-4viên nang

25

NanoCureumin thay vì phải ăn 4kg nghệ tươi, uống 120g (hơn 1 lạng) tỉnh bột nghệ hay uống tới 24 viên nang Curcumin

Hình 1.15.Minh họa độ hấp thu tốt của NanoCurcumin

Hiện tại, các nhà khoa học trên thế giới cũng thử nghiệm nhiều công nghệ tạo Cureumin kích thước nano để tăng sinh khả dụng và giảm độc tính của 'Curcumin Các công nghệ này bao gồm các phân tử nano lipid-rắn, huyền phù nano, nhũ tương nano, Curcumin xyclodextrin ty phan tach, hat nano hydrogel, phức hệ (Curcumin phospholipid và Curcumin két hgp trong các phân tử nano của polymer 'Công nghệ nano hiện nay đang được ứng dụng ngày càng nhiều không chỉ

đối với Cureumin mà đối với nhiều được chất hóa học khác với mục đích là nâng

cao hiệu quả hấp thu dược chất vào máu Tuy nhiên giá thành lại rất đắt

Hình 1.16 Quy trình sản xuất CumarGold NanoCurcumin đầu tiên tại VN

26

Với những ưu điểm tuyệt vời như vậy, xu hướng sử dụng tỉnh nghệ

NanoCurcumin trong ngừa và điều trị bệnh tăng cao Trên thị trường hiện nay chủ yếu bày bán loại sản phẩm nảy nên chúng tôi chọn đối tượng phân tích là TPCN

chứa NanoCurcumin, dạng viên nang (cứng hoặc mềm) dé phân tích hàm lượng,

1.3 Một số nghiên cứu về định lượng Curcumin

Trên thể giới, nhiều phương pháp đã được xây dựng để định tính và định lượng Curcumin được tổng hợp ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu định lượng Curcumin bằng phương pháp HPLC sử

dụng detector PDA và UV-VIS

STT Mẫu Pha dong TLTK

T [Hat Curcumin 6 [- Ala dung dịch đệm | - Bước sóng:420nm | [30] kích thước Nano | amoni axetat(pH 4,5) | - Cot C18

va Bla ACN (250 x 4,6 mm, 5 ym)

~ Điều kiện gradient: | - Téc d6 dong: | mL/p

Ban đầu 95%A, tiến | - Nhiệt độ cột 45 + 2°C

tới S5%A ở 20 phút, cuối cùng là S%A ở

gbitrong 0,1% : ACN (1:1, v) | (250 X 4,6 mm, 5 um)

poly(butyl) (Điều chỉnh đệmpH | - Tốc độ dòng: I,5 mL/p

cyanoacrylat 3.0 với amoniae)

4 | Curcuminoid Dung dich axit axetic [= Bước sóng: 420nm | [18]

2

+ Gradient khai triển

"Thời gian và tỷ lệ +0 3 phút 10% B;

+ 8 phút : 20% B;

+ 13 phút: 25% B;

+ 18 phat : 35% B

+ Giữ 10 phút trước khi quay lại điều kiện

1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC|I5]

28

Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyền qua pha tĩnh đề mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động

(Qué trình tách sắc ký gồm những cân bằng động xảy ra và diễn biến liên tục

trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động trong những điều kiện nhất định Nó là

sự vận chuyển và phân bố lặp đi lặp lại nhiều lần liên tục của các chất tan X, (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đàu cột đến cuối cột tách Trong quá trình đó, chất tan X, luôn luôn được phân bố lại giữa 2 pha, trong khi pha động luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định

Cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất phân tích là khác nhau.do đó chúng có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên các chất phân tích di chuyền với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau

Asal

@ Sắc kí

Hình 1.17 Minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ki

1.4.2 Các giai đoạn chạy sie ky HPLC [15]

tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường)

Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách -> chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) đẻ rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau) 1.4.2.2 Giai đoạn phát hiện và xứ lý kết quá phân tích

'Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi

là detector

Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đỗ trong đó chứa các thông tin cần thiết như: Thời gian lưu, điện tích và chiều cao peak, hệ số phân giải, hệ số đối xứng

+ Với I chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ

vào tính chất này để phân tích định tính

+ Độ lớn peak được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này

tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng đẻ định lượng chất phân tích

Sắc đồ

“Cột tách HPLC Peak: ving, 06, xanh

"Đình chứa dung môi

(Pha động)

Bom cao ấp (đi thống phân phát dung môi)

Hình 1.18 Hệ thắng HPLC

1.4.3 Detector trong HPLC|9|, [IS]

Trong kĩ thuật phân

HPLC, việc tách các chất xảy ra liên tục trong cột

tách, các chất tan được nạp vào đầu cột và di ra khỏi cột tách nhờ pha động Vì thế

30

detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động đi ra từ cột sắc ký

với dòng chảy liên tục

Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp, là

bộ phận dùng để thu nhận và phát hiện các chất hoặc hợp chất phân tích dựa theo tinh chất hóa học, hóa lý hay tính chất vật lý của chất phân tích

Có nhiều loại detector khác nhau cho kĩ thuật HPLC như deteetor phổ há

‘thu quang phan tir UV — Vis, detector mang diot phat quang (PDA), detector phd huỳnh quang (RF), detector phổ khối phân tử (MMS),

Trong đề tai này, chúng tôi sử dụng đetector mảng diot phát quang (PDA):

Loại detector này dựa trên sự phát quang của một diot đặc biệt, khi nó bị chùm sáng

tác động vào Loại này mới ra đời (sau 1990), về nguyên tắc nó cũng hoạt động

tương tự như dectector phổ hấp thu quang vùng phổ UV-Vis Mỗi detector thường,

có hàng trăm diot phát quang, tạo thành một mảng diot, nên nó cũng có vùng làm

việc từ 190 — 1100 nm và có tính không gian ba chiều Vì vậy loại này thu nhận

được hình không gian của peak hấp thụ của chất và nhiều peak đồng thời Mỗi peak

như một đỉnh núi Loại detector này có độ nhạy và chọn lọc rất cao, tốc độ đo cao

hơn và có thể đo được từ 2 đến 42 kênh (mỗi kênh 1 ở riêng), chọn sóng đo hắp thụ cho từng chất là dễ dàng, hạn chế sự chen lấn và trùng sóng hắp thụ Hiện nay nó

được dùng khá phô biến trong các hệ máy HPLC (từ năm 2000) Song muốn dùng

nó có hiệu quả thì phải có máy tính và bộ phần mềm chuyên dụng

Hinh 1.19 Detector mảng Diot phát quang ctia Agilent

(1) ~ Nguồn sáng; (2) - Bộ lọc chùm sáng nguồn; (3) - Hệ thấu kính; (4) —

FowCell HQ; (5) — Thâu kính; (6) Khe sáng; (7) — Cách từ lõm; (8) — Mảng diot

Ming diot phát quang hiện có hai loại: S12 va 1024 Byte

1.4.4 Phương pháp định lượng trong HPLC|15|

31

1.4.4.1 Diện tích và chiều cao peak

Tín hiệu đo là diện tích của peak hay chiều cao của peak Để tiến hành định lượng chất phân tích, người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân

giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế

Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì diện tích hoặc chiều cao của peak tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích:

S=K.C (S:dign tich cia peak); h=K.C (h: chiều cao của peak) Các phương trình này dùng để định lượng chất phân tích bằng HPLC, thường

người ta dùng diện tích của peak dé độ chính xác cao hơn

Để tính diện tích peak, ta dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài sẵn chương trình, phương pháp có thê dùng cho cả những peak bị trôi đường nền Đề có

độ chính xác cao thì hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0.80+ 1.20 Việc tính toán diện tích peak sẽ gặp khó khăn khi peak có cường độ quá cao, bị don, không đối

xứng hoặc đetector bị nhiễu

Nếu đánh giá dựa vào chiều cao peak (khoảng cách từ đường nền đến đỉnh peak) thì không cần xét đến hệ số đối xứng

1.44.2 Dinh lượng

Trong phân tích sắc ký, thường dùng các phương pháp định lượng:

s* Phương pháp ngoại chuẩn (phương pháp đường chuẩn):tiến hành xây

dựng phương trình đường chuẩn (bằng phương pháp hồi quy tuyến tính) biểu diễn

sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích (hoặc chiều cao) peak vào nồng độ các dung dịch chuẩn của chất phân tích Sau đó, từ diện tích (hoặc chiều cao) peak của chất phân tích trong mẫu, xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu từ phương trình đường chuẩn

‹# Phương pháp thêm chuẩn: phương pháp này thường sử dụng khi có ảnh

hưởng của các chất trong môi trường mẫu (matrix)

~_ Thêm chuẩn 1 điểm: Tiên hành chạy 2 phép sắc ki

+ Thứ nhất là phép sắc kí với dung dịch phân tích, gh¡ diện tích peak S.:

§,=kCŒ, 32

+ Thứ hai là thêm vào chất phân tích 1 lượng chất phân tích chính xác và

ghi lại sắc ki dé: §vr= kC, +Cy)

Từ 2 thí nghiệm nảy ta rút ra được C, là nồng độ chất phân tích

~_ Thêm chuẩn đường chuẩn:

+ Chuẩn bị 1 dãy dung dịch phân tích trong các điều kiện hoàn toàn như nhau

+ Thêm vào dãy dung dịch trên những lượng chất chính xác khác nhau theo bảng

+ Xây dựng phương trình đường hoi quy tuyên tính biểu diễn sự phụ thuộc của

S vào nồng độ thêm chuẩn, được phương trình có dạng: S = a + bC Từ đó: C; = a/b

s

Hình 1.20 Đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn

$* Phương pháp nội chuẩn: trong mẫu, các chất phân tích có thể bị ảnh

hưởng bởi nhiều yếu tố như: nền, các điều kiện khác gây sai số hệ thống Để loại trừ ảnh hưởng này người ta thêm vào mẫu chất nội chuẩn có tính chất gần giống tính chất của chất phân tích, có nồng độ cũng gần bằng nồng độ của chất phân tích (Cx),

có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất phân tích, đỉnh peak tách khỏi đỉnh peak-

it phan tích ở cùng điều kiện sắc ký Tiến hành 3 phép đo sắc ký:

~ _ Thứ nhất là phép sắc ký của chất chuẩn nội, nhận được H, tương ứng với C, cia cl

~ Thit hai la phép sắc ký của chất chuẩn có nồng độ Cc ứng với Hẹ, từ đó rút ra được hệ số ảnh hưởng Fx - là đại lượng đưa vào để loại trừ ảnh hưởng của nền cũng như các điều kiện đo khác

33

~_ Phép thứ ba là chất phân tích chưa biết C, ứng với chiều cao H,, tir dé tính ra nồng độ của nó

Mục đích của luận văn là nghiên cứu xác định NanoCurcumin trong thực

phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng detector PDA

"Những nội dung nghiên cứu cụ thê như sau:

1) Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố để tìm điều kiện thích hợp cho phép

xác định NanoCurcumin bằng phương pháp HPLC dùng detector PDA:

~ Khảo sát ảnh hưởng pH của dung dich đệm

~ Khảo sát ảnh hưởng của pha động

~ Khảo sát tốc độ dòng

2) Thẩm định phương pháp phân tích

~ Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký

~ Khoảng tuyến tính

~ Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

~ Xác định độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

3) Xây dựng quy trình và áp dụng quy trình phân tích vào thực tế:

~ Quy trình xứ lý mẫu

Áp dụng quy trình đã xây dựng đề định lượng NanoCurcumin trong một số

loại thực phẩm chức năng trên thị trường Thừa Thiên Huế

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

~ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Series 20A của hãng Shimazdu, Nhật Bản:

-4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc

ky Symmetry C18 (150mm x 4,6 mm, 5 ym) ciia hang GL Sciences Inc, Nhật Bản

34

~ Cân phân tích Sartorius; thiét bị lọc nước siêu sạch của hãng Bamstead International, USA; tủ sấy của hãng Memmert; màng lọc 0.45 wm cia hang

Sartorius Stedim, Đức;máy lắc siêu âm, máy đo pH, các dụng cụ thủy tỉnh, bình

định mức, pipet có độ chính xác phù hợp

2.2.2 Hóa chất

~ Chất chuẩn: Curcumin chuan (99%, India)

~ Mẫu thử: chế phẩm chứa NanoCurcumin (loại viên nang)

~ Metanol, axetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck)

~ Dung môi, hóa chất khác: KH;PO¿, H:PO4, nước cất đạt tiêu chuẩn tỉnh

khiết phân tích

2.3 Phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quan

Lấy mẫu ngẫu nhiên các mẫu TPCN chứa NanoCurcumin trên thị trường

thành phố Huế, bảo quản theo quy định ghi trên nhãn sản phẩm

2.3.2 Xây dựng qui trình phân tích Curcumin

2.3.2.1 Xử lý mẫu phân tích

Quá trình xử lý mẫu được tiến hành theo tai ligu[22],[24],[36],[37]

2.3.2.2 Khảo sát các điều kiện HPLC

Dựa vào tài liệu[22]24] 36] [37], tôi tiến hành khảo sát mẫu chuẩn trên máy HPLC với cột C18, nhiệt độ phòng, thể tích tiêm 20uLL, detector mảng diot phát quang (PDA) ở bước sóng 424 nm

~ Khảo sắt ảnh hưởng của pH dụng dịch đệm

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng dung dich dém kali dihidrophotphat KH;PO,50mM Tiến hành khảo sát lựa chọn pH thích hợp

~ Khảo sắt ảnh hưởng của pha động

Hệ pha động có thể sử dụng là hỗn hợp dung môi phân cực, pha động chính

là cơ sở để khảo sát tốc độ dòng Tiến hành khảo sát lựa chọn tỉ lệ dung môi pha

35

động cho thời gian lưu vừa phải, peak của chất phân tích cân đối, sắc nét, chất tách

hoàn toàn, hệ số đối xứng phủ hợp mà áp suất cột không quá cao

~ Khảo sắt ảnh hướng của tắc độ dòng

Dựa trên pha động và tỉ lệ đã được chọn, khảo sát các tốc độ dòng từ 0,5

Độ ổn định của hệ thống sắc ký được biểu thị bằng sai số tương đối RSD%, yêu cầu đặt ra là RSD% < 2, thời gian lưu không quá dài

2.3.3.2 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệulà khả năng phát hiện đượcchất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chắt Trong phép phân tích định tính: phải chứng minh được kết quả là dương tính

khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là

âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi

bị ảnh hưởng của tắt cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác

Tính đặc hiệu của phương pháp sắc ký lỏng thường được tiến hành thông qua hai phép thử sau

~ Thứ nhất, phân tích mẫu trắng: kết quả thu được là không cho tín hiệu phân tích Nếu mẫu trắng xuất hiện tín hiệu thì cần phải thay đổi phương pháp để loại trừ các ánh hưởng

~ Thứ hai, phân tích mẫu trắng thêm chuẩn: kết quả phải cho tín hiệu đối với chất phân tích

36