TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.). LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO PHẠM MỸ NGỌC TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS WILLD... Vai trò của auxin và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

PHẠM MỸ NGỌC

TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT

SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.)

OHWI ET OHASHI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS BÙI TRANG VIỆT

TS LÊ THỊ TRUNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

L ỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

PGS TS Bùi Trang Việt, Trưởng Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên - ĐHQG Tp HCM, người đã giảng dạy, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình

hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và hoàn chỉnh bài luận văn

TS Lê Thị Trung đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều

kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành luận văn

TS Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngô Hoang, Th.S Trịnh Cẩm Tú đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến chân tình, những kinh nghiệm bổ ích

cho luận văn của em

Quý thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận

văn của em

Ban chủ nhiệm và toàn thể quý thầy cô khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh

Các bạn cao học khoá 19, CN Hồ Thị Mỹ Linh (Chuyên viên Phòng thí nghiệm khoa

Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Em Như (Cao học khoá 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh)

và các em Huy ên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV đang thực hiện đề tài tại Bộ môn Sinh lý

Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ tôi trong việc tìm kiếm sách và tài liệu tham khảo

M ỤC LỤC

7

LỜI CẢM ƠN7 1

7

MỤC LỤC7 2

7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT7 6

7

MỞ ĐẦU7 7

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU7 8

7

1.1 Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi7 8

7

1.1.1 Phân loại học7 8

7

1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái cây Đậu7 8

7

1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật7 8

7

1.2.1 Khái niệm7 8

7

1.2.2 Mô phân sinh ngọn chồi7 9

7

1.2.2.1 Đặc điểm7 9

7

1.2.2.2 Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi7 10

7

1.2.2.3 Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi7 11

7

1.2.3 Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi7 11

7

1.2.3.1 Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm7 11

7

1.2.3.2 Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành7 12

7

1.2.4 Sự phát triển chồi7 12

7

1.2.4.1 Sự phát triển chồi nách7 12

7

1.2.4.2 Sự hình thành và phát triển chồi bất định7 13

7

1.3 Vai trò của auxin và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái ngọn chồi7 14

7

1.3.1 Vai trò của auxin7 14 1.3.2 Vai trò của cytokinin 16

1.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi7 17

7

1.3.3.1 Tăng sinh chồi bên7 17

7

1.3.3.3 Sự hình thành rễ7 18

7

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP7 19

7

2.1.Vật liệu7 19

7

2.2.Phương pháp7 19

7

2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn7 19

7

2.2.2.Khử trùng hạt7 19

7

2.2.3 Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7 19

7

2.2.4 Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7 20

7

2.2.5 Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7 21

7

2.2.5.1 Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu

đỏ in vitro 6 ngày tuổi7 21

7

2.2.5.2 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi7 21

7

2.2.6 Quan sát hình thái giải phẫu7 22

7

2.2.7 Đo cường độ quang hợp và cường độ hô hấp7 23

7

2.2.8 Đo hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật7 23

7

2.2.9.Xử lý số liệu7 23

7

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN7 24

7

3.1 Kết quả7 24

7

3.1.1 Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn7 24

7

3.1.2 Nuôi cấy hạt để tạo cây in vitro trên môi trường MS7 26 3.1.3 Sự phát triển chồi mầm 26

3.1.3.1 Trong giai đoạn hạt nảy mầm7 26

7

3.1.3.2 Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô theo thời gian từ giai đoạn hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi7 27

7

3.1.3.3 Ảnh hưởng của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật lên sự phát triển chồi mầm7 28

7

3.1.4 Các biến đổi hình thái của mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi7

30

7

3.1.5 Sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn7 33

7

3.1.5.1 Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp của cây in vitro7 33

7

3.1.5.2 Sự phát triển chồi nách từ nách lá của cây in vitro và cây trong vườn7 33

7

3.1.6 Quan sát hình thái giải phẫu của chồi nách7 36

7

3.1.7 Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7 45

7

3.1.8 Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7 47

7

3.1.8.1 Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường AIA 2 mg/l và sau đó chuyển sang môi trưòng MS theo thời gian7 47

7

3.1.8.2 Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường MS và sau đó chuyển sang môi trưòng AIA 2 mg/l theo thời gian7 51

7

3.1.9 Sự thay đổi cường độ quang hợp và hô hấp của chồi ngọn sau khi xử lý AIA 2 mg/l theo thời gian7 54

7

3.1.10 Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tăng trưởng chồi7 55

7

3.1.11 Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7 57

7

3.1.11.1 Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi7 57

7

3.1.11.2 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l với BA theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi 62

3.2 Thảo luận7 1

7

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ7 12

7

4.1 Kết luận7 12

7

4.2 Đề nghị7 12

7

TÀI LIỆU THAM KHẢO7 14 PHỤ LỤC 18

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA : Abcisic acid

AIA : Acetic indol acid

BA : Benzyl Adenin

CĐHTTTV : Chất điều hoà tăng trưởng thực vật

GR 1 R : ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào ở trạng thái trưởng thành

GAR 3 R : Giberelic acid

IBA : Indol Butyric acid

MS : Murashige và Skoog

TLT : Trọng lượng tươi

TLK : Trọng lượng khô

cs : cộng sự

M Ở ĐẦU

Phát sinh hình thái là cơ sở cho việc vi nhân giống thực vật mà hiện nay đang rất được quan tâm Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được gọi là mô phân sinh Hơn nữa, kiểm soát hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi ở mức phân tử dưới tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt là auxin và cytokinin, gần đây được nghiên cứu bởi nhiều tác giả

Do đó, đề tài tập trung nghiên cứu trên cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi,

rất thông dụng ở Việt Nam, để hiểu về hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi dưới tác động của auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin Việc khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự phát sinh hình thái chồi ở cây Đậu được thực hiện dưới các khía cạnh hình thái học và sinh lý học, qua đó bổ sung thêm kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sự vi nhân giống và giảng dạy

Ảnh 1.1 Cây Đậu đỏ

Vigna angularis (Willd.) Ohwi

et Ohashi

(http://www.botanyvn.com/cnt.a sp?param=news&newsid=934)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi

1.1.1 Phân loại học

Cây Đậu được dùng trong đề tài này là cây Đậu đỏ, được phân loại như sau:

Ngành : 7Magnoliophyta7

Lớp : 7Magnoliopsida7

Bộ : 7Fabales7

Họ : 7Fabaceae7

5

Loài : 5Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng

Hộ, 1999)

1.1.2 Mô t ả đặc điểm hình thái cây Đậu

Cây Đậu đỏ (adzuki bean) là loại cỏ nhất niên, đứng

hay leo Cây có chiều cao trung bình 50-80 cm, có cạnh và lông

dài Cuống lá dài 10-12 cm, có lông Lá thường có hình xoan,

đầu tròn, có thùy, dài 6-8 cm và có lông Mỗi lá gồm 4-5 cặp

gân phụ Hoa mọc thành chùm ở nách lá, dài 3-10 cm, có màu

vàng nhạt Đài hoa có 5 răng ngắn Trái dài 6-10 cm và rộng

0,7 cm, có chót nhọn Hột dài 6-10 mm, có màu nâu Bộ nhiễm

sắc thể của Đậu đỏ 2n = 22

Cây Đậu đỏ được trồng nhiều ở Nha Trang, Sài

Gòn,… và được trồng để lấy hạt

Công dụng của cây Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng;

hột giúp lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ, 1999)

1.2 S ự phát sinh hình thái thực vật

1.2.1 Khái ni ệm

Sự phát sinh hình thái thực vật là sự phát triển cơ thể thực vật theo thời gian để hoàn tất chu trình phát triển Phát triển chỉ những thay đổi của tế bào, mô hay cơ quan từ lúc khởi đầu cho

đến lúc trưởng thành Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh cơ quan (organogenesis) và phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000)

Trong sự phát sinh cơ quan in vitro, có thể tạo các cơ quan theo con đường phát sinh cơ

quan trực tiếp (các cơ quan tạo ra trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mô sẹo, sau đó

các cơ quan tạo ra từ mô sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình căn bản sau:

- Sự điều hoà hướng kéo dài tế bào

- Sự kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia của tế bào

Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự phát triển ở mức tế bào thể hiện qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia và kéo dài tế bào) và phân hóa tế bào Ở thực vật, sự phân chia và kéo dài tế bào tách biệt nhau theo không gian và thời gian (Bùi Trang Việt, 2000)

Môn phát sinh hình thái là môn học nhằm mô tả các biến đổi hình thái và cấu trúc, phân tích các yếu tố nội sinh và ngoại sinh, và nghiên cứu sự điều hòa hình thái thực vật

Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện đến nguồn gốc và sự phát triển hình thái thực vật Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó Những kỹ thuật của nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp được dùng nhiều nhất là:

- Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó

- Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một

cơ thể thực vật

Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành do kích

thước quá nhỏ bé của các loại mô cấy, nên sự áp dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh là cách hữu hiệu để tìm hiểu về sự phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được

gọi là mô phân sinh (Vernoux và cs, 2010)

1.2.2 Mô phân sinh ng ọn chồi

1.2.2.1 Đặc điểm

Các mô phân sinh là những vùng riêng biệt luôn hiện diện trong đời sống thực vật Các tế bào ở vùng mô phân sinh có khả năng phân chia không ngừng, tế bào nhỏ, xếp sát nhau và không có khoảng gian bào Tế bào chất của tế bào mô phân sinh có độ nhớt cao, có nhiều không bào nhỏ li ti,

số lượng các bào quan (ribosome, ty thể, lạp thể) nhiều Nhân lớn chiếm vị trí trung tâm Như vậy, cấu tạo của tế bào mô phân sinh nói lên hoạt tính sinh lý cao của chúng (Bùi Trang Việt, 2000)

Mô phân sinh là cơ sở hình thành các mô vĩnh viễn Nhờ hoạt động của mô phân sinh mà cây sinh trưởng và phát triển Trong quá trình sinh phôi, mô phân sinh ngọn chồi phát triển ở vùng giữa hai sơ khởi lá mầm (đối với cây hai lá mầm) hay ở gốc của thuẫn (đối với cây một lá mầm)

Mô phân sinh ngọn chồi có đường kính 100 – 200µm (Bùi Trang Việt, 2000)

Khi cây trưởng thành, mô phân sinh ngọn nằm ở ngọn của chồi chính, chồi bên của thân

và ở ngọn rễ Các mô phân sinh ngọn hoạt động phân chia suốt cả đời sống của cây, giúp cây dài ra (Nguyễn Như Khanh, 2009)

1.2.2.2 Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi

Có nhiều quan điểm về tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi, trong đó quan điểm thường gặp nhất là sự tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi thành các vùng hay lớp phân biệt (Esau, 1967)

Mô phân sinh ngọn chồi Arabidopsis có ba lớp: L1, L2, và L3 L1 là lớp ngoài cùng (lớp

ngoại vi), L2 là lớp bên trong lớp ngoại vi L1 và L2 tạo nên vỏ L3 là lớp thể và ở giữa là vùng đỉnh Vỏ cho các lớp biểu bì và dưới biểu bì của thân và lá Một số ít tế bào từ các phân chia trong

vỏ và thể cho sơ khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa) (Bùi Trang Việt, 2000)

Nếu chia mô phân sinh ngọn chồi theo vùng thì mô phân sinh ngọn chồi được chia thành

ba vùng chính:

- Vùng đỉnh (vùng mô phân sinh chờ) chứa các tế bào có không bào lớn, tế bào chất chứa ít rRNA, chu kì tế bào rất dài, hoạt tính phân chia thấp, tế bào chủ yếu ở pha GR 1 R Vùng này còn được gọi là mô phân sinh chờ vì chúng chỉ hoạt động khi mô phân sinh ngọn chuyển sang trạng thái sinh sản

- Vùng bên (vùng khởi sinh, hay vùng phát sinh cơ quan) chứa các tế bào nhỏ hơn với không bào nhỏ, giàu rRNA, có hoạt tính phân chia cao Chu kì tế bào (pha GR 1 R) ngắn Đây là vùng phát sinh lá và các mô của thân (bao gồm các mô dẫn)

- Vùng lõi (vùng phát sinh mô) nằm dưới vùng đỉnh, chứa các tế bào có không bào lớn, hàm lượng rRNA ít hơn so với vùng đỉnh, hoạt tính phân chia và chu kì phân chia tế bào của vùng này ở mức trung gian so với vùng đỉnh và vùng bên (Bùi Trang Việt, 2000; Taiz và Zeiger, 2002)

Vùng lõi là vùng phát sinh mô lõi của thân trong khi các cơ quan khác đều xuất phát từ vùng bên (Esau, 1967)

Theo một cách phân chia khác, tổ chức mô phân sinh ngọn chồi gồm tunica (vỏ) và corpus (thể) Ở Arabidopsis và hầu hết cây hai lá mầm, tunica gồm lớp L1 bao phủ phía ngoài mô

phân sinh ngọn chồi và lớp L2 nằm ngay dưới lớp L1 Corpus (được gọi là L3) không phải là một lớp tế bào đơn lẻ mà là nhóm các tế bào ngay dưới tunica (Evert, 2006)

1.2.2.3 Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi

Các tế bào ở lớp áo bọc ngoài hay tunica (hai hay ba lớp) xếp đều dặn, bao quanh các tế bào trung tâm, và phân chia theo những mặt phẳng vuông góc với bề mặt của phôi (anticlinial division) Các lớp tế bào trung tâm (thể corpus) phân bố không đều đặn và phân chia theo các mặt

phẳng khác nhau (Nguyễn Như Khanh, 2009)

1.2.3 Ho ạt động của mô phân sinh ngọn chồi

1.2.3.1 Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm

Từ hợp tử, sự phát triển phôi trong hạt được kiểm soát theo thời gian và không gian qua hai giai đoạn chính: sinh phôi và trưởng thành của phôi Kết quả của sự phát triển phôi trong noãn là hạt chín, vỏ noãn sẽ mất hầu hết nước và tạo nên vỏ hạt bền chắc bao quanh phôi và nội nhũ Vào lúc đó, phôi ngừng phát triển và hạt ở vào trạng thái ngủ Hạt sẽ không phát triển tiếp cho đến khi nảy mầm Như vậy, sự nảy mầm của hạt thường chỉ xảy ra sau một giai đoạn khô (giai đoạn ngủ) ở cuối giai đoạn trưởng thành của phôi Phôi đang ngủ bao gồm thân mầm và rễ mầm chứa mô phân sinh đỉnh Các mô phân sinh sẽ tạo ra các tế bào làm cho phôi dài ra khi hạt nảy mầm (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự nảy mầm của hạt được xem như là sự tái lập tăng trưởng của phôi Quá trình này bắt đầu từ sự tái thu nước của hạt cho tới sự lú rễ mầm ra khỏi hạt Các đặc tính quan trọng nhất của sự nảy mầm là: hấp thu nước mạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh, và phát sinh nhiệt mạnh (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự nảy mầm cuả hạt gồm ba giai đoạn chính:

- Giai đoạn thu nước (6 – 12 giờ tùy loại hạt)

Hạt (nhất là phôi) thu nước mạnh, phồng lên và tăng trọng lượng tươi Sự thu nước đi kèm với sự gia tăng cường độ hô hấp, biểu hiện của sự tái lập hoạt tính biến dưỡng

- Giai đoạn nảy mầm theo nghĩa hẹp (12 – 48 giờ)