NGHIÊN cứu QUY TRÌNH THU NHẬN, ĐỊNH LƯỢNG và xác ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME ARTOCAPINE từ mủ mít

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN ENZYME Nghiên cứu quy trình thu nhận, định lượng và xác định hoạt tính enzyme ARTOCAPINE từ mủ mít Protease (còn được gọi là proteinase hay peptidase) là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (CO~NH) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa,..) và động vật (gan, dạ dày bê,..).

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC



BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN – ENZYME

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN,

ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH

ENZYME ARTOCAPINE TỪ MỦ MÍT

[Document subtitle]

MỞ ĐẦU 3

I TỔNG QUAN 4

1 Enzyme protease 4

1.1 Phân loại enzym protease: 4

1.2 Ứng dụng protease 5

1.3 Nguồn thu nhận protease 6

2 Cây mít 6

2.1 Giới thiệu cây mít 6

2.2 Nguyên nhân chọn đối tượng mủ mít để thu nhận enzyme protease 7

3 Protease từ mủ mít 8

II HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ - THIẾT BỊ 8

1 Hoá chất 8

2 Dụng cụ 8

3 Thiết bị 8

III QUY TRÌNH THU NHẬN 9

1 Sơ đồ quy trình 9

2 Thuyết minh quy trình 10

2.1 Thu nhận mủ mít 10

2.2 Hòa tan 10

2.4 Tủa cồn 10

2.5 Ly tâm 11

2.6 Hoà tan tủa 11

2.7 Sắc kí lọc gel 11

2.8 Điện di 12

IV KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 15

1 Đường chuẩn Albumin 15

2 Đường chuẩn Tyrosyne 15

3 Kết quả đo, tính toán hàm lượng, hoạt tính enzyme 16

4 Đề xuất quy trình thu nhận protease từ mủ mít 17

4.1 Kết quả lọc gel: Khảo sát hàm lượng và hoạt tính protease ở E5 18

4.2 Kết quả hàm lượng và hoạt tính enzyme trong từng giai đoạn 19

4.3 Kết quả điện di 21

V PHỤ LỤC 22

1 Cách pha các dung dịch sử dụng trong thí nghiệm 22

2 Các phương pháp sử dụng trong thí nghiệm 24

2.1 Sắc kí lọc gel 24

2.2 Điện di 25

2.3 Định lượng protein theo phương pháp Biuret 25

2.4 Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải tiến 26

3 Phụ lục hình ảnh 28

VI KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đượac sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…Hằng năm luợng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thưc phẩm (đông tụ sữa làm cho phomát, làm mềm thịt, bổ sung đểtăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…(sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…)

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn Tuynhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãienzyme trong sản xuất, nên một hướng nghiên cứu mới thu nhận enzyme từ nguồn gốcthực vật hứa hẹn sẽ mở ra một phương pháp mới tận dụng nguồn enzyme trong tự nhiên.Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có

độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phươngpháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết

I TỔNG QUAN

1 Enzyme protease

- Protease (còn được gọi là proteinase hay peptidase) là nhóm enzym thủy phân cókhả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tửpolypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự dohoặc các peptide phân tử thấp

- Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa, ) và động vật (gan, dạ dày bê, )

1.1 Phân loại enzym protease:

1.1.1 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:

- Protease động vật: pepsin, tripsin, chymotripsin…

- Protease thực vật: papain, bromelin, ficin…

- Protease vi sinh vật: subtilisin,…

1.1.2 Dựa vào sự phân bố enzyme

- Protease nội bào (endoprotease): các enzyme hoạt động chủ yếu bên trong tế bàonhư: catepsin,…

- Protease ngoại bào (exoprotease): các enzyme này hoạt động ở các mô,các cơ quanđặc hiệu ngoài tế bào như pepsin, chymotrypsin,…

1.1.3 Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein:

- Endopeptidase (proteinase): phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tửprotein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptidemạch ngắn, pepton…)

- Exopeptidase (polypeptidase): phân cắt liên kết peptide ở hai đầu mạch

1.1.4 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động:

- Protease serin: Trung tâm hoạt động có nhóm (-OH) như: tripsin, subtilopeptidase

- Protease cystein: Trung tâm hoạt động có nhóm (-SH) như papain, bromelin,…

- Protease acid: trung tâm hoạt động có nhóm (-COOH) như pepsin, renin,…

- Protease kim loại:trung tâm hoạt động có các nguyên tố kim loại:cacboxypeptidase A,…

1.1.5 Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease:

- Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động ở vùng acid

- Protease kiềm: Trypsin,chymotrypsin,… hoạt động ở vùng pH kiềm

- Protease trung tính: amylase,papain,… hoạt động ở vùng pH trung tính

I.2 Ứng dụng protease

Protease có nhiều ứng dụng phục vụ đời sống con người:

- Chất tẩy rửa: Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cảcác loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạchkính hoặc răng giả và kem đánh răng Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửanhiều nhất là trong bột giặt Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửathường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn,máu và các chất do cơ thể con người tiết ra

- Công nghiệp thuộc da: Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâmướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da Thông thường các phương pháp thuộc dathường dùng các hóa chất độc hại như natri sunfit, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọngđến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông Việc sử dụng enzyme

để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da vàlàm giảm ô nhiễm môi trường Protein là một thành phần cơ bản của da và lôngnên protease đã được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da

và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất

có hiệu quả

Ngoài ra, protease còn ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác như:

- Trong nghệ thực phẩm:

 Chế biến thịt: làm mềm và tăng hương vị thịt

 Công nghiệp sữa: làm đông tụ sữa để sản xuất phomat

 Sản xuất bánh mì: giảm thời gian đảo trộn, làm nhuyễn bột, tăng độdẻo, tạo độ xốp.

 Sản xuất bia: tăng độ bền của bia và giảm thời gian lọc

 Sản xuất nước mắm: tăng hiệu suất thu hồi đạm

- Trong y học: men tiêu hoá, điều chế môi trường sản xuất vaccine…

- Trong sản xuất keo động vật, thức ăn gia súc, dệt may, mỹ phẩm, điều chế dịchđạm thuỷ phân làm chất dinh dưỡng, chất tăng hương vị, thực phẩm cho người ănkiêng…

1.3 Nguồn thu nhận protease

Hiện nay, protease có thể được thu nhận từ các nguồn:

- Động vật: niêm mạc dạ dày bê, ruột non, tuyến tuỵ cá basa,…

- Vi sinh vật: nấm men Bacillus subtillis, nấm mốc Aspergillus oryzae, xạ khuẩn,…

- Thực vật: dứa, mủ đu đủ, mủ sung, mủ mít…

2 Cây mít

2.1 Giới thiệu cây mít

Cây mít có tên khoa học là Artocarpus heterphyllus, thuộc họ Dâu tằm

Moraceae, được cho là có nguồn gốc từ dãy núi Ghats phía nam Ấn Độ và từ đó

đã lan khắp Ấn Độ, Philippine Đây là loại cây trồng phổ biến ở các nước ĐôngNam Á (Việt Nam, Thái Lan, Indonesia…), Bangladesh, Sri Lanka, Brazil… Mítthuộc loại cây gỗ, thường xanh quanh năm, có thể cao từ 8 đến 15m, đường kínhgốc đạt đến 1.5m và sống đến 100 năm

Lá mít mọc cách, hình trứng, đầu lá phình to và hơi nhọn, cạnh đáy thon, khicòn non lá có 3 thùy, lá dày, cứng, mặt trên của lá màu xanh thẫm, nhẵn, không cólông, mặt dưới của lá hơi thô, màu xanh nhạt Mặt lá rộng từ 1-12cm, dài 8-15cm

Rễ cọc của cây mít phát triển từ khi cây còn nhỏ, đánh cây đi trồng dễ làm chết câynon Ở cây già bộ rễ phát triển mạnh có khi nổi lên mặt dất bám chắc cho nênchống gió bão tốt

Mít được xem là loại cây ăn trái có quả chín lớn nhất trong số các loài thảomộc Quả sinh ra trên cây thân chính hoặc ở chân những cành lớn, cây già quả có

khuynh hướng mọc thấp thậm chí mọc cả ở những rễ ăn nổi trên mặt đất Quả míthình bầu dục hay hình tròn, quả to kích thước khoảng (30-60) cm x (20-30) cm,trọng lượng 4.5-27.3kg; một số giống nhỏ hơn nặng từ 1.4-4.5kg ; vỏ dày và ghồghề có nhiều gai nhọn Khi chưa chín vỏ quả có màu xanh, khi quả bắt đầu chín vỏchuyển từ màu lục sang màu nâu Bên trong có nhiều múi ăn được, ngọt, thơm,giòn Qủa mít có các thảnh phần cấu tạo gồm: vỏ, xơ, múi, hạt, cùi (lõi).

Mít trồng ở nước ta bao gồm nhiều loại với chất lượng quả khác nhau, nhưng

có những đặc điểm sinh thái chung gần giống nhau như:

 Thích nghi dễ dàng ở vùng khí hậu ấm áp, không sống được ở nơi có nhiệt

độ thấp Có khả năng chịu được khô hạn nhưng trong trường hợp đó cây sinhtrưởng kém, ra hoa kết trái kém

 Có thể sống được trên nhiều vùng đất đai khác nhau

 Ở nơi đất tốt mít sinh trưởng và phát triển nhanh, bảo tồn được những đặctính tốt của cây mẹ

 Mít phát triển nhanh trong những năm đầu (từ 1-3 tuổi), những năm sau câychậm lớn về chiều cao, to nhanh về đường kính, mít có khả năng tái sinh chồimạnh khi cây còn dưới 5-6 tuổi

 Mít ra hoa kết quả từ 3-5 tuổi, chậm nhất là 7 tuổi Mít ra hoa từ tháng 1-2,quả chín từ tháng 6-8

2.2 Nguyên nhân chọn đối tượng mủ mít để thu nhận enzyme protease

Cây mít là loại cây nhiệt đới được trồng rất nhiều ở Việt Nam để lấy quả vìđặc tính sinh trưởng nhanh, dễ thích nghi, khi tiến hành thu hoạch quả, mủ mítđược xem là nguồn phế phẩm, không chỉ không có công dụng, gây ô nhiễm môitrường mà còn gây khó chịu cho người nếu bị dính phải và cũng rất khó rửasạch bằng nước và xà phòng thông thường mà phải dùng các dung môi hữu cơnhư xăng, dầu hoả

Protease có trong mủ mít có thể thay thế renin – một loại enzyme được sửdụng trong ngành công nghiệp chế biến sữa Lượng renin được sản xuất hiệnchưa đáp ứng được nhu cầu thực tế, xu hướng sử dụng protease thực vât (mủmít, hạt mít…) ngày càng phát triển

Công nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa không thể không sử dụng các chếphẩm enzym Có thể nói, các chế phẩm enzym đóng vai trò quyết định để tạo racác sản phẩm sữa Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta sửdụng enzym renin thu nhận từ dạ dày bê Trong 10 năm trở lại đây xu hướng sửdụng enzym protease thực vật ngày càng phát triển như papain từ nhựa cây đu

đủ, bromelin từ trái dứa hoặc ficin từ cây sung đã được nghiên cứu nhiều trênthế giới Nhưng hiện nay enzym protease từ mủ mít chỉ có một công trìnhnghiên cứu tại Ai Cập Nơi mà có những thử nghiệm đầu tiên và tìm thấy mộtvài ứng dụng của enzym protease trong lĩnh vực sản xuất bơ, phô-mai…

3 Protease từ mủ mít

- Protease thu nhận từ mủ mít thường được gọi là Artocarpin hay AMP48.

- Artocarpin có kích thước 48 kDa, hoạt động tốt trong dung dịch thiol reducing

regents, pH 8, pI 6.3, bị ức chế trong phenyl methyl sulphonyl flouride (PMSF)

- Bảo quản tối ưu trong đệm Tris – STT – EDTA [2].

II HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

III QUY TRÌNH THU NHẬN

Ly tâm thu tủa

Hoà tan tủa

Dịch lỏng Enzyme thô

Điện di Cồn 75

Hình III.1: Sơ đồ quy trình tinh sạch protease

E2 E1

E5

E3

Ghi chú:

E1 Enzyme thô sau khi hoà tan với đệm

E2 Dịch enzyme sau khi lọc

E3 Dịch lỏng sau khi ly tâm

E4 Dịch enzmye sau khi hoà tan tủa cồn với đệm

E5 Enzyme đã qua tinh sạch

2 Thuyết minh quy trình

2.1 Thu nhận mủ mít

Tiến hành lấy mủ: lau cuống trái, dao và becher đựng mủ bằng bông tẩm cồn Becher

để trong thùng đá, dùng dao inox cắt đứt phần cuống trái, dùng becher hứng phần mủchảy xuống, khi hết mủ tiếp tục cắt cách vết cắt trước khoảng 1-2cm, làm như thế cho đếnkhi vết cắt tiếp xúc với ruột trái mít Mủ thu nhận được bảo quản lạnh để dùng liền hoặcgiữ lạnh trong tủ đông nếu không sử dụng ngay

2.5 Ly tâm

Khi tủa hình thành tiến hành ly tâm tủa với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút, thutủa, để bay hơi tự nhiên trong tủ lạnh Trong quá trình ly tâm nhiệt độ tăng theo thời giannên cần làm lạnh dịch kỹ trước khi ly tâm

2.6 Hoà tan tủa

Thêm đệm phosphat pH 7.5 với tỉ lệ tủa : đệm = 1 : 1 , khuấy cho đến khi tủa tan hoàntoàn

2.7 Sắc kí lọc gel

- Tính toán lượng gel cần ngâm

 Cột có chiều cao 20cm, đường kính 0.7cm

 Nhồi gel vào cột 18cm, như vậy thể tích gel cần dùng là:

 Gạn bỏ nhưng hạt mịn nổi trên bề mặt tránh làm cản trở quá trình lọc gelsau này bằng cách thay dung dịch đệm phía trên 4-5 lần

 Trước khi nhồi vào cột, cho thêm đệm vào hỗn hợp này để hỗn hợp khôngquá đặt

gel vào cột đến khi đạt độ cao cần thiết Trên mặt gel luôn có một lớp dung dịchđệm để tránh gel bị khô, không khí lọt vào.

 Khóa mao quản lại, để gel ổn định trong khoảng 1-2h, sau đó cho chạy cộttrước với dung dịch đệm, đến khi cột gel ổn định thì cho mẫu vào cột

 Đưa mẫu vào cột: mở khóa mao quản đến khi lớp dung dịch đệm vừa cạntới mặt gel thì cho mẫu vào cột Dùng pipetan hút 1ml mẫu cho vào xilanh Bơmmẫu vào cột gel sau với màng lọc 0.45µm nhẹ nhàng tránh xáo trộn gel và tạo bọtkhí

- Thu mẫu

 Lần lượt hứng mẫu bằng ống nghiệm, mỗi ống nghiệm khoảng 3ml

 Thu 20 ống, đo OD bước sóng 280nm

 Sau khi lọc gel xong, tiến hành rửa gel bằng nước cất, sau đó rửa tiếp bằngcồn (tránh gel bị nhiễm mốc) mới bảo quản để sử dụng cho lần sau nếu cộtgel chưa bị tắt nghẽn

2.8 Điện di

 Chuẩn bị gel điện di:

 Gel polyacrylamide thường đặt đứng

 Rửa sạch các tấm thủy tinh bằng nước, để khô rồi lau lại bằng ethanol Ráp cáctấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất và kẹp khuôn trên giá đỡ

 Pha gel điện di

2.8.1 Chuẩn bị dung dịch running gel (gel chạy) theo bảng dưới đây

Đổ gel chạy (running gel) trước, tới vạch dưới của khuôn kính

Mono solution 2.5ml

Running Gel pH 8.8 1.875ml

H2O 3.125ml

APS 10% 25µl

Bảng III.2: Hoá chất pha Running Gel dùng để điện di

Thêm 8 uL SureCast TEMED cho mỗi 8 mL dung dịch gel Trộn đều và đổ gel vào giếng ngay để dung dịch running gel (gel chạy) đông lại

2.8.2 Đổ stacking gel (gel gom) theo bảng dưới đây Tổng thể tích của bảng dùng cho 1

gel

Mono solution 0.325mlRunning Gel pH 8.8 0.625ml

H2O 1.525mlTEMED 2µlAPS 10% 12.5µl

Bảng III.3: Hoá chất pha Stacking Gel trong điện di

 Thêm 3 uL SureCast TEMED cho mỗi 3 mL dung dịch gel Trộn đều và đổ gel vàogiếng ngay để dung dịch stacking gel (gel gom) đông lại

 Nghiêng bộ cầm tay để dung dịch có thể chạm đáy

 Cho dung dịch stacking gel vào cho đến khi chạm vào cạnh trên của miếng kiếngphía trước

 Đặt bộ cầm tay trở về vị trí thẳng đứng

 Đặt lược vào từ từ bắt đầu từ phía đầu kia và trượt nó giữa miếng kiếng cho tới khi

cả 2 đầu vào đúng vị trí

 Để stacking gel đông lại (5-10phút)

 Kiểm tra sự đông gel bằng cách xem lượng gel còn dư lại đã đông chưa

 Bỏ kẹp và lược ra Gel có thể được sử dụng ngay hoặc gói trong giấy thấm nước vàgiữ ở 4 độ cho lần sau

Sau khi gel gom (stacking gel) đông Tháo bộ kính ra khỏi khuôn kính Lắp bộkính có gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di đầy bộ khung điện cực

 Chuẩn bị mẫu:

Hút mỗi mẫu cần điện di 100μl vào tube 1,5ml có bổ sung 20μl Load buffer 6X l vào tube 1,5ml có bổ sung 20μl vào tube 1,5ml có bổ sung 20μl Load buffer 6X l Load buffer 6X Đun sôi cách thủy trong 5 phút, để nguội

 Tiến hành điện di:

Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi bộ điện di Bơm từng mẫu vào từng giếng với lượng là20μl vào tube 1,5ml có bổ sung 20μl Load buffer 6X l Thang chuẩn là Protein Ladder với lượng 10-15μl vào tube 1,5ml có bổ sung 20μl Load buffer 6X l

Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định, 100V- 200V,trong 30 - 90 phút

Sau khi vạch màu chỉ thị xuống gần đến đáy của gel, tắt điện và lấy gel ra

 Nhuộm gel và rửa nhuộm:

Sau khi lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Stainingsolution)

Lắc nhẹ 10-30 phút cho Staining solution thấm vào gel

Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (Destaining solution) Thay dung dịch rửa mớivài lần với thời gian khoảng 15 phút/lần cho đến khi miếng gel có màu trong suốt vàxuất hiện nhiều vạch xanh lơ trên gel Quan sát các vạch này và xác định kích thướcenzyme dựa vào thang chuẩn trên bản gel

1 Đường chuẩn Albumin