Ứng Dụng ‘Dấu’ Phân Tử Trong Công Tác Giống Cây Trồng pot

Sự khác biệt giữa cá thể/giống/loài = PolymorphismPhân biệt/nhận diện đặc điểm nhận diện – ‘Dấu’ ‘DNA Marker’ Kháiniệm: DấuMarker= đặ điểmdùngđể phânbiệt/nhậndiện Dấu di truyền Geneti

Chương 1 Ứng Dụng ‘Dấu’ Phân Tử Trong

Công Tác Giống Cây Trồng

Dấu phân tử

(Molecular Markers/DNA Markers)

Sự khác biệt giữa cá thể/giống/loài = Polymorphism

Phân biệt/nhận diện
đặc điểm nhận diện – ‘Dấu’

‘DNA Marker’

Kháiniệm:

Dấu(Marker)= đặ điểmdùngđể phânbiệt/nhậndiện

Dấu di truyền (Genetic Marker) = đặ điểmdùngđể phân

biệt/nhậndiệnvề bảnchấtditruyền Dấu phân tử (DNA Marker) = đặc điểm ADN dùng để phân

biệt/nhận diện (về bản chất di truyền)

Ứng dụng: Dùng để phân biệt/nhận diện sự khác nhau (về bản chất

di truyền) giữa các cá thể/giống/loài

Yêu cầu:

+ Khác nhau (Polymorphism) giữa các cá thể/các giống/các loài

+ mang tính đặc trưng và ổn định, ít/không bị thay đổi bởi đk

ngoại cảnh

Đặc điểm của các loại ‘Genetic Marker’

+++

+ +

+

Mức độ Polymorph

+++

+++

++

+

Đòi hỏi kỹ thuật

+ +++

+

Hình thái /Nông học

+++

++

++

Phản ánh b/chất DT

+ ++

++

Chịu t/động ngoại

cảnh

+++

+++

+

Số lượng Marker

ADN Protein

Isozyme Marker

Dấu phân tử (Molecular Markers)

= Dấu ADN (DNA Markers)

Dấu phân tử được thiết lập và xác định dựa trên sự đa dạng

(Polymorphism) xuất hiện ngẫu nhiên (Naturally) trên

phân tử ADN (VD: mất, thay thế, thêm các base nitơ,

hay thay đổi về ‘trình tự sắp xếp đặc biệt’ (patterns) của

các base nitơ)

Phân loại: có 2 nhóm dấu ADN

- Dựa trên đột biến của 1 cặp base nitơ (thiếu, thay thế, thêm)

làm thay đổi điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn

(regconition sites) (RFLP, SCAR, SNP), hoặc thay đổi trình

tự vị trí gắn của ‘con mồi’ (primer) (RAPD), hoặc thay đổi

cả 2 (AFLP)

Kỹ thuật phân tích Dấu phân tử

• Cắt ADN (Restriction Digestion)

• Phản ứng PCR

• Điện di ADN (Gel Electrophoresis)

Các dạng DNA Marker trên TV

Dựa trên kỷ thuật cắt bằng Enz cắt giới hạn (Digestion):

- RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism)

- DArT (Diversity Array Technique)

Dựa trên kỷ thuật PCR:

- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA Marker)

- SSR (Simple Sequence Repeat)

- ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)

- SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Dựa trên Digestion + PCR:

- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Các dạng DNA Marker trên TV

Dựa trên kỷ thuật Digestion:

- RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism)

- DArT (Diversity Array Technique)

Dựa trên kỷ thuật PCR:

- RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)

- SSR (Simple Sequence Repeat)

- ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)

- SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Dựa trên Digestion + PCR:

- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

- SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions )

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Nguyên tắc: + Cắt ‘genomic ADN’ bằng Enz cắt giới hạn

+ Điện di để phân tách các đoạn cắt

 Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism)

Điểm nhận diện của mỗi Enz giới hạn có:

+ Trình tự đặc biệt của các base nitơ

+ Không phụ thuộc vào bất kỳ loại gien nào

+ Phân bố ngẫu nhiên khắp toàn bộ bộ gien của SV

 Kiểu gien≠ = vị trí điểm nhận diện của Enz giới hạn≠

 Kết quả cắt≠(đoạn được cắt có chiều dài≠)

6 Nu-cutter GAATTC 4 Nu-cutter TCGA

Enzymes cắt ADN ở vị trí chuyên biệt

Điểm nhận diện thường có trình tự đối xứng (palindromes):

RFLP (ttheo )

RFLP (ttheo.)

RFLP ↔ Đa dạng về

điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn Dạng k/quả:

Có // Không

RFLP (ttheo.)

RFLP = co-dominant (phân biệt được

Heterozygote/Homozygote)

Ưu điểm:

Mức độ đa dạng tương đối cao (Relatively High Polymorphism)

Marker mang tính đồng trội (Co-dominant)

Kết quả ổn định (Reproductive)

Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC

Khuyết điểm:

Đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và đắt tiền;

Đòi hỏi số lượng lớn ADN

Đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết)

RFLP (ttheo.)

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA Markers)

Nguyên tắc:

+ Sử dụng 1 con mồi ngắn (~10 bp) (Primer F = Primer R)

+ Kỹ thuật PCR  Tổng hợp ngẫu nhiên các đoạn ADN

trên khắp bộ gien (đoạn tổng hợp có chiều dài <1 Kb)

+ Điện di để phân tách các đoạn được tổng hợp

 Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism)

RAPD = Đa dạng (Polymorphism) về vị trí gắn của con mồi

Kết quả điện di

RAPD (ttheo )

Cá thể 232 mang băng B

là đồng hợp tử hay dị hợp tử ở locus B ?

 Trội hoàn toàn (Có/không) ???

B

Hạn chế của PPháp

Băng B thực sự là do khác biệt về di truyền hay

do sai sót về kỹ thuật ?

 Tính ổn định ???

RAPD (ttheo )

A

Ưu điểm:

Phương pháp đơn giản, rẽ tiền và ít tốn thời gian nhất

Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC

Không đòi hỏi số lượng lớn ADN

Không đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết)

Khuyết điểm:

Marker không chuyên biệt (Unspecific)

Marker mang tính trội (Dominant)

Kết quả không ổn định (UnReproductive)

RAPD (ttheo )

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

= RFLP + RAPD

Nguyên tắc:

+ Cắt ‘Genomic ADN’ bằng Enz giới hạn

+ Gắn Adaptor ở 2 đầu mỗi đoạn được cắt

+ Kỹ thuật PCR với con mồi = Adaptor

+ Điện di để phân tích các đoạn ADN được tổng hợp

 Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism)

AFLP = Đa dạng về điểm nhận diện của Enz giới hạn

+ Đa dạng về vị trí gắn của con mồi

AFLP (Các bước cơ bản)

Mẫu

A B

Adaptor

AFLP (cont.)

Polymorph

(Đa hình)

Ưu điểm:

Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC

Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism)

Marker tương đối chuyên biệt (specific)

Kết quả rất ổn định (Reproductive)

 được áp dụng trên nhiều loài SV khác nhau

Khuyết điểm:

Phương pháp tương đối phức tạp và tốn kém

Marker mang tính trội (Dominant)

Đòi hỏi số lượng ADN tương đối lớn

AFLP (ttheo )

VNTR: Variable Number Tandem Repeats

• Vùng không mang thông tin DT (Non-coding)

• Nhiều đoạn lặp (copy) của cùng 1 trình tự đặc biệt (Motifs)

• Đa dạng (Polymorphism) rất cao giữa các cá thể cùng loài

= Khác biệt về số lượng đoạn lặp của 1 trình tự đặc biệt

 SSR (Simple Sequence Repeat = MicroSatellite)

VNTR

SSR (Simple Sequence Repeats/Microsatellites) S

SSR có trong bộ gien của tất cả SV nhân thật (Eukaryote) và có

chứa từ vài đến vài trăm đoạn lặp (Copies) của 1 trình tự đặc

biệt (Motif) từ 1-4 base nitơ

• Rất đa dạng (nhiều alen/locus)

• Rất nhiều locus SSR (hàng

1000 locus) trong mỗi loài SV

Nguyên tắc:

+ Kỹ thuật PCR với 2 con mồi (F/R) tương ứng với 2 đầu của SSR + Điện di để

phân tách các đoạn được tổng hợp

 Tìm và

ghi nhận sự

đa dạng

• Thường sử dụng đề tìm sự

đa dạng trong cùng loài;

• Thường sử dụng để tìm quan hệ gia phả

SSR (ttheo )

Ưu điểm:

Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism)

Phương pháp nhanh và rẽ tiền

Marker mang tính đồng trội (Co-Dominant)

Không đòi hỏi số lượng và chất lượng ADN

Marker chuyên biệt (specific)

Kết quả rất ổn định (Reproductive)

Khuyết điểm:

Cần biết trước thông tin về đối tượng NC  Đối tượng

áp dụng có giới hạn

Cần nhiều thời gian và công sức để thu thập thông tin

trước về đối tượng NC

SSR (ttheo )

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Các dạng SNP

subarray

Slide

gene

spot pingroup

SNP (ttheo )

Stable (L.kết bền)

Unstable (L.Kết không bền)

 L.kết không bền có thể bị c t bằng Enz S1 hoặc bị tách

DArT = AFLP + Array

DArT = Đa dạng về điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn

(Thay đổi 1 Nu hay mất đoạn, thêm đoạn)

DArT (Diversity Array Technique Marker)

Nguyên tắc:

+ Thiết kế Chip dựa trên các thông tin đã biết trước (đoạn biết trước)

+ Đoạn chưa biết được nhân lên và gắn màu huỳnh quang

+ Cho lai đoạn chưa biết // đoạn đã biết

+ Rữa và đ c kết quả

A Diversity Array Panel of 4 parents of CIAT’s 2 cassava mapping

populations onto which was hybridized Cy3-and Cy5-labeled

cloned amplicons of 2 of these parents

Nguyên tắc phát hiện đa dạng (Diversity Arrays)

A B C D E F G H

Cần có 5 ưu điểm:

• Có mức độ đa dạng từ cao
rất cao

• Mang đặc tính đồng trội

• Phân bố ngẫu nhiên và rộng khắp bộ gien của SV

• Dễ thực hiện và rẽ tiền

• Có tính ổn định cao

Dấu phân tử ‘lý tưởng’ ???

Đặc điểm của các dấu ADN (DNA Markers)

-+++

+ + ++

RFLP

+ +

++

+++

Technical Facilities

-+

-Prior Information

+++

+/-Automation

+

++

RAPD

+++

+++

++

Reproductivity

+++

+++

++

Polymorphisme

DArT SSR

AFLP

(Karp et al., 1997; O’Hanlon et al., 2000 )

Dấu phân tử được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

– Nghiên cứu và phân tích ngân hàng vật liệu di truyền,

– ChNn đoán về di truyền,

– Khảo sát và lập lý lịch giống hoặc các SV chuyển gien

– N ghiên cứu bộ gien

– Phân tích phả hệ và sự quan hệ giữa các SV trong quá

trình tiến hóa

– Tìm sự liên kết giữa dấu phân tử và các đặc điểm mong

muốn
chọn giống

Ứng dụng của dấu phân tử

Câu hỏi ???