aureus trên đĩa 96 giếng là một công cụ hiệu quả để sàng lọc và nghiên cứu các hoạt chất có khả năng kháng biofilm, với các lợi thế vượt trội về giá thành, tính đồng nhất, lượng mẫu, cũ
TỔNG QUAN
Tổng quan về Staphylococcus aureus
1.1.1 Giới thiệu về Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus lần đầu tiên được xác định vào năm 1884 bởi Anton
Rosenbach, một bác sĩ phẫu thuật người Đức [27], [28] S aureus là một thành viên của chi Staphylococcus Các thuật ngữ Staphylococcus được đề xuất bởi Sir Alexander
Ogston từ tiếng Hy Lạp (staphyle nghĩa là chùm nho) do sự sắp xếp đặc trưng của nó thành cụm [6], [27]
Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus [42]
Trái: hình ảnh trên kính hiển vi; Phải: hình ảnh trên kính hiển vi điện tử
Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), S aureus được xếp vào: Giới:
Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi:
S aureus được phân biệt với các loài tụ cầu khác trên cơ sở sắc tố vàng của khuẩn lạc, kết quả dương tính của các phép thử coagulase, lên men đường mannitol và deoxyribonuclease [23]
1.1.2 Đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy
S aureus là vi khuẩn Gram dương không di động, được đặc trưng bởi các cầu khuẩn riờng lẻ cú đường kớnh từ 0,5 đến 1,5 àm, là vi khuẩn kỵ khớ đa dạng [6] Tụ cầu vàng S aureus có thể chịu được nhiệt độ cao tới 60ºC trong vòng 30 phút và nồng độ muối cao tới 10% [9]
Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) hình thành khuẩn lạc nhẵn, đường kính khoảng 1–2 mm; sau 24 giờ nuôi ở 37°C, khuẩn lạc có màu vàng chanh Trên môi trường thạch máu, Staphylococcus aureus phát triển nhanh và gây tan máu hoàn toàn Trên môi trường thạch manitol, tụ cầu vàng lên men manitol và tạo ra vùng màu vàng quanh khuẩn lạc Trên môi trường canh thang, tụ cầu vàng làm đục môi trường và để lâu có thể lắng cặn.
1.1.3 Khả năng gây bệnh của S aureus
Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường ký sinh ở da và mũi họng, đóng vai trò là tác nhân gây bệnh cho người có đề kháng yếu Với nhiều yếu tố độc lực, nó có thể gây bệnh ở những người suy giảm đề kháng và có khả năng gây ra nhiều loại bệnh khác nhau Đây là vi khuẩn gây bệnh phổ biến nhất với khả năng gây nhiều bệnh khác nhau [1].
Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) ký sinh trên da và niêm mạc mũi có thể xâm nhập qua lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da để gây nhiễm khuẩn mủ như mụn nhọt và ổ áp xe Mức độ nhiễm khuẩn phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch.
Tụ cầu vàng là một trong những vi khuẩn thường gặp gây nhiễm khuẩn huyết Do gây nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, vi khuẩn có thể xâm nhập vào máu và gây nhiễm khuẩn huyết - một bệnh lý rất nặng Từ nhiễm khuẩn huyết, tụ cầu vàng có thể lan tới các cơ quan khác và hình thành các ổ áp xe ở gan, phổi, não, tuỷ; đồng thời có thể gây viêm nội tâm mạc và viêm tắc tĩnh mạch Một số nhiễm khuẩn khu trú này có thể trở thành viêm mạn tính, như viêm xương.
Viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nguy hiểm [1]
Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng có thể xảy ra khi ăn phải độc tố tiết ra bởi tụ cầu hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm ưu thế sau thời gian dài dùng kháng sinh phổ rộng, làm tiêu diệt các vi khuẩn chí bình thường nhạy cảm và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng kháng kháng sinh tăng trưởng Triệu chứng thường rất cấp tính: sau ăn 2–8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, sau đó phân và chất nôn chủ yếu là nước Do mất nước và chất điện giải nên có thể dẫn tới sốc Ngộ độc thức ăn do S aureus là một trong những ngộ độc thực phẩm rất phổ biến ở Việt Nam.
Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu
Nguy cơ nhiễm khuẩn vết mổ và vết bỏng rất cao và có thể dẫn đến nhiễm khuẩn huyết, đặc biệt do các chủng tụ cầu có khả năng kháng kháng sinh mạnh Các chủng tụ cầu này khiến việc điều trị trở nên khó khăn và tỷ lệ tử vong của nhiễm khuẩn huyết rất cao Vì vậy cần chú ý vệ sinh vết thương, tuân thủ đúng phác đồ kháng sinh và theo dõi sát tình trạng nhiễm khuẩn để giảm thiểu biến chứng nghiêm trọng.
Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)
Một số chủng tụ cầu vàng tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồng rộp da Bệnh này thường gặp ở trẻ sơ sinh và có tiên lượng xấu.
Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome)
Hội chứng này thường gặp ở phụ nữ sử dụng bông gạc không sạch khi có kinh nguyệt hoặc những người bị nhiễm khuẩn vết thương [1]
Về mặt lâm sàng, một vấn đề chính liên quan đến S aureus là mức độ kháng thuốc đáng kể đối với nhiều loại kháng sinh, gây phức tạp cho việc điều trị Methicillin được phát triển vào cuối thập niên 1950, và S aureus kháng methicillin (MRSA) được xác định trên lâm sàng vào năm 1960 Nhiễm khuẩn do các chủng S aureus kháng methicillin có tỷ lệ tử vong cao hơn so với nhiễm khuẩn do các chủng nhạy cảm với methicillin, đồng thời làm tăng thời gian nằm viện và chi phí chăm sóc sức khỏe liên quan.
Biofilm của S aureus
Có nhiều định nghĩa khác nhau được đề xuất để mô tả biofilm, nhưng nhìn chung biofilm được định nghĩa là một cộng đồng vi sinh vật (VSV) gồm các tế bào nằm trong ma trận của các chất cao phân tử ngoại bào do chúng tự sản xuất Ma trận này cơ bản được cấu thành từ polysaccharide, DNA ngoại bào (eDNA) và protein, với cấu trúc, tỉ lệ phần trăm và số lượng phụ thuộc nhiều vào điều kiện hình thành Vì vậy, tính chất và thành phần của biofilm có thể thay đổi đáng kể tùy theo môi trường và giai đoạn phát triển của nó.
1.2.2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S aureus
Quá trình hình thành biofilm của S aureus gồm ba giai đoạn chính: gắn ban đầu, phát triển biofilm hoàn chỉnh và tách tế bào để hình thành biofilm mới Ba giai đoạn này tạo thành một vòng khép kín, liên kết chặt chẽ với sự hình thành, tồn tại và phát tán của các nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm.
Trong giai đoạn gắn ban đầu, Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) có thể bám dính và hình thành biofilm trên cả bề mặt sinh học lẫn bề mặt nhân tạo Sự gắn kết được xem là bước đầu của quá trình phát triển biofilm, phụ thuộc vào các tương tác kỵ nước giữa tế bào S aureus và bề mặt phi sinh học hoặc thông qua các protein bề mặt liên kết với các protein nền của vật chủ như fibrinogen, fibronectin và vitronectin Những cơ chế này giúp tế bào S aureus gắn dính chắc và bắt đầu quá trình hình thành biofilm trên nhiều loại bề mặt khác nhau.
Trong giai đoạn phát triển hoàn chỉnh của biofilm, sau khi các VSV bám dính sẽ tăng sinh để phát triển; đồng thời các tế bào tiết ra các chất cao phân tử bao gồm polysaccharides và protein để xây dựng ma trận biofilm Các chất cao phân tử từ tế bào chết được cho là đóng góp vào ma trận biofilm, trong đó đáng chú ý nhất là protein và ADN, khi được giải phóng khỏi tế bào chết được gọi là ADN ngoại bào (eDNA) (xem hình 1.2)
Ở giai đoạn tách tế bào và hình thành biofilm mới, sự tách rời và phá vỡ biofilm đi kèm với quá trình sản sinh các biofilm mới tại các vị trí khác Các tiểu phần vi khuẩn được tách ra có thể đến vị trí mới, bám dính và tái tạo một biofilm tại nơi tới Giai đoạn này liên quan đến sự khởi phát các biến chứng nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm, chẳng hạn như nhiễm khuẩn catheter và nhiễm khuẩn huyết (xem hình 1.2)
Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S aureus [30]
Theo một số tài liệu những năm gần đây, sự hình thành biofilm của S aureus bao gồm 5 giai đoạn: 1) gắn, 2) nhân lên, 3) lan tỏa, 4) hoàn chỉnh và 5) phân tán [17], [26],
Mô hình biofilm 5 pha mở rộng mô hình biofilm truyền thống bằng cách phân chia quá trình phát triển biofilm thành ba pha bổ sung: nhân lên (multiplication), lan tỏa (exodus) và hoàn chỉnh (maturation) Trong pha nhân lên, tế bào bắt đầu phát triển, phân chia và tự tổng hợp một ma trận gồm protein và eDNA Pha lan tỏa được kích hoạt bởi biểu hiện và bài tiết nuclease Nuc1, dẫn đến phân hủy eDNA trong nền và giải phóng một phần tế bào khỏi biofilm, phá vỡ cấu trúc cũ để xây dựng một biofilm lớn hơn Quá trình này đi kèm với giai đoạn phát triển nhanh và hình thành cấu trúc tháp đặc trưng của biofilm hoàn chỉnh ở tụ cầu Dù mới được công nhận gần đây, mô hình biofilm 5 pha hiện nay vẫn ít tài liệu dựa trên nó và phần lớn nguồn tham khảo dựa trên mô hình ba pha truyền thống; tuy nhiên, mô hình 5 pha không mâu thuẫn và là sự bổ sung toàn diện cho khung ba pha.
Hình 1.3 Mô hình hình thành biofilm S aureus 5 giai đoạn [26]
1.2.3 Thành phần biofilm của S aureus
Biofilm của S aureus là một cộng đồng vi khuẩn S aureus tồn tại trong ma trận các hợp chất cao phân tử ngoại bào, thường bao gồm polysaccharide PNAG (poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine) do chính chúng tổng hợp, ADN ngoại bào (eDNA), và các protein có nguồn gốc từ sự ly giải của tế bào vi khuẩn chết.
PNAG, còn được gọi là PIA (polysaccharide intercellular adhesin), là thành phần chính của chất cao phân tử ngoại bào Việc sản xuất PNAG phụ thuộc operon ica gồm các gen icaA, icaD, icaB và icaC: icaA là N-acetylglucosamin transferase và sự phối hợp của icaA với icaD đã được chứng minh tạo ra oligomer N-acetylglucosamin; chu trình tổng hợp PNAG phát triển nhờ icaoC, một protein màng đảm nhận chức năng vận chuyển PIA ra ngoài màng tế bào icaB nằm trên bề mặt vi khuẩn là PIA deacetylase, có vai trò gắn PIA vào màng tế bào PIA đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính, hình thành biofilm và né tránh miễn dịch, đồng thời tăng khả năng kháng với các chất kháng khuẩn.
Protein đóng vai trò thiết yếu trong quá trình gắn kết và phát triển chất nền biofilm Các protein này không chỉ là thành phần cấu trúc mà còn tham gia vào các tương tác với bề mặt và các tế bào trong biofilm, giúp hình thành mạng lưới liên kết ổn định Nhiều protein liên kết bề mặt đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn kết, là các adhesin hoặc các protein bám bề mặt giúp tế bào gắn kết và phát triển chất nền biofilm Hiểu rõ vai trò của protein trong biofilm giúp tối ưu hóa chiến lược kiểm soát sự hình thành và phá vỡ chất nền biofilm, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị và quản lý nhiễm khuẩn Do đó, protein là yếu tố then chốt ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của biofilm, tạo nên mạng lưới phức tạp có ý nghĩa trong sinh học vi khuẩn và ứng dụng y học.
A, protein liên kết fibrinogen (FnBPA và FnBPB), protein bề mặt S aureus (SasG), protein liên kết biofilm (Bap) và yếu tố đông tụ B (ClfB) Ngoài ra, các protein nội bào đã được xác định trong ma trận biofilm Những protein này có thể được giải phóng bằng cách ly giải tế bào và được kết hợp không đặc hiệu vào chất nền [20] eDNA: eDNA trong chất nền biofilm của S aureus có chức năng cung cấp sự ổn định cho biofilm Người ta cho rằng eDNA này có nguồn gốc từ sự ly giải các tế bào vi khuẩn chết [22] Có thể do đặc tính cao phân tử và anion của ADN, nó cực kỳ “dính” và do đó, eDNA dễ tương tác với nhiều phân tử bề mặt khác, góp phần hình thành mạng lưới chất nền biofilm ngoại bào [30]
1.2.4 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm của S aureus
Nhiều yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng sâu sắc đến các giai đoạn hình thành biofilm của S aureus
Thành phần của môi trường nuôi cấy
Việc hình thành biofilm phụ thuộc mạnh vào môi trường và điều kiện nuôi cấy, và sự thay đổi kiểu hình biofilm có thể được quan sát ở các môi trường nuôi cấy khác nhau Bổ sung glucose và NaCl có thể làm tăng đáng kể quá trình hình thành biofilm, cho thấy vai trò của các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện sinh lý trong sự phát triển của cộng đồng vi sinh trên bề mặt Các nghiên cứu đã sử dụng các nồng độ glucose và NaCl khác nhau trong quá trình hình thành biofilm, và các kết quả này sẽ được trình bày cụ thể hơn ở phần bàn luận.
Lý do bổ sung NaCl và glucose đã được đồng thuận trong cộng đồng nghiên cứu về lĩnh vực này Theo đó, việc bổ sung NaCl tăng cường khả năng kết hợp, độ ổn định và độ bền của biofilm bằng cách tăng biểu hiện của operon ica Bên cạnh NaCl, việc bổ sung glucose cũng được xem xét như một yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành biofilm và sự điều hòa của hệ thống sinh học liên quan.
Việc bổ sung glucose cũng thúc đẩy sự hình thành biofilm Có nhiều giả thuyết giải thích vai trò của glucose bổ sung; một giả thuyết được chấp nhận rộng rãi cho rằng glucose có thể được phosphoryl hóa bởi glucokinase để tạo thành glucose-6-phosphate, sau đó tham gia vào giai đoạn đồng hóa và hỗ trợ hình thành biofilm Bên cạnh đó, glucose còn có thể đóng vai trò là tiền chất cho VSV tổng hợp các polysaccharide như PNAG [16], [21].
Biofilm có thể hình thành trên cả các bề mặt tự nhiên như van tim, khớp và trên các bề mặt nhân tạo như catheter, khớp giả, stent, lá kính hay đĩa 96 giếng Các đặc tính của bề mặt bám dính đóng vai trò then chốt trong quá trình hình thành biofilm; tính kỵ nước, độ nhẵn và điện tích của bề mặt ảnh hưởng mạnh đến sự gắn kết và khả năng tách rời của vi khuẩn, từ đó quyết định tốc độ và quy mô phát triển của biofilm Điều kiện tạo biofilm chịu sự tác động của những đặc tính này cũng như tương tác giữa vi khuẩn và bề mặt, góp phần làm rõ cơ chế và phương pháp kiểm soát biofilm trong các ứng dụng y tế.
Biofilm là một kiểu hình thích nghi của vi khuẩn trước các điều kiện bất lợi Ở S aureus MRSA, điều kiện hiếu khí cho thấy biofilm yếu hơn so với môi trường giàu CO2, trong khi thiếu oxy có thể làm tăng quá trình ly giải tế bào và thúc đẩy hình thành biofilm Mặc dù biofilm có thể hình thành ở phạm vi pH rất đa dạng, một biofilm bền vững đòi hỏi nuôi cấy ở pH phù hợp; ở S aureus, khoảng pH phù hợp là rất rộng, từ acid yếu đến kiềm yếu, và chỉ một vài điều kiện khắc nghiệt như pH 3 hoặc pH 12 mới có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển biofilm Biofilm ổn định hơn ở các môi trường có pH liên quan đến trạng thái sinh lý của tế bào Ngoài ra, stress như tiếp xúc với kháng sinh ở liều gây chết có thể kích thích sự tập hợp vi khuẩn, làm tăng tổng hợp polysaccharide PNAG và giải phóng eDNA từ quá trình ly giải tế bào, góp phần làm tăng thành phần nền và sự hình thành biofilm Yếu tố nhiệt độ và thời gian nuôi cấy cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm của vi khuẩn.
1.2.5 Các bệnh liên quan đến biofilm của S aureus
Biofilm và các thất bại trong điều trị nhiễm khuẩn
Biofilm không chỉ bảo vệ VSV khỏi sự biến đổi pH, nhiệt độ và sự khan hiếm chất dinh dưỡng, mà còn ngăn chặn sự tiếp cận của cộng đồng vi khuẩn trong biofilm với thuốc kháng sinh và tế bào miễn dịch của vật chủ Nhờ hàng rào bảo vệ này, biofilm cung cấp thêm sức đề kháng cho vi khuẩn, giúp chúng chịu được các điều kiện khắc nghiệt và có khả năng đáp ứng kém với kháng sinh Các bằng chứng cho thấy biofilm có thể chịu được nồng độ kháng sinh cao gấp 10-1000 lần so với tế bào vi khuẩn ở dạng tự do.
Sự kém đáp ứng của vi khuẩn trong biofilm xuất phát từ nhiều nguyên nhân, trong đó có thể phân loại thành các yếu tố dược động học (PK) và dược lực học (PD) của thuốc Các yếu tố PK—như hấp thu, phân phối, chuyển hóa và thải trừ—có thể làm thay đổi nồng độ thuốc tại vị trí biofilm và làm giảm hiệu quả điều trị Bên cạnh đó, các yếu tố PD liên quan đến tác dụng của thuốc lên tế bào vi khuẩn, khả năng xuyên qua lớp biofilm và sự thay đổi nhạy cảm của vi khuẩn trong môi trường biofilm, cũng góp phần làm tăng sự kém đáp ứng Hiểu rõ các yếu tố PK-PD giúp tối ưu hóa liều lượng và lịch trình dùng thuốc để cải thiện hiệu quả điều trị và khắc phục tình trạng kháng thuốc liên quan đến biofilm.
Các yếu tố về dược động học ảnh hưởng đến nồng độ kháng sinh
Chất nền polysaccharide và cấu trúc biofilm đóng vai trò như một lớp màng bảo vệ, làm giảm sự khuếch tán của kháng sinh vào biofilm và ngăn cản sự xâm nhập của chúng Hàng rào này đồng thời giảm tốc độ khuếch tán của kháng sinh trong biofilm Bên cạnh đó, kháng sinh có thể phản ứng với các thành phần của biofilm eDNA, thành phần của chất nền ngoại bào, thể hiện khả năng chelat với kháng sinh Thành phần polysaccharide và protein cũng đã được chứng minh có khả năng phản ứng với một số kháng sinh Những yếu tố này dẫn đến nồng độ kháng sinh tiếp xúc với vi khuẩn ở mức thấp, khiến hiệu quả diệt VSV không đạt được.
Các yếu tố về dược lực học ảnh hưởng đến hoạt lực kháng sinh
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến dược lực học của kháng sinh với VSV trong biofilm Đáng chú ý là sự chuyển đổi sang kiểu hình dai dẳng và dung nạp kháng sinh, khiến các tế bào VSV trong biofilm có thể tồn tại ngay cả khi thuốc ở nồng độ gây ức chế bên ngoài khu vực lân cận Cấu trúc của biofilm và ma trận ngoại bào tạo hàng rào, làm giảm khuếch tán kháng sinh và bảo vệ vi khuẩn khỏi tác dụng của thuốc Thêm vào đó, trạng thái trao đổi chất thấp và sự hình thành persister cells làm giảm nhạy cảm của VSV với kháng sinh Các yếu tố môi trường như pH, oxy và tín hiệu giữa tế bào cũng ảnh hưởng đến hiệu lực điều trị, trong khi hoạt động bơm đẩy thuốc và các cơ chế thích nghi khác càng làm phức tạp việc xâm nhập và tiêu diệt tế bào đích Vì vậy, để tối ưu hóa điều trị nhiễm khuẩn liên quan biofilm, cần tiếp cận đa mục tiêu, nhắm đúng dược lực học và ngăn ngừa sự chuyển đổi sang trạng thái dai dẳng và dung nạp.
10 kháng sinh cũng như (ii) tăng khả năng xuất hiện kiểu hình kháng kháng sinh của các VSV trong biofilm
Trong biofilm, môi trường khắc nghiệt như nồng độ oxy thấp, độ pH giảm, nhiệt độ cao, thiếu chất dinh dưỡng và mật độ VSV cao tạo áp lực lên các vi khuẩn, thúc đẩy chúng chuyển sang các kiểu hình ít nhạy cảm với kháng sinh Quá trình này dẫn đến sự chuyển đổi sang kiểu hình dai dẳng và trạng thái dung nạp kháng sinh, khiến các VSV trong biofilm có xu hướng giảm đáp ứng với thuốc và làm tăng khả năng tồn tại của nhiễm trùng Vì vậy, biofilm đóng vai trò then chốt trong cơ chế kháng thuốc và khiến điều trị nhiễm khuẩn gặp nhiều thách thức.
Dung nạp là đặc trưng của một phần hoặc toàn bộ quần thể vi khuẩn không đáp ứng với điều trị bằng kháng sinh Đây được xem như hai kiểu hình tiền đề cho sự hình thành các kiểu hình liên quan đến kháng thuốc, mang ý nghĩa quan trọng trong hiểu biết về cơ chế đề kháng và hướng tiếp cận điều trị hiệu quả.
Kiểu hình dung nạp kháng sinh là đặc tính của toàn bộ quần thể vi sinh vật (VSV), cho thấy khả năng sống sót tăng lên khi tiếp xúc với kháng sinh diệt khuẩn ở nồng độ cao mà không liên quan tới sự thay đổi của nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kiểu hình này làm chậm lại các quá trình thiết yếu của VSV, khiến tốc độ tăng trưởng giảm hoặc ngừng hẳn Dung nạp kháng sinh thường xảy ra ở một số trường hợp đặc biệt hoặc ở những VSV có tốc độ tăng trưởng rất chậm Kiểu hình dai dẳng kháng sinh mô tả một quần thể VSV không đồng nhất về khả năng dai dẳng kháng sinh: có một tiểu quần thể mang kiểu hình dai dẳng, trong khi phần còn lại vẫn nhạy cảm với kháng sinh; sự khác biệt này được đánh giá thông qua tham số MDK (minimum duration for killing) – thời gian tối thiểu để kháng sinh tiêu diệt một lượng xác định VSV Dưới tác dụng của kháng sinh diệt khuẩn, quần thể VSV sẽ phân thành hai nhóm: một tiểu quần thể dung nạp kháng sinh (MDK tăng) và phần còn lại nhạy cảm với kháng sinh (MDK không tăng).
Biofilm có cấu trúc và sinh lý đặc biệt có thể làm tăng khả năng xuất hiện các kiểu hình kháng kháng sinh và tạo điều kiện cho sự phát triển kháng đột biến dần trong quá trình điều trị bằng kháng sinh Điều này đặc biệt phổ biến ở các chủng đột biến, vốn rất phổ biến trong các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp mạn tính [24] Bên cạnh đó, mật độ tế bào vi khuẩn cao trong biofilm cho phép trao đổi gen kháng thuốc theo chiều ngang giữa các vi khuẩn một cách hiệu quả, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển khả năng kháng thuốc kháng sinh [35].
Một số mô hình biofilm và ứng dụng trong nghiên cứu
1.4.1 Mô hình biofilm in vitro
Mô hình biofilm trên đĩa 96 giếng là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để nuôi cấy và nghiên cứu biofilm, nhờ khả năng sàng lọc cao, tính đơn giản, chi phí thấp và thao tác dễ dàng Mô hình này cho phép đánh giá tác dụng của nhiều mẫu và nhiều điều kiện cùng lúc, đồng thời khảo sát được đa nồng độ kháng sinh trên biofilm Do những ưu điểm đó, nó thường được xem như bước tiền thân cho các nghiên cứu in vivo.
Hình 1.5 Biofilm S aureus trên đĩa 96 giếng và bề mặt miếng titan [32]
Ngoài ra, các mô hình biofilm được xây dựng trên các bề mặt nhựa, kim loại và silicon nhằm đánh giá khả năng hình thành biofilm trên từng vật liệu, đồng thời có các mô hình biofilm trên lá kính giúp quan sát biofilm dưới kính hiển vi [33].
1.4.2 Mô hình biofilm in vivo
Một số mô hình động vật đã được phát triển để nghiên cứu sự hình thành biofilm trên catheter trong môi trường sống thực (in vivo) Các mô hình này không chỉ cho phép đánh giá hiệu quả của nhiều chất kháng khuẩn và các đặc tính cơ bản của biofilm vi khuẩn hình thành trong điều kiện thực tế, mà còn giúp khảo sát sự xâm nhập hay phân bố của VSV đến các cơ quan khác nhau Mô hình được sử dụng phổ biến nhất là catheter gắn trên chuột và thỏ.
Hình 1.6 Nhiễm khuẩn biofilm trên catheter được cấy trong bụng chuột [36]
Các mô hình nhiễm khuẩn dị vật dưới da đã được phát triển trên chuột lang, chuột đồng, chuột nhắt, ngựa con, thỏ và chuột cống Trong mô hình này, dị vật được đưa vào các túi dưới da và biofilm được cho phép hình thành trên vật liệu cấy ghép Mô hình này đặc biệt thích hợp để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường được cấy ghép đối với sự hình thành biofilm.
Trong nhiều nghiên cứu in vivo, biofilm được hình thành trên vật liệu sinh học được cấy vào ổ phúc mạc của thỏ hoặc chuột Mô hình này cho phép hình thành một bệnh nhiễm khuẩn mạn tính có thể duy trì đến 6 tháng Các mô hình nhiễm khuẩn dị vật trong phúc mạc đã được sử dụng để nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng sinh đối với biofilm của vi khuẩn, cũng như đánh giá tầm quan trọng của việc phát hiện số VSV trong biofilm.
Các mô hình nhiễm khuẩn đường tiết niệu được thực hiện trên chuột và thỏ, trong đó người ta đưa vào bàng quang các vật liệu như đĩa kẽm, ống thông hoặc ống polyethylen để mô phỏng tình trạng nhiễm khuẩn Mô hình này cho thấy tầm quan trọng của việc đánh giá các yếu tố gây nhiễm và hiệu quả của các biện pháp can thiệp trong nghiên cứu tiền lâm sàng, từ đó đóng góp dữ liệu có giá trị cho hiểu biết và điều trị nhiễm khuẩn đường tiết niệu.
Biofilm hình thành đóng vai trò then chốt trong nhiễm khuẩn đường tiết niệu; nghiên cứu này đánh giá tác động của các loại kháng sinh khác nhau đối với sự phát triển của biofilm trên các ống thông và so sánh hiệu quả của các loại ống thông khác nhau trong việc ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường tiết niệu [8].
Để nghiên cứu nhiễm khuẩn tai mũi họng liên quan đến biofilm, một số mô hình động vật đã được phát triển, trong đó chuột và thỏ là hai loài được lựa chọn chính Các mô hình này cho thấy khả năng hình thành biofilm của một số vi khuẩn trên niêm mạc mũi họng và tai giữa, đồng thời cho phép đánh giá tác dụng của các chất kháng khuẩn trên biofilm Nhờ đó, các nhà khoa học có thể điều tra sự lây nhiễm liên quan đến biofilm và đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị nhằm ngăn chặn sự hình thành và phát triển biofilm trong nhiễm khuẩn tai mũi họng.
1.4.3 Cách đánh giá các chỉ tiêu thành phần của biofilm
Trong những thập kỷ qua, đã có nhiều mô hình in vitro được mô tả để nghiên cứu sự hình thành và phát triển của biofilm Trong hầu hết các mô hình này, việc định lượng biofilm chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp đếm, tuy nhiên tốn nhiều công sức và thời gian Gần đây, một số phương pháp hiện đại hơn đã được tiếp cận nhằm định lượng các chỉ tiêu thành phần của biofilm, mang lại lựa chọn nhanh chóng và hiệu quả hơn cho đánh giá tổng sinh khối Đánh giá tổng sinh khối biofilm bằng nhuộm Crystal Violet (CV) vẫn là một kỹ thuật phổ biến, dễ thực hiện và cho phép ước lượng khối lượng biofilm trên các mẫu nghiên cứu.
Nhuộm tím tinh thể (CV) lần đầu tiên được mô tả bởi Christensen và cộng sự
Kể từ năm 1985, phương pháp đo sinh khối biofilm bằng Crystal Violet (CV) đã được chỉnh sửa để tăng độ chính xác và cho phép định lượng sinh khối biofilm trên toàn bộ giếng CV là một chất nhuộm màu cơ bản liên kết với các phân tử bề mặt mang điện âm và polysaccharid trong chất nền ngoại bào, do đó CV phù hợp để đánh giá tổng sinh khối biofilm vì cả tế bào (sống và chết) và chất nền đều bị nhuộm màu bởi CV Tuy nhiên, CV kém thích hợp để đánh giá việc tiêu diệt các tế bào trong biofilm hoặc mức độ sống còn của tế bào trong biofilm Để định lượng VSV sống trong biofilm, người ta sử dụng chuyển hóa resazurin như một chỉ số hoạt động sống.
Resazurin là một loại thuốc nhuộm tan trong nước, không độc hại, bị khử bởi các phản ứng chuyển điện tử liên quan đến hô hấp để sản xuất resorufin (RF) phát quang Khi bị khử, resazurin thay đổi màu từ xanh lam sang hồng rồi trong suốt Giai đoạn đầu tiên của quá trình khử resazurin màu xanh thành RF màu hồng là do sự mất đi một nguyên tử oxy liên kết lỏng lẻo với nitơ của nhân phenoxazin, và giai đoạn thứ hai của sự khử tạo thành trạng thái không màu.
Hình 1 1 Quá trình khử của resazurin [12]
Resazurin bị khử nhanh chóng trong các tế bào sống và được ứng dụng phổ biến những năm gần đây để định lượng biofilm thông qua đánh giá khả năng chuyển hóa resazurin (không huỳnh quang) thành resorufin (phát huỳnh quang) Tín hiệu huỳnh quang từ resorufin cho phép đo lường nhanh mật độ và hoạt động của biofilm mà không làm hại tế bào, đồng thời cung cấp dữ liệu định tính và định lượng về sự sống của vi khuẩn trên bề mặt Phương pháp này đơn giản, tiết kiệm và dễ tích hợp vào quy trình thí nghiệm vi sinh, mang lại lợi ích trong nghiên cứu sinh học phân tử, vi sinh môi trường và đánh giá hiệu quả các biện pháp xử lý biofilm Do đó, kỹ thuật đo lường dựa trên chuyển hóa resazurin sang resorufin đang trở thành công cụ quan trọng để khảo sát sinh học của biofilm và tối ưu các ứng dụng thực tiễn.
13 quang sẽ được đo với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng là 560/590 nm Resazurin có thể áp dụng cho một số VSV như E coli và S aureus [12], [25]
Nhuộm – quan sát biofilm với Syto9/propidium iod
Hệ nhuộm Syto9/propidium iodide được sử dụng rất phổ biến cho các nghiên cứu quan sát biofilm bằng kính hiển vi đồng tiêu (Confocal laser scanning microscopy) nhằm đánh giá tình trạng sống/chết của VSV trong biofilm Syto9 khuếch tán thụ động qua màng tế bào và liên kết với DNA của cả tế bào sống lẫn tế bào chết, cho màu xanh lá khi quan sát với bước sóng kích thích 505 nm và phát xạ 515 nm Khi được kết hợp với propidium iodide, một thuốc nhuộm bắt màu tế bào chết, mẫu sẽ cho màu đỏ huỳnh quang ở bước sóng kích thích 600 nm và phát xạ 610 nm [31].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu và chủng giống
Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu
1 299 mẫu cao chiết dược liệu Đại học Dược Hà Nội Viện dược liệu Đại học Cần Thơ Viện hóa học Việt Nam
2 Cao lá ổi, các mẫu phân đoạn từ cao lá ổi Học viên cao học Tống
Chủng chuẩn ATCC được cung cấp bởi Phòng nghiên cứu dược lý phân tử và tế bào (FACM) - Đại học Công giáo Louvain, Vương quốc Bỉ, và được lưu trữ ở nhiệt độ -80°C tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia - Đại học Dược Hà Nội.
Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Hóa chất Hãng – nước sản xuất
1 Môi trường lỏng Tryptic Soy (TSB) Merck – Đức
2 Môi trường lỏng Brain Heart Infusion (BHI) Merck – Đức
3 Môi trường lỏng Muller Hinton (MHB) Merck – Đức
4 Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher chemical
6 Tím tinh thể Sigma-Aldrich
7 Môi trường thạch Tryptic Soy Agar (TSA) Chuẩn bị từ peptone, cao thịt, NaCl, thạch bột
8 Dung dịch đệm phosphate pH 7.4 (Phosphate- buffered saline – PBS)
Chuẩn bị từ NaCl, KCl,
9 Natri clorid, glucose Trung Quốc
Bảng 2.3 Thành phần các môi trường
Peptone từ bột đậu nành 3.0
Công thức pha: pha 30g môi trường trong 1 lít nước cất
Công thức pha: pha 21g môi trường trong 1 lít nước cất
Công thức pha: pha 37g môi trường trong 1 lít nước cất
Cách pha resazurin: cân resazurin chính xác, pha trong nước cất vô khuẩn để đạt nồng độ 1 mg/10 ml Bảo quản trong tủ lạnh và sử dụng trong vòng 1 tháng Khi sử dụng, pha loãng dung dịch theo tỷ lệ phù hợp với mục đích thí nghiệm.
10 lần trong nước cất vô khuẩn
Cách pha tím tinh thể (crystal violet – CV): cân CV, pha nồng độ 2,5g/l trong ethanol Bảo quản tránh ánh sáng Khi sử dụng, pha loãng 50 lần trong nước cất
Bảng 2.4 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Trang thiết bị, máy móc Xuất xứ
1 Cân kỹ thuật Satorius – Đức
2 Cân phân tích Satorius – Đức
3 Tủ lạnh Sanyo – Nhật Bản
6 Tủ cấy vô khuẩn BioAir – Italy
7 Nồi hấp tiệt khuẩn 50L ALP – Nhật Bản
9 Pipet 1000-200; 200-20; 20-1 àl Nichiryo – Nhật Bản
10 Pipet đa kênh AHN – Đức
11 Hộp đựng đầu típ loại 1000 μl, 200μl Hàn Quốc
12 Đĩa 96 giếng SPL – Hàn Quốc
13 Máy đọc vi đĩa 96 giếng huỳnh quang - UV Varioskan Lux/
14 Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U5100 - Nhật Bản
16 Dụng cụ thủy tinh: bình nón, cốc có mỏ, ống đong, đĩa petri… Trung Quốc
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát một số môi trường phù hợp cho nuôi cấy biofilm của S aureus
Áp dụng nguyên tắc dựa trên các nguồn nguyên liệu thương mại sẵn có, bài viết nhấn mạnh việc đảm bảo đồng đều giữa các lô thí nghiệm, tăng tính ứng dụng và khả năng chuyển giao cho các đơn vị nghiên cứu khác Dựa trên nguyên tắc nghiên cứu tài liệu, cần bổ sung một số nguyên liệu nhằm tăng khả năng tạo biofilm của VSV, nhằm mục tiêu tạo ra biofilm ổn định và đáng tin cậy cho các ứng dụng nghiên cứu.
Thực hiện khảo sát một số môi trường phù hợp cho nuôi cấy tạo biofilm của S aureus
2.2.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy tạo biofilm của S aureus
Trên nguyên tắc nghiên cứu tài liệu và nguyên tắc đảm bảo biofilm hoàn chỉnh, ổn định và thuận tiện cho thiết kế nghiên cứu đánh giá hoạt tính trên mô hình biofilm này, bài viết nhấn mạnh sự cần thiết của việc tổng hợp và đánh giá nguồn tư liệu liên quan để xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp nhằm hình thành biofilm đồng nhất Việc biofilm được xây dựng đầy đủ và ổn định sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính, tăng tính lặp lại và độ tin cậy của kết quả trên mô hình biofilm, từ đó hỗ trợ quá trình ra quyết định và tối ưu hóa phương pháp nghiên cứu.
Khảo sát nuôi cấy tạo biofilm theo thời gian với điều kiện có thay mới môi trường và không thay môi trường hàng ngày
2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng biofilm của một số hoạt chất Đánh giá tác dụng kháng biofilm trên 300 mẫu cao chiết dược liệu từ Việt Nam Đánh giá khả năng kháng biofilm ở dạng đơn, hoặc kết hợp với moxifloxacin (hiệu quả trong điều trị S aureus trong biofilm) và vancomycin (kháng sinh hàng đầu trong điều trị MRSA).
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa chủng
Chủng sử dụng trong nghiên cứu là Staphylococus aureus ATCC 33591 được lưu ở - 80ºC tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Đại học Dược
Tại Hà Nội, mẫu được cấy lên thạch TSA để hoạt hóa trước khi sử dụng; tất cả các thao tác cấy được thực hiện trong tủ cấy vô khuẩn; tủ cấy được tiệt trùng bằng cách lau sạch bằng cồn 96% và bật đèn UV một giờ.
Cân, đong các thành phần theo công thức môi trường và hòa tan chúng; đậy kín bằng nút bông không thấm nước hoặc nắp xoáy Hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút bằng nồi hấp tiệt khuẩn Sau tiệt khuẩn, bảo quản các bình đựng môi trường lỏng trong tủ lạnh và dùng trong 1 tuần Đối với môi trường thạch, phân phối lên các đĩa Petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô sao cho lớp thạch có độ dày khoảng 2 mm, mặt thạch nhẵn và phẳng Đợi thạch nguội và đông lại, đậy kín, bảo quản trong tủ lạnh và dùng trong 1 tuần.
Quá trình kích hoạt giống vi sinh được thực hiện định kỳ mỗi tuần, dựa trên việc chọn môi trường nuôi phù hợp với từng loại VSV và thực hiện các thao tác vô khuẩn cần thiết Các chủng vi khuẩn sau đó được nuôi cấy trên môi trường phù hợp để phát triển và đạt được các đặc tính mong muốn, nhằm đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của kết quả.
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm của S aureus trên đĩa 96 giếng
Biofilm được tạo trên đĩa 96 giếng đáy bằng của SPL Chuẩn bị hỗn dịch VSV trong PBS, đo quang ở bước sóng 600nm (OD = 0,5) Pha loãng 100 lần trong môi trường nuôi cấy phù hợp để có nồng độ vi khuẩn 0,005 ở OD600nm (tương đương 10 7 CFU/mL) Cho vào các giếng thể tích 200 μl/giếng hỗn dịch VSV đã pha loãng, các
18 giếng ở rìa đĩa cho thể tích 200 μl môi trường nuôi cấy Ủ ở 37°C trong thời gian nghiên cứu tương ứng
Trong thực nghiệm khảo sát các môi trường nghiên cứu, thực hiện với các môi trường TSB, BHI, MHB nguyên bản, pha loãng, bổ sung NaCl 2%, bổ sung glucose 1% hoặc bổ sung đồng thời NaCl 2% và glucose 1%
Trong thực nghiệm khảo sát các điều kiện nghiên cứu, chúng tôi thực hiện theo các mốc thời gian 6 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Hai điều kiện thực nghiệm được so sánh là thay mới môi trường dinh dưỡng mỗi ngày và không thay đổi môi trường dinh dưỡng mỗi ngày Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá tác động của việc thay đổi hay giữ nguyên môi trường dinh dưỡng lên kết quả thí nghiệm ở từng thời điểm, đồng thời xác định mức độ biến động và tính ổn định của các tham số đo được dưới hai điều kiện dinh dưỡng khác nhau.
2.3.3 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu của biofilm Đánh giá hai chỉ tiêu chính của biofilm là tổng sinh khối biofilm (nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể (crystal violet - CV) và lượng VSV sống trong biofilm (đánh giá trực tiếp bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch và gián tiếp thông qua chuyển hóa resazurin thành resorufin)
2.3.3.1 Đánh giá lượng VSV sống trong biofilm
Lượng VSV sống được đánh giá trực tiếp bằng xác định bằng phương pháp đếm CFU trên đĩa thạch
Mẫu cần đếm số lượng CFU được rửa nhẹ nhàng 2 lần với thể tích 200 μl PBS Vi sinh vật (VSV) trong biofilm sẽ được phóng khỏi biofilm bằng 200 μl nước cất vô khuẩn, bằng cách hút và nhả với pipet tối thiểu 20 lần, sau đó được vortex thật kỹ hoặc siêu âm trong vòng 1 phút nếu cần để tách rời hoàn toàn các khuẩn lạc Mẫu sau đó sẽ được pha loãng trong PBS trên đĩa 96 giếng theo cơ số log10 đến nồng độ phù hợp Khuẩn lạc sẽ được đếm trên đĩa thạch TSA sau khi cấy trải và ủ 24 giờ ở 37°C Nồng độ được chọn là nồng độ có từ 30-300 khuẩn lạc trên đĩa Lượng VSV trong mẫu được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc trên đĩa và nồng độ pha loãng, được biểu thị dưới dạng log10.
Trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính các chất kháng biofilm, mẫu thử được thực hiện trên cùng đĩa với mẫu chứng (không bổ sung chất có hoạt tính) Lượng VSV trong mẫu thử được so sánh với mẫu chứng thông qua giá trị log10 CFU/ml, nhằm xác định mức giảm số lượng vi sinh vật và hiệu quả ức chế biofilm.
Đánh giá khả năng sống của vi sinh vật được thực hiện gián tiếp bằng cách đo khả năng chuyển hóa resazurin (không huỳnh quang) thành resorufin (phát huỳnh quang) của VSV sống, đây là phương pháp phù hợp cho sàng lọc với số lượng mẫu lớn và thời gian ngắn Mẫu cần đánh giá khả năng chuyển hóa resazurin thành resorufin được rửa 2 lần bằng PBS Mẫu sau đó ủ với 200 μl resazurin ở nồng độ 10 mg/L trong nước cất vô khuẩn, 30 phút ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng Sau 30 phút ủ, mẫu được đo cường độ huỳnh quang trên máy đọc vi đĩa Varioskan Lux với bước sóng kích thích 560 nm và phát xạ 590 nm Kết quả được so sánh theo tỷ lệ phần trăm với mẫu chứng (môi trường TGN).
Hình 2.1 Sự chuyển màu từ resazurin màu xanh sang resorufin màu hồng
2.3.3.2 Đánh giá tổng lượng sinh khối biofilm
Tổng lượng sinh khối biofilm sẽ được đánh giá thông qua việc nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể (crystal violet - CV)
Để định lượng biofilm, mẫu được rửa nhẹ bằng PBS hai lần và thấm khô lượng PBS dư bằng giấy thấm Biofilm sau đó được sấy khô và cố định ở 60°C trong tối thiểu 2 giờ Mẫu được nhuộm màu bằng tím Crystal Violet (CV) ở nồng độ 50 mg/L trong 15 phút, ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng Các mẫu biofilm được rửa nhẹ bằng nước RO để loại bỏ CV dư CV được hòa tan trong axít acetic 66% trong vòng 1 giờ, tránh ánh sáng Các đĩa mẫu được đo hấp thụ để định lượng biofilm.
UV tại bước sóng 570nm trên máy đọc vi đĩa Varioskan Lux
2.3.4 Phương pháp chuẩn bị các mẫu thử
Các mẫu cao dược liệu được chuẩn bị trong DMSO ở nồng độ cao; nếu mẫu không tan trong DMSO, quá trình hòa tan sẽ được thực hiện tiếp trong môi trường nuôi cấy TGN và phần không tan sẽ bị loại bỏ Sau khi hòa tan, dung dịch dược liệu được pha loãng trong TGN để đạt nồng độ làm việc mong muốn; dung dịch này có thể được pha loãng thêm nữa hoặc so sánh với các dung dịch tham chiếu như moxifloxacin hoặc vancomycin để phục vụ thử nghiệm Trước đó, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy DMSO ở mức 1% không ảnh hưởng đến S aureus ở dạng tự do lẫn biofilm.
2.3.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm của một số dược liệu
Biofilm 24 giờ của S aureus trong TGN được sử dụng để đánh giá hoạt tính của cao dược liệu trên biofilm Thực hiện với 3 điều kiện là ở dạng đơn, kết hợp moxifloxacin (Mxf) nồng độ 1,5mg/l và kết hợp với vancomycin (Van) nồng độ 20mg/l Cao dược liệu được sử dụng với nồng độ 100mg/l Sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy,
Bước 20: thêm môi trường TGN, TGN-Mxf và TGN-Van cho mẫu chứng; ba môi trường tương tự sẽ được kết hợp với cao dược liệu ở nồng độ 100 mg/l để làm mẫu thử Xem hình 2.2 mô tả thí nghiệm.
Hình 2.2 Mô tả thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng biofilm
Biofilm này sẽ tiếp tục được ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau 24 giờ, lượng VSV trong các mẫu sàng lọc sẽ được đánh giá thông qua chuyển hóa resazurin
Những mẫu quan tâm sẽ được đánh giá đầy đủ hơn thông qua hai tiêu chí chính: đo lượng VSV trong biofilm bằng phương pháp cấy đếm và đánh giá sự chuyển hóa của resazurin, và ước lượng tổng sinh khối biofilm bằng kỹ thuật nhuộm CV.
Số liệu thí nghiệm thô được xử lý bằng phần mềm Excel 2010
Xử lý thống kê cũng như biểu diễn kết quả trên phần mềm GraphPad 4.0 Số liệu được trình bày dưới dạng ± sai số chuẩn
Chứng Cao 1 Cao 2 Cao 3 Cao 4
KẾT QUẢ
Đánh giá tác dụng kháng biofilm của một số hoạt chất
3.3.1 Sàng lọc hoạt tính kháng biofilm của một số dược liệu ở Việt Nam
Trong khuôn khổ nghiên cứu sàng lọc các mẫu cao dược liệu khác nhau ở Việt Nam nhằm đánh giá tác dụng kháng biofilm, tác vụ sàng lọc được thực hiện ở ba điều kiện: (i) ở dạng đơn chất với nồng độ 100 mg/L, (ii) kết hợp với moxifloxacin 1,5 mg/L, và (iii) kết hợp với vancomycin 20 mg/L; hai nồng độ này tương ứng với nồng độ tối đa mà các kháng sinh này đạt được trong máu Moxifloxacin được xem là kháng sinh hiệu quả trong diệt vi khuẩn trong biofilm, còn vancomycin là tiêu chuẩn vàng trong điều trị MRSA Các mẫu được so sánh với chứng dương (không có dược liệu, kháng sinh) trên cùng đĩa 96 giếng; những mẫu có sự giảm > 25% giá trị RF so với chứng dương ở cùng điều kiện được coi là có khả năng diệt S aureus trong biofilm Thí nghiệm được thực hiện tối thiểu 3 lần độc lập.
Trong 300 mẫu được sàng lọc, có 11 mẫu (tỷ lệ 3,6%) có khả năng diệt S aureus trong biofilm, ở dạng đơn lẻ hoặc khi kết hợp với kháng sinh Khả năng diệt khuẩn của 11 mẫu này ở 3 điều kiện thực nghiệm được trình bày trong bảng Trong số đó, chỉ có 5 mẫu có khả năng diệt S aureus trong biofilm ở dạng đơn lẻ Khi được kết hợp với kháng sinh, gần như tất cả các mẫu đều cho thấy tác động tốt và tăng cường khả năng diệt khuẩn của kháng sinh, kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của các mẫu dược liệu có khả năng diệt
S aureus trong biofilm so với mẫu chứng
Mẫu Dạng đơn +Van +Mxf
3.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao ổi (DHN10)
Đối tượng quan tâm là DHN10 - cao chiết lá ổi, được đánh giá hoạt tính kháng biofilm bằng cách phân tách cao methanol tổng thành các phân đoạn có độ phân cực tăng dần tương ứng với các dung môi n-hexan, CH2Cl2, EtOAc và H2O sau khi hoà tan với nước với lượng vừa đủ Các phân đoạn H2O, n-hexan, EtOAc và CH2Cl2 được đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao lá ổi ở ba điều kiện: môi trường TGN, TGN kết hợp moxifloxacin nồng độ 1,5 mg/L và TGN kết hợp vancomycin nồng độ 20 mg/L Các kết quả được so sánh với mẫu chứng trên cùng đĩa 96 giếng.
Bảng 3.2 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm của các mẫu cao tổng và các phân đoạn
H 2 O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH 2 Cl 2 )
CV % H 2 O n-hexan EtOAc CH 2 Cl 2 Cao Chứng
98,3 ±9,9 Kết quả biểu hiện tỷ lệ % của mẫu thử so với mẫu chứng không kháng sinh, dưới dạng trung bình ± sai số
Hình 3.6 Tỉ lệ % tổng sinh khối biofilm của các mẫu cao tổng và các phân đoạn H 2 O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH 2 Cl 2 )
Dựa trên đánh giá sau khi nhuộm tím tinh thể, kết quả cho thấy mẫu cao tổng và các mẫu cao phân đoạn từ H2O, n-hexan, EtOAc, CH2Cl2 không làm giảm tổng sinh khối biofilm so với mẫu chứng (không bổ sung dược liệu và kháng sinh), ở cả điều kiện thực nghiệm có bổ sung kháng sinh và không bổ sung kháng sinh.
Bảng 3.3 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của các mẫu cao tổng và các phân đoạn
H 2 O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH 2 Cl 2 )
RF % H 2 O n-hexan EtOAc CH 2 Cl 2 Cao Chứng
97,4 ±11,9 Kết quả biểu hiện tỷ lệ % của mẫu thử so với mẫu chứng không kháng sinh, dưới dạng trung bình ± sai số
Bảng 3.4 trình bày lượng VSV trong biofilm ở dạng log10 CFU/ml đối với các mẫu cao tổng và các phân đoạn chiết bằng nước (H2O), n-hexan, ethyl acetate (EtOAc) và dicloromethan (CH2Cl2) Các giá trị được thể hiện theo từng dung môi, cho phép so sánh mức độ hiện diện của vi sinh vật trong biofilm giữa các mẫu và đánh giá hiệu quả chiết tách VSV từ biofilm.
TGN+Mxf co nt ro l co nt ro l M
TGN+Van con tr ol con tr ol V an H2 O n- he xa n
Hình 3.7 thể hiện tỷ lệ phần trăm giá trị huỳnh quang RF và lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/ml) của các mẫu cao tổng và các phân đoạn chiết theo nước (H2O), n-hexan, ethyl acetate (EtOAc) và dicloromethan (CH2Cl2) Kết quả cho thấy sự khác biệt về mức độ huỳnh quang và số lượng VSV giữa các phân đoạn dung môi, giúp đánh giá hiệu quả chiết xuất và phân bố vi sinh vật trong biofilm theo từng dung môi Đây là cơ sở để tối ưu hóa quy trình chiết và hiểu rõ hơn về cơ chế liên kết của VSV trong biofilm dựa trên các phân đoạn chiết.
Kết quả chuyển hóa resazurin cho thấy đây là cách đánh giá lượng VSV gián tiếp thông qua khả năng chuyển hóa resazurin Nghiên cứu cho thấy có hai mẫu phân đoạn cao là n-hexan và CH2Cl2 có hoạt tính kháng biofilm mạnh Khi được sử dụng ở dạng đơn, cũng như ở dạng kết hợp, hai mẫu này duy trì hoạt tính kháng biofilm đáng kể.
TGN co ntro l H2 O n-h exan E tO Ac
TGN + Mxf co ntro l co ntro l M
TGN + Mxf co ntro l co ntro l M
TGN + Van co ntro l co ntro l V an
TGN + Van co ntro l co ntro l V an
Phân đoạn nước và EtOAc có hoạt tính kém hơn so với các phân đoạn khác Phân đoạn n-hexan làm giảm chuyển hóa VSV 72,0% khi sử dụng đơn, 73,3% khi kết hợp với moxifloxacin và 73,2% khi kết hợp với vancomycin Phân đoạn CH2Cl2 cho thấy giảm chuyển hóa VSV 70,3% khi sử dụng đơn, 76,2% khi kết hợp với moxifloxacin và 76,3% khi kết hợp với vancomycin.
Kết quả đánh giá lượng VSV sống bằng cấy đếm CFU đã chỉ ra cao phân đoạn
CH2Cl2 có hoạt tính tốt nhất trong các phân đoạn được đánh giá Phân đoạn CH2Cl2 có khả năng diệt 0,67 log10 CFU/ml ở dạng đơn, tăng lên 1,1 log10 CFU/ml khi kết hợp với moxifloxacin và 0,88 log10 CFU/ml khi kết hợp với vancomycin, tương đương diệt 1 log10 CFU/ml (tương đương 90% VSV) Sự khác biệt giữa các mẫu thử và mẫu chứng (TGN không bổ sung dược liệu, kháng sinh) được phân tích bằng One-way ANOVA với test Dunnett, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Kết quả thử hoạt tính 4 phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4
Phân đoạn có hoạt tính tốt nhất được phân tích và chiết xuất bằng CH2Cl2, sau đó được chạy trên cột silica gel bằng dung môi cloroform (CHCl3) 100% nhằm mục đích làm giàu và tách các phân đoạn nhỏ Quá trình này đã cho ra bốn phân đoạn nhỏ mang nhãn 1.1, 1.2, 1.3 và 1.4 Tiến hành thử hoạt tính kháng biofilm của các phân đoạn nhỏ này theo quy trình tương tự như thử với mẫu cao, nhằm xác định phân đoạn có hoạt tính nổi bật và phục vụ cho các bước đánh giá tiếp theo.
Bảng 3.5 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm của các phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4
102,3 ±1,2 96,9 Kết quả biểu hiện tỷ lệ % của mẫu thử so với mẫu chứng không KS, dưới dạng trung bình ± sai số
Hình 3.8 Tỉ lệ % tổng sinh khối biofilm của các phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4
TGN + Mxf co nt ro l co nt ro l M
TGN + Van con tr ol con tr ol V an 1.1 1.2 1.3 1.4
Qua kết quả nhuộm bằng tím tinh thể, các phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 và 1.4 cho thấy chúng không làm giảm tổng sinh khối của biofilm so với mẫu chứng (không bổ sung dược liệu, kháng sinh) Kết quả này được thể hiện ở cả hai điều kiện thí nghiệm: có bổ sung kháng sinh và không bổ sung kháng sinh.
Bảng 3.6 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của các phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4
22,9 ±2,9 128,5 Kết quả biểu hiện tỷ lệ % của mẫu thử so với mẫu chứng không KS, dưới dạng trung bình ± sai số
Kết quả chuyển hóa resazurin cho thấy ba phân đoạn 1.1, 1.2 và 1.3 đều có tác dụng tốt trên đối tượng vi khuẩn trong biofilm; khi sử dụng ở dạng đơn, các phân đoạn này ức chế 59,2–72,3% quá trình chuyển hóa, và khi được kết hợp với kháng sinh mức ức chế tăng lên 72,7–81,6% của sự chuyển hóa VSV Ngược lại, phân đoạn 1.4 không có tác dụng đối với vi khuẩn trong biofilm.
Bảng 3.7 Lượng VSV trong biofilm (log 10 CFU/ml) của các phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 log CFU/ml Chứng 1.1 1.2 1.3
Kết quả đếm CFU cho thấy ở các mẫu 1.1, 1.2 và 1.3, khi sử dụng ở dạng đơn hoặc kết hợp với moxifloxacin đều có khả năng diệt vi sinh vật trong biofilm Sự khác biệt giữa các mẫu được xác định là có ý nghĩa thống kê bằng One-way ANOVA, và so sánh với mẫu chứng (TGN không bổ sung dược liệu, kháng sinh) được thực hiện bằng test Dunnett Mẫu 1.1 và 1.3 thể hiện hiệu quả diệt vi khuẩn trong biofilm rất tốt Cụ thể, phân đoạn 1.1 có khả năng diệt 0,4 log10 CFU/ml ở dạng đơn, 3,14 log10 CFU/ml khi kết hợp với moxifloxacin, và 0,51 log10 CFU/ml khi kết hợp với vancomycin Phân đoạn 1.3 có khả năng diệt 0,41 log10 CFU/ml ở dạng đơn, 3,77 log10 CFU/ml khi kết hợp với moxifloxacin, 1,66 log10 CFU/ml
CFU/ml khi kết hợp với vancomycin (diệt được 3 log10 CFU/ml tương đương với 99,9% VSV)
Hình 3.9 Tỷ lệ % giá trị huỳnh quang RF và lượng VSV trong biofilm (log 10 CFU/ml) của các phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3
TGN + Mxf co ntr ol co ntr ol MF
TGN+Mxf co nt rol co nt rol M FX 1 1
TGN + Van co ntr ol co ntr ol Van 1 1
TGN+Van co nt ro l co nt ro l V an 1.1 1.2 1.3
1 Về việc xây dựng mô hình biofilm trên đĩa 96 giếng
Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy phù hợp cho biofilm trên đĩa 96 giếng được xác định là TSB bổ sung NaCl 2% và glucose 1% Việc sử dụng môi trường này cho thấy biofilm có tổng sinh khối lớn và số lượng VSV trong biofilm đạt cao nhất so với các môi trường thử nghiệm khác.
Khi bổ sung NaCl, glucose hoặc đồng thời NaCl và glucose vào TSB, số lượng VSV và tổng sinh khối của biofilm đều tăng lên, cho thấy tác động kích thích lên sự hình thành biofilm và tương đồng với nhiều thử nghiệm trước đó Nghiên cứu của Lade và cộng sự đã sử dụng 40 chủng S aureus được chọn ngẫu nhiên (21 MRSA và 19 MSSA) và được phân tích để đánh giá tác động của các yếu tố này trong môi trường nuôi phù hợp tới biofilm.