ĐỖ THỊ HUYỀN THƯƠNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH vật của TINH dầu TRẦU KHÔNG KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Các sản phẩm chiết xuất hay tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của thực vật đã được khám phá rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về khả năng điều chỉnh tính kháng thuốc của VSV.. Nhiều nghiên

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn

Khắc Tiệp, người thầy đã hết sức tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, quan tâm và động viên

em trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học cũng như thực hiện đề tài khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh,

HVCH Nguyễn Thị Cẩm Vân người cô, người thầy, người chị luôn quan tâm, giúp

đỡ, động viên, tận tình chỉ bảo để em có những hướng đi đúng đắn hơn trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, trong suốt 5 năm học đại học đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu để

em tự tin hơn trong những tháng ngày sắp tới

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Công ty CP tinh dầu thiên nhiên Hà Nội đã tài trợ nguyên liệu tinh dầu cho đề tài

Em xin cảm ơn bạn Trần Thị Minh Thu, Hoàng Thị Ánh Nhật và những người bạn

đã cùng em thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh vì đã luôn đồng hành, hỗ trợ, tận tình giúp đỡ và động viên tinh thần em rất nhiều trong suốt khoảng thời gian nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài

Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, những người luôn là hậu phương vững chắc, là động lực tinh thần, luôn ủng hộ em bước trên con đường này

Nghiên cứu được tài trợ bởi đề tài cấp Trường Đại học Dược Hà Nội theo quyết

định 798/QĐ-DHN năm 2021 Tên đề tài: "Nghiên cứu tạo biofilm của Staphylococcus

aureus trên đĩa 96 giếng, ứng dụng sàng lọc khả năng diệt biofilm của một số dược liệu

tại Việt Nam", quyết định số 798/QĐ-DHN (xem phụ lục 2)

Hà Nội, ngày 27 tháng 6 năm 2022

Sinh viên

Đỗ Thị Huyền Thương

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tinh dầu 2

1.1.1 Đại cương về tinh dầu 2

1.1.2 Tinh dầu có tác dụng kháng khuẩn 4

1.1.3 Tinh dầu trên đối tượng vi khuẩn dai dẳng 6

1.1.4 Tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh 8

1.2 Tinh dầu trầu không và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trầu không 10 1.2.1 Ví trí, phân loại 10

1.2.2 Đặc điểm trầu không 10

1.2.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu trầu không 12 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14

2.1.1 Nguyên liệu và chủng giống 14

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 14

2.1.3 Môi trường sử dụng 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Đánh giá khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu trầu không 16

2.2.2 Đánh giá khả năng diệt vi khuẩn tồn tại dai dẳng của tinh dầu trầu không 16 2.2.3 Đánh giá khả năng tạo tác dụng hiệp đồng với các kháng sinh của tinh dầu trầu không 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa chủng 16

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu trầu không 17

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính diệt vi khuẩn tồn tại ở dạng dai dẳng 19

2.3.4 Phương pháp xác định tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh 20

2.3.5 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 23

3.1 Khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu trầu không 23

3.1.1 MIC, MBC của tinh dầu 23

3.1.2 Khả năng diệt khuẩn theo nồng độ của tinh dầu trầu không 23

3.2 Khả năng diệt vi khuẩn tồn tại dai dẳng 25

3.2.1 Khả năng diệt vi khuẩn dai dẳng 25

3.2.2 Khả năng diệt khuẩn trong biofilm 26

3.3 Khả năng hiệp đồng tác dụng với một số loại kháng sinh 27

3.3.1 Nhóm Betalactam với S aureus ATCC 33591 MRSA 27

3.3.2 Một số kháng sinh và vi sinh vật khác 31

BÀN LUẬN 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture

Collection

Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ

BLEO Betle leaf essential oil Tinh dầu trầu không

CCEO Cinnamomum cassia essential oil Tinh dầu quế

CLSI Clinical Laboratory Standard

Institute

Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm

DMSO Dimethyl sulfoxide

FIC (index) Fractional Inhibitory

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

Bảng 2.2 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15

Bảng 2.4 Mô tả sắp xếp thí nghiệm xác định MIC 18

Bảng 2.5 Mô tả sắp xếp thí nghiệm tương tác tinh dầu - kháng sinh thông qua thử nghiệm checkerboard 21

Bảng 3.1 Giá trị MIC, MBC của tinh dầu trầu không (μl/ml & %) trên các chủng VSV 23

Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm checkerboard giữa tinh dầu trầu không và meropenem 28 Bảng 3.3 Giá trị FIC và FIC index khi kết hợp tinh dầu trầu không với một số kháng sinh và vi sinh vật 31

Bảng 4.1 So sánh giá trị MIC của tinh dầu trầu không (kết quả nghiên cứu của nghiên cứu này) với một số tinh dầu phổ biến trên các chủng vi sinh vật 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây trầu không (Piper betle L.) 10

Hình 3.1 Đáp ứng của tinh dầu trầu không với các chủng vi sinh vật tại các nồng độ khác nhau 24Hình 3.2 Tác dụng diệt vi khuẩn dai dẳng theo thời gian khi sử dụng kháng sinh có hoặc không kết hợp tinh dầu trầu không 25Hình 3.3 Tác dụng diệt vi khuẩn dai dẳng sau 24 giờ khi sử dụng kháng sinh có hoặc không kết hợp tinh dầu trầu không 25Hình 3.4 Kết quả diệt khuẩn trong biofilm của kháng sinh moxifloxacin có hoặc không kết hợp với tinh dầu trầu không 27Hình 3.5 Đường cong nồng độ - đáp ứng của meropenem khi sử dụng đơn và khi phối hợp với tinh dầu trầu không tại thời điểm 24 giờ 29Hình 3.6 Đường cong nồng độ - đáp ứng của ceftriaxone khi sử dụng và khi phối hợp với tinh dầu trầu không tại thời điểm 24 giờ 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng kháng sinh đang là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với việc điều trị hiệu quả một loạt các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, nấm gây ra Việc lạm dụng kháng sinh góp phần vào sự gia tăng tỉ lệ các loại nấm, vi khuẩn kháng thuốc Với sự gia tăng của

vi sinh vật (VSV) kháng thuốc và thiếu các loại kháng sinh mới được đưa ra thị trường, việc cần phải tìm ra các chiến lược để đối phó với trình trạng này là vô cùng cấp thiết Trước đây, việc sàng lọc các sản phẩm tự nhiên chưa được quan tâm Tuy nhiên, hiện tại việc sử dụng các loại thuốc thảo dược trên toàn thế giới đang trở nên phổ biến, khai thác các sản phẩm tự nhiên để làm thuốc là một xu hướng đang nở rộ Các sản phẩm chiết xuất hay tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của thực vật đã được khám phá rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về khả năng điều chỉnh tính kháng thuốc của VSV Những nghiên cứu này có thể cung cấp phương hướng khả thi trong tương lai trong việc đảo ngược khả năng kháng thuốc của VSV [74]

Trầu không (Piper betle L.) là cây trồng phổ biến quen thuộc ở nhiều tỉnh thành

trên khắp cả nước và được biết đến từ lâu qua phong tục nhai trầu Ngoài ra, trầu không được coi như một vị thuốc hay được sử dụng trong y học cổ truyền Bên cạnh các thành phần được nghiên cứu nhiều trong lá trầu không thì tinh dầu trầu không trong những năm gần đây cũng đang được quan tâm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tinh dầu từ lá trầu không có nhiều hoạt tính sinh học nổi bật như kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kích thích thần kinh trung ương, kháng acetylcholinesterase, kháng β-glucuronidase, chống viêm, làm lành vết thương… cho thấy khả năng ứng dụng đầy hứa hẹn của tinh dầu này trong nông nghiệp, y học và công nghiệp dược phẩm [24], [64] Nhằm ứng dụng những hoạt tính sinh học của tinh dầu trầu không, đặc biệt là hoạt tính kháng vi sinh vật để điều trị một số bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn, chúng tôi lựa

chọn thực hiện đề tài “Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu trầu không”

nhằm mục tiêu:

1 Đánh giá được khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu trầu không

2 Đánh giá được khả năng diệt vi khuẩn dai dẳng của tinh dầu trầu không

3 Đánh giá được khả năng tạo ra tác dụng hiệp đồng với các kháng sinh của tinh dầu trầu không

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tinh dầu

1.1.1 Đại cương về tinh dầu

1.1.1.1 Khái niệm

Thực vật tạo ra một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp như một biện pháp bảo

vệ tự nhiên chống lại sự tấn công của vi sinh vật và sâu bệnh, như chất tạo màu, mùi hương hoặc chất thu hút thụ phấn [74] Tinh dầu là một hỗn hợp 20-60 thành phần với nồng độ khác nhau, thường có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong lipid và các dung môi hữu cơ, thường có tỷ trọng nhẹ hơn nước, dễ bay hơi ở nhiệt độ thường và được tạo ra từ quá trình trao đổi chất thứ cấp của các loại thảo mộc [4] Tinh dầu được tìm thấy với số lượng lớn trong các túi dầu hoặc các tuyến dầu trong vỏ quả, chủ yếu là phần vỏ ngoài và lớp biểu bì [38] Ngoài ra, tinh dầu còn được chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của thực vật như chồi, hoa, lá, thân, cành, hạt, quả, rễ, gỗ hoặc vỏ cây

1.1.1.2 Chiết xuất

Tinh dầu có thể được chiết xuất từ một số loại cây với các bộ phận khác nhau bằng nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau Phương pháp sử dụng để chiết xuất tinh dầu thường phụ thuộc vào nguyên liệu thực vật được sử dụng Phương pháp chiết xuất là một trong những yếu tố chính quyết định chất lượng của tinh dầu Quy trình chiết xuất không phù hợp có thể gây hư hỏng hoặc thay đổi tính chất vật lý, hóa học của tinh dầu, dẫn đến mất hoạt tính sinh học, các đặc tính tự nhiên, đổi màu, mất mùi/hương vị…[50] Các phương pháp chiết xuất tinh dầu thường được sử dụng và đem lại hiệu suất chiết xuất cao như phương pháp cất kéo hơi nước, chiết xuất bằng dung môi, phương pháp ướp, phương pháp ép [4], [73] Phương pháp cất kéo hơi nước là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để chiết xuất tinh dầu thực vật, đây là phương pháp phân lập các hợp chất bị phân hủy ở nhiệt độ cao bằng việc chưng cất chúng theo cách mà hơi nước được đưa vào nguyên liệu thô [53]

1.1.1.3 Thành phần

Tinh dầu được tìm thấy trong nhiều loại thực vật khác nhau, đặc biệt là các loại cây thơm, có mùi và hương vị đặc biệt, được chi phối bởi số lượng thành phần và tỉ lệ của chúng trong tinh dầu [50] Các thành phần hóa học của tinh dầu bao gồm hai nhóm terpenoids (monoterpens và sesquerpenes) và phenylpropanoids (aldehyde, phenol, dẫn xuất metoxy,…) [4], [53] Hơn 100 thành phần với các tỷ lệ khác nhau (1% - 70%) có thể được tìm thấy trong một loại tinh dầu duy nhất [35] Trong hỗn hợp này, một vài thành phần chính có nồng độ tương đối cao (20-70%), các thành phần khác thường có ở

dạng vết [15] Ví dụ, thành phần chính của tinh dầu đinh hương (Syzygium aromaum )

là eugenol (68,52%) trong khi α-caryophyllene (1,85%) có ở dạng vi lượng [27] Các thành phần chính khác có trong tinh dầu là ar-turmerone (63.4%) của cây nghệ

(Curcuma longa) [26], cinnamaldehyde (87,6%) của tinh dầu quế (Cinnamomum cassia)

[70], zingiberene (37,549%) của tinh dầu gừng [72]…

nó cũng được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, tiêu hóa cũng

như các rối loạn của hệ thống miễn dịch, nội tiết và thần kinh [61] Một vài loại tinh dầu

đã được ứng dụng trong điều trị với (i) tác dụng trên đường tiêu hóa như kích thích tiêu hóa, lợi mật, thông mật, (ii) tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn đường hô hấp như tinh

dầu bạch đàn, bạc hà, (iii) tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa cây Barosma

betulina, (iv) tác dụng kích thích thần kinh trung ương của dược liệu chứa tinh dầu giàu

anethol: đại hồi, (v) tác dụng diệt ký sinh trùng: trị giun với tinh dầu giun, santonin, trị sán với thymol, diệt ký sinh trùng sốt rét với Artemisinin [4]

Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Tinh dầu ngày càng được chú ý như một loại gia vị hoặc một chất phụ gia tự nhiên

để kéo dài thời hạn sử dụng của các sản phẩm thực phẩm, do rủi ro khi sử dụng chất bảo quản tổng hợp [50] Tinh dầu với tư cách là chất kháng khuẩn tự nhiên đã nhận được sự quan tâm lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm và đóng gói do mối quan tâm và nhu cầu về an toàn thực phẩm của người tiêu dùng ngày càng tăng [38]

Ứng dụng trong kỹ nghệ pha chế nước hoa, xà phòng, mỹ phẩm, hương liệu

Ðây là một ngành công nghiệp rất lớn, sử dụng chủ yếu là nguồn tinh dầu trong thiên nhiên, ngoài ra còn có những chất thơm tổng hợp, bán tổng hợp Xu hướng ngày càng sử dụng các hương liệu tự nhiên, đòi hỏi phải đi sâu nghiên cứu phát hiện nguồn tài nguyên tinh dầu nhằm thoả mãn yêu cầu của lĩnh vực này [4] Ví dụ tinh dầu hoa

hồng (tinh dầu Oleum osarum) được sử dụng rộng rãi trong nhiều loại nước hoa, các sản phẩm mỹ phẩm như phấn, kem, lotion…Tinh dầu bạc hà (tinh dầu Mentha arvensis) sử

dụng làm chất thơm trong các sản phẩm thuốc, nước uống, thực phẩm, nước hoa…

1.1.2 Tinh dầu có tác dụng kháng khuẩn

Thuốc kháng sinh đã đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm tỷ lệ mắc bệnh

và tỷ lệ tử vong do các bệnh truyền nhiễm Tuy nhiên, việc sử dụng bừa bãi và lạm dụng trong y học lâm sàng đã làm cho những lợi ích về chăm sóc sức khỏe này đang bị đe dọa

vì sự xuất hiện và lan rộng của các VSV có khả năng kháng thuốc [57] Bất chấp những tiến bộ trong liệu pháp này, chúng ta vẫn đang sống trong thời đại mà các ca nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh đang gia tăng một cách đáng báo động [16]

Kháng kháng sinh có thể dẫn đến thất bại trong điều trị, tăng chi phí điều trị cũng như tỷ lệ tử vong và gây ra các vấn đề khó khăn trong kiểm soát nhiễm trùng thậm chí còn làm lây lan VSV kháng thuốc từ bệnh viện sang cộng đồng Các bệnh như viêm phổi, lao, nhiễm độc máu, bệnh lậu và các bệnh lây truyền qua thực phẩm ngày càng trở nên khó điều trị hơn, và đôi khi không thể điều trị được vì thuốc kháng sinh ngày càng kém hiệu quả Nếu không có hành động khẩn cấp, chúng ta đang hướng tới kỷ nguyên hậu kháng sinh, trong đó các bệnh nhiễm trùng thông thường và vết thương nhẹ có thể gây tử vong [16]

1.1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và khám phá các phân tử mới hoặc thay thế từ nhiều nguồn khác nhau để làm giảm tình trạng kháng thuốc và chống lại các VSV kháng thuốc ngày càng trở nên phổ biến Theo đó, tinh dầu thu được từ thực vật

và các thành phần của chúng là nguồn thay thế tiềm năng do có khả năng kháng khuẩn chống các VSV gây bệnh [71] Hoạt động kháng khuẩn của tinh dầu có liên quan đến hoạt tính của từng thành phần đơn lẻ, cũng như tác động hiệp đồng của chúng Mặc dù hoạt tính đó thường được quy cho các hợp chất chính, nhưng tương tác giữa các thành phần chính và phụ cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động kháng khuẩn của tinh dầu và không nên bỏ qua [53] Hiệu quả của các loại tinh dầu sẽ tùy thuộc vào tình trạng nhiễm khuẩn và loại vi khuẩn muốn điều trị (Gram dương hoặc Gram âm) hoặc nấm Hoạt tính kháng khuẩn thường được đánh giá bằng cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu - tiêu diệt nhiều hơn 99% các chất cấy

ban đầu (MBC) trong các thử nghiệm in vitro [18], [67]

1.1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu

Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu không phải do một cơ chế duy nhất mà sẽ là một chuỗi các phản ứng liên quan đến toàn bộ tế bào vi khuẩn, tinh dầu hoạt động theo nhiều cách khác nhau để làm mất khả năng sống của VSV Nhiều nghiên cứu cho rằng tinh dầu có tác dụng nhạy hơn trên vi khuẩn Gram dương so với vi khuẩn Gram âm do sự khác biệt trong thành phần màng tế bào của chúng [18] Nhưng nhìn chung, tinh dầu có thể ảnh hưởng đến cả cấu trúc màng ngoài lẫn tế bào chất của VSV Tính kị nước của tinh dầu gây thay đổi tính thấm của màng, ảnh hưởng đến việc vận chuyển các phân tử

và ion dẫn đến sự mất cân bằng trong tế bào VSV Điều này dẫn đến sự đông tụ tế bào chất, sự biến tính của một số enzym và protein của tế bào, làm mất các chất chuyển hóa

và ion Tất cả những thay đổi sinh lý này có thể dẫn đến ly giải và gây chết tế bào VSV [45]

1.1.2.3 Một số tinh dầu có tác dụng kháng VSV

Một số thành phần tinh dầu đã được chứng minh là có tác dụng kháng VSV như carvacrol, thymol, eugenol, perillaldehyde, cinnamaldehyde và acid cinnamic, có nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 0,05–5 μl/ml đối với một số loại vi khuẩn như Escherichia

coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium…khi thử

nghiệm in vitro [58]

Tinh dầu gừng (GEO) đã được nghiên cứu rộng rãi với sự tập trung đặc biệt vào các hoạt động chống oxy hóa, kháng nấm và kháng khuẩn, cũng như các ứng dụng ngày càng tăng của chúng trong bảo quản thực phẩm GEO cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn

đáng kể đối với E coli và S aureus, nó tác động trực tiếp lên màng tế bào, gây tổn

thương màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến rò rỉ các chất đại phân tử như protein và acid nucleic từ đó làm suy giảm hoạt động trao đổi chất và cuối cùng là chết tế bào vi khuẩn

Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch cho thấy ở nồng độ 2 mg/ml và 1 mg/ml GEO có hoạt tính ức chế sự phát triển (MIC) tạo ra vùng ức chế có đường kính 12,3 mm

và 17,1 mm lần lượt trên các vi khuẩn E coli và S aureus và ở nồng độ 4 mg/ml và 2

mg/ml cho thấy có tác dụng diệt khuẩn (MBC) đối với các loại vi khuẩn trên [72]

Tinh dầu lá nghệ (Curcuma longa) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đặc biệt mạnh đối với các VSV Gram dương Bacillus cereus ATCC 14579 và S aureus ATCC 29213 (MIC = 78 μg/ml) và hoạt tính kháng nấm đối với Aspergillus niger ATCC 16888 (MIC

= 19,5 μg/ml) Các hoạt động kháng VSV được quan sát thấy trong tinh dầu lá nghệ có

chính trong tinh dầu quế có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất so với các thành phần khác

[75] Ngoài ra CCEO thể hiện tác dụng ức chế đối với chủng Klebsiella aerogenes kháng

carbapenem và polymyxin ngay ở nồng độ thấp (0,0019%) và có giá trị MIC là 17,57 μg/ml CCEO ở nồng độ MIC làm giảm số lượng VSV hơn 99,9% (giảm gần 5 log CFU/ml) sau 24 giờ điều trị.CCEO đã chứng minh các đặc tính kháng khuẩn đầy hứa

hẹn chống lại chủng K aerogenes - một chủng vi khuẩn đề kháng với hầu hết các loại

kháng sinh lâm sàng, với MIC thấp và tác dụng nhất quán Từ kết quả nghiên cứu của

nhóm cho thấy CCEO là một ứng cử viên tiềm năng cho các nghiên cứu in vivo trên các

mô hình động vật để chứng minh khả năng ứng dụng điều trị kháng khuẩn trên lâm sàng [70]

1.1.3 Tinh dầu trên đối tượng vi khuẩn dai dẳng

Việc hình thành biofilm (màng sinh học) và hình thành tế bào dai dẳng được xem

là có liên quan trực tiếp đến những thất bại trong quá trình điều trị nhiễm khuẩn, đặc biệt là các nhiễm khuẩn dai dẳng, tái phát, có tính chất mạn tính Vi khuẩn chuyển đổi tạo hai kiểu hình này mang lại cho chúng những khả năng mạnh mẽ để tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt và có thể làm tiền đề cho sự hình thành kiểu hình kháng kháng sinh [10], [33], [9]

1.1.3.1 Kiểu hình dai dẳng

Dai dẳng kháng sinh mô tả một tiểu quần thể VSV có kiểu hình dung nạp, dẫn đến

né tránh đáp ứng với điều trị kháng sinh – chúng gắn liền với trạng thái dừng hoạt động/ ngủ đông, trong đó VSV không phát triển và giảm hoạt động so với các vi sinh vật ở trạng thái bình thường Kiểu hình dai dẳng kháng sinh đặc trưng bởi đường cong diệt khuẩn 2 pha: Khi một quần thể VSV tiếp xúc với kháng sinh, các VSV có kiểu hình nhạy cảm sẽ bị tiêu diệt nhanh chóng sau đó tốc độ diệt VSV chậm lại do có sự hiện diện của các VSV kháng kháng sinh và dung nạp kháng sinh - không phân chia, giảm đáp ứng với kháng sinh Sau khi kháng sinh được loại bỏ, các VSV dai dẳng còn tồn tại này phát triển trở lại, tạo nên một quần thể giống hệt quần thể trước tiếp xúc với kháng sinh, bao gồm VSV dung nạp và nhạy cảm [10], [43]

Các tế bào dai dẳng được tạo ra hoặc hình thành ngẫu nhiên như một phản ứng với những thay đổi của môi trường như căng thẳng do kháng sinh hoặc chất dinh dưỡng Sự

hiện diện của tế bào dai dẳng đã được được ghi nhận trên cả in vitro và in vivo ở một số loại vi khuẩn bao gồm E.coli, S.aureus, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas

aeruginosa…hoặc trên lâm sàng ở người bệnh - nhấn mạnh sự phát triển tính dai dẳng

như một chiến lược sinh tồn trong các môi trường khắc nghiệt [59]

Các VSV dai dẳng kháng sinh có thể tồn tại sau quá trình điều trị, điều này sẽ kéo dài thời gian điều trị nhiễm khuẩn Do đó, dai dẳng kháng sinh có thể là một yếu tố quan trọng trong nhiều trường hợp nhiễm khuẩn dai dẳng Việc kháng sinh không đạt được tác dụng diệt khuẩn hiệu quả với các đối tượng VSV này là nguyên nhân chính dẫn đến nhiễm khuẩn dai dẳng cũng như của sự phát triển của kiểu hình kháng kháng sinh [10]

1.1.3.2 Biofilm

Biofilm liên quan đến 65-80% trường hợp nhiễm khuẩn ở người, đặc biệt là những bệnh có biểu hiện dai dẳng hoặc tái phát Màng sinh học là một cộng đồng VSV nằm trong ma trận các hợp chất cao phân tử ngoại bào do chính chúng tổng hợp nên và một vài thành phần có nguồn gốc từ sự ly giải các tế bào vi khuẩn chết Biofilm bám dính vào nhiều bề mặt khác nhau, bao gồm cả bề mặt sinh học và bề mặt nhân tạo [9], [59]

Hàng rào vật lý này được cho là có khả năng bảo vệ chống lại các áp lực từ môi trường như nhiệt, ẩm, cũng như chống lại hệ thống miễn dịch của vật chủ Vi khuẩn tạo màng sinh học thích nghi với môi trường tương ứng và có sức đề kháng với điều kiện môi trường cao hơn so với tế bào trôi nổi tự do Các vi khuẩn trong biofilm rất kém đáp ứng với các kháng sinh, liên quan chủ yếu đến sự giảm sinh khả dụng do hiệu ứng cản trở của ma trận biofilm, điều này hạn chế khả năng tiếp xúc của thuốc với các VSV trong biofilm Với cấu tạo từ polysaccharid, DNA ngoại bào và protein, ma trận biofilm có thể tương tác với thuốc cũng như hạn chế sự khuếch tán của thuốc trong biofilm Cả hai tác động này dẫn tới nồng độ thuốc trong biofilm thấp và không phát huy được tác dụng Ngay cả khi nồng độ thuốc trong biofilm đủ cao, sự đáp ứng của các vi khuẩn trong biofilm với kháng sinh là không đầy đủ, do nhiều nguyên nhân liên quan đến dược lực học [9], [33]

Môi trường khắc nghiệt trong biofilm thúc đẩy các VSV chuyển sang các kiểu hình giảm đáp ứng với kháng sinh Các VSV trong biofilm có xu hướng chuyển sang kiểu hình “dai dẳng” hoặc “dung nạp”, đặc trưng cho một phần hoặc tất cả quần thể vi khuẩn không đáp ứng với điều trị bằng kháng sinh Các VSV có kiểu hình dai dẳng tồn tại trong biofilm, dù với số lượng nhỏ nhưng có khả năng tồn tại dưới tác động của kháng sinh nồng độ cao và hệ miễn dịch Khi quá trình điều trị kết thúc, những vi khuẩn này hoạt động như một điểm tạo mầm để khởi tạo một nhiễm khuẩn/nhiễm khuẩn biofilm mới, do đó chiến lược để diệt các vi khuẩn dai dẳng trong biofilm cũng rất quan trọng [52], [9]

1.1.3.3 Tinh dầu như một giải pháp cho đối tượng vi khuẩn dai dẳng

Với tác dụng kháng VSV nổi bật cùng tác động đa mục tiêu đã làm cho tinh dầu

và các chất chiết xuất từ thực vật trở thành đối tượng nghiên cứu tiềm năng khi tìm các tác nhân mới có khả năng diệt hoặc hỗ trợ kháng sinh diệt các tác nhân dai dẳng hay VSV trong biofilm Nghiên cứu của Mitra Mohammadi Bazargani và Jens Rohloff (2015) chỉ ra rằng tinh dầu rau mùi, hồi, bạc hà và các chiết xuất của chúng có hiệu quả trong việc giảm sinh khối màng sinh học và làm suy giảm hoạt động trao đổi chất của

các tế bào kết dính trong màng sinh học được hình thành bởi E coli và S aureus ở nồng

độ thử nghiệm MIC [40] Hay trong nghiên cứu của Nguyễn Khắc Tiệp và cộng sự

(2022) sàng lọc 300 mẫu dược liệu tại Việt Nam về khả năng diệt S aureus trong biofilm kết quả cho thấy có 11 mẫu chiếm tỷ lệ 3,6% có khả năng diệt S aureus trong biofilm ở dạng đơn lẻ hoặc kết hợp với kháng sinh và có 5 mẫu có khả năng diệt S aureus trong

biofilm ở dạng đơn lẻ Khi kết hợp với kháng sinh, gần như tất cả các mẫu trên đều cho thấy một tác động tốt, tăng cường khả năng diệt khuẩn của kháng sinh và diệt được hơn

25% số S aureus trong biofilm so với mẫu chứng dương ở cùng điều kiện thực nghiệm

[9]

Tinh dầu có tác dụng không chọn lọc đối tượng trên màng, nó sẽ tác động lên cả

vi khuẩn dai dẳng và không dai dẳng vì thế trở thành ứng cử viên tiềm năng với tác dụng diệt các đối tượng VSV tạo ra biofilm gây hại [43], [33] Tác động của tinh dầu đối với

sự ức chế và phân tán biofilm có thể liên quan đến khả năng phản ứng, tính kỵ nước và tốc độ khuếch tán của tinh dầu trong chất nền, cũng như thành phần và cấu trúc của màng sinh học Các thành phần chính của tinh dầu có thể hoạt động theo một số cách để làm xáo trộn sự phát triển của màng sinh học, chẳng hạn như ức chế hệ thống điều chỉnh

về biểu hiện gen dựa theo mật độ quần thể VSV hay thông qua sự can thiệp vào hoạt động của vi khuẩn [71]

1.1.4 Tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh

1.1.4.1 Tương tác giữa tinh dầu và kháng sinh

Liệu pháp kết hợp thuốc kháng sinh và tinh dầu hiện đang trở nên phổ biến và là một lĩnh vực tiềm năng cho các nghiên cứu trong tương lai do có thể khắc phục được hạn chế của các biện pháp đơn trị liệu [34]

Tác dụng hiệp đồng giữa kháng sinh và tinh dầu cho phép làm giảm nồng độ có tác dụng của kháng sinh trên vi khuẩn gây bệnh (từ đó cho phép giảm liều và hạn chế độc tính của thuốc) hoặc tăng tác dụng diệt khuẩn hay khôi phục tính nhạy cảm của kháng sinh trên các chủng VSV kháng thuốc Tác dụng hiệp đồng này có thể liên quan đến một số cơ chế như tác động dựa trên nhiều cơ chế khác nhau, tác động dựa trên các tương tác hóa lý hay tác dụng ức chế cơ chế đề kháng của vi khuẩn bởi tinh dầu [1]

Sử dụng tinh dầu trong ngăn ngừa kháng thuốc của vi khuẩn là rất hứa hẹn vì đó

là những hợp chất đa thành phần với các mục tiêu hoạt động khác nhau, so với nhiều chất kháng khuẩn thông thường chỉ có một vị trí mục tiêu duy nhất [29], [74] Các thành phần khác nhau của tinh dầu có thể tương tác để làm giảm hoặc tăng hiệu quả kháng khuẩn Kiểm tra sự tương tác giữa các hợp chất tinh dầu và kháng sinh thông qua chỉ số FIC index (test checkerboard) có thể thấy sự phối hợp kháng sinh và tinh dầu tạo ra ba loại hiệu ứng:

(i) Tác dụng hiệp đồng (FIC index < 0,5) khi tác dụng của các chất kết hợp lớn hơn tổng các tác dụng riêng lẻ

(ii) Tác dụng đối kháng (FIC index > 4): tác dụng tổng hợp ít hơn khi chúng được phối hợp cùng nhau so với khi sử dụng riêng lẻ

(iii) Không có tác động qua lại hoặc chỉ có tác dụng cộng (FIC index từ 0,5 - 4) khi hiệu ứng tổng bằng tổng các hiệu ứng riêng lẻ [1], [74]

1.1.4.2 Một số nghiên cứu về tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh

Các tinh dầu có thể có tác dụng độc lập hoặc được sử dụng kết hợp cùng kháng sinh Các loại tinh dầu được phát hiện là chất tăng cường hiệp đồng mặc dù chúng có thể không tạo ra bất kỳ tác dụng ức chế đáng kể nào khi sử dụng một mình, nhưng khi

chúng được sử dụng kết hợp với các loại thuốc tiêu chuẩn, tác dụng kết hợp vượt qua hiệu suất riêng lẻ của chúng và tạo ra hoạt tính kháng khuẩn tăng cường [74]

Các thí nghiệm đánh giá tác dụng hiệp đồng của kháng sinh với tinh dầu khi thực

hiện trên chủng S aureus đều cho kết quả hiệp đồng tốt làm giảm đáng kể MIC của

kháng sinh Như trong nghiên cứu của Yassine El Atki và cộng sự (2019) đánh giá tác

dụng hiệp đồng của tinh dầu quế (Cinnamomum cassia) khi kết hợp với kháng sinh kết

quả làm giảm MIC của ampicillin và chloramphenicol 2-8 lần [75] Hay khi kết hợp tinh

dầu tràm (Melaleuca armillaris) với cloxacillin hiệu quả diệt khuẩn vẫn được duy trì

ngay cả khi pH môi trường giảm từ 7,4 xuống 5,0 và nồng độ kháng sinh cần thiết để ức chế sự phát triển của vi khuẩn đã giảm đi đáng kể (khi môi trường nuôi cấy được acid hóa, nồng độ cloxacillin trong hỗn hợp tinh dầu/ cloxacillin giảm thậm chí tới 10 lần để

ức chế vi sinh vật) [20]

Trong một nghiên cứu khác, các mẫu tinh dầu nghệ (tinh dầu Curcuma longa) có

hoạt tính kháng khuẩn yếu trên các chủng tụ cầu nhạy cảm với methicillin (MSSA) và không có tác dụng trên chủng tụ cầu kháng methicillin (MRSA), tuy nhiên khi kết hợp tinh dầu nghệ NT01 với cefoxitin trên các chủng MRSA cho tác dụng hiệp đồng giúp làm giảm nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) của cefoxitin trong thử nghiệm checkerboard

từ mức độ kháng (> 4 mg/l), vượt qua điểm gãy đề kháng (4 mg/l) để quay về giá trị nhạy cảm (≤ 4 mg/l) và tăng cường hoạt lực diệt khuẩn (Emax), tiềm lực diệt khuẩn (Cs

và EC50) trong thử nghiệm đường cong nồng độ - đáp ứng [1]

Norfloxacin và tinh dầu Pelargonium graveolens cho tác dụng hiệp đồng khi kết hợp để chống lại các chủng vi khuẩn B cereus ATCC 11778, S aureus ATCC 6538 và

S aureus ATCC 29213 với FIC lần lượt là 0,50; 0,37 và 0,38 Kết quả nghiên cứu cho

thấy sự kết hợp tinh dầu và kháng sinh có khả năng làm giảm liều hiệu quả tối thiểu của norfloxacin, do đó giúp giảm thiểu các tác dụng không mong muốn tiềm ẩn của kháng sinh [54]

Ngoài S aureus còn nhiều thí nghiệm đánh giá tác dụng hiệp đồng tinh dầu – kháng sinh được thực hiện trên các chủng P aeruginosa, E coli như khi kết hợp kháng sinh

ampicillin và chloramphenicol với tinh dầu quế làm giảm 2 lần MIC kháng sinh đối

với P aeruginosa, 2-4 lần đối với E coli [25] Trong 1 nghiên cứu khác khi kết hợp tinh dầu của vỏ cây quế (Cinnamomum zeylanicum) với clindamycin kết quả cho thấy tăng

cường hoạt động kháng khuẩn của clindamycin và làm giảm nồng độ ức chế tối thiểu

của clindamycin (giảm 16 lần) đối với chủng Clostridium difficile gây độc Thí nghiệm

chứng minh có tác dụng hiệp đồng giữa tinh dầu vỏ quế và kháng sinh clindamycin với FIC là 0,312 [60]

1.2 Tinh dầu trầu không và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trầu không 1.2.1 Ví trí, phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [66] trầu không (Piper betle

L.) có vị trí phân loại như sau:

Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Ngọc Lan (Magnoliopsidae) Liên bộ Hồ Tiêu (Piperanae)

Bộ Hồ Tiêu (Piperales) Họ Hồ Tiêu (Piperaceaea) Chi Hồ Tiêu (Piper) Loài: Piper

betle L

1.2.2 Đặc điểm trầu không

1.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Trầu không (Piper betle L.) là một loài thân leo, sống lâu năm, thân nhẵn Lá mọc

so le, cuống có bẹ, dài 1,5 – 3,5 cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10 – 13 cm, rộng 4,5 –

9 cm, phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lên rất nhiều điểm chứa tinh dầu nhỏ, gân lá thường 5 Hoa khác gốc mọc thành bông Quả mọng không có vòi sót lại [5]

Hình 1.1 Hình ảnh cây trầu không (Piper betle L.)

1.2.2.2 Phân bố

Trầu không có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng từ 2500 năm trước, sau đó lan sang Madagasca và Đông Phi Ngày nay trầu không được trồng phổ biến ở khắp các nước nhiệt đới vùng Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Srilanka, Maylasia, Thái Lan, Indonesia, Việt Nam, Trung Quốc…[21], [23], [31]

1.2.2.3 Thành phần hóa học

Tinh dầu trầu không (BLEO) được thu từ lá trầu và thể hiện mùi thơm đặc trưng của cây Theo nhiều nghiên cứu, trong lá trầu không có rất nhiều các điểm chứa tinh dầu nhỏ và là bộ phận chứa hàm lượng tinh dầu cao nhất [5] Qua thu thập tài liệu cho thấy thành phần BLEO thu từ các mẫu lá trầu không khác nhau có thể phân lập được gần 100 hợp chất, hầu hết các hợp chất này đều có cấu tạo monoterpen, sesquiterpen và phenylpropanoid Những hợp chất monoterpen và sesquiterpen này rất phong phú về

cấu tạo hóa học và trong công thức cấu tạo của chúng có thể có hoặc không có nguyên

tử oxy [41], [65]

Theo nhiều tài liệu công bố, thành phần chính của BLEO là các hợp chất phenylpropanoid bao gồm: Eugenol, Methyl eugenol, Eugenol acetate, Estragole/ Methyl chavicol, Chavicol, Anethole/Isoestragole, Safrole, Chavicol acetate [65], [68] Ngoài ra còn có các hợp chất monoterpen chính trong BLEO bao gồm: α-Thujene, α-Pinene, Camphene, Sabinene, Myrcene, α-Terpinene, β-Phellandrene, 1,8-Cineole/Eucalyptol, (E) β-Ocimene, γ-Terpinene, Terpinolene, Linalool [37], [65] Các sesquiterpen thường gặp: δ-Elemene, α-Copaene, β-Elemene, E-β-Caryophyllene, β-Copaene, γ-Elemene, Aromadendrene, α-Humulene, γ-Muurolene, Germacrene, β-Selinene, α-Selinene, Bicyclogermacrene, α-Muurolene, cis-β-Guaiene, δ-Cadinene, Palustrol, Spathulenol, Caryophyllene oxide, Globulol, Viridiflorol, Cubenol, α-Cadinol [37], [65]

Tuy nhiên sự có mặt và hàm lượng của các thành phần trong tinh dầu có sự biến đổi giữa các vùng địa lý, điều kiện sinh trưởng, giống, nguồn, điều kiện canh tác, vụ mùa, giai đoạn trưởng thành, phương pháp thu hoạch, chiết xuất và bảo quản [2], [41] Trong nghiên cứu của Swagata Karak và cộng sự (2018), BLEO được thu từ lá của các giống trầu ở bảy địa phương khác nhau ở Ấn Độ cho thấy có thành phần chính khác nhau cả về hợp chất và tỉ lệ: Chavicol (22,85%) là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất ở Meetha, Eugenol (33,06%) chiếm tỉ lệ cao nhất ở Manikdanga, Safrole (42,77%) chiếm

tỉ lệ cao nhất ở Chhaanchi, Eugenol acetate chiếm tỉ lệ cao nhất (35,77% và 40,03%) ở

Bangla và Manikdanga [65]… Nghiên cứu thành phần BLEO ở Srilankan cho thấy Safrole là thành phần chính trong BLEO chiếm 52,7%, sau đó là allylpyrocatechol diacetate (15,4%), eugenol (6,4%) và eugenyl acetate (5,8%) [41] Nghiên cứu của Mitali Madhumita và cộng sự (2019) cho thấy Eugenol là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất trong BLEO được thu từ làng Dantan Ấn Độ (44,14 %) [37] hay ở Đài Loan Eugenol (36,2%) [55] Một vài nghiên cứu khác lại cho thấy trong BLEO thu ở Kharagpur, Ấn Độ phân lập được 46 thành phần trong đó chavibetol (22,0%) chiếm tỉ

lệ cao nhất sau đó là estragole (15,8%), β-cubebene (13,6%), chavicol (11,8%) và caryophyllene (11,3%) là các hợp chất chính [63] Hay 4-allyl-2-methoxy-phenol acetate chiếm 31,7% là thành phần chính trong BLEO thu từ Thái Lan [13]

Tại Việt Nam nhiều nghiên cứu về thành phần của tinh dầu trầu không cũng đã được thực hiện Một nhóm nghiên cứu do Nguyễn Thiện Chí và cộng sự khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu không thu tại Hậu Giang đã phân tích thành phần tinh dầu và xác định được 9 hợp chất bao gồm các hợp chất thuộc terpen và các dẫn xuất của phenol trong đó hợp chất 4- allyl-1,2-diacetoxybenzene chiếm hàm lượng cao nhất (34,55%) [2] tương tự với nghiên cứu thu BLEO từ lá trầu không ở Nam Bộ 4- allyl-

1,2-diacetoxybenzene cũng là thành phần chính chiếm 44,21% [6] Mẫu trầu không thu tại Thừa Thiên Huế và Hải Dương đều có eugenol là thành phần chiếm ưu thế nhất trong BLEO lần lượt là 63,9% và 77,24% Ngoài ra trong cả 2 mẫu trầu không trên đều chứa eugenol acetate (10,8% và 8,67%) và 1 vài hoạt chất thể hiện hoạt tính sinh học tồn tại với tỉ lệ nhỏ hơn trong BLEO như: chavicol, chavicol acetate, 4-allyl-1,2 diaxetoxybenzen… [3], [68]

1.2.2.4 Hoạt tính sinh học và công dụng

Tinh dầu trầu không có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kích thích thần kinh trung ương, kháng acetylcholinesterase, kháng β-glucuronidase, chống viêm, làm lành vết thương… Đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học cho thấy khả năng ứng dụng đầy hứa hẹn của loại tinh dầu này trong nông nghiệp, y học và công nghiệp dược phẩm [24], [64] Trong thực hành y học cổ truyền,

lá trầu được sử dụng để thụt rửa âm đạo ở Indonesia, làm nước súc miệng ở Ấn Độ và Thái Lan, điều trị các vấn đề về răng miệng, đau đầu, viêm khớp và đau khớp ở Malaysia Ở Srilanka, nước lá trầu không được dùng để chữa bệnh ngoài da Ngoài ra,

lá trầu không có thể được sử dụng làm thuốc ho, thuốc bổ, hoặc chất làm se Các ứng dụng truyền thống của lá trầu không có liên quan đến đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm của chúng [44] Tính kháng khuẩn, kháng nấm ở BLEO cũng như ứng dụng của nó

trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đã được chứng minh trong các nghiên cứu in vitro

và trên lâm sàng và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong ngành Dược phẩm

1.2.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu trầu không

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Tinh dầu trầu không có hoạt tính tiêu diệt các vi khuẩn Gram âm và Gram dương cũng như các loài nấm, kể cả những loài đa kháng thuốc và gây ra các bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng [24], [30], [39], [46] BLEO cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại

Gram (-) E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris lần lượt với MIC là 300; 500; 4000 µg/ml Các chủng Gram (+) S.aureus ATCC 25923,

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Propionibacterium acnes ATCC 6919, Streptococcus peroris có MIC lần lượt là 500; 500; 1000; 2000 µg/ml Ngoài ra nghiên

cứu cho thấy tinh dầu trầu không là tác nhân diệt nấm mạnh nhất với MIC thấp nhất chống lại tất cả các chủng ATCC và nấm phân lập lâm sàng được thử nghiệm [24], [39], [46]

Năm 2005, Arambewela cùng các cộng sự nghiên cứu, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của BLEO thu từ sáu vùng ở Srilankan Kết quả cho thấy tinh dầu trầu không có

tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn S aureus, Streptococcus pyrogenes, E

coli với MIC lần lượt là5000; 2500; 312 µg/ml [14]

BLEO có hoạt tính cao chống lại sự phát triển của bốn loại nấm là Arthroderma

benhamiae, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Ctenomyces serratus và năm loại nấm Aspergilli gây bệnh Kết quả thí nghiệm cho thấy BLEO tạo

ra vòng vô khuẩn kháng nấm có đường kính dao động từ 18mm – 60mm lớn hơn so với

chứng Griseofluvin là 15mm Ngoài ra các vi khuẩn B subtilis, Bacillus pumilus, S

aureus, Salmonella typhi và Vibrio cholerae cũng được phát hiện là nhạy cảm với tinh

dầu trầu không trong đó vi khuẩn B subtilis cho đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn so

với các vi khuẩn còn lại Tinh dầu cũng được phát hiện là có hiệu quả đối với sán

dây (Taenia solium) và giun móc (Bunostomum trigonocephalum) hơn thuốc tẩy giun

tổng hợp piperazine phosphate và hexyl resorcinol [28]

Sử dụng phương pháp pha loãng và phương pháp khuếch tán đĩa/khuếch tán giếng thạch để xác định hoạt động kháng khuẩn của tinh dầu Nghiên cứu của Adeltrudes chỉ

ra BLEO có nồng độ ức chế tối thiểu đối với S aureus ở mức 125 μg/ml, Streptococcus

pyogenes 15,60 μg/ml, C.albicans 250 μg/ml và Trichophyton mentagrophytes 195

μg/ml Vùng ức chế tăng trưởng có đường kính 67,5mm đối với S aureus, 90 mm đối với S Pyogenes, C albicans và T mentagrophytes Kết quả đã chứng minh rằng tinh

dầu trầu không là một tác nhân kháng khuẩn rất hiệu quả [11]

1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, tinh dầu lá trầu không thu ở tỉnh Hậu Giang bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) thu được thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá hợp chất 4-Allyl-1,2-diacetoxybenzene với hàm lượng 34,55% Hoạt tính kháng

vi sinh vật của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả thử hoạt tính kháng VSV cho thấy tinh

dầu trầu không có khả năng ức chế sự tăng trưởng của 3 chủng vi sinh vật: B subtillis,

Fusarium oxysporum và Aspergillus niger với giá trị MIC lần lượt là 100, 200 và

200μg/mL [2], hay trong nghiên cứu của Nguyễn Đinh Nga và cộng sự (2010) đánh giá

tác động của tinh dầu trầu không đối với chủng C albicans cho thấy tác dụng diệt nấm

hoàn toàn sau 2 giờ thử nghiệm ở nồng độ 1-2 MIC [7]

Ngoài ra tinh dầu trầu không cũng được nghiên cứu với ứng dụng diệt khuẩn trong nông nghiệp và thủy sản như sử dụng các hợp chất và tinh dầu lá trầu không để ức chế

một số vi khuẩn Aeromonas hydrophina và Vibro parahaemolyticus gây bệnh trên thủy

sản [8]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu và chủng giống

Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu

thiên nhiên Hà Nội

Các chủng VSV nghiên cứu

1 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 ATCC1

2 Candida albicans ATCC 10231 ATCC

3 Staphylococcus aureus ATCC 33591 ATCC

4 Escherichia coli ATCC 25922 ATCC

5 Bacillus subtilis ATCC 6633 ATCC

6 Samonella enterica ATCC 35664 ATCC

7 Klebsiella pneumoniae ATCC 2146 ATCC

8 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ATCC

Kháng sinh (KS)

1Các chủng chuẩn ATCC được cung cấp bởi phòng nghiên cứu dược lý phân tử và tế bào (FACM) - Đại học công giáo Louvain, Vương quốc Bỉ và Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương Lưu trữ trong tủ -80ºC tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia - Đại học Dược Hà Nội

Lựa chọn tinh dầu trầu không từ Công ty CP Tinh dầu thiên nhiên Hà Nội với yêu cầu không chứa methyl eugenol Do một số nghiên cứu về thành phần tinh dầu trầu không tại một số nơi, hàm lượng methyl eugenol tương đối cao, trong khi yêu cầu chế phẩm <0,001% Bảng thử nghiệm thành phần mẫu tinh dầu trầu không sử dụng không chứa methyl eugenol do nhà cung cấp thực hiện (xem phụ lục 1)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.2 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2 Cân phân tích Satorius – Đức

12 Hộp đựng đầu típ loại 1000 μl, 200μl Hàn Quốc

14 Máy đọc vi đĩa 96 giếng huỳnh quang - UV Varioskan

Lux/Thermofihser

17

Dụng cụ thủy tinh: bình nón, cốc có mỏ, ống đong,

ống nghiệp có nút xoáy, pipet, đĩa petri… Trung Quốc

2.1.3 Môi trường sử dụng

Bảng 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Thạch agar Việt Nam Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisherchemical Môi trường Mueller

Amoni citrate Natri acetat MnSO4 H2O

0,2 0,5 0,004

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu trầu không

- Xác định được nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của VSV (MIC) và nồng độ có khả năng diệt VSV (MBC)

- Đánh giá khả năng diệt khuẩn của tinh dầu trầu không theo nồng độ

2.2.2 Đánh giá khả năng diệt vi khuẩn tồn tại dai dẳng của tinh dầu trầu không

- Đánh giá khả năng diệt vi khuẩn tồn tại dai dẳng khi sử dụng tinh dầu trầu không,

kháng sinh (vancomycin, meropenem) đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trên chủng S aureus

- Đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu trầu không với vancomycin, meropenem,

ceftriaxon trên chủng S aureus ATCC 33591 và K pneumoniae ATCC 2146

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa chủng

Các chủng sử dụng trong nghiên cứu bao gồm các chủng L acidophilus, E coli,

S aureus, C albicans, K pneumoniae, B subtilis, P aeruginosa, S enterica được lưu

ở - 800C tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia - Đại học Dược

Hà Nội, sau đó được cấy lên thạch TSA hoặc SDA trước khi sử dụng Tất cả các thao

tác được thực hiện trong tủ cấy vô khuẩn Tủ cấy được tiệt trùng bằng cách lau sạch bằng cồn 960 và bật đèn UV một giờ

Cân, đong các thành phần theo công thức môi trường (mục 2.1.3) Hòa tan các

thành phần, đậy kín bằng nút bông không thấm nước hoặc nắp xoáy Hấp tiệt khuẩn ở

1150C, 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau khi tiệt khuẩn xong, các bình đựng môi trường lỏng được bảo quản trong tủ lạnh, sử dụng trong 1 tuần Các bình đựng môi trường thạch được phân phối lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín, bảo quản trong tủ lạnh, dùng trong 1 tuần Hoạt hóa giống thực hiện 1 tuần 1 lần, sử dụng môi trường thạch tương ứng với VSV, dùng que cấy vô trùng lấy một vòng VSV từ ống giống cấy sang bề mặt thạch tương ứng theo hình zigzag Các chủng sau đó được ủ 370C

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu trầu không

2.3.2.1 Phương pháp xác định MIC với các đối tượng vi sinh vật

 Quy trình đánh giá MIC:

Nồng độ tối thiểu ức chế VSV (MIC) của tinh dầu trầu không được xác định bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng sử dụng canh thang MHB cho vi khuẩn

hoặc Sabouraud-dextrose cho C albicans, MRS cho L.acidophilus trên đĩa 96 giếng

theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa kỳ (Clinical & Laboratory Standards Institute – CLSI) [19]

Tinh dầu trầu không được hòa tan trong dung môi phù hợp có Tween 80 với nồng

độ 4%, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong môi trường phù hợp Các mẫu tinh dầu được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng, từ các giếng ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng ở cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân, như trong bảng 2.4

Hỗn dịch vi sinh vật có độ đục tương đương 0,5 McFarland được chuẩn bị trong

PBS, với các khuẩn lạc trên đĩa thạch TSA cho vi khuẩn hoặc SDA cho C albicans, thạch MRS cho L acidophilus được ủ 37°C, qua đêm Hỗn dịch này được pha loãng

100 lần trong MHB hoặc Sabouraud-dextrose cho C albicans, MRS cho L.acidophilus

để thu được hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5x106 vi khuẩn/ml và 104 vi nấm/ml Hỗn dịch làm việc được bổ sung vào các giếng trong đĩa (trừ các giếng ở cột 12, vai trò chứng âm) Các đĩa được nắp kín, ủ ở 37℃ trong 20 giờ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật

Việc đánh giá bằng mắt được xác nhận lại bằng việc bổ sung natri resazurin (20 µl nồng độ 0,1 µg/ml) vào các giếng, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sự hiện diện của vi khuẩn sống được đánh giá thông qua sự khử hóa resazurin màu xanh lam, không huỳnh quang thành resorufin màu hồng, phát huỳnh quang MIC được xác định

là nồng độ thấp nhất không có sự tăng lên của cường độ huỳnh quang Tất cả các thử nghiệm được thực hiện 3 lần độc lập

Bảng 2.4 Mô tả sắp xếp thí nghiệm xác định MIC

(+)

12 (-)

2.3.2.2 Phương pháp xác định MBC với các đối tượng vi sinh vật

Xác định kết quả nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) dựa trên đĩa xác định MIC, tất cả các giếng không mọc được cấy lên đĩa thạch để xác định MBC

 Quy trình đánh giá MBC

Tất cả các giếng không mọc trên đĩa xác định MIC được đem đi cấy để xác định MBC Sau khi ủ ở 37 độ C trong 24 giờ, đếm số khuẩn lạc xuất hiện

Nồng độ MBC là nồng độ thấp nhất có khả năng diệt lớn hơn 99% số vi sinh vật

so với thời điểm ban đầu

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi sinh vật ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ tinh dầu được chuẩn bị tương tự như trong xác định MIC

Cho dung dịch VSV tiếp xúc với với tinh dầu trầu không nồng độ khác nhau Dãy

nồng độ từ cao đến thấp gần với MIC Mẫu được ủ 37ºC trong 20h Lượng VSV sống trong mẫu trước và sau khi tiếp xúc với tinh dầu, sẽ được đánh giá bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch Mẫu sẽ được pha loãng đến nồng độ phù hợp trong PBS, sau đó được cấy lên môi trường thạch phù hợp, TSA cho các vi khuẩn, SDA cho các vi nấm,

thạch MRS cho L acidophilus Số lượng khuẩn lạc được xác định bằng phương pháp

đếm sau khi ủ ở 37ºC trong 24 giờ

Khả năng diệt khuẩn của mẫu được đánh giá dựa trên khả năng diệt vi sinh vật, so sánh với thời điểm trước khi tiếp xúc với tinh dầu Kết quả được biểu diễn dưới dạng hiệu số log10 CFU/ml giữa mẫu có tiếp xúc với tinh dầu và trước khi tiếp xúc với tinh dầu (delta log10 CFU/ml hoặc ∆log10 CFU/ml)

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính diệt vi khuẩn tồn tại ở dạng dai dẳng

2.3.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi khuẩn dai dẳng

Thí nghiệm được thiết kế để làm với S aureus ATCC 33591 và hai kháng sinh là

meropenem, vancomycin

Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật 24 giờ: Chủng VSV được lấy từ ống Cryotube hoặc đĩa Petri Cấy một que cấy hoặc 2-3 khuẩn lạc vào 5 ml MHB trong ống nghiệm Ủ qua đêm, 370C trong máy lắc ổn định nhiệt Sau đó pha loãng 100 lần hỗn dịch VSV từ các ống được ủ qua đêm trong môi trường MHB Đem ủ 24h, 370C trong máy lắc ổn định nhiệt để thu được hỗn dịch VSV 24 giờ Quá trình nuôi cấy 24 giờ này thúc đẩy một phần VSV chuyển đổi sang kiểu hình dai dẳng

Chuẩn bị dung dịch kháng sinh, tinh dầu trầu không với nồng độ thích hợp (nồng

độ tinh dầu được chuẩn bị tương tự như trong xác định MIC) Bảo quản 40C

Thực hiện thí nghiệm trong các ống nghiệm lần lượt bổ sung kháng sinh, tinh dầu

và hỗn dịch VSV 24 giờ: Sử dụng KS vancomycin 50 mg/l và meropenem 30mg/l đơn độc hoặc có kết hợp với tinh dầu 1 ml/l (¼ MIC) và sử dụng đơn độc tinh dầu trầu không nồng độ (¼ MIC và 8 MIC)

Đếm mẫu VSV không tiếp xúc với kháng sinh Tính toán nồng độ pha loãng thích hợp Đếm mẫu VSV có tiếp xúc với kháng sinh tại các thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 24 giờ Tính toán nồng độ pha loãng phù hợp Ủ các mẫu cấy đếm sau 24 giờ Đếm số khuẩn lạc

Lượng VSV còn sống ở các thời điểm được tính toán dựa trên số khuẩn lạc và nồng

độ pha loãng và được biểu diễn dưới dạng log10 CFU/ml

2.3.3.2 Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn trong biofilm

Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm

Biofilm được tạo trên đĩa 96 giếng đáy bằng của SPL, sử dụng nồng độ vi khuẩn 0,005 ở OD620 nm (tương đương 107 CFU/mL), trong môi trường nuôi cấy TGN (TSB

có bổ sung NaCl và glucose), thể tích 200 μl/giếng, ủ ở 37°C trong 24 giờ

Phương pháp đánh giá hoạt tính diệt khuẩn trong biofilm

Biofilm 24 giờ được sử dụng để đánh giá hoạt tính của tinh dầu trên đối tượng biofilm Nghiên cứu được thực hiện với 3 đối tượng là (i) moxifloxacin, (ii) moxifloxacin kết hợp với tinh dầu trầu không nồng độ ¼ MIC và (iii) moxifloxacin kết hợp tinh dầu trầu không nồng độ 8 MIC Trong đó moxifloxacin được sử dụng với một dãy nồng độ từ 0,001 đến 1000 mg/l Cụ thể môi trường nuôi cấy sẽ được thay thế bằng TGN với vai trò mẫu chứng hay TGN có bổ sung kháng sinh, tinh dầu với vai trò mẫu thử Biofilm này sẽ tiếp tục được ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau 24 giờ, định lượng VSV sống trong biofilm bằng phương pháp cấy đếm CFU trên đĩa thạch Mẫu cần đếm số

lượng CFU sẽ được rửa nhẹ nhàng với PBS VSV trong biofilm sẽ được phá ra khỏi biofilm bằng nước cất vô khuẩn, pipetting lên xuống tối thiểu 20 lần, sau đó sẽ được vortex thật kỹ hoặc siêu âm trong vòng 1 phút nếu cần để tách rời hoàn toàn các khuẩn lạc Mẫu sau đó sẽ được pha loãng đến nồng độ phù hợp và cấy trải trên thạch TSA, ủ

24 giờ tại 37°C và đếm lượng khuẩn lạc Lượng VSV còn sống ở các thời điểm được tính toán dựa trên số khuẩn lạc và nồng độ pha loãng Kết quả được biểu diễn dưới dạng

đường cong nồng độ (log mg/l) - đáp ứng (log CFU/ml) (xem mục 2.3.4.2)

2.3.4 Phương pháp xác định tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh

2.3.4.1 Test Checkerboard – xác định tác dụng hiệp đồng

Test checkerboard đánh giá tác động giữa KS và TD trầu không thông qua việc xác định giá trị MIC 2 chiều, với MIC KS theo chiều ngang và MIC TD trầu không theo chiều dọc, cùng trên 1 đĩa 96 giếng Chủng nghiên cứu, môi trường nuôi cấy và điều kiện thí nghiệm như test xác định MIC Ở đĩa KS, dãy các nồng độ KS được chuẩn bị trong MHB, với nồng độ tương tự như bảng 2.5, mỗi giếng 50µl, thực hiện 02 đĩa độc lập Ở đĩa TD trầu không, dãy các nồng độ TD được chuẩn bị trong MHB như trong hình 2.5, mỗi giếng 130µl Sau đó, lấy 50µl từ đĩa TD trầu không cho vào cùng vị trí ở đĩa KS để thu được 100µl dung dịch kết hợp KS-TD trầu không, các giếng hàng A là

KS riêng lẻ, các giếng cột 10 là TD trầu không riêng lẻ, cột 11 là chứng dương, cột 12

là chứng âm Sau đó, 100 µl hỗn dịch VSV làm việc (xem phần MIC) được bổ sung vào tất cả các giếng (trừ cột 12, chứng âm) Mẫu được ủ và đọc như đánh giá MIC Giá trị MIC của các mẫu dạng tự do (MIC KS, MIC TD trầu không) và dạng kết hợp (MIC KS-hỗn hợp, MIC TD trầu không-hỗn hợp) được sử dụng để tính tổng tỷ lệ nồng độ ức chế (FIC index- Fractional Inhibitory Concentration index)

𝑀𝐼𝐶 𝑋 ℎỗ𝑛 ℎợ𝑝

𝑀𝐼𝐶 𝑌 ℎỗ𝑛 ℎợ𝑝𝑀𝐼𝐶 𝑌 = 𝐹𝐼𝐶 𝑋 + 𝐹𝐼𝐶 𝑌 = 𝐹𝐼𝐶 𝑖𝑛𝑑𝑒𝑥 Giá trị FIC index được sử dụng để đánh giá tương tác giữa các mẫu, với (i) FIC index nhỏ hơn 0,5 các mẫu sẽ có tác dụng hiệp đồng, (ii) FIC index từ 0,5 đến 4 các mẫu không có tác động qua lại hoặc chỉ có tác dụng cộng và (iii) FIC index > 4 tương ứng với tác dụng đối kháng giữa các mẫu thử

Bảng 2.5 Mô tả sắp xếp thí nghiệm tương tác tinh dầu - kháng sinh thông qua thử nghiệm checkerboard

2.3.4.2 Phương pháp xây dựng đường cong nồng độ - đáp ứng

Đường cong nồng độ - đáp ứng được thực hiện với một dải nồng độ từ rất cao đến rất thấp, để có cái nhìn đầy đủ về dược lực học của KS cũng như sự kết hợp KS Đường cong nồng độ - đáp ứng được thực hiện trong điều kiện tương tự khi thực hiện xác định MIC, trong môi trường MHB, trên đĩa 96 giếng Hỗn dịch vi khuẩn nồng độ 1,5x106

được ủ với nồng độ khác nhau bổ sung hoặc không bổ sung tinh dầu trầu không với nồng độ quan sát thấy giá trị hiệp đồng tốt nhất Hòa tan và pha loãng dịch nuôi cấy đến nồng độ phù hợp trong PBS và cấy trải lên thạch TSA Số lượng khuẩn lạc (colony-forming unit-CFU) được đếm sau khi ủ ở 37 °C trong vòng 24 giờ

Sự thay đổi số lượng vi khuẩn trong các mẫu được so sánh với mẫu khởi điểm to Các giá trị Emax và Cs được tính dựa trên phương trình hồi quy Hill-Langmuir từ đường cong nồng độ - đáp ứng trên phần mềm GraphPad 4.0 Giá trị Emax (Δlog10 CFU/ml) hiệu lực diệt khuẩn tối đa là sự biến đổi về số lượng VSV còn sống so với mẫu khởi điểm t0 Giá trị Cs (mg/l) là nồng độ KS thấp nhất, có khả năng ức chế sự phát triển của VSV

2.3.5 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch

Chuẩn bị môi trường tương tự ở mục 2.3.1 Cấy các VSV E coli, S aureus, K

pneumoniae, B subtilis, P aeruginosa, S enterica lên đĩa thạch TSA hoặc SDA cho C albicans hoặc MRS cho L acidophilus

Mẫu được pha loãng trong PBS theo cơ số log 10 đến nồng độ phù hợp bằng phương pháp vi pha loãng trên đĩa 96 giếng: hút chính xác 30 µl hỗn dịch VSV pha vào giếng thứ nhất chứa 270 µl PBS, trộn đều Sau đó hút chính xác 30 µl dịch đã được đồng nhất trong giếng thứ nhất pha loãng sang giếng thứ 2 (chứa 270 µl PBS), trộn đều Tiếp tục pha loãng như vậy cho tới nồng độ pha loãng cuối cùng Cấy lên môi trường đã chuẩn

bị trên đĩa petri, ủ ở 370C, trong 24 giờ Đọc số khuẩn lạc mọc trên đĩa petri CFU được tính dựa trên số khuẩn lạc và độ pha loãng, được biểu hiện dưới dạng log10 CFU/ml