Tổng hợp dẫn xuất coumarin mới áp dụng trong phân tích trắc quang

Chúng có nhiều tác dụng dược lý và sinh học khác nhau và có thể được tìm thấy trong các chất có chiết xuất khác nhau, như Cortex Fraxini, có hoạt tính chống viêm tương quan với sự hiện d

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài:

TỔNG HỢP DẪN XUẤT COUMARIN MỚI ÁP DỤNG

TRONG PHÂN TÍCH TRẮC QUANG

Mã số đề tài : 21/1HHSV04

Chủ nhiệm đề tài : LÊ THỊ THANH TRÚC

Đơn vị thực hiện : KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 4 năm 2022

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, nhóm chúng em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM đã tạo điều kiện và cung cấp nguồn kinh phí để chúng em có thể thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học này

Chúng em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Thầy PGS.TS.Trần Nguyễn Minh Ân-Giáo viên hướng dẫn đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉnh sửa, giải đáp thắc mắc cũng như khó khăn mà nhóm gặp phải trong quá trình nghiên cứu

và hoàn thành đề tài này

Bên cạnh đó, nhóm chúng em cũng lời cảm ơn tới Khoa Công nghệ Hóa học đã tạo điều kiện cơ sở vật chất cũng như máy móc và trang thiết bị để chúng em có thể hoàn thành để tài nghiên cứu này

Tuy nhiên, với sự cố gắng và nỗ lực hết sức trong quá trình thực hiện đề tài này nhưng không tránh khỏi những thiếu sót Nhóm nghiên cứu kính mong hội đồng khoa học, các chuyên gia, những người quan tâm đến đề tài có những ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, chúng em xin chúc quý thầy cô thật nhiều sức khỏe để tiếp tục cống hiến hết mình cho sự nghiệp giáo dục

Tp.HCM, ngày 28 tháng 4 năm 2022 Nhóm nghiên cứu

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

I Thông tin tổng quát

1.1 Tên đề tài: Tổng hợp dẫn xuất coumarin mới áp dụng trong phân tích trắc

quang

1.2 Mã số: 21/1HHSV04

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

(học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 3 năm 2021 đến tháng 10 năm 2021

1.5.2 Gia hạn (nếu có): không có

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 3 năm 2021 đến nay

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

1.6.1 Mục tiêu:

a) Mục tiêu tổng quát:

- Tổng hợp mới dẫn xuất coumarin mang nhóm thế Bromo ở C-3 từ

7-diethylamino-4-methyl coumarin, thử nghiệm hoạt tính sinh học trong in vitro theo

mô hình molecular docking model

b) Mục tiêu cụ thể:

- Tổng hợp các dẫn xuất coumarin mang nhóm thế Bromo ở vị trí C-3 từ diethylamino-4-methyl coumarin thông qua phản ứng Brom hóa

7 Nghiên cứu mô hình docking phân tử để đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư,

kháng khuẩn, nấm, kháng viêm, ức chế emzym α-glucosidase

1.6.2 Nội dung thực hiện, phương pháp nghiên cứu:

a) Nội dung 1: Tổng hợp dẫn xuất coumarin từ 7-diethylamino-4-methyl coumarin

- Cách tiếp cận: Đọc tài liệu, xây dựng qui trình thực nghiệm, tiến hành thực

nghiệm dựa trên hình , thu nhận và phân tích kết quả

- Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng: Thực nghiệm dựa trên tài liệu có hiệu

chỉnh thay đổi qui trình

- Kết quả dự kiến: Bộ dữ liệu phân tích hóa lý đúng của các cấu trúc: IR, 1H,13NMR và HR-MS

C-b) Nội dung 2: Nghiên cứu, đánh giá mô phỏng hoạt tính sinh học của dẫn xuất

coumarin trong in vitro

- Cách tiếp cận: Đọc tài liệu, tiến hành thực nghiệm dựa trên hình , thu nhận và

phân tích kết quả

- Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng: Áp dụng các gói phần mềm (tin học-

y sinh): Chemoffice, Avogadro, AutoDockTools-1.5.6rc3, Discovery Studio 2021 Client, Molegro Molecular Viewer và Gromacs để giải thích toàn diện mối quan hệ cấu trúc hoạt tính ligand với các dòng tế bào ung thư, kháng khuẩn, nấm, kháng

viêm, ức chế enzym α-glucosidase

- Kết quả dự kiến: Các giá trị năng lượng tối ưu của các cấu trúc; giá trị ΔG của các

phản ứng ligand-receptor của hợp chất, hình minh họa

1.6.3 Kết quả nghiên cứu

Nội

dung Công việc thực hiện Kết quả phải đạt

Thời gian (bắt đầu, kết thúc)

Cá nhân chủ trì

1

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

của dung môi, nhiệt độ, tỷ lệ mol,

xúc tác PEG-400 đến hiệu suất

của các phản ứng

Bảng kết quả, yếu tố phù hợp cho quá trình tổng hợp

05/05/2021 3 sinh viên

05/05/2021-3 Bộ dữ liệu Phân tích hóa lý của dẫn xuất: IR, NMR, HR-Mass Cấu trúc phù hợp với dự đoán 10/06/2021-10/07/2021

3 sinh viên, cán bộ hướng dẫn trợ giúp

Discovery Studio 2019 Client,

Molegro Molecular Viewer và

Gromacs để giải thích toàn diện

(in silico molecular docking

docking model) mối quan hệ cấu

trúc hoạt tính ligand (hợp chất

hữu cơ) và receptor (dòng tế bào

ung thư, khuẩn, nấm, kháng oxi

hóa)

Các giá trị năng lượng tối ưu của các cấu trúc; Giá trị ΔG của các phản ứng ligand-receptor của 5 cấu trúc; Hình min họa

31/08/2021 Cán bộ hướng 3 sinh viên,

10/07/2021-dẫn trợ giúp

01/09/2021-17/10/2021 3 sinh viên

1.6.4 Nguyên nhân

Vì điều kiện môi trường, nhiệt độ,… không đáp ứng được yêu cầu nên phản ứng Ginard (2) theo như trong thuyết minh ban đầu khó xảy ra Điều này nằm ngoài tính

toán của nhóm

1.6.4 Kết quả của cơ quan quản lý

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 10 triệu đồng

Bằng chữ: mười triệu đồng

II Kết quả nghiên cứu

1 Đặt vấn đề

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Coumarin và các dẫn xuất của nó được tìm thấy trong nhiều loài thực vật khác, ở dạng tự do hoặc ở dạng heteroside như Apiaceae, Asteraceae, Fabiaceae, Rosaceae, Rubiacae và Họ Solanaceae [1] Chúng có nhiều tác dụng dược lý và sinh học khác nhau và có thể được tìm thấy trong các chất có chiết xuất khác nhau, như Cortex Fraxini, có hoạt tính chống viêm tương quan với sự hiện diện của phenolic acid và coumarin, eculin, esculetin, fraxin và fraxetin [2] Các hoạt tính sinh học của các chất chiết xuất từ thực vật khác nhau của các dẫn xuất coumarin có tác dụng dược

lý và y học khác nhau [3] Cấu trúc của nó cho phép thay thế ở sáu vị trí khác nhau,

do đó cung cấp nhiều khả năng sửa đổi tổng hợp trên cấu trúc khung coumarin có nhiều hoạt tính sinh học mới [4] Các dẫn xuất từ nhân dị tố coumarin có khả năng

ức chế sự tăng trưởng trong các dòng tế bào ung thư ở người như A549 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), MCF-7 (ung thư vú) và HL-60 (ung thư bạch cầu) Hiện nay, các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên có trong các thuốc chiếm phần lớn trên thị trường, đặc biệt là thuốc về bệnh truyền nhiễm cho thấy chúng có hiệu lực vượt trội, tính đặc trị cao Tuy nhiên, số lượng sản phẩm tự nhiên và điều kiện hạn chế nên việc nghiên cứu các hợp chất bán tổng hợp, tổng hợp để cung cấp các dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao và tiến tới thử nghiệm cận lâm sàng hoặc lâm sàng để phát triển thuốc mới góp phần trong việc ức chế hoặc phát triển thuốc miễn dịch còn nhiều khó khăn Trong một số thử nghiệm lâm sàng, các dẫn xuất coumarin thể hiện hoạt động chống tăng sinh tế bào trong ung thư tuyến tiền liệt, u ác tính và ung thư biểu mô tế bào thận Đây là một tác chất phản ứng với đa dạng vị trí nhóm thế

có hoạt tính sinh học cao-mang tiềm năng phát triển trong ngành dược học Hướng đến mục tiêu ức chế sự di căn của tế bào ung thư, thông qua sàng lọc lý thuyết docking phân tử, nhận thấy nhóm Bromo tạo phức tốt, ưa nước hơn và khả năng tương tác với tế bào gây bệnh tương đối cao hơn các nhóm thế thông thường, các hợp chất này mang hoạt tính sinh học nổi bật như kháng viêm, kháng khuẩn, nấm,

kháng oxy hóa, ức chế enzyme α-glucosidase ở người [5] Đây là lĩnh vực luôn luôn

mới mẻ và thú vị, thu hút nhiều nhà khoa học khám phá các hoạt tính của coumarin

và các dẫn xuất liên quan Các dẫn xuất coumarin mang nhóm thế ở vị trí số 3 chưa

có nghiên cứu so với các nhóm thế ở vị trí khác đã có nhiều công trình nghiên cứu

thành công được công bố trên tạp chí quốc tế và trong nước Từ những tính chất nổi bật nêu trên, chúng tôi mong muốn tổng hợp dẫn xuất Bromo ở vị trí số 3 (C-3) từ nguyên liệu ban đầu là 7-diethylamino-4-methyl coumarin và thử nghiệm hoạt tính

sinh học trong in vitro

1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Đưa ra các dự báo tin cậy trong lĩnh vực sàng lọc ảo hoạt tính sinh học định hướng tổng hợp và áp dụng

1.2.2 Về mặt thực tiễn

- Góp phần vào phát triển thuốc và biệt dược, phát triển các thuốc điều trị ung thư hướng đích và các thuốc điều trị bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn, nấm, các bệnh rối loạn chuyển hóa hiệu quả Từ đó giúp tiết kiệm chi phí, thời gian và nhân lực cho dự án

2 Mục tiêu

2.1.Mục tiêu tổng quát

- Tổng hợp mới dẫn xuất coumarin mang nhóm thế Bromo ở C-3 từ

7-diethylamino-4-methyl coumarin, thử nghiệm hoạt tính sinh học trong in vitro theo

mô hình molecular docking model

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Tổng hợp các dẫn xuất coumarin mang nhóm thế Bromo ở vị trí C-3 từ diethylamino-4-methyl coumarin thông qua phản ứng Brom hóa

7 Nghiên cứu mô hình docking phân tử để đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư,

kháng khuẩn, nấm, kháng viêm, ức chế emzym α-glucosidase

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Nội dung 1: Tổng hợp dẫn xuất coumarin từ 7-diethylamino-4-methyl coumarin

- Cách tiếp cận: Đọc tài liệu, xây dựng qui trình thực nghiệm, tiến hành thực

nghiệm dựa trên hình, thu nhận và phân tích kết quả

- Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng: Thực nghiệm dựa trên tài liệu có hiệu

chỉnh thay đổi qui trình

H-NMR,13C-NMR và HR-MS

3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu, đánh giá mô phỏng hoạt tính sinh học của dẫn

xuất coumarin trong in vitro

- Cách tiếp cận: Đọc tài liệu, tiến hành thực nghiệm dựa trên hình, thu nhận và phân

tích kết quả

- Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng: Áp dụng các gói phần mềm (tin học-

y sinh): Chemoffice, Avogadro, AutoDockTools-1.5.6rc3, Discovery Studio 2021 Client, Molegro Molecular Viewer để giải thích toàn diện mối quan hệ cấu trúc hoạt tính ligand với các dòng tế bào ung thư, kháng khuẩn, nấm, kháng viêm, ức chế

enzym α-glucosidase

- Kết quả dự kiến: Các giá trị năng lượng tối ưu của các cấu trúc, giá trị ΔG của các

phản ứng ligand-receptor của hợp chất, hình minh họa

4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu

Nội

dung Công việc thực hiện Kết quả phải đạt (bắt đầu, kết thúc) Thời gian

1

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

của dumg môi, nhiệt độ, tỷ lệ mol, xúc tác PEG-400 đến hiệu

suất của các phản ứng

Bảng kết quả, yếu tố phù hợp cho quá trình tổng hợp

1.5 tháng

1

Tổng hợp (diethylamino)-4-methyl-2-

3-bromo-7-thioxo-2H-chromen-2-one

Sản phẩm tinh

3

Bộ dữ liệu Phân tích hóa lý của

dẫn xuất: IR, NMR, HR-Mass Cấu trúc phù hợp với dự đoán 1 tháng

3

Áp dụng các gói phần mềm công

cụ mạnh (tin học- y sinh):

Chemoffice, Avogadro, AutoDockTools-1.5.6rc3, Discovery Studio 2019 Client,

Molegro Molecular Viewer và

Gromacs để giải thích toàn diện

(in silico molecular docking

docking model) mối quan hệ cấu

trúc hoạt tính ligand (hợp chất

hữu cơ) và receptor (dòng tế bào

ung thư, khuẩn, nấm, kháng oxi

hóa)

Các giá trị năng lượng tối ưu của các cấu trúc; Giá trị ΔG của các phản ứng ligand-receptor của 5 cấu trúc; Hình min họa

1.5 tháng

5 Đánh giá các kết quả đã được và kết luận

Tổng hợp và nhận danh thành công dẫn xuất methyl coumarin với nguyên liệu ban đầu là 7-(diethylamino)-4-methyl coumarin thông qua phản ứng Brom hóa với thời gian phản ứng ngắn, nhiệt độ thấp, hiệu suất cao (91%)

3-Bromo-7-(diethylamino)-4-Ligand Cou-Br đã thực hiện sàng lọc ảo với các đại phân tử protein và enzyme

(receptor) của các dòng tế bào: tế bào ung thư vú, MCF-7; tế bào ung thư gan,

HepG2; tế bào ung thư vân cơ, RD; tế bào ung thư phổi, LUNG; enzyme glucosidase, 4J5T:PDB, nấm Cadida albicans, 6KAZ:PDB; kháng khuẩn

α-Escherichia coli, 6VYL:PDB và kháng viêm, 4WCU:PDB Ligand Cou-Br phản

ứng tốt với receptor của các dòng tế bào trên và có thể trở thành thuốc phân phối tiềm năng

Còn với tế bào ung thư gan, HepG2; ung thư vân cơ RD và khuẩn

Escherichia coli, 6VYL:PDB do không thể tiến hành thực nghiệm các nghiên cứu

trong in vitro nên hoạt tính ức chế không cao

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

6.1 Tóm tắt kết quả ( Tiếng Việt)

Tổng hợp thành công hợp chất chromen-2-one) với hiệu suất cao 91% Cấu trúc của dẫn xuất này cũng đã được xác định bằng phương pháp hóa lý hiện đại như FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

(3-bromo-7-(diethylamino)-4-methyl-2H-1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp DEPT 90, 135, CPD và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: COSY (H, H), HMBC và HSQC để xác định vị trí brom thế vào khung coumarin và xác nhận sự phù hợp với cấu trúc của dẫn xuất Sau đó thực hiện docking ligand này trên các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), gan (HepG2), vân cơ

(RD); ức chế enzyme α-glucosidase và kháng nấm Candida albicans Kết quả sàng lọc ảo trong in vitro trên các dòng tế bào ung thư ở người, cho thấy hợp chất (3-

bromo-7-(diethylamino)-4-methyl-2H-chromen-2-one) có khả năng ức chế mạnh

đối với tế bào ung thư tuyến vú, ung thư phổi, ức chế enzyme α- glucosidase, kháng nấm Candida albicans và kháng viêm

6.2 Tóm tắt kết quả ( tiếng Anh)

The (3-bromo-7-(diethylamino)-4-methyl-2H-chromen-2-one) synthesized sucessfully with the yield reaction was 91% The structure of this derivative has also been determined by physical chemistry such as infrared, FT-IR, nuclear magnetic resonance spectroscopy: 1H-NMR, 13C-NMR, combined DEPT 90, 135, CPD and 2D nuclear magnetic resonance spectroscopy: COSY (H, H), HMBC and HSQC to determine the substituent bromine position in the coumarin framework and confirm the concordance of the derivative's structure This ligand was then

docked on breast (MCF-7), liver (HepG2), and musculoskeletal (RD) cell lines; glucosidase enzyme inhibitor and antifungal Candida albicans Results of virtual screening in in vitro on human cancer cell lines, showed that compound (3-bromo-

α-7-(diethylamino)-4-methyl-2H-chromen-2-one) has the ability to inhibit strong in

breast cancer cells, lung cancer cells, inhibiting the enzyme α-glucosidase, fungal Candida albicans and anti-inflammatory

anti-III Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo

3.1 Kết quả nghiên cứu ( sản phẩm dạng 1,2,3)

2 Dự thi Eureka 2021 Bài dự thi Eureka cấp

trường và Tp.HCM Đã hoàn thành

Ghi chú:

- Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chỉ được

chấp nhận nếu có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn trường ĐH Công Nghiệp Tp HCM đã

cấp kính phí thực hiện nghiên cứu theo đúng quy định

- Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm trong phần phụ lục minh chứng ở cuối

báo cáo (đối với ấn phẩm là sách, giáo trình cần có bản photo trang bìa, trang chính

và trang cuối kèm thông tin quyết định và số hiệu xuất bản)

3.2 Kết quả đào tạo

TT Họ và tên

Thời gian thực hiện đề tài

- Kèm bản photo trang bìa chuyên đề nghiên cứu sinh/ luận văn/ khóa luận và

bằng/giấy chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành

công luận án/ luận văn;( thể hiện tại phần cuối trong báo cáo khoa học)

IV Tình hình sử dụng kinh phí

T

Kinh phí được duyệt

(triệu đồng)

Kinh phí thực hiện

(triệu đồng)

Ghi chú

A Chi phí trực tiếp

2 Nguyên, nhiên vật liệu, thiết bị, máy móc, … 9.6 9.6

V Kiến nghị ( về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)

Tổng hợp thêm các dẫn xuất coumarin mang thế brom, so sánh sự khác nhau và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng

Tiếp tục sàng lọc in vitro với tế bào ung thư vú, nấm Cadida albicans, kháng khuẩn Escherichia coli, kháng viêm và kháng enzyme α – glucosidase

Vì điều kiện môi trường, nhiệt độ,… không đáp ứng được yêu cầu nên phản ứng Ginard khó xảy ra, cần nghiên cứu hướng mới để có thể tổng hợp được dẫn xuất coumarin mang nhóm thế acid để có thể nghiên cứu sâu hơn và có tính ứng dụng cao trong cuộc sống

VI Phụ lục sản phẩm ( liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

(Đã đính kèm ở phần III)

Tp HCM, ngày 21 tháng 4 năm 2022

Trưởng (đơn vị) (Họ tên, chữ ký)

Lê Thị Thanh Trúc

PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

(báo cáo tổng kết sau khi nghiệm thu, đã bao gồm nội dung góp ý của hội đồng nghiệm thu)

1 Tổng quan

1.1 Khái niệm về coumarin

1.1.1 Giới thiệu về coumarin

Coumarin (2H-chromen-2-one) là một chất hữu cơ thơm thuộc nhóm chất benzopyrone Hợp chất benzopyrone gồm một vòng benzen kết hợp với một vòng

pyrone, có hai loại thường gặp là benzo-α-pyrone thường được gọi là coumarin và benzo-γ-pyrone thường được gọi chromone [6] Coumarin tồn tại nhiều trong các

loài thực vật: Cỏ mực, Ba dót, Bạch chỉ, Sài đất, Mù u, Hoàng kỳ, Cúc La Mã, Quế…

Hình 1.1 Cấu trúc chung của coumarin

Coumarin thuộc nhóm các hợp chất phenol nhưng phần lớn các nhóm OH phenol được ether hóa (thay -H bằng nhóm -CH3 hay bằng mạch terpenoid có từ 1-3 đơn vị isoprenoid) Trong tự nhiên, coumarin ít tồn tại dưới dạng glycosid, nếu có thì mạch

cũng thường đơn giản, hay gặp là glucose.[6]

Coumarin ban đầu được coi là một dẫn xuất benzoic acid, nhưng sự tổng hợp bởi

Sr WH Perkin [7-8] từ salicylaldehyde bằng phản ứng cổ điển đã thiết lập mối quan

hệ với acid o-hydroxycinnamic, làm mất một phân tử nước tạo vòng lacton Ngoài

ra, các công thức và danh pháp khác nhau đã được đề xuất theo các công trình nghiên cứu tiếp theo sau đó Trong số các cấu trúc phân tử được đề xuất bởiPerkin-

1868 (I), Basecke-1870 (II), Strecker-1867, Fittig-1868, và Tiemann-1877 (III),Salkowski-1877 (IV), Morgan và Micklethwait-1906 và Clayton-1906 (V), công thức phân tử III đã chứng tỏ là hoàn toàn phù hợp với các phản ứng đã biết của dẫn xuấtcoumarin và đã được chấp nhận rộng rãi [9]

Hình 1.2 Công thức coumarin 1.1.2 Tính chất vật lý [10]

Coumarin có dạng tinh thể từ không màu đến trắng, dễ thăng hoa, có mùi thơm

Có tỷ trọng 0.935 g/cm3 (20°C (68°F)), điểm sôi 301.71°C (575.08°F, 574.86oK)

Ở dạng kết hợp glycosid thì có thể tan trong nước, ở dạng aglycon thì dễ tan trong dung môi kém phân cực Các dẫn xuất coumarin có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại Cường độ huỳnh quang phụ thuộc nhóm oxy của phân tử coumarin cũng như pH của dung dịch Khả năng cho huỳnh quang mạnh nhất là nhóm OH ở

H2SO4 trong cồn thì thường kèm theo sự dehydrat hóa và có sự biến đổi cấu trúc, ví

dụ visnadin tạo thành 3’ceto, 3, 4’ dihydroseselin

Coumarin gắn được brom ở nhiệt độ lạnh tạo thành dibromid Chất này dễ bị cắt

tạo HBr và cho dẫn chất 3-bromcoumarin

Do hiệu ứng liên liệp của dây nối đôi ở vị trí 3-4 với nhóm carbonyl nên tạo ra trung tâm ái điện tử ở carbon Do đó coumarin có thể tác dụng với một số chất lưỡng cực Ví dụ với kali cyanur thì tạo thành 4-cyanohydrocoumarin

Benzen khi có mặt AlCl3 không tác dụng với các coumarin nhóm 1, còn với furocoumarin thì xảy ra sự mở vòng furan và tạo thành dẫn chất 6 (1', 2' diphenylethyl)-7 hydroxy coumarin

Hình 1.3 Phản ứng của furocoumarin có mặt của benzene và AlCl3

- Tác dụng chữa bệnh bạch biến, lang trắng hoặc bệnh vảy nến Tính chất này chỉ có

ở những dẫn xuất furanocoumarin như psoralen, angelicin, xanthotoxin

- Một số có tác dụng chống viêm như calophylloid trong cây Mù u

- Một số có tác dụng chống ung thư như daphneticin và cleomiscosin

- Ngoài ra, hàng loạt các chất coumarin trong tự nhiên và trong tổng hợp thí nghiệm, người ta nhận thấy rằng đối với coumarin nhóm 1, nếu OH ở C-7 được acyl hóa thì tác dụng chống co thắt tăng, gốc acyl có 2 đơn vị isopren (ví dụ geranyloxy) thì tác dụng tốt nhất Đối với nhóm psralen, nếu nhóm hydroxy, methoxy hay isopentenyloxy ở vị trí C-5 hay C-8 thì tăng tác dụng Đối với nhóm angelicin, nếu có methoxy ở C-5 hay C-6 cũng tăng tác dụng Những dẫn chất acyldihydrofuranocoumarin và acyldihydropyranocoumarin thì tác dụng chống co thắt rất tốt, nhóm acyl ở đây tốt nhất có 5 carbon, nếu kéo dài mạch carbon thì tác dụng bị hạ thấp

1.1.5 Các phương pháp tổng hợp coumarin

Vòng coumarin hình thành nhờ phản ứng ngưng tụ aldol giữa o-rtho

hydroxybenzaldehyde với anhydride acetic có mặt xúc tác natri acetate

a) Phản ứng Pechmann

Pechmann [12] chỉ ra rằng dẫn xuất coumarin được hình thành khi hỗn hợp của một phenol và acid malic được làm nóng với sự hiện diện của acid sulfuric đậm đặc

Hình 1.4 Phản ứng tổng hợp coumarin của Perkin

Sau đó Pechmann và Duisberg [13] phát hiện ra rằng các phenol có thể ngưng tụ

với các ester β-ketonic trong sự hiện diện của acid sulfuric đối với các dẫn xuất

coumarin

Hình 1.5 Phản ứng ngưng tụ với các ester β-ketoester

Đây là phương pháp đơn giản và thường được sử dụng để tổng hợp các coumarin

từ các dẫn xuất của phenol và các ester β-keto hoặc acid cacboxylic chưa bão hòa

Thông thường, phản ứng Pechmann cũng được thực hiện với sự có mặt của phosphorous pentoxide, acid trifluoroacetic và nhôm clorua Các muối chloride của kim loại ZnCl2, TiCl4, InCl3, triflates, acid sulfonic và chất lỏng ion được nghiên cứu để tạo ra các dẫn xuất 7-hydroxycoumarin có hiệu cao ở nhiệt độ thường

b) Phản ứng Friedel-Crafts

Bert [14] đã phát triển một phương pháp chung cho tổng hợp coumarin, trong đó bao gồm ngưng tụ phenolic với CH2ClCH=CHCl hoặc bằng phản ứng Friedel-Crafts trong sự hiện diện của bột kẽm để thu được ROC6H4CH2CH=CHCl, cũng có thể được tổng hợp bằng cách cô đặc CH2ClCH=CHCl với ete bromophenolic qua phản ứng Grignard Điều này sau đó được chuyển đổi thành coumarin tương ứng theo hai cách

Hình 1.6 Phản ứng Friedel-Crafts c) Phản ứng Knoevenagel

Là phản ứng ngưng tụ của aldehyde với hợp chất methylene hoạt động khi có mặt ammonia hoặc amine Xúc tác thường sử dụng trong phản ứng là base, hoặc hỗn hợp của amine và acid carboxylic, hoặc acid Lewis trong môi trường đồng thể Khi sử dụng xúc tác là acid malonic hoặc pyridine thì gọi là sự kết hợp Doebbner [15]

Hình 1.7 Phản ứng Knoevenagel 1.2 Nghiên cứu docking phân tử

Sàng lọc ảo như một phần quan trọng của nghiên cứu, hỗ trợ giải thích về hoạt

tính sinh học trong in vitro, có rất nhiều công cụ sàng lọc ảo như Autodock, Vina

dock, Schrodinger Với nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn công cụ Autodock Nó

sẽ sử dụng giao diện người dùng đồ họa được gọi là AutoDockTools hoặc ADT, giúp người dùng dễ dàng thiết lập hai phân tử để docking (liên kết receptor và ligand) [16] Autodock tính toán dựa trên cơ học phân tử cụ thể docking sử dụng thuật toán di truyền Lamarckian và hàm năng lượng tự do thực nghiệm [17]

Friedrich Miescher đã cô lập được DNA lần đầu tiên vào năm 1869 Francis Crick

và James Watson nhận ra cấu trúc phân tử chuỗi xoắn kép của nó vào năm 1953, dựa trên mô hình xây dựng từ dữ liệu thu thập qua ảnh chụp nhiễu xạ tia X do Rosalind Franklin thực hiện

Theo đó, docking là một phương pháp tính toán dựa trên các phần mềm dùng để nghiên cứu khả năng gắn kết của một hay nhiều phân tử hay cấu tử (ligand) lên điểm tác động của cấu trúc không gian 3 chiều các đại phân tử như protein (receptor, enzyme, …) Các nghiên cứu docking phân tử được sử dụng để xác định

sự tương tác giữa hai phân tử và tìm định hướng tốt nhất của phối tử có thể hình thành phức hợp với năng lượng tối thiểu Các phân tử nhỏ được gọi là phối tử thường phù hợp trong hốc của protein, các hốc protein này trở nên hoạt động khi tiếp xúc với bất kỳ các hợp chất bên ngoài và do đó được gọi là điểm tác động Các kết quả được phân tích bằng một chức năng tính điểm thống kê chuyển năng lượng tương tác sang các giá trị số gọi là điểm docking Hình dạng 3D của các phối tử bị liên kết có thể được hình dung bằng cách sử dụng các công cụ khác nhau như Pymol, Rasmol… có thể giúp suy luận sự phù hợp nhất của phối tử Dự đoán chế độ tương tác protein-ligand có thể giả thiết vị trí hoạt động của phân tử protein

và giúp chú thích protein tốt hơn [18]

Hình 1.8 Mô phỏng sự tương tác tạo liên kết giữa ligand và protein

Mục tiêu của phương pháp này là cho phép phân tử cơ chất được dịch chuyển trong không gian xung quanh vùng hoạt động dự đoán của protein Một ligand dẫn truyền thuốc tốt là một ligand nhận diện đủ ba vùng: vùng nhận diện protein (vòng thơm, dị vòng, …) thông qua các amino acid, vùng linker là tương tác ligand thông qua các liên kết hydrocarbon hoặc van der Waals, vùng nhận diện nhóm chức gồm các tương tác ưa nước, hydrogen, … [19]

Phương pháp thực hiện: Nghiên cứu docking của các hợp chất có hoạt tính tốt

trên tế bào ung thư trong in vitro sau đó tiếp tục thử nghiệm in silico docking

model, sự docking của các hợp chất thuốc với dòng tế bào được thực hiện bằng phần mềm AutoDock Tools Cấu trúc tinh thể của tế bào ung thư vú MCF-7 (tương ứng với mã hiệu tế bào 6VNN) được lấy từ Ngân hàng Dữ liệu Protein Data Banks

(PDB) Trước khi tính toán, protein đóng vai trò là một thụ thể (receptor) trong nghiên cứu docking đã được chuẩn bị về cấu trúc bằng cách sử dụng phần mềm Discovery studio 4.0 Hình dạng của hợp chất có hoạt tính sinh học được tối ưu hóa năng lượng bằng cách áp dụng trường lực cơ học và cấu dạng của chúng đã cực tiểu hóa năng lượng được chọn lọc cho nghiên cứu docking Phần mềm AutoDock Tools (ADT) đã được sử dụng để áp dụng cho phối tử và receptor Đối với đại phân tử protein, tất cả các phân tử không chuẩn liên quan đến protein đã bị khử bỏ (nước, ligand nhỏ, các hợp chất dị vòng, các enzyme) Các liên kết hydrogen giữa phối tử

và thụ thể được được hình thành Sau đó điện tích các nguyên tử Kollman United được phân bổ (Kollman United điện tích tính cho receptor) Đối với hợp phối tử, tất

cả hydrogens đã được thêm vào, điện tích Gasteiger (tính cho ligand) được tính toán

và hợp nhất các liên kết hydro không phân cực và cuối cùng được lưu ở định dạng file (*.pdbqt) Trung tâm hộp lưới, các bản đồ lưới và các giá trị khoảng cách điểm lưới với giá trị mặc định để tối đa hóa phân tích cấu dạng liên kết Các vị trí (pose) được tạo ra trong quá trình tính toán sẽ được đánh giá dựa trên các giá trị năng lượng liên kết cực tiểu (kcal.mol-1) Các phần mềm BIOVIA Discovery Studio và Molecule Molegro Viewer (MMV) được sử dụng để trực quan hóa và trình bày kết quả dưới dạng các hình ảnh Một tính toán cho việc ức chế enzyme BACE1 áp dụng trong việc điều trị bệnh Alzheimer được thực hiện hiệu quả bằng phần mềm Autodock [19] Một số giới hạn của phương pháp docking đã được báo cáo, chức năng hàm điểm được sử dụng để đánh giá sự phù hợp vị trí docking tốt nhất cho liên kết protein và ligand Tất cả các chương trình docking đều có thể tạo ra các cấu trúc phối tử tương tự như các cấu trúc phức hợp protein được xác định về mặt tinh thể học cho ít nhất một trong các mục tiêu Các chương trình lập dữ liệu xác định các hợp chất hoạt động từ một nhóm các hợp chất mồi nhử có liên quan đến dược phẩm; tuy nhiên, không có chương trình nào hoạt động tốt cho tất cả các mục tiêu Đối với dự đoán về ái lực hợp chất, không có chương trình docking nào hoặc chức năng hàm điểm nào đưa ra dự đoán hữu ích về ái lực ligand-phối tử [16] Một số kết quả docking hiệu quả: các dẫn xuất aminothiazole có tác dụng dược lý mạnh như

chất ức chế FabH đối với hoạt tính kháng khuẩn: tiếp cận in vitro và trong silico

docking [20] Tổng hợp đặc tính và docking phân tử của các dẫn xuất Thiazole có hoạt tính sinh học mới như là một loại thuốc chống khối u gây độc tế

Thiazolyl-bào đầy tiềm năng [21] Một nghiên cứu trong in vitro và vio của quinoliniumolate

và 2H-1,2,3-Triazole trích ly từ thân của Paramignya trimera và các hoạt tính ức chế α-Glucosidase [22] rGO-SO3H tổng hợp xanh xúc tác cho tổng hợp cho dẫn xuất thế Floro của Aminomethylene Bisphosphonates Fluoro và các nghiên cứu về Docking phân tử kháng tế bào ung thư [23] Dựa trên những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu mô hình docking phân tử của dẫn xuất Brom-Coumarin đối

với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (6VNN) [24], ung thư gan HepG2 (2G33) [25] ,

ung thư vân cơ RD (1P9M) [26] , ung thư phổi LUNG (4ASD) [34], ức chế enzyme

α-glucosidase (4J5T) [27], dòng tế bào kháng khuẩn Escherichia coli (6VYL) [28]

, kháng viêm (4WCU) [29] và kháng nấm Candida albicans (6KAZ) [30], từ đó

đánh giá hoạt tính sinh học trong in vitro, sử dụng các phần mềm công cụ như:

Autodock, Discovery Studio, Avogadro và Molego Molecular Viewer

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo Trần Quang Thịnh [31] đã báo cáo về việc tổng hợp thuốc nhuộm huỳnh quang dựa trên các dẫn xuất coumarin Kết quả cho thấy hợp chất này 7- (diethylamino) -3- (thieno [3,2-b] thiophen-2-yl) -2H-chromen-2-one (Cou-TT), với bước sóng phát xạ ở 508nm (nhìn thấy), đây là một trong những thuốc nhuộm huỳnh quang tiềm năng cho phát triển các đầu dò huỳnh quang

Năm 2016, Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự [32] đã thực hiện tổng hợp một số dẫn xuất coumarin theo phương pháp không dung môi trong lò vi sóng bằng phản ứng cộng hợp nucleophin với các amin khác nhau, cho hiệu suất đạt từ 55- 70% Các sản phẩm coumarin cũng đã được khảo sát hoạt tính sinh học, kết quả cho thấy các sản phẩm tổng hợp được đều có tính kháng khuẩn, chống nấm cao

Theo Trịnh Hoàng Dương (2016) [33] đã phân lập bốn coumarin là ostruthin, methoxyostruthin, 7-hydroxycoumarin và 7- methoxycoumarin cùng với bốn acridon alkaloid là oriciacridon, 5-hydroxynoracronycin, citruscinin-I và glycocitrin-III từ rễ cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 sử dụng phương pháp sulforhodamin B cho thấy các hợp chất này có hoạt tính yếu với IC50 từ 30.53 đến 62.90 µg/mL

8-Theo Nguyễn Thị Mỹ Nương (2016) [34] đã điều tra độc tính tế bào có chọn lọc của Nam Địa Long trên một số dòng tế bào ung thư như MCF-7, Hep G2, NCI-H460 và các nguyên bào sợi bình thường Kết quả là Nam Địa Long gây độc tế bào trên tất cả các tế bào khối u và tế bào bình thường, với tác dụng cao nhất trên tế bào MCF-7 Giá trị SI cho MCF-7, Hep G2 và NCI-H460 lần lượt là 6.45, 1.61 và 1.29 cho thấy khả năng gây độc tế bào chọn lọc cao của Nam Địa Long về phía MCF-7 Năm 2017, Nguyễn Trung Nhân và các cộng sự [22] đã nghiên cứu chất dẫn xuất quinoliniumolate và 2H-1,2,3-Triazole từ dịch chiết hòa tan CHCl3 của thân cây

Paramignya trimera và hoạt động ức chế α-Glucosidase trong in silico Cấu trúc của

chúng được làm sáng tỏ dựa trên việc giải thích dữ liệu quang phổ, hợp chất có hoạt

động ức chế α-glucosidase, với giá trị IC50 là 137.9 μM.

Năm 2018, hai isoprenoid, blumenol A, vomifoliol 9-O-β-D-glucopyranoside và

một coumarin là cleomiscosin A được tách ra từ các dịch chiết hữu cơ của lá, thân

và rễ loài Brucea mollis Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D NMR và phổ khối lượng MS [35]

Năm 2019, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thúy Hằng [36] đã tổng hợp và đánh giá hoạt động sinh học của các dẫn xuất Pyrazole mới sở hữu cả dược chất Coxib và Combretastatins thông qua chuỗi phản ứng ngưng tụ Claisen-Knorr, cho thấy rằng việc kết hợp các nhóm dược lý quan trọng của hai phân tử gốc celecoxib và combretastatin A-4 đóng vai trò rất lớn trong việc xác định các hoạt động sinh học tốt hơn của các hợp chất lai coxib mới

Năm 2020, nhóm tác giả [37] đã tổng hợp, nghiên cứu ức chế enzyme

α-glucosidase và gắn kết phân tử của các dẫn xuất hydrazide cho thấy N-substituted

có sự ức chế mạnh hơn so với ban đầu Nghiên cứu này cho thấy rằng những hợp chất này có nhiều hứa hẹn phân tử cho liệu pháp điều trị bệnh tiểu đường

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Ravi và các cộng sự (2016) [38] đã tổng hợp, đánh giá hoạt động chống viêm trên Vivo và nghiên cứu về các dẫn xuất Isatin mới Các hợp chất tổng hợp được đặc trưng bởi FT-IR, 1H-NMR, dữ liệu phổ khối và được sàng lọc về hoạt tính

chống viêm in vivo bằng phương pháp gây phù chân bằng carrageenan Các hợp

chất được thử nghiệm cho thấy hoạt động chống viêm từ nhẹ đến trung bình và có thể so sánh với tiêu chuẩn Chất ức chế COX-2 celecoxib

Tatamiya và các cộng sự (2017) [39] đã tổng hợp, đánh giá hoạt tính của mustard coumarin trong ống nghiệm và hoạt động chống lại các dòng tế bào ung thư ở người (PC-3) Trong số các hợp chất này được sàng lọc, ba hợp chất NT-2g, NT-2f và NT-2e cho thấy GI50 nằm trong khoảng từ 80 đến 95 µg/ml Tất cả các hợp chất cho thấy hoạt động chống ung thư từ trung bình đến tốt

N-Một loạt các coumarin mới liên kết với các dẫn xuất pyrimidine đã được tổng hợp thông qua chiếu xạ vi sóng đã được Soniya và các cộng sự (2018) [40] thực hiện tổng hợp Cấu trúc của các hợp chất tổng hợp được phân tích bởi IR, 1H-NMR,

13C-NMR, GC-MS và CHN Sau đó sàng lọc các hoạt tính chống vi khuẩn và chống

ung thư (dòng tế bào Hela và A549) (in vitro) Kết quả nghiên cứu cho thấy hầu hết

các hợp chất có hoạt tính ức chế sự phát triển của sinh vật gây bệnh, các dẫn xuất coumarin-pyrimidine được tổng hợp là đầy hứa hẹn trong các hệ thống phân phối thuốc, có thể được sử dụng để điều trị ung thư

Kumar và các cộng sự (2018) [41] khám phá các dẫn xuất Coumarin như một chất ức chế mạnh nhiều loại protein bao gồm EGFR, tyrosine kinase, ERK1/2, PI3K, HSP 90, Bax, protein STAT, NF-KB và telormerase có liên quan đến ung thư phổi

Manoj và cộng sự (2019) [42] đã phát hiện các phân tử dị vòng được đánh giá là

có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Các mô hình dị vòng đơn giản và nhỏ hoạt động như chất ức chế α-glucosidase đầy tiềm năng và có thể dẫn đến việc

kiểm soát tình trạng tăng đường huyết sau ăn trong bệnh đái tháo đường típ 2

Goud và các cộng sự (2020) [43] cho rằng coumarin là một trong những nền tảng được sử dụng rộng rãi nhất để phát triển các chất chống ung thư mang lại hiệu quả cao Một số dẫn xuất coumarin đã được phát triển để chống lại Galectin-1 (Gal-1), anhydride cacbonic (CAs), protein Tubulin và các mục tiêu thiết yếu khác để điều trị ung thư

Jaskiran và các cộng sự (2020) [44] đã ứng dụng y sinh của 4-hydroxy coumarin như một chất chuyển hóa từ nấm và các dẫn xuất của nó Tiềm năng của chất này như một chất chống ung thư, chống viêm nhiễm, hạ sốt và kháng khuẩn

Coumarin phytochemical và các dẫn xuất của nó đã được nhóm tác giả (2020) [45] chú ý với đặc tính ức chế sinh học rộng, bao gồm các hoạt động kháng khuẩn Các nhóm thế ở vị trí C3 và C4 của coumarin được ưu tiên cho sự phát triển thành các chất kháng khuẩn mới hơn

2 Nội dung và phương pháp

2.3 Thiết bị

Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S Hệ thống cô quay với công suất cần được cung cấp là 1400W, nhiệt độ tối đa 250oC, tốc độ quay 0-280 rpm Máy UV-Vis dùng cho bản mỏng TLC có bước sóng 365/254 nm, công suất: 2 đèn

x 15W, nguồn điện: 220-240V/50Hz Máy quang phổ Bruker (Tensor 27)-KBr (disk), máy Bruker AM500, máy quang phổ khối lượng micrOTOF-Q II-ESI-Qq-TOF

2.4 Tiến hành thí nghiệm

Cho 10g (0.04mol) 7-(diethylamino)-4-methyl coumarin tinh khiết và 50ml

CHCl3 vào bình cầu hai cổ, khuấy tan hoàn toàn trên bếp khuấy từ, dùng ống nhỏ giọt cho dung dịch gồm 7,72g (0.04mol) NBS trong 100ml CHCl3 vào bình cầu và tiếp tục khuấy Theo dõi phản ứng bằng cách chấm sắc ký bản mỏng sau mỗi 15-30 phút Phân lập sản phẩm bằng sắc ký cột: Cột sắc ký có đường kính 5 cm và chiều cao silicagel trong cột là 50 cm Hệ dung môi triển khai cột Ethyl Acetate: Hexane (2:10 = VEA: VHexane) Tiến hành nhồi cột và chạy cột, triển khai hệ 100% n-Hexane

để thẩm thấu hết cột, cho dung môi chảy đến vừa ngang mực silicalgel thì khóa cột lại và cho mẫu dung dịch coumarin thô trong clororform vào Đến khi dung dịch coumarin vừa ngang mực silicagel thì cho bông gòn vào, rồi cho hệ dung môi chạy cột đã khảo sát TLC Thu và kiểm tra các phân đoạn, sau đó cô quay chân không để thu coumarin tinh khiết.[46]

những cách tính toán phức tạp [47] Phổ FT-IR được sử dụng để phân tích các hợp

chất hữu cơ là phổ biến nhất Bức xạ hồng ngoại thì không có đủ năng lượng hiệu quả để gây nên kích thích electron, nhưng nó là nguyên nhân làm cho những nguyên tử, nhóm nguyên tử trong những hợp chất hữu cơ dao động nhanh hơn của các liên kết cộng hóa trị liên kết với nhau Những dao động này thì được định lượng

và chúng xuất hiện, những hợp chất hấp thu năng lượng IR trong những vùng riêng

biệt của phổ Vùng phố hồng ngoại có thể chia làm 3 vùng trong bảng 3.1 như sau:

Tần số của một giao động giãn và vị trí của nó trong phổ IR liên quan đến hai hệ

số Khối lượng của những nguyên tử liên kết là các nguyên tử nhẹ sẽ dao động ở tần

số cao hơn so với một nguyên tử nặng hơn và liên quan đến sự cứng nhắc của liên kết Liên kết ba thì cứng hơn và dao động ở tần số cao hơn những liên kết đôi và liên liên kết đôi thì cứng hơn liên kết đơn (dao động ở tần số cao hơn) Tần số dao động giãn của nhóm liên quan đến hydro như: C-H, N-H, O-H luôn luôn xuất hiện ở tần số cao

Bảng 2.2 Tần số dao động của một vài nhóm chức

ra trong phân tử khi tương tác với bức xạ điện từ Năng lượng cần thiết cho NMR là trong phạm vi tần số radio của phổ điện từ và năng lượng cần thiết thì thấp hơn hơn nhiều năng lượng cần thiết bởi các phương pháp phổ học khác Do khó khăn trong

tái sản xuất từ trường đủ chính xác cho phổ NMR, một chuẩn nội được sử dụng như

là một điểm tham chiếu Vị trí của một tín hiệu NMR được đo liên quan đến sự hấp thu của chuẩn Tetramethyl Silan (TMS) (CH3)4Si, là chuẩn cho phổ 1H và 13C NMR Độ dời hóa học được đo ở tần số (Hz) tương ứng với một vị trí của tín hiệu liên quan đến TMS Thông thường chuyển đổi tần số thành giá trị  (ppm) bằng cách chia tần số độ dời hóa học với tần số của máy phổ Sự chuyển đồi này cho ra một kết quả quan trọng, độ dời hóa học là độc lập với tần số của máy phổ Độ dịch chuyển hóa học cho biết vị trí của tín hiệu đo [47]

; M = mega= million

Đa số các hợp chất hữu cơ đều có các proton hấp thu trong khoảng 0-12 δ ppm trong vùng từ trường thấp so với TMS và các 13C hấp thu trong khoảng 1-220 δ ppm trong vùng từ trường thấp so với TMS Phổ 1H-NMR cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử và cũng cho biết mỗi loại proton đó có bao nhiêu nguyên

tử H Mỗi một loại proton trong phân tử cho một mũi cộng hưởng (mũi đơn) hoặc bị chẻ tách thành nhiều mũi cộng hưởng (mũi đa) Sự chẻ mũi này được gọi là sự spin-spin hoặc sự ghép cặp do các proton ở kề bên đã tương tác lên proton đang khảo sát,

số lượng mũi bị chẻ tách tuân theo quy luật n+1 và có diện tích tương đối theo tỉ lệ

của tam giác Pascal Hằng số ghép (J), đơn vị đo tính bằng Hertz (Hz), là khoảng

cách giữa hai proton ở kề bên ghép từ với nhau trên phổ 1H-NMR tạo tín hiệu là mũi đôi Do hai proton này ghép từ với nhau (còn gọi là tách spin-spin) nên khoảng cách giữa các mũi đôi trong các tín hiệu của hai loại proton này sẽ bằng nhau Các hằng số ghép thường có giá trị trong khoảng 0-18 Hz Phổ 13C-NMR cho thông tin quan trọng về khung sườn cacbon của hợp chất hữu cơ Hạt nhân đồng vị C-13 có

từ tính nên có thể truy suất được trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân Vì hàm lượng đồng vị C-13 rất thấp nên độ nhạy trong phổ NMR của hạt nhân 13C so với của proton 1H vào khoảng 1/5700 Phổ 13C-NMR có các đặc điểm khác với phổ 1H-NMR như: mỗi cacbon riêng biệt chỉ cho một tín hiệu mũi đơn duy nhất, không có

sự chẻ mũi Trong một thực nghiệm DEPT, các tín hiệu trong phổ NMR 13C có thể

bị nén lại hoặc đảo chiều phụ thuộc vào số proton liên kết với nguyên tử carbon và cài đặt chương trình xung Thực nghiệm DEPT (45) cung cấp một phổ NMR 13C ở

đó chỉ các nguyên tử carbon mà có các proton gắn vào các nguyên tử carbon xuất hiện Các tín hiệu do các nguyên tử carbon tứ cấp không xuất hiện Phổ cho bởi chương trình xung DEPT (90) trình bày các tín hiệu chỉ từ các nguyên tử carbon mà

có 1H liên kết với carbon Các tín hiệu từ các nguyên tử carbon có các nguyên tử hydro liên kết được quan sát trong phổ NMR 13C từ một thực nghiệm DEPT (135)

Dù gì thì các tín hiệu từ các nguyên tử carbon có 2 proton liên kết (carbon methylen

CH2) đã bị đảo chiều (mũi âm) Sự so sánh các phổ từ một bộ của các thực nghiệm DEPT cho phép chúng ta xác định số proton liên kết với mỗi nguyên tử carbon

trong một phân tử Bảng 3.12 tóm tắt thông tin mà thu nhận được từ một phổ 13C được khử ghép cặp băng rộng (broadbands decoupling) và ba phổ thực nghiệm DEPT

Bảng 2.3 Đặc tính độ dời hóa học 1H-NMR trong dung môi CDCl3

Hydrocarbon thơm (proton benzylic) (Ar-C-H) 2.2 - 3.0

Bảng 2.4 Đặc tính của các độ dời hóa học 13C-NMR trong dung môi CDCl3

Carboxylic acid, ester và amid (C=O) 160 - 180

Bảng 2.5 Hướng của các tín hiệu 13C trong các thực nghiệm NMR, DEPT

dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong một điện trường hoặc

từ trường nhất định Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã được ghi nhận sau khi đi qua bộ phận tách ion Khối phổ

đồ gồm trục x miêu tả khối lượng của ion (m/z) thể hiện dưới dạng một tín hiệu gọi

là vạch phổ hay một peak Cường độ của peak thể hiện trên trục y miêu tả hàm lương của ion đó Peak có cường độ cao nhất gọi là peak cơ sở (base peak), người ta quy ước xem cường độ của eak cơ sở là 1 hay 100%, các peak còn lại định tính ra phần trăm của peak cơ sở

2.6 Phương pháp mô phỏng hoạt tính sinh học

Dựa trên các tài liệu về docking phân tử, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình thực hiện mô phỏng docking phân tử như sơ đồ hình 3.3 Để việc đánh giá hoạt tính sinh học của các dòng tế bào ung thư, nấm, khuẩn, enzyme, điển hình là đánh giá hoạt tính kháng viêm của dòng tế bào 4WCU được lấy từ ngân hàng dữ liệu Protein Data Banks có kết quả cao, phải xác định được tâm hoạt tính trên đại phân tử của receptor được thực hiện trên phần mềm Dicovery Studio 2021 Tối ưu hóa năng lượng dựa trên phần mềm Avogadro Đối với đại phân tử này, chúng tôi nhận thấy

có 4 chuỗi A, B, C, D ứng với 4 tâm hoạt tính tương ứng A (X = 23.141, Y = 1.448, Z = -6.589), B (X = 28.471, Y = -61.251, Z = -29.144), C (X =31.593, Y= 6.367, Z= -47,066) và D (X= 17.411, Y= -54.200, Z= -69.921) Qua thực hiện

-docking với ligand Cou-Br, chúng tôi nhận thấy chỉ có 1 tâm hoạt tính của ligand C

là bền nhất vì nó có giá trị năng lượng tự do G âm nhất nên tiến hành docking với ligand đã tồn tại trong receptor 4WCU Đối với các tế bào ung thư khác cũng tính toán tương tự như dòng tế bào 4WCU bằng phầm mềm AutodockTools, Discovery Studio 2021 [48-49]

Công thức tính năng lượng tự do G như sau:

Gbind = HvdW + Hhbond + Helec + Sconf + Gdesolv [50]

Trong đó: HvdW: giá trị van der Waals

Hhbond: liên kết hydro Helec: tĩnh điện của phối tử Sconf: giá trị entropy của phối tử

Đọc target từ

Autodock

Đọc ligand từ Autodock

File tham số gird để chạy autogrid4.exe

Chuẩn bị file tham số chạy docking.exe

Thêm liên kết hydrogen phân cực

Thêm điện tích Gasteiger

Chọn ligand cho autodock

Lưu file dạng:

target.pdbqt

Chọn và mở file ligand.pdbqt

Đặt tham số tọa độ hộp lưới, khoảng cách tâm hộp lưới, (X,Y,Z)

Lưu file dạng:

dock.gpf

Chọn phân tử target.pdbqt

Chọn ligand

Xác nhận tham

số ligand

Chọn giải thuật gene

Chọn giải thuật

di truyền

Lưu file dạng : dock.dpf

Tập lệnh từ hệ điều hành DOS

Kết quả trong file: *.txt

Xây dựng kết quả bằng phần mềm: Discovery studio, Visualizer, Molegro Molecular

Viewer Tính lặp

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thực hiện mô phỏng docking phân tử

Các bước chính trong docking phân tử [51]: Bước 1 – chuẩn bị protein: Trong bước này, cấu trúc 3D của thụ thể sẽ được tải xuống từ ngân hàng dữ liệu protein PDB (Protein data bank) Sau đó cấu trúc thu được nên được xử lý trước Điều này phải chấp nhận loại bỏ phân tử nước, ion, ổn định điện tích, …theo các thông số có sẵn Bước 2 – dự đoán điểm tác động: Sau khi chuẩn bị protein, cần dự đoán điểm tác động của protein Các thụ thể (receptor) có thể có nhiều điểm tác động nhưng cần lựa chọn một trong những điểm ưa thích nhất Hầu hết các phân tử nước và các

dị tố cần được loại bỏ nếu có Bước 3 – chuẩn bị phối tử: Phối tử có thể được lấy từ nhiều cơ sở dữ liệu như ZINC, Pub chem hoặc có thể phác họa bằng công cụ Chem draw Bước 4 – Docking: Ligand được gắn với protein và các tương tác được phân tích Điểm số chức năng là điểm dựa trên cơ sở phức ligand tốt nhất được chọn

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ, thời gian phản ứng, tỉ

lệ mol đến hiệu suất phản ứng

Bảng 3.1 Bảng khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

Dung môi Nhiệt độ Thời gian Tỉ lệ mol Hiệu suất

Cloroform 60oC 2h 1:1 85% Qua các nghiên cứu đã được công bố về điều kiện phản ứng giữa coumarin và tác nhân NBS cùng với quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả tổng hợp

dẫn xuất Cou-Br cho thấy dung môi acetonitrile, cloroform có nhiệt độ và tỉ lệ mol

phản ứng là như nhau nhưng cloroform là tối ưu nhất vìthời gian phản ứng nhanh, hiệu suất phản ứng cao và dễ phân lập sản phẩm

3.2 Tổng hợp dẫn xuất 3-bromo-7-(diethylamino)-4-methyl coumarin

Tổng hợp dẫn xuất Brom-coumarin: phản ứng xảy ra trong thời gian ngắn 2 giờ,

ít tạp chất và dễ cô lập sản phẩm, phản ứng xảy ra trong điều kiện nhiệt độ thấp có khuấy từ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi Hexan:Ethyl acetate=10:2 Duy trì ổn định các điều kiện phản ứng và kiểm tra điểm dừng phản ứng bằng TLC Quan sát quá trình phản ứng cho thấy, trong thời gian vừa cho NBS vào phản ứng xảy ra tương đối nhanh khi mà chưa bắt đầu gia nhiệt, dự đoán phản ứng có thể xảy ra ở nhiệt độ thường nên không tiến hành gia nhiệt Phản ứng xảy ra trong 2 giờ, ở khoảng thời gian này cho thấy sản phẩm đậm lên rất rõ Tuy nhiên sau 1.5 giờ quan sát TLC cho thấy sản phẩm bắt đầu có sản phẩm phụ sinh ra trên đầu sản phẩm và phía dưới coumarin Tại thời điểm 110 phút dừng phản ứng và tiến hành sắc ký cột phân lập sản phẩm Sau phân lập sản phẩm thu được dẫn xuất Brom-Coumarin tinh khiết với hiệu suất 91%

Hình 3.1 Sắc kí cột, sắc kí bản mỏng và Cou-Br tinh khiết 3.3 Đặc tính hóa lí

3.3.1 Phổ FT-IR

1500 2000

2500 3000

3500 4000

Hình 3.2 Phổ FR-IR của hợp chất Cou-Br

( , cm-1): 2957 (CH, vòng thơm), 1715 (C=O), 1620, 1577, 1517 (C-O), 1409 (C=C), 1267 (C-O,C-N), 744,670 (C-Br, vòng thơm mang nhóm thế)

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất Cou-Br

Tại vị trí hấp thu cộng hưởng δH = 2.51 ppm, đây là tín hiệu mũi singlet (s)

Tại vị trí hấp thu cộng hưởng δH = 6.474 – 6.470, đây là tín hiệu mũi doublet (d)

1H-NMR (500MHz, CDCl3, d1, TMS),  (ppm): 2.51 (s, 3H, H4-CH3), 6.47 (d,

1H, J = 2.0 Hz, H8-Ar), 7.40 (d, 1H, J = 9.0 Hz, H5-Ar), 6.60 (dd, J1 = 9.5 Hz, J2 = 2.5 Hz, H6-Ar), 1.2 (t, J = 7.3 Hz, 6H, 2CH2-CH3), 3.40 (q, 4H, J = 7.2 Hz, 2CH2-

CH3)

Về cường độ tín hiệu, trên phổ 1H-NMR cho thấy có tổng cộng 6 proton được tách thành các tín hiệu với cường độ tương đối tốt Trong vùng trường mạnh xuất

hiện một tín hiệu singlet với độ chuyển dịch δ = 2.51 ppm là tín hiệu của proton H4

trong nhóm methyl của vòng thơm Ngoài ra phổ tương quan hai chiều COSY (H, H) cho thấy proton H5 ghép cặp proton H6 và proton H8, do đó sẽ cho tín hiệu

double double với độ dịch chuyển δ = 6.60 ppm và hằng số ghép cặp J 1 = 9.5 Hz, J 2

= 2.5 Hz Kết quả phân tích phổ của hợp chất được cho là phù hợp với cấu trúc dự

đoán của Cou-Br

3.3.4 Phổ 13 C-NMR

Hình 3.5: Phổ 13C-NMR của hợp chất Cou-Br

13C-NMR (125 MHz, CDCl3, d1, TMS) và DEPT,  (ppm): 12.4 (CH3, CH3-CH2

-N), 19.1 (CH3, CH3-Alyl), 44.9 (CH2), 97.4 (CH), 105.7 (C-Br), 109.13 (CH), 109.06 (C=C), 126.1 (CH), 150.6 (C-N), 151.5 (C-CH3), 154.5 (C=C), 158.1 (C=O)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR cho ra 12 tín hiệu, so với cấu trúc thiếu 2 tín hiệu Điều này được giải thích do một số vi trí carbon có tín hiệu trùng lấp với nhau

3.3.5 Phổ tương quan 2 chiều HMBC, COSY

Các tương quan phổ 2 chiều: HMBC, COSY được trình bày ở hình cho thấy tín

hiệu proton H ở 1.2 ppm (t, J = 7.3 Hz, 6H, 2CH2-CH3) tương quan với C1’, proton

H ở 3.4 (q, 4H, J = 7.2, 2CH2-CH3) tương quan với C1’, C2’, C7, C ở 2.51 (s, CH3), proton H-5 phù hợp với C4

Hình 3.6: Phổ tương quan 2 chiều COSY của hợp chất Cou-Br

Hình 3.7: Phổ tương quan 2 chiều HMBC của hợp chất Cou-Br

Hình 3.8 Các tương quan phổ 2 chiều: HMBC và COSY 3.4 Kết quả đánh giá docking phân tử

Bảng 3.2 Kết quả tính toán quan trọng trong mô hình docking của ligand, Cou-Br

với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (6VNN:PDB), ung thư gan Hep-G2

(2G33:PDB), ung thư vân cơ RD (1P9M:PDB), ung thư phổi LUNG (4ASD:PDB),

enzyme α-glucosidase (4J5T:PDB), nấm Candida albicans (6AKZ:PDB), khuẩn

Escherichia coli (6VYL:PDB), kháng viêm (4WCU:PDB)

Dòng tế bào,

ΔG (Kcal/mol)

Ki (µm)

Số liên kết hydro

Đặc tính và độ dài liên kết hydro

Cou-Br:O (3.13 Å) 3.4.1 Tế bào ung thư vú, MCF7:6VNN:PDB

Hình 3.9 Ligand cấu dạng bền nhất, Cou-Br tương tác với protein đích của dòng tế

bào ung thư vú, 6VNN:PDB

Hình 3.10 Các tương tác thuốc quan trọng giữa ligand cấu dạng bền nhất, Cou-Br

và protein đích của tế bào ung thư vú, 6VNN:PDB được trình bày trên sơ đồ 2D

Cấu dạng bền của ligand Cou-Br sau khi tính toán được chọn lựa là cấu dạng lần

23/200 lần chạy, cấu dạng này phân tích tương tác giữa ligand và receptor

6VNN:PDB Trong hình 3.9 là cấu dạng bền của Cou-Br được nhúng vào trong

receptor 6VNN cho thấy nó đã được bao phủ bởi các chuỗi protein đích Những tương tác đó được đánh giá là rất mạnh vì các giá trị năng lượng tự do của liên kết,

ΔG và hằng số ức chế Ki giữa phối tử bền nhất, Cou-Br và protein đích (MCF-7)

đã được tính toán -7.32 Kcal /mol và 4.32 µM Năng lượng Gibbs càng nhỏ thì hằng

số ức chế Ki càng nhỏ, sự liên kết giữa ligand và receptor càng bền

Hình 3.9 là ligand cấu dạng bền nhất, Cou-Br tương tác với protein đích của

dòng tế bào ung thư vú, MVCF-7:PDB Còn trong Hình 3.10, các tương tác đáng kể

đã được hình thành từ các vị trí hoạt động đến phối tử bền nhất như tương tác halogen từ ARG 394, LEU 391 tương tác với bromo của vòng phenyl, MET 388, LEU 387 và LEU 391 tương tác với nhóm methyl, các tương tác alkyl từ PHE 404,

LEU 387 liên kết với nhóm phenyl vòng thơm Tóm lại, phối tử Cou-Br đối với tế

bào ung thư vú, MCF-7 là thuốc phân phối tiềm năng vì nó xác định tốt các nhóm chức năng (thông qua liên kết hydrophilic, liên kết halogen), các tương tác Alkyl, Pi-alkyl và các tương tác Van Der Waals khác liên kết yếu với thành tế bào

3.4.2 Tế bào ung thư gan, HepG2:2G33:PDB

Hình 3.11 Tương tác giữa cấu dạng bền nhất của ligand Cou-Br và protein của

dòng tế bào ung thư gan, HepG2:2G33:PDB

Hình 3.12 Các tương tác quan trọng của cấu dạng bền nhất của ligand Cou-Br và

protein của dòng tế bào ung thư gan, HepG2:2G33:PDB được trình bày trên sơ đồ

2D

Cấu dạng bền của ligand Cou-Br sau khi tính toán được chọn lựa là cấu dạng lần 25/200 lần chạy Trong hình 3.11 là cấu dạng bền của Cou-Br được nhúng vào

trong receptor 2G33 cho thấy nó đã được bao phủ bởi cac chuỗi protein đích Liên kết này có sự thay đổi năng lượng tự do Gibbs, G = -7.17 kcal/mol và hằng số ức

chế (in silico) Ki = 5.58 μM

Hình 3.12 là các tương tác trong liên kết là tương tác Carbon Hydrogen Bond, alkyl, Pi-Donor Hydrogen Bond và van der Waals Cho thấy tương tác ligand giữa

Pi-trionin (C:128) của chuỗi amino acid với vòng thơm của Cou-Br, liên kết TRP

(C:125) tương tác với phân tử O và gốc Brom của nhóm phenyl, các liên kết van de

Waals tương tác yếu với ligand Cou-Br Do đó các tương tác quan trọng của cấu

dạng bền của ligand với protein của dòng tế bào ung thư gan HepG2 chưa hội đủ yếu tố để trở thành thuốc tiềm năng

3.4.3 Tế bào ung thư vân cơ, RD:1P9M:PDB

Hình 3.13 Tương tác giữa cấu dạng bền nhất của ligand Cou-Br và protein của

dòng tế bào ung thư vân cơ, RD:1P9M:PDB

Hình 3.14 Các tương tác quan trọng của cấu dạng bền nhất của ligand Cou-Br và

protein của dòng tế bào ung thư vân cơ, RD:1P9M:PDB được trình bày trên một sơ

đồ 2D

Cấu dạng bền của ligand Cou-Br sau khi tính toán được chọn lựa là cấu dạng lần 25/200 lần chạy Trong hình 3.13 là cấu dạng bền của Cou-Br được nhúng vào

trong receptor RD, 1P9M cho thấy liên kết này có sự thay đổi năng lượng tự do Gibbs, kcal/mol và hằng số ức chế Ki = 56.14 μM

Hình 3.14 cho thấy 2 tương tác ligand giữa trionin (A:134) của chuỗi amino

acidvới vòng thơm của Cou-Br, tương tác ligand giữa trionin (A:130) với nhóm

methylene của dây béo (CH3-CH2-N), không nhận diện được nhóm hydropholic, không có tương tác lưỡng cực halogen ,các tương tác van der Waals liên kết yếu với

ligand Cou-Br Tóm lại, phối tử Cou-Br chưa là thuốc tiềm năng vì nó không có

khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vân cơ RD:1P9M:PDB

3.4.4 Tế bào ung thư phổi, 4ASD:PDB

Hình 3.15 Ligand cấu dạng bền, Cou-Br tương tác với các tâm hoạt tính trên

receptor, protein đích, cấu trúc tinh thể của dòng tế bào ung thư phổi, 4ASD:PDB

Hình 3.16 Các tương tác giữa các amino acid của protein của dòng tế bào ung thư

phổi, 4ASD:PDB và ligand cấu dạng bền Cou-Br

Hình 3.17 Các tương tác quan trọng của ligand cấu dạng bền nhất, Cou-Br và

protein của dòng tế bào ung thư phổi LUNG, 4ASD:PDB được trình bày trên sơ đồ

Hình 3.16 cho thấy các amino acid hoạt động của protein của dòng tế bào ung

thư phổi, 4ASD: PDB hình thành xung quanh ligand cấu dạng bền Cou-Br Hình

3.17 là các tương tác trong liên kết là tương tác Carbon Hydrogen Bond, Pi-alkyl, Pi-Pi T-shapped, Pi-Sigma và van der Waals Cho thấy các tương tác đáng kể đã được hình thành từ các vị trí hoạt động đến phối tử bền nhất như tương tác Pi-Sigma chuỗi A của LEU 1035, tương tác Pi-Pi T-shapped chuỗi A của PHE 1047, tương tác Pi-Alkyl chuỗi A của VAL 916, VAL 899, VAL 848, ALA 866, LEU

840 Tiếp đến nhận diện được nhóm Alkyl qua tương tác Carbon Hydrogen Bond của ASP 1046 với CH2-CH3-N Tóm lại, phối tử Cou-Br đối với tế bào ung thư

phổi, 4ASD:PDB là thuốc phân phối tiềm năng vì nó xác định tốt các nhóm chức năng (thông qua liên kết hydrophilic, liên kết halogen) và các tương tác Van Der Waals khác liên kết yếu với thành tế bào

3.4.5 Ức chế enzyme α-glucosidase, 4J5T:PDB

Hình 3.18 Tương tác giữa cấu dạng bền nhất của ligand, Cou-Br với các vị trí hoạt

tính trên enzyme α-glucosidase, 4J5T:PDB

Hình 3.19 Tương tác giữa các amino acid còn lại của enzyme, 4J5T:PDB với các

nguyên tử trên ligand