Khảo sát đặc tính có lợi của Bacillus được phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ tại Cần Giờ

Bài viết Khảo sát đặc tính có lợi của Bacillus được phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ tại Cần Giờ tiến hành nghiên cứu đặc tính có lợi của chủng Bacillus phân lập từ các ao nuôi tôm nước lợ ở huyện Cần Giờ nhằm tuyển chọn để sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho tôm.

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CÓ LỢI CỦA BACILLUS ĐƯỢC PHÂN LẬP

TỪ AO NUÔI TÔM NƯỚC LỢ TẠI CẦN GIỜ

Lê Thị Phụng 1,* , Trần Thị Mai Phương 2 , Đinh Thị Thùy Trâm 1

, Nguyễn Văn Chí2

1 Trường Đại học Tài nguyên và Môi trường, 236B Lê Văn Sỹ, phường 1, quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh

2 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP HCM,

227 Nguyễn Văn Cừ, Phường 4, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh

* Email: ltphung@hcmunre.edu.vn

TÓM TẮT

Bacillus là nhóm vi khuẩn có lợi hiện diện trong đa số các chế phẩm sinh học được sử dụng

trong nuôi trồng thủy hải sản, đặc biệt là nuôi tôm Khả năng cạnh tranh của Bacillus subtilis đối với vi khuẩn gây bệnh trước tiên là ở số lượng tế bào vi khuẩn Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có

khả năng tiết ra các chất kháng sinh sinh học có tác dụng ức chế, cạnh tranh sự phát triển và tiêu diệt một số loài vi khuẩn gây bệnh Ở nước ta các chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy hải

sản đều phải nhập ngoại, giá thành cao Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus phân lập từ các

ao nuôi tôm nước lợ ở huyện Cần Giờ được khảo sát đặc điểm sinh trưởng của các chủng mang các đặc tính có lợi làm cơ sở cho việc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học

Từ khóa: Bacillus, chế phẩm sinh học, Vibrio parahaemolyticus, ao nuôi tôm, huyện Cần Giờ

1 MỞ ĐẦU

Hiện nay, chất kháng sinh được sử dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực, chủ yếu được dùng trong ngăn ngừa và điều trị các hình thức viêm nhiễm do vi khuẩn gây ra trên nhiều đối tượng khác nhau bao gồm cả con người và trong nuôi trồng thủy sản Số lượng các loại kháng sinh mới ngày càng ít đi và đã bắt đầu thời điểm mà các kháng sinh hiện tại không đủ để điều trị những bệnh nhiễm khuẩn trên các loài thủy sản Thêm vào đó là hội chứng hoại tử gan tụy cấp trên tôm do

Vibrio parahaemolyticus gây ra đang gây thiệt hại nặng nề cho ngành thủy sản hiện nay và chưa có

thuốc phòng trị đặc hiệu, nên cần có biện pháp phòng chống thích hợp

Do đó, đòi hỏi các nhà khoa học phải liên tục nghiên cứu tìm ra các hướng đi mới hiệu quả hơn và một tiềm năng mới đầy hứa hẹn là sản xuất ra chế phẩm sinh học có tác dụng thay thế chất

kháng sinh Bacillus là nhóm vi khuẩn có mặt chủ yếu trong các chế phẩm sinh học vì có những đặc

tính có lợi như: tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học: vitamin, acid amin, kháng sinh, enzym protease, α-amylase và một số enzyme có lợi khác Nó còn có khả năng làm ổn định pH, trung hòa độc tố, cung cấp một số men cần thiết để giúp cho quá trình hấp thu dưỡng chất tốt hơn: Enzyme amylase: thủy phân tinh bột và các sản phẩm chứa tinh bột thành đường glucose; Enzyme protease: xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid; Lipase: xúc tác quá trình thủy phân liên kết ester của chất béo tạo thành glycerol và acid béo [1]

Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có khả năng tiết ra các chất kháng sinh sinh học có tác dụng ức chế, cạnh tranh sự phát triển và tiêu diệt một số loài vi khuẩn gây bệnh như vi khuẩn Vibrio harveyi [2]

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc tính có lợi của chủng Bacillus phân lập từ các ao nuôi

tôm nước lợ ở huyện Cần Giờ nhằm tuyển chọn để sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho tôm

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi thực hiện khảo sát đặc tính có lợi sinh ra bởi

10 chủng Bacillus sp được phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ tại Cần Giờ của phòng thí nghiệm Bộ

môn Sinh Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM

Chủng vi sinh vật gây bệnh: Chủng Vibrio parahaemolyticus Vp2 gây hoại tử bệnh gan tụy

cấp trên tôm được cung cấp bởi Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II

2.1.2 Thiết bị

Cân điện tử, Nồi hấp khử trùng Autoclave, Máy đo pH, Microplate reader, Tủ cấy vô trùng, Máy lắc ổn nhiệt, Tủ ủ vi sinh, Máy quang phổ kế, Máy ly tâm lạnh Z216MK, Tủ lạnh

2.1.3 Vật liệu

Môi trường nuôi cấy Luria Bertani (LB): Trypton 10g, Yeast Extract 5 g, NaCl 10 g, Nước cất vừa đủ 1 lít

Môi trường TSA (Tryptone Soy Agar): Trypton Water 22,5 g, Pepsoy 1 g, Agar 26 g, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,3

Môi trường TSB 3 % NaCl (Tryptone Soy Broth): Trypton Water 22,5 g, Pepsoy 1 g, NaCl

25 g, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,3

Môi trường Landy: Glucose 20g, Cao nấm men 1g, L- sodium glutamate 5 g, MgSO4 0,5 g, KCl 0,5 g, KH2PO4 1 g, FeSO4 0,15 mg, MnSO4 0,5 mg, CuSO4 0,16 mg, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,0-7,6

2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc tính có lợi

2.2.1 Khả năng sinh 2,5- Diketopiperazines có hoạt tính kháng khuẩn

Nhằm tối ưu quá trình thu nhận 2,5- Diketopiperazines có hoạt tính kháng khuẩn, chúng tôi

tiến hành nuôi khảo sát chủng Bacillus subtilis trong môi trường Landy có điều kiện pH, nhiệt độ,

tốc độ lắc, độ mặn môi trường ban đầu thay đổi để xác định được điều kiện thích hợp nhất cho nuôi

cấy Chúng tôi tiến hành khảo sát bốn môi trường nuôi TSB, Landy, M9, Opt để thu được dịch

ngoại bào có khả năng kháng V parahaemolyticus cao nhất Nghiên cứu thực hiện tăng sinh chủng

B subtilis trong môi trường LB trong 12 giờ, sau đó bơm 1 % dịch nuôi sang các môi trường cần khảo sát: TSB, Landy, M9, Opt Dịch nuôi ở 37 oC, lắc 200 vòng/phút và trong 24 giờ Sau 24 giờ nuôi, thu dịch ly tâm ở 12000 vòng/phút, 5 oC, trong 10 phút [3]

Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên V parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp

2.2.2 Khảo sát pH của môi trường nuôi cấy

Nhằm xác định khoảng pH tối ưu của môi trường nuôi cấy lên hoạt tính kháng khuẩn của

Bacillus, chúng tôi tiến hành khảo sát pH của môi trường nuôi cấy Nghiên cứu thực hiện tăng sinh

chủng B subtilis trong môi trường LB Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy với các pH như

sau: 4, 5, 6, 7, 8, 9, các thành phần môi trường như nhau Đem hấp khử trùng ở 121 ºC, 1 atm Sau

đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống là 1 % và nuôi trong điều kiện lắc ở 37 ºC với tốc độ lắc 200 vòng/phút Thu canh trường nuôi cấy sau 18 giờ, thu dịch ly tâm ở 12000 vòng/phút, 5 o

C, 10 phút thu dịch để loại tế bào [4]

Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên

V parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng

khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp

2.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ nuôi cấy Nghiên cứu thực hiện tăng sinh chủng B subtilis trong môi trường LB

Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy để nuôi cấy Đem hấp khử trùng ở 121 ºC, 1 atm Điều chỉnh các nhiệt độ lần lượt như sau: 28 oC, 30 oC, 37 oC Sau đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống là

1 % và nuôi trong điều kiện lắc ở 37 ºC với tốc độ lắc 200 vòng/phút Thu canh trường nuôi cấy sau

18 giờ, thu dịch ly tâm ở 12000 vòng/phút, 5 oC, 10 phút thu dịch để loại tế bào [4]

Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên

V parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng

khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp

2.2.4 Khảo sát độ mặn môi trường nuôi

Nhằm xác định độ mặn thích hợp cho hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus, chúng tôi tiến hành khảo sát độ mặn môi trường nuôi cấy Nghiên cứu thực hiện tăng sinh chủng B subtilis trong môi

trường LB Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy với các độ mặn như sau: 0,5 % NaCl, 1 % NaCl, 1,5 % NaCl, 2 % NaCl, các thành phần môi trường như nhau Đem hấp khử trùng ở 121 ºC,

1 atm Sau đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống là 1% và nuôi trong điều kiện lắc ở 37 ºC với tốc độ lắc 200 vòng/phút Thu canh trường nuôi cấy sau 18 giờ, thu dịch ly tâm ở 12000 vòng/phút, 5 oC,

10 phút thu dịch để loại tế bào [4]

Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên

V parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng

khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả của sinh 2,5 - Diketopiperazines

Bacillus sp

Bacillus sp

Bacillus sp Bac 7 Bacillus sp Bac 10

Hình 1 Khả năng đối kháng giữa các chủng Bacillus đối với Vibrio parahaemolyticus

Hình 1 cho thấy khả năng sinh 2,5 - Diketopiperazines đối kháng giữa các chủng Bacillus đối với Vibrio parahaemolyticus, trong đó, Bacillus sp Bac 6 có khả năng ức chế sự phát triển của

Vibrio parahaemolyticus lớn hơn so với Bacillus sp Bac 4, Bacillus sp Bac 7 và Bacillus sp Bac

10 Bacillus sp Bac 2 và 3 không có khả năng ức chế sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus

Đây là đặc tính hết sức quan trọng và có ý nghĩa của Bacillus phân lập từ tự nhiên và ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trị bệnh và cải thiện môi trường nuôi tôm

3.2 Khả năng chịu pH

Sau khi thu nhận chế phẩm 2,5-DKP từ môi trường Landy với 6 độ pH khác nhau là 4, 5, 6, 7,

8, 9 sau 18 giờ nuôi cấy, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm này đối với vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt

tính kháng khuẩn (AU/ml) theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp Kết quả thu được:

Kết quả từ hình 2 hoạt tính kháng V parahaemolyticus của Bacillus subtilis 6 tại các pH: 5, 6,

7 là 400 AU/ml, còn tại pH 8 và pH 9 là 100 AU/ml, tại pH4 thì Bacillus subtilis 6 không thể phát triển Nên ta có thể kết luận rằng tại khoảng pH 5, 6, 7 là tốt nhất cho Bacillus subtilis 6 phát triển

và sinh 2,5-DKP có hoạt tính cao So sánh với khoảng pH trong điều kiện ao nuôi tôm nước lợ ở

nước ta là 7,5 - 8,2, điều này cho thấy chủng Bacillus subtilis 6 có khả năng chịu khoảng pH rộng

phù hợp với điều kiện ao nuôi tôm nước ta, thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học

Bacillus sp

Bacillus sp

Bacillus sp

Bacillus sp

Hình 2 Hoạt tính kháng V parahaemolyticus của Bacillus subtilis tại các pH khác nhau

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Tiến hành khảo sát tại các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau: 28 oC, 30 oC và 37 oC Thử nghiệm

khả năng kháng khuẩn trên chủng Vibrio parahaemolyticus Kết quả thu được:

Hình 3 Hoạt tính kháng V parahaemolyticus của Bacillus subtilis tại các nhiệt độ khác nhau

Từ những kết quả trên, hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus của Bacillus subtilis Bac 6 tại

37 oC là 400 AU/ml, còn tại 28 oC và 30 oC là 200 AU/ml Kết quả này tương đồng với kết quả của một nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn bằng giếng thạch [5] cho thấy nhiệt độ thích hợp nhất cho

quá trình nuôi cấy Bacillus subtilis sinh 2,5-DKP kháng Vibrio parahaemolyticus là 37 oC Nên ta

có thể kết luận rằng tại 37 oC là nhiệt độ thích hợp nhất cho Bacillus subtilis Bac 6 phát triển và sinh

2,5-DKP có hoạt tính cao

3.4 Khả năng chịu mặn của Bacillus

Tiến hành khảo sát tại các nồng độ muối trong các môi trường nuôi cấy khác nhau: 0.5 %, 1 %,

1.5 %, 2 % Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên chủng V parahaemolyticus, kết quả thu được:

Hình 4 Hoạt tính kháng V parahaemolyticus của Bacillus subtilis tại các độ mặn khác nhau

Hình 4 cho thấy Bacillus subtilis 6 đều có hoạt tính kháng V parahaemolyticus trong khoảng nồng độ muối từ 0,5-2,0 %, tại 0,5 % NaCl cho hoạt tính kháng V parahaemolyticus là cao nhất

Như vậy từ những kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng chủng vi sinh vật này tạo chế phẩm sinh học có thể ứng dụng phòng chống bệnh hiệu quả trên tôm tùy theo nồng độ muối môi trường nuôi

4 KẾT LUẬN

Từ các chủng Bacillus được phân lập từ ao nuôi tôm tại huyện Cần Giờ, nghiên cứu đã chọn được 04 chủng có khả năng kháng với V parahaemolyticus, trong đó chủng Bacillus Bac 6 có khả năng sinh 2,5-DKP kháng V parahaemolyticus cao nhất Đồng thời, 2,5-DKP có đặc điểm sinh

trưởng phù hợp với điều kiện nuôi tôm ở nước ta như khoảng chịu pH (5-7), chịu mặn tương đối (0-2 %), nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi cấy và sinh 2,5-DKP là 37 oC Việc nghiên cứu được

các đặc tính có lợi của Bacillus tuy chỉ là bước đầu trong phòng thí nghiệm nhưng có giá trị mang

tính ứng dụng cho việc nghiên cứu điều kiện sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ trong nuôi tôm ở nước ta

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Altan, A - Isolation and Molecular Characterization of Extracellular Lipase and Pectinase

Producing Bacteria from Olive Oil Mills, İzmir Institute of Technology, 2004

2 Nguyễn Thị Ngọc Huyền - Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio, Luận văn tốt

nghiệp, Ngành Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ, 2012

3 Phạm Văn Ty - Công nghệ sinh học - công nghệ vi sinh và môi trường, 2006, Nxb Giáo dục,

TP HCM

4 Arici, M., Bilgin, B., Sagdic, O and Ozdemir, C - Some characteristics of Lactobacillus isolates from infant faeces, Food Microbiology (2004) 19-24

5 S Remya Reghunath và ctv, Isolation and Identification of Bioactive Molecules Produced by

Entomopathogenic bacteria, Acinetobacter calcoaceticus, 2017

INVESTIGATION OF BENEFICIAL PROPERTIES OF BACILLUS ISOLATED

FROM BRACKISH WATER SHRIMP PONDS IN CAN GIO

Le Thi Phung 1,* , Tran Thi Mai Phuong 2 , Dinh Thi Thuy Tram 1 , Nguyen Van Chi2

1

Ho Chi Minh University for Natural Resouces and Environment,

236B Lê Văn Sĩ Str., Dist Tân Bình, HCMC 2

University of Science, Vietnam National University HCMC,

227 Nguyen Van Cu Str., Dist 5, HCMC

* Email: ltphung@hcmunre.edu.vn

ABSTRACT

Bacillus is a group of beneficial bacteria that presents in the majority of biological products for

aquaculture, especially for shrimp.Competitiveness of Bacillus subtilis towards the harmful bacteria firstly is the number of bacterial cells Beside, Bacillus subtilis is capable of secreting biological

antibiotics that inhibit the growth and destruction of some pathogenic bacteria In our country, microbial products used in aquaculture must be imported with a very high price In this research, the

strains of Bacillus isolated from brackish shrimp ponds of Can Gio district were examined for the

growth characteristics of the strains with beneficial properties as the basic for the production of biological products

Keywords: Bacillus, probiotic, Vibrio parahaemolyticus, shrimp ponds, Can Gio district