Đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM THỰC KHUẨN THỂ KIỂM SOÁT BỆNH GAN THẬ.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA

CHẾ PHẨM THỰC KHUẨN THỂ KIỂM SOÁT BỆNH GAN THẬN MỦ

TRÊN CÁ TRA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA

CHẾ PHẨM THỰC KHUẨN THỂ KIỂM SOÁT BỆNH GAN THẬN MỦ

TRÊN CÁ TRA

LỜI CẢM ƠN

Còn nhớ ngày nào những bước chân non nớt của một tân sinh viên từ quê lên SàiThành với bao nhiêu ước mơ, hoài bão Thấm thoát đã bốn năm Bốn năm, một quá trìnhkhông ngắn cũng không quá dài, đủ để em trải nghiệm, học hỏi và cảm nhận những điều đãđến tại nơi đây- ngôi trường mang tên: “Đại học Bách Khoa” Thật sự đại học là một xã hộithu nhỏ để em được trải nghiệm trước khi bước ra ngoài cuộc đời chông chênh Qua bốnnăm đại học, em nhận ra rằng: “Chỉ cần quyết tâm, mình sẽ luôn làm được những điều mìnhmuốn” Nói về Luận văn tốt nghiệp, đây là giai đoạn cuối cùng trong hành trình học tập củamỗi sinh viên, giúp sinh viên củng cố các kiến thức để vận dụng vào công việc sau này.Trong suốt quá trình học tập và làm luận văn, em may mắn khi có thầy cô, gia đình và nhữngngười bạn luôn sát cánh bên em hỗ trợ em

Em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến toàn bộ thầy cô ở trường Đại học Bách Khoa đặc biệt

là các thầy cô ở Bộ môn Công nghệ Sinh học thuộc khoa Kỹ thuật Hóa Học đã luôn tận tụyvới chúng em Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Hoàng Anh Hoàng và cô Lê PhiNga đã giúp em định hướng đề tài, tận tình chỉ dẫn, hỗ trợ cho em trong suốt quá trình làmluận văn Em cũng xin cảm ơn cô Oanh và các anh chị cán bộ ở Cần Thơ đã giúp đỡ em thậtnhiều Cảm ơn chị Xuân ở phòng thí nghiệm trường Bách Khoa đã có những góp ý, chỉ dẫncho em về cách thức thực hiện thí nghiệm trong luận văn

Cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên con, hỗ trợ và động viêncon để con luôn có niềm tin tiến về phía trước Cảm ơn những người bạn đã bên tôi cùng tôiviết lên những trang sách tuổi thanh xuân tươi đẹp

Luận văn tốt nghiệp không tránh khỏi những sai sót do kiến thức còn hạn chế, em rấtmong nhận được ý kiến đóng góp, nhận xét và sự chỉ dẫn từ quý Thầy cô để em có thể bổsung và hoàn thiện luận văn này!

Em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 1 năm 2021

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Cá tra là một mặt hàng xuất khẩu chủ lực và quan trọng của Việt Nam Tuy nhiênnhững năm gần đây tình hình nuôi cá tra trở nên bấp bênh do giá cả, thị trường không ổnđịnh và tình hình dịch bệnh trên cá diễn biến phức tạp Bệnh gan thận mủ do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây ra là một trong những bệnh phổ biến trên cá tra và gây thiệt hại rất

nặng nề Liệu pháp thực khuẩn là một trong những liệu pháp tiềm năng đang được nghiêncứu để thay thế cho việc sử dụng kháng sinh

Mục đích của luận văn là đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể ở quy mô in

vitro và in vivo Ở quy mô in vitro, hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể được thể hiện qua

việc so sánh sự thay đổi giá trị OD600 của canh trường nuôi cấy vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri khi bổ sung dịch chế phẩm thực khuẩn thể M26 ở các mức MOI = 0.02, MOI = 0.2,

MOI = 2 so với mẫu đối chứng Ở quy mô in vivo, 21 nghiệm thức gồm 1260 con cá được

gây cảm nhiễm bệnh bằng cách thêm trực tiếp dịch vi khuẩn với các mật độ khác nhau vàonước nuôi cá, sau đó cá sẽ được điều trị bằng việc cho ăn thức ăn phun chế phẩm thực khuẩnthể với mật độ xác định, hiệu quả của chế phẩm được đánh giá qua việc tính toán tỷ lệ cáchết tích lũy sau 14 ngày

Kết quả của luận văn cho thấy chế phẩm ở quy mô in vitro ở 3 giá trị MOI = 0.02, MOI

khuẩn bắt đầu giảm nhanh sau từ khoảng 1 đến 3 giờ tùy vào nồng độ MOI bổ sung Tất cả

hiện tượng vi khuẩn kháng thực khuẩn thể, tuy nhiên vẫn thấp hơn mẫu đối chứng Ở quy

mô in vivo, tỷ lệ cá chết tích lũy ghi nhận là 75.5 ± 5.0 đối với nghiệm thức B7P0 (là nghiệm

thức cá được cho lây nhiễm ở mật độ vi khuẩn cao nhất và được cho ăn bằng thức ăn chứathực khuẩn thể bất hoạt), trong khi đó tỷ lệ tử vong tích lũy của B7P7 (là nghiệm thức cáđược cho lây nhiễm ở mật độ cao nhất và điều trị bằng mật độ thực khuẩn thể cao nhất ) là51.7 ± 5.8

Các kết quả trên cho thấy chế phẩm thực khuẩn thể có hiệu quả kiểm soát vi khuẩn ở

điều kiện in vitro và in vivo

Striped catfish (Pangasius hypophthalmus) is a major and important export item of

Vietnam However, in recent years, the situation of pangasius farming has becomeprecarious due to unstable prices, unstable markets, and complicated fish diseases White

spots in the diseases of the internal organs caused by Edwardsiella ictaluri bacteria is one of

the common diseases in pangasius and causes heavy losses Phage therapy is one of thepotential therapies being studied as an alternative to the use of antibiotics

The purpose of the thesis is to evaluate the effectiveness of bacteriophage preparations

in vitro and in vivo At the in vitro experiment, the effectiveness of phage preparation is

shown by comparing the change in OD600 value of Edwardsiella ictaluri culture when

adding with M26 bacteriophage preparation at concentrations MOI = 0.02, MOI = 0.2, MOI

= 2 compared to the control sample At the in vivo experiment, 21 groups consisting of

1,260 fish were infected by directly adding bacterial suspensions with different densitiesinto the tanks, then the fish were feed with phage-sprayed-pellets The effectiveness of thepreparation was evaluated by calculating the cumulative mortality rate after 14 days

The results show that the preparation at in vitro experiment at 3 values of MOI = 0.02,

MOI = 0.2, MOI = 2 are all effective in controlling bacteria The OD600 value of the bacterialsolution began to decline rapidly after about 1 to 3 hours depending on the concentration of

were close to zero in the following time points, while the OD600 of the control samples kept

phage increased due to the phenomenon of bacteria resistance to phage, but still lower than

the control sample At in vitro experiment, the cumulative mortality rate was 75.5 ± 5.0 for

the B7P0 treatment (which was the fish that was infected with the highest bacterial densitiesand fed with food containing bacteriophages), while the cumulative mortality of B7P7(which was the fish that was infected at the highest density and treated with the highestbacteriophage density) was 51.7 ± 5.8

The above results show that phage preparations have good therapeutic effect at the in

vitro and in vivo.

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

repeats

DANH MỤC BẢ

Bảng 2.1 Thành phần và lượng hóa chất môi trường TSA xviii Bảng 2 2 Thành phần và lượng hóa chất dung dịch SM xviii Bảng 2.3 Thành phần và lượng hóa chất môi trường LB xix YBảng 3.1 Nhiệt độ và pH của bể cá trong 14 ngày thí nghiệm xxxiii

DANH MỤC HÌ

Hình 1 1 Mô tả thực khuẩn thể thuộc bộ Caudovirales [3] i

Hình 1 2 Chu trình tan và tiềm tan của thực khuẩn thể [3] iii

Hình 1.3 Sản phẩm Pyo Bacteriophage của công ty BRIMMEDICAL phòng các bệnh do Staphylococcus, E. coli, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus gây ra Nguồn: http://www.brimmedical.com/phage-products.html v

Hình 1.4 Sản phẩm của công ty Agriphage phòng trừ vi khuẩn gây bệnh trên cây cà chua Nguồn: https://www.agriphage.com/product-info/ vi

Hình 1.5 Khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn E.ictaluri A Sự phát triển của vi khuẩn E ictaluri trên môi trường TSA sau 48 giờ ủ ở 28 o C B Vi khuẩn E.taluri nhuộm Gram (100X) C Vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử Nguồn: http:// microgen.ouhsc.edu x

Hình 1.6 A Giải phẫu cá tra bị nhiễm bệnh gan thận mủ B Các đốm trắng trong nội tạng của cá [65] xi

Hình 1.7 Cá tra xi

Y Hình 2.1 Một góc của sơ đồ bố trí thí nghiệm xxvii

Hình 2.2 Hộp đựng thức ăn cho cá mỗi lần ăn xxvii

Hình 2.3 Gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri ở cá xxviii

Hình 3.1 Các đốm tan của thực khuẩn thể M26 trong phương pháp Plaque Assay xxx

Hình 3.2 Sự thay đổi OD600 của dịch vi khuẩn E ictaluri theo thời gian khi bổ sung thực khuẩn thể M26 với các mức MOI =0.02, MOI = 0.2, MOI = 2 xxxi

Hình 3.3 Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 3 giờ bổ sung dịch chế phẩm phage M26 xxxii

Hình 3.4 Dấu hiệu cá tra thí nghiệm nhiễm bệnh gan thận mủ xxxiii

Hình 3.5 Tỷ lệ cá chết tích lũy khi cho ăn bằng thức ăn có phun chế phẩm phage bất hoạt xxxiv

Hình 3.6 Tỷ lệ cá chết tích lũy khi cho ăn bằng thức ăn có phun chế phẩm phage mật độ 10 5 PFU/ g thức ăn xxxv

Hình 3.7 Tỷ lệ cá chết tích lũy khi cho ăn bằng thức ăn có phun chế phẩm phage mật độ 106 PFU/ g thức ăn xxxv

Hình 3 8 Tỷ lệ cá chết tích lũy khi cho ăn bằng thức ăn có phun chế phẩm phage mật độ 107 PFU/ g thức ăn xxxvi

Hình 3.9 Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trên môi trường EIA sau 36 giờ xxxviii

Hình 3.10 Kết quả điện di xxxix

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu xx

Sơ đồ 2 2 Sơ đồ thí nghiệm xác định mật độ thực khuẩn thể trong chế phẩm xxi

Sơ đồ 2.3 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm quy mô in vitro xxiii

Sơ đồ 2.4 Sơ đồ nội dung thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm in vivo xxv

Sơ đồ 2.5 Bố trí thí nghiệm minh họa xxvi

MỞ ĐẦU

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những mặt hàng thủy sản xuất khẩu

chủ lực, mang lại nhiều lợi nhuận cho nền kinh tế của nước ta Những năm gần đây tìnhhình dịch bệnh đã khiến cho sản lượng cá tra giảm mạnh cùng với giá cả bấp bênh, thịtrường xuất khẩu không ổn định đã làm cho người nông dân và các doanh nghiệp sản xuất

cá tra bị lỗ nặng Bệnh gan thận mủ trên cá tra do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là một

trong những bệnh phổ biến, khó điều trị và gây thiệt hại rất nhiều

Kháng sinh là một trong những phương pháp phổ biến để điều trị, tuy nhiên việc lạmdụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng Gần đây nhiều lô hàng xuấtkhẩu cá tra sang các thị trường châu Âu bị trả về do tồn dư kháng sinh quá cao, bên cạnh đóviệc sử dụng quá nhiều kháng sinh dẫn đến tình trạng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng trởnên phức tạp Liệu pháp thực khuẩn thể là một liệu pháp sử dụng thực khuẩn thể để tiêu diệt

vi khuẩn, đây là một liệu pháp tiềm năng và đang được nghiên cứu ứng dụng trong tương lai

để thay thế cho việc sử dụng kháng sinh Thực khuẩn thể có tính đặc hiệu tấn công đúng vào

vi khuẩn gây bệnh nên không làm ảnh hưởng đến các hệ vi sinh vật có lợi trong môi trườngxung quanh, không gây bệnh cho con người hay động vật khác; thực khuẩn thể cũng có khảnăng đồng tiến hóa với vi khuẩn nên cũng có khả năng kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩnkháng phage; chế phẩm thực khuẩn thể có thể được sản xuất bằng cách nuôi vi khuẩn trongmôi trường giá rẻ rồi bổ sung một lượng nhỏ thực khuẩn thể vào

Các nghiên cứu về thực khuẩn thể đang cho kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm.Tuy nhiên để thực khuẩn thể trở thành một liệu pháp thực tiễn trong tương lai, trước khi đưa

chế phẩm thực khuẩn thể ra ứng dụng đại trà thì cần phải nghiên cứu chặt chẽ từ quy mô in

vitro đến in vivo Luận văn nhằm để đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể trong

việc kiểm soát bệnh gan thận mủ trên cá tra cả quy mô in vitro và in vivo, kết quả sẽ là nền

tảng cho các nghiên cứu ở quy mô lớn hơn và tương lai việc sản xuất chế phẩm thực khuẩnthể phòng bệnh trên thủy sản sẽ được phát triển mạnh mẽ, giảm thiểu được dịch bệnh, đểngành thủy sản ngày càng trở nên phát triển đất nước ta thêm.giàu.đẹp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thực khuẩn thể

1.1.1 Đặc điểm hình thái của thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể (bacteriophages) hay gọi tắt là phage được định nghĩa là virus xâmnhiễm vi khuẩn Thực khuẩn thể được phát hiện độc lập bởi Frederick Twort và Felixd’Hérelle vào đầu thế kỷ XX [1], [2] Các thực khuẩn thể được thiết kế để sử dụng trongviệc điều trị, tuy nhiên do sự phổ biến của kháng sinh lúc bấy giờ nên liệu pháp thực khuẩnthể dần trở nên bị quên lãng, mặc dù nghiên cứu về thực khuẩn thể vẫn được tiếp tục ở Liên

Xô cũ (Georgia và Nga) và Ba Lan [3]

Tương tự các loại virus khác, thực khuẩn thể rất đa dạng về cấu trúc cũng như bộ máy

di truyền Phần lớn các thực khuẩn thể đã biết là virus có đuôi thuộc bộ Caudovirales Dưới

kính hiển vi, thực khuẩn thể được cấu tạo bởi lớp vỏ capsid bao gồm các protein hoặclipoprotein bảo vệ vật liệu di truyền là Deoxyribonucleic acid (DNA) hay Ribonucleic acid(RNA), cùng với đuôi Đuôi có thể nhận dạng vật chủ thông qua các thụ thể ở sợi đuôi(Hình 1.1) [3]

Hình 1 1 Mô tả thực khuẩn thể thuộc bộ Caudovirales [3]

1.1.2 Chu kì xâm nhiễm của thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể nhân lên trong hệ thống tế bào chủ theo chu trình sinh tan (lytic cycle)

và chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) Đây là cơ sở để chia thực khuẩn thể thành hai nhóm

là thực khuẩn thể độc (virulent phage) và thực khuẩn thể ôn hòa (temperate phage)

Chu trình tan: Các thực khuẩn thể làm chết tế bào vật chủ ngay lập tức gọi là phage

độc và chúng sinh sản theo chu trình tan Thực khuẩn thể sẽ gắn đặc hiệu lên bề mặt vật chủ

thông qua một thụ thể (receptor) và sau đó tiêm vật liệu di truyền của nó vào tế bào vật chủ.Capsid rỗng của thực khuẩn thể còn lại ở bên ngoài Tế bào vật chủ sẽ cung cấp vật liệu vàenzyme để sao chép, phiên mã, dịch mã vật chất di truyền của thực khuẩn thể Khideoxyribonucleic acid (DNA) của tế bào vật chủ bị phân hủy, bộ gen của thực khuẩn thểkiểm soát toàn bộ hoạt động của tế bào để tạo các cấu phần của nó Các protein của vỏcapsid được tổng hợp thành ba phần riêng: đầu đa diện, ống đuôi và các sợi đuôi, sau đóchúng lắp ráp tạo thành các phae mới Phage hoàn tất chu trình khi enzyme lysozyme đượctạo ra để tiêu hóa vách tế bào Tế bào vi khuẩn bị vỡ, hàng trăm phage mới thoát ra ngoài vàtiếp tục chu kỳ tiếp theo

Chu trình tiềm tan: trong chu trình này thực khuẩn thể ôn hòa không ly giải tế bào

chủ ngay lập tức thay vào đó bộ gen của chúng được đưa vào bộ gen của tế bào chủ tại các

vị trí cụ thể DNA này trong bộ gen tế bào chủ được gọi là prophage Prophage sẽ được saochép cùng với bộ gen vi khuẩn chủ, thiết lập một mối quan hệ ổn định Chu trình tiềm tan cóthể kéo dài vô hạn cho đến khi vi khuẩn gặp điều kiện sống môi trường bất lợi, khi đó chutrình tiềm tan kết thúc và chu trình tan bắt đầu [4]

Hình 1 2 Chu trình tan và tiềm tan của thực khuẩn thể [3]

Các thực khuẩn thể ôn hòa (những thực khuẩn thể biểu hiện vòng đời lysogenic)được coi là những thể tham gia vào quá trình chuyển gen ngang (horizontal gene transfer)giữa các tế bào vi khuẩn do đó không thích hợp để sử dụng trong liệu pháp thực khuẩnthể Ngược lại những thực khuẩn thể độc lực có chu trình tan sẽ được ưu tiên phát triểntrong liệu pháp [5], [6].

1.2 Liệu pháp thực khuẩn thể

1.2.1 Liệu pháp thực khuẩn thể là gì?

Liệu pháp thực khuẩn thể là một liệu pháp sử dụng virus xâm nhiễm đặc hiệu với vikhuẩn để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Đây là một quá trình gồm hai bước liênquan đến sự xâm nhập của thực khuẩn thể vào vi khuẩn mục tiêu và sau đó giết chết vikhuẩn Nói cách khác các thực khuẩn thể sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn qua chu trình tan [7] Do

cơ chế hoạt động của thực khuẩn thể khác với kháng sinh và thực khuẩn thể cũng có khảnăng đồng tiến hóa với vi khuẩn nên đây là một giải pháp tiềm năng thay thế cho thuốckháng sinh trong tình trạng xuất hiện nhiều vi khuẩn kháng thuốc như hiện nay

1.2.2 Tại sao liệu pháp thực khuẩn thể lại được quan tâm trong ngành nuôi trồng thủy sản?

Ngày nay tình trạng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đang dần trở nên trầm trọng, gâyảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người, động thực vật, môi trường và các lĩnh vực kháctrong đó phải kể đến là lĩnh vực nuôi trồng thủy sản

Dân số trên thế giới đang tăng lên với tốc độ nhanh chóng là 75 triệu người mỗi năm

từ năm 1971 đến năm 2016 và ước tính đạt 9.2 tỷ người vào năm 2050 [8] Nuôi trồng thủysản là ngành sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất, đóng vai trò quan trọng trong việccung cấp thức ăn cho dân số trong tương lai Năm 2016, nuôi trồng thủy sản chiếm 45% sảnlượng cá toàn cầu và số lượng này tăng lên 52% vào năm 2025 Nuôi trồng thủy sản diễn rachủ yếu ở chây Á, với số lượng 77 triệu tấn năm 2016 cung ứng 90% sản lượng cá cho toàncầu Để đáp ứng nhu cầu protein dự kiến, sản lượng thủy sản sẽ tăng gấp đôi từ 80 triệu tấnvào năm 2016 lên khoảng 140 triệu tấn vào năm 2050 [9], [10]

Tuy nhiên các bệnh do vi khuẩn gây ra các tác động lớn đến các yếu tố kinh tế củangành nuôi trồng thủy sản Người ta đã ước tính rằng khoảng 34% nhiễm trùng có nguồngốc từ vi khuẩn [11] Không chỉ tác động lên kinh tế, những vi khuẩn gây bệnh khi tấn công

thủy sản có ảnh hưởng to lớn tới sức khỏe cộng đồng vì mầm bệnh này có thể lây lan quatiếp xúc trực tiếp với động vật ốm và thức ăn có nguồn gốc từ động vật [12]

Một mối đe dọa khác đến từ khả năng kháng thuốc của mầm bệnh Người ta ước tínhrằng vật nuôi tiêu thụ 73% tổng lượng kháng sinh trên thế giới [13] Ngày nay, kháng sinhkhông những được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng mà còn được sửdụng như tác nhân phòng ngừa hoặc thúc đẩy tăng trưởng Vì vật có nhiều bệnh trước đây

dễ chữa bây giờ lại trở thành một vấn đề lớn [14] Trong một số trường hợp ngay cả khi liệupháp kháng sinh có hiệu quả trong phòng thí nghiệm thì hiệu quả thực tế của nó rất thấp[15]

Vào năm 2006, chính quyền European Union ( EU) đã ban hành lệnh cấm sử dụngkháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi Dự kiến năm 2022 sẽ cấm sửdụng các loại kháng sinh quan trọng đối với y học của con người và cấm sử dụng bất kỳ loạikháng sinh nào mà không có đơn của bác sĩ chăn nuôi [16] Do đó có thể trong tương laikháng sinh sẽ không được sử dụng rộng rãi như trước nữa

Các nhà khoa học trên thế giới đang nỗ lực nghiên cứu những liệu pháp có thể thay thếkháng sinh đặc biệt trong ngành nuôi trồng thủy sản [17] Nếu tìm ra được giải pháp, khảnăng sẽ tiêu diệt được những vi khuẩn kháng thuốc, giúp cho thủy sản phát triển tốt, nângcao năng suất và lợi nhuận kinh tế Liệu pháp thực khuẩn thể là một trong những ứng viênsáng giá cho lời giải này

Ngày nay ngoài kháng sinh ra cũng có một số biện pháp khác cho việc kháng khuẩntrong nuôi trồng thủy sản, các biện pháp có thể kể đến như là vaccine, phytogenics,probiotic và liệu pháp thực khuẩn thể Mỗi liệu pháp điều có ưu, nhược điểm riêng và cầncân nhắc để phát triển ra một liệu pháp kháng khuẩn trong tương lai

Nói về kháng sinh, kháng sinh có tác dụng nhanh, dễ sử dụng Tuy nhiên nó có ảnhhưởng nhiều đến hệ vi sinh vật đường ruột của động vật, khả năng tiêu hoá, hấp thụ chấtdinh dưỡng cũng như khả năng kháng bệnh [18] Ngoài ra một số hoạt chất nhưoxytetracycline cũng hoạt động như chất ức chế miễn dịch và do đó làm tăng nhu cầu sửdụng thuốc kháng sinh để hỗ trợ hệ thống miễn dịch [18]–[20] Kháng sinh ngày càng mất

tác dụng do việc các phân tử kháng sinh giải phóng ra môi trường quá nhiều với ước tínhkhoảng 75%, thậm chí được bổ sung trực tiếp vào nước [21] Bởi kháng sinh có hiệu quảđáng tin cậy với những chủng vi khuẩn nhạy cảm song không bền vững

Vaccine cũng là liệu pháp được sử dụng thành công trong ngành nuôi trồng thủy sản:vaccine giảm được lượng kháng sinh đáng kể trong sản xuất cá hồi Tuy nhiên vaccinekhông thể dùng để bảo vệ những con cá thiếu hệ thống miễn dịch Bên cạnh đó không thểtiêm cho hết một lượng lớn vật nuôi [22]

Ngoài ra còn có một liệu pháp cũng được quan tâm là Phytogenics Phytogenics lànhững chất được chiết xuất từ tự nhiên, phần lớn trong số đó thật sự là tinh dầu [23] Đâycũng là một biện pháp đầy hứa hẹn trong việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh ở lĩnh vực nuôi

trồng thủy sản Liệu pháp này đã cho hiệu quả tích cực trong điều kiện in vitro Tuy nhiên

để hiểu rõ cơ chế hoạt động của Phytogenics cần phải thực hiện một lượng lớn thí nghiệm

in vivo [18] Bản chất của Phytogenics đang là một lời giải cùng với việc tìm kiếm nguồn

cung ứng cũng có thể gặp khó khăn trong việc tìm kiếm nguyên liệu thô chứa Phytogenic vìtrong tự nhiên có một số nguyên liệu dường như không có sẵn

Probiotic cũng là một giải pháp thay thế hợp lý cho thuốc kháng sinh Tuy nhiên tácđộng của chúng không được hiểu rõ [18], [24] Năm 2016, trong các trại nuôi tôm người ta

bổ sung probiotic theo từng thời kỳ sinh trưởng của tôm Kết quả là hiệu quả của probioticchỉ xuất hiện ở một số giai đoạn nhất định khiến liệu pháp này dường như không có địnhhướng [25] Ngoài ra cũng rất khó kết hợp với các dung dịch kháng khuẩn vì cả vi khuẩn cólợi và có hại đôi khi cũng ở trong cùng một loài [26]–[28]

Và cuối cùng liệu pháp thực khuẩn thể được đánh giá là một liệu pháp tiềm năng nhấttrong việc kháng khuẩn Thực khuẩn thể có phạm vi ký chủ hẹp, nên chỉ tấn công đặc hiệuvới các vi sinh vật mục tiêu mà không ảnh hưởng đến các hệ vi sinh vật có lợi khác Vikhuẩn có thể kháng thuốc dễ dàng hơn kháng thực khuẩn thể vì cơ chế tấn công của thựckhuẩn thể khác thuốc, thực khuẩn thể có khả năng tiến hóa và phát triển cùng vật chủ trongmột môi trường Một số vi khuẩn sau khi kháng thực khuẩn thể có xu hướng giảm khả năngsinh sản hoặc giảm độc lực [24] Điều này có thể được giải thích là khi vi khuẩn phát triển

sự kháng thực khuẩn thể bằng việc đột biến các thụ thể để thực khuẩn thể không tiếp cận,

khi mất thụ thể thì hoạt động lây nhiễm của vi khuẩn cũng bị hạn chế [29] Bên cạnh đóthực khuẩn thể được tìm thấy rất nhiều trong tự nhiên và việc phân lập thực khuẩn thể có thểnói là tương đối dễ dàng [30]–[34]

Trong số các liệu pháp thay thế kháng sinh cho nuôi trồng thủy sản, thực khuẩn thểdường như là một liệu pháp hứa hẹn nhất và nhận được ngày càng nhiều sự quan tâm củacộng đồng

1.2.3 Cơ hội và thách thức của liệu pháp thực khuẩn thể trong ngành nuôi trồng thủy sản?

Liệu pháp thực khuẩn thể là một liệu pháp tiềm năng không chỉ mang đến những cơhội tương lai trong việc điều trị các bệnh do vi khuẩn mà còn có thể thay thế kháng sinh mộtcách hiệu quả và bền vững, song liệu pháp này còn đang trong quá trình nghiên cứu và cũngcòn vô vàn thách thức cần giải quyết

Về tính đặc hiệu: thực khuẩn thể thường ít hoặc không tương tác đối với hệ vi sinh vật

có lợi trong môi trường, điệu này kháng sinh chưa làm được Tuy nhiên phổ xâm nhiễm vậtchủ hẹp và không có lợi trong trường hợp thủy sản bị bệnh toàn thân do nhiều loại vi khuẩngây ra cùng một lúc [6], [35]

Về độ an toàn: thực khuẩn thể chỉ tấn công các tế bào vi khuẩn mục tiêu mà không làm

ảnh hưởng đến con người cũng như các sinh vật khác Vì cơ chế hoạt động khác với khángsinh nên thực khuẩn thể có thể chống lại cả những chủng vi khuẩn đa kháng thuốcantimictobial resistance (AMR ) [36] Thực khuẩn thể luôn tiến hóa cùng vi khuẩn để chốnglại nhau vì thế trong tương lai có thể vi khuẩn sẽ phát triển khả năng đa kháng thực khuẩnthể [35]

Về sự kích thích khả năng miễn dịch: thực khuẩn thể có thể cảm ứng phản ứng miễn

dịch của cơ thể vật nuôi vì vậy thực khuẩn thể dễ bị đào thải Câu hỏi đặt ra làm sao tìmđược cách để thực khuẩn thể có thể vượt qua hệ miễn dịch của cơ thể vật nuôi, tiếp cận với

tế bào vi khuẩn gây bệnh Việc loại bỏ thực khuẩn thể ra khỏi cơ thể vật nuôi cũng sẽ gặp

một số khó khăn Thực khuẩn thể có thể tự nhân lên trong điều kiện in vivo, nhưng phải có

một chất dẫn đường để thực khuẩn thể có thể định hướng mà tiến đến vị trí nhiễm trùng[37], [38]

Thực khuẩn thể tồn tại rất nhiều ở ngoài môi trường tự nhiên, dễ phân lập và tốn ítkinh phí Nhưng thay vào đó thực khuẩn thể lại nhạy cảm với các thông số hóa lý khácnhau dẫn đến sự không ổn định [39], [40]

Đối với khía cạnh môi trường: đa số trường hợp phage không độc với con người và

môi trường, tuy nhiên có thể dẫn đến mất cân bằng hệ sinh thái khi loại bỏ hoàn toàn mộtloài vi khuẩn và khả năng có thể xuất hiện một loại vi khuẩn khác mạnh hơn để lấp vào chỗtrống [41]

Mặc dù còn nhiều điều chưa biết về thực khuẩn thể, cũng như đến nay chưa có nhữngquy định, hướng dẫn để liệu pháp này trở thành liệu pháp được điều trị phổ biến nhưng cácnhà nghiên cứu khoa học ngày càng nỗ lực, các nghiên cứu về thực khuẩn thể cũng khôngngừng tăng lên hứa hẹn trong tương lai liệu pháp này sẽ xóa bỏ hết những rào cản tháchthức để trở thành liệu pháp thay thế hiệu quả và bền vững trong thời kì hậu kháng sinh hiệnnay

1.2.4 Các đặc điểm và yêu cầu của chế phẩm thực khuẩn thể

Chế phẩm thực khuẩn thể là một sản phẩm diệt khuẩn được tạo ra từ việc ứng dụngliệu pháp thực khuẩn thể Chế phẩm thực khuẩn thể hiện nay được sản xuất đóng gói dướihai dạng: bột và lỏng [42], [43] Trên thị trường có một số công ty sản xuất chế phẩm thựckhuẩn như công ty Ariphage của Mỹ chuyên sản xuất chế phẩm thực khuẩn thể trong nôngnghiệp, công ty BRIMMEDICAL chuyên sản xuất các loại chế phẩm phục vụ cho y học

Hình 1.3 Sản phẩm Pyo Bacteriophage của công ty BRIMMEDICAL phòng các bệnh

do Staphylococcus, E coli, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus gây ra Nguồn:

http://www.brimmedical.com/phage-products.html

Hình 1.4 Sản phẩm của công ty Agriphage phòng trừ vi khuẩn gây bệnh trên cây cà

chua Nguồn: https://www.agriphage.com/product-info/

Tuy nhiên chế phẩm thực khuẩn thể sử dụng trong thủy sản thì chưa được sản xuất đạitrà và đến nay trên thị trường vẫn chưa có công ty nào kinh doanh và sản xuất loại chế phẩm

sử dụng trong lĩnh vực này Vì có một số vấn đề liên quan đến kinh tế, môi trường và cácquy định

Về pháp lý: Hiện nay ở hầu hết các quốc gia, thực khuẩn thể chỉ có thể được đăng ký

riêng lẻ, do đó việc đăng ký một loại hỗn hợp thực khuẩn thể là rất khó khăn [44] Cho đếnnay chỉ có một số chế phẩm thực khuẩn thể được đăng ký trên toàn thế giới và không có chếphẩm nào dành riêng cho nuôi trồng thủy sản [35] Do sự an toàn của thực khuẩn thể vẫn làtrở ngại chính cho việc sử dụng chúng trên quy mô đại chúng, do đó cần phải có thêm nhiềunghiên cứu trong lĩnh vực này bao gồm các tác động của thực khuẩn thể đối với môi trường

và nguy cơ chuyển gen [45]

Về môi trường: trong tự nhiên thực khuẩn thể đóng một vai trò quan trọng hỗ trợ chu

trình của các yếu tố sinh hóa [46] Các thực khuẩn thể độc có tính đặc hiệu cao, không làmảnh hưởng đến vi khuẩn có ích và động thực vật và môi trường, đến nay không có nhiềubằng chứng về việc thực khuẩn thể có hại [47] Bên cạnh đó, nếu tiêu diệt tận gốc một mầmbệnh nào thì có thể dẫn đến chỗ trống của một số loài vi khuẩn khác xâm nhập trở lại Liệupháp thực khuẩn thể trong các khu vực nuôi cá có thể phá hủy môi trường thông qua sự phá

vỡ hệ vi sinh vật Các thực khuẩn thể điều chỉnh số lượng vi khuẩn nhất định, chúng chọn

lọc một số vi khuẩn do đó làm thay đổi tỷ lệ trong quần xã vi khuẩn Vì vi khuẩn cũng cótác động quan trọng đến chu trình chuyển hóa chất hữu cơ trong sinh quyển bằng việc giảiphóng các hợp chất thông qua việc ly giải tế bào nên đến nay liệu pháp thực khuẩn thể khiđược sử dụng vẫn là một vấn đề đang được tranh cãi.

Nói về kinh tế: chế phẩm thực khuẩn thể mang lại nhiều giá trị trong khía cạnh này.

Kháng sinh là mặt hàng chiếm chi phí cao thứ ba trong giá thành sản xuất cá tra (2.5%) Tuynhiên người ta ước tính rằng chỉ cần giảm 1% chi phí cho kháng sinh cũng tạo ra khoản tiếtkiệm gần 13 triệu USD cho ngành thủy sản ở Việt Nam [48] Vì vậy chế phẩm thực khuẩnthể giá thấp được kì vọng giảm chi phí thay cho kháng sinh do các thực khuẩn thể nhânlênnhanh,chỉ cần một lượng nhỏ khi bắt đầu và các thực khuẩn thể có thể được tạo ra từ quátrình lên men đơn giản với các nguyên liệu, chi phí thấp [49]

Một chế phẩm thực khuẩn thể sử dụng trong lĩnh vực thủy sản cần đáp ứng các yêucầu sau:

hiệu cao, tấn công được chủng vi sinh vật gây bệnh, không tấn công các hệ vinh sinhvật khác của môi trường, để tránh trường hợp tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thựckhuẩn thể không mong muốn Nếu thủy sản bị bệnh do tác nhân của nhiều vi sinhvật thì sử dụng hỗn hợp của nhiều thực khuẩn thể qua việc phối trộn, kết hợp nhiềuloại thực khuẩn thể

khỏi sự tiêu diệt của thực khuẩn thể qua các hình thức như đột biến các thụ thể màphage bám vào, ngăn DNA của thực khuẩn thể tiêm vào vi khuẩn hay là phân cắtDNA nhờ hệ thống CRISPR-Cas, song thực khuẩn thể cũng luôn tiến hóa để thíchứng với sự thay đổi của vi khuẩn để phát triển khả năng kháng khuẩn Yêu cầu đặt ra

là các thực khuẩn thể sử dụng phải có mức đột thích ứng, tiến hóa nhanh để chống lạikhả năng kháng thực khuẩn thể của vi khuẩn [50], [51]

 Thực khuẩn thể là tác nhân bên ngoài nên khi vào cơ thể cá để điều trị bệnh thựckhuẩn thể sẽ gây ra các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu ngăn sựgắn kết của virus với vi khuẩn, đôi khi dẫn tới tác động điều trị bị giảm hoặckhông có [38] Vì vậy chế phẩm thực khuẩn thể cần phải chứa những thành phần

để bảo vệ thực khuẩn thể vượt qua hệ miễn dịch của cơ thể cá, đưa thực khuẩnthể đến được vị trí nhiễm trùng Một số các biện pháp như thực hiện vi bao thựckhuẩn thể, sử dụng chất bảo vệ hay chất đệm thích hợp hoặc sàng lọc các đột biến(bằng phương pháp di truyền hoặc hóa học) nhằm để chọn lọc ra được nhữngchủng thực khuẩn thể có khả năng vượt qua lớp hàng rào miễn dịch của cơ thểvật nuôi [38]

Gram âm, một lượng lớn nội độc tố lipopolisacharides (LPS) của vi khuẩn đượcgiải phóng Khi nội độc tố giải phóng có thể gây ra phản ứng dị ứng và dẫn đếnnhiễm trùng toàn thân ở vi sinh vật [52], [53] Một số phương pháp như sắc ký,hấp thụ hoặc siêu lọc để loại bỏ nội độc tố LPS [38] Tuy nhiên cho đến nay khi

sử dụng chế phẩm thực khuẩn thể, không có ghi nhận bất kỳ trường hợp tác dụngphụ nào

khuẩn thể là tiêm, ngâm nước và cho ăn Theo những nghiên cứu gần đây việc cho ănhiệu quả hơn ngâm nước và ít hiệu quả nhất là tiêm [54] Là người nghiên cứu, sảnxuất chế phẩm, ta phải tính toán và lựa chọn cách sử dụng nào vừa hiệu quả trongviệc điều trị bệnh vừa mang lại giá trị kinh tế cao

khuẩn thể trong chế phẩm, nếu quá ít thì sẽ không hiệu quả trong điều trị, còn nếuquá cao thì ảnh hưởng đến kinh tế Bên cạnh đó ta cần xác định thời gian mà thựckhuẩn thể phát triển, xâm nhập, ly giải tế bào vi khuẩn và bị kháng bởi vi khuẩn để

bổ sung thực khuẩn thể vào lúc phòng và các giai đoạn bệnh trên thủy sản sao chohợp lý

 Yêu cầu về tính ổn định của chế phẩm: Hoạt động của thực khuẩn thể có thể bị ảnhhưởng bởi một số yếu tố như thành phần dung dịch (có hoặc không có ion), các thông

số của quá trình sản xuất như nhiệt độ, áp suất hoặc pH của môi trường Các điềukiện môi trường sản xuất hay bảo quản khắc nghiệt làm cấu trúc đuôi của thực khuẩnthể thay thì sẽ ảnh hưởng đến khả năng liên kết với thụ thể của vật chủ, thậm chí pháhủy toàn bộ cấu trúc của thực khuẩn thể [55]–[57]

thấy khoảng pH trung tính 6-8 là tối ưu cho hầu hết các thực khuẩn thể và proteincủa chúng Vì vậy pH của chế phẩm cũng cần phải nằm trong khoảng giá trị này

để đảm bảo cho sự an toàn của thực khuẩn thể [54]

thực khuẩn thể có khoảng nhiệt độ rộng để phù hợp cho việc sản xuất cũng nhưbảo quản [41]

thực khuẩn thể Tuy nhiên cũng cần một số nồng độ ion vì chúng tương tác vớicapsid và ổn định protein [58]

1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri – nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ

1.3.1 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterbacteriaceae, bộ

Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria và ngành Proteobacteria [59] Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lần đầu tiên được phân lập bởi Hawke vào năm 1979 trên cá nheo Mỹ

nhiễm bệnh ESC (Enteric Septicemia of Catfish: nhiễm trùng máu) [60] Đến năm 1981 tác

nhân gây bệnh này mới được định danh là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.

E.ictaluri thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước biến đổi từ 1.2-1.5 x

hơn 30 oC , không sinh bảo tử, yếm khí tùy tiện [61]

Vi khuẩn E.ictaluri có thể phát triển trên các môi trường dinh dưỡng như môi trường

MacConkey agar (MCK), tryptic soy agar (TSA), brain heart infusion agar (BHIA)

thioglycollate (THIO) [62] Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA hay BHIA, xuất hiệncác khuẩn lạc có dạng hình tròn, kích thước khoảng 1-2 nm

Hình 1.5 Khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn E.ictaluri A Sự phát triển của vi khuẩn E.

ictaluri trên môi trường TSA sau 48 giờ ủ ở 28 oC B Vi khuẩn E.taluri nhuộm Gram

(100X) C Vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử Nguồn: http:// microgen.ouhsc.edu

Vi khuẩn E.ictaluri gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá nheo Mỹ (Ictalurus furcatus) [60],

cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan [63], cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở

Việt Nam và Indonesia và trên một số loài cá da trơn khác

1.3.2 Bệnh gan thận mủ trên cá tra

Dịch bệnh là một trong những yếu tố kìm hãm sự phát triển của thủy sản, ảnh hưởngđến chất lượng thủy sản, công sức người nông dân và lợi nhuận của doanh nghiệp Trong đó

bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri, bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila

bệnh trắng đuôi hay các bệnh liên quan đến ký sinh trùng là các bệnh phổ biến trên cá tra[64], [65] Bệnh gan thận mủ xuất hiện đầu tiên ở Đồng bằng Sông Cửu Long vào mùa lũnăm 1998 tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và hiện nay đã lây lan khắp các tỉnh

có nuôi cá tra ở Việt Nam Bệnh vào mùa lũ khoảng tháng 7, 8, 9 và trong một chu kì nuôibệnh có thể xuất hiện 3-5 lần Bệnh xuất hiện trên tất cả các giai đoạn phát triển của cá tra,giai đoạn cá giống có tỷ lệ hao hụt lớn nhất [66]

Dấu hiệu bệnh lý của cá: bên ngoài bình thường, da sậm màu, cá bơi lội lờ đờ, bỏ ăn,tách đàn một vài cá xuất huyết vi, xoang bụng có dịch màu vàng, gan thận trước, thận sauxuất hiện các đóm trắng có đường kính từ 0.5 – 2 mm Thận nhạt màu, nhũn, tỳ tạng xunghuyết, bóng hơi trắng [61]

Hình 1.6 A Giải phẫu cá tra bị nhiễm bệnh gan thận mủ B Các đốm trắng trong nội tạngcủa cá [65].

1.4 Cá tra

1.4.1 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng của cá tra

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một loài cá da trơn trong họ Pangasiidae [67] Cá

tra có da trơn, thân dài, lưng xám đen, lưng hơi bạc, miệng rộng có hai đôi râu dài Cá tra

nhưng có thể chịu nóng đến 45oC

Hình 1.7 Cá tra

Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20năm Cá tra thích ăn mồi tươi sống vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau khi còn nhỏ và chúng vẫntiếp tục ăn nhau nếu không được cho ăn đầy đủ Sức sinh sản của cá tra tương đối có thể tới

135 ngàn trứng/kg con cái cái Mùa vụ sinh sản bắt đầu từ tháng 5-6 âm lịch [68]

Cá tra có thịt trắng, không mùi, hương vị thơm ngon sau khi nấu, có thể chế biến nhiềumón ăn như canh chua, kho, chiên Thịt cá tra rất bổ dưỡng, không chứa cholesterol, chứanhiều thành phần dinh dưỡng như vitamin A, D, E, các acid béo không no cần thiết cho cơthể như MUFA, PUFA, Omega 3 EPA, DHA Ăn cá giúp giảm các bệnh liên quan đến timmạch, tốt cho não, bổ mắt, ngăn ngừa ung thư, da khỏe đẹp [69]

1.4.2 Đóng góp của cá tra trong ngành nuôi trồng thủy sản

Cá tra là một mặc hàng thủy sản xuất khẩu quan trọng của Việt Nam chiếm 90% trongtổng số 1.4 triệu tấn cá da trơn được sản suất trên toàn cầu trong đó cá tra filet là mặc hàngxuất khẩu được ưa chuộng nhất Theo số liệu thống kê từ Hiệp hội chế biến và xuất khẩuthủy sản Việt Nam, trong năm 2019, với tổng diện tích canh tác thủy sản là 4 968 ha cùngvới sản lượng đạt trên 1 triệu tấn, việc xuất khẩu thủy sản đã tạo ra 8.6 tỷ đô la Mỹ cho nềnkinh tế quốc gia, trong đó cá da trơn sọc là mặt hàng xuất khẩu nhiều thứ 2 chiếm 23.2%[70] Việt Nam đã xuất khẩu cá tra sang 131 thị trường với những thị trường chính gồmTrung Quốc-Hồng Kông, Mỹ, EU, ASEAB, Mexico, Brazil, Colombia và Nhật Bản đạt 1.61

tỷ USD, chiếm 80.4% tổng giá trị xuất khẩu Bên cạnh đó mỗi năm ngành nuôi trồng thủysản cá tra tạo ra 20 000 đến 23 000 cơ hội việc làm tại địa phương ở đồng bằng sông CửuLong [71]

Việc nuôi cá tra hiện nay có khá nhiều bất cập từ việc giá cả bấp bênh, phụ thuộc vàocác thị trường xuất khẩu như Trung Quốc và Mỹ, trong những năm trước ngành cá tra cònphải đối mặt với thuế chống bán phá giá, chương trình thanh tra cá da trơn, chiến dịch truyềnthông bôi nhọ từ thị trường EU [72] Bên cạnh đó khi nuôi cá người dân gặp nhiều khó khănkhi cá tra bị nhiễm bệnh và việc sử dụng thuốc kháng sinh quá nhiều làm tăng chi phí Tìnhtrạng sử dụng kháng sinh đến mức báo động đến mức nhiều lô hàng từ các nhà sản xuất cá

da trơn hàng đầu của Việt Nam gần đây đã bị từ chối do tồn dư kháng sinh quá mức tại cácthị trường nhập khẩu như Mỹ, Nhật Bản, Nga, Hàn Quốc và Canada [73]

1.4.4 Tương lai của cá tra Việt Nam

Mặc dù còn gặp rất nhiều khó khăn, nhưng trong tương lai cũng còn rất nhiều cơ hội vàcách giải quyết vấn đề cho ngành cá tra Việt Nam

Về thị trường tiêu thụ: ngoài Trung Quốc và Mỹ là hai thị trường chính của ngành cátra Việt Nam thì chúng ta cần có chiến lược đa dạng hóa thị trường với một số thị trườngmới như Mỹ Latinh, Nam Á và Trung Đông, nơi mà thu nhập cũng như tốc độ đô thị hóatăng nhanh thì các sản phẩm cá tra nuôi giá rẻ có chỗ đứng ổn định trong tương lai.

Về khâu nuôi cá: phải đầu tư vào khâu nuôi, chăm sóc cá giống, nâng cao chất lượng,quy hoạch nuôi tập trung, kiểm soát mầm bệnh, mở rộng thị trường Sản phẩm cá tra đượcsản xuất tuân thủ các tiêu chuẩn quản lý chất lượng quốc tế và an toàn thực phẩm nghiêmngặt như Global GAP, ASC và BAP [74] Để thực hiện điều đó ta cần phải tìm ra mộtphương pháp bền vững, thay thế cho kháng sinh như việc nghiên cứu liệu pháp thực khuẩnthể, chúng ta cần có quy trình kỹ thuật cụ thể giúp cá khỏe mạnh tự nhiên Tóm lại cần nângcao chất lượng cá để từ đó giá thành sản phẩm tăng cao và mang lại nhiều lợi nhuận

1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về việc kiểm soát bệnh gan thận mủ trên cá tra bằng thực khuẩn thể

1.5.1 Nghiên cứu về hiệu quả của thực khuẩn thể trong việc kiểm soát vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong điều kiện in vitro

Năm 2008, báo cáo đầu tiên về thực khuẩn thể đặc hiệu của E ictaluri do Walakira và

cộng sự công bố Hai dòng thực khuẩn thể ΦeiDWF và ΦeiAU đã phân lập và khảo sát hoạttính có chu kì tiềm ẩn là 40 phút và hệ số nhân 270 [75]

Năm 2018, tác giả Hoàng Anh Hoàng và cộng sự đã phân lập từ gan, thận cá tra ởĐồng bằng Sông Cửu Long một dòng thực khuẩn thể độc có tên MK7 xâm nhiễm đặc hiệu

E ictaluri Thực khuẩn thể này cho khả năng bất hoạt E ictaluri trong môi trường tổng hợp

là 15 giờ và trong nước ao là 21 giờ []

Trong Luận văn thạc sĩ của Phạm Đỗ Trà My về “Nghiên cứu phối trộn thực khuẩn thể

nhằm kiểm soát vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra”, tác giả đã

phân lập được các thực khuẩn thể G1, G7, G8 và G9.2 từ gan của cá tra Khảo sát khả năng

ức chế vi khuẩn E ictaluri của các thực khuẩn thể cho thấy hầu hết đều có thời gian ức chế

ổn định tron khoảng 18-20 giờ, ngoại trừ các thực khuẩn thể G9.2 do hoạt tính xâm nhiễm

không ổn định Sau các mốc thời gian trên xuất hiện vi khuẩn kháng thực khuẩn Đây làthách thức lớn nhất của liệu pháp thực khuẩn thể Một trong những giải pháp là sử dụng hỗnhợp thực khuẩn thể (phage cocktail) Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của cácphage cocktail G1 + G7, G7 + G8 và G1 + G8 cho thấy không phải tất cả phage cocktail đềulàm tăng hiệu quả ức chế vi khuẩn Chỉ có phage cocktail G7 + G8 cho thời gian ức chế lênđến 28 giờ, lâu hơn so với từng thực khuẩn thể riêng lẻ [76]

1.5.2 Nghiên cứu về hiệu quả của thực khuẩn thể trong việc kiểm soát vi khuẩn trong điều

kiện in vivo

 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 2014, tác giả Rói Hammershaimb Christiansen đã tiến hành phát hiện, định lượng

thực khuẩn thể tiêu diệt vi khuẩn Flavobacterium psychrophilum gây bệnh trên cá hồi thông qua đường miệng quy mô in vitro Trong nghiên cứu nhóm tác giả kiểm tra sự tồn tại của thực khuẩn thể FpV-9 một thực khuẩn thể đặc hiệu tiêu diệt vi khuẩn Flavobacterium

psychrophilum gây bệnh trên cá hồi với quy mô in vivo, thí nghiệm khảo sát ba con đường

phân phối thực khuẩn thể vào cơ thể của cá: ngâm, đặt ống qua đường miệng vào dạ dày cá

và cho cá ăn bằng thức ăn được phun chế phẩm thực khuẩn thể Trong đó việc sử dụng viênthức ăn có phun thực khuẩn thể đã phát hiện ra các thực khuẩn thể trong ruột, lá lách và

PFU/ mg lá lách Thí nghiệm này chứng minh thực khuẩn thể có khả năng sống sót khi điqua dạ dày cá và đến ruột, bên cạnh đó cũng cho kết quá được thực khuẩn thể có thể chịu

và 10% tỷ lệ sống sót ở 5 oC trong 8 tháng [77] Đây là thí nghiệm có ý nghĩa cho các nghiên

cứu hiệu quả của thực khuẩn thể trong kiểm soát bệnh quy mô in vitro về sau.

Năm 2015 tác giả Yolanda J Silv cùng cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của thực

khuẩn thể kiểm soát Aeromonas salmonicid trên cá Solea senegalensis Mục đích của nghiên

cứu này là để kiểm tra hiệu quả của liệu pháp thực khuẩn thể để vô hiệu hóa vi khuẩn

Aeromonas salmonicida, tác nhân gây bệnh nhọt, một bệnh cá đặc trưng bởi tỷ lệ tử vong và

tỷ lệ mắc bệnh cao Để đạt được mục tiêu này, một thể thực khuẩn mới đã được phân lập,

xác định đặc điểm và thử nghiệm ở những con non Solea senegalensis bị gây nhiễm bệnh Kết quả cho thấy sau 6 giờ xử lý, thể thực khuẩn đã ức chế sự phát triển của A salmonicida

cả trong môi trường nuôi cấy và nước biển khi có cá con (≈ 4 và 2,5 Log PFU mL-1 , tương

ứng) Sau 72 giờ, cá con được xử lý bằng thực khuẩn thể sau khi tiếp xúc với A.

salmonicida không có tỷ lệ tử vong, trái ngược với những cá chỉ tiếp xúc với vi khuẩn này,

tỷ lệ tử vong là 36% Kết quả này chỉ ra rằng việc điều trị thực khuẩn thể đã có hiệu quả.Bên cạnh đó trong nghiên cứu người ta quan sát thấy sự phát triển hạn chế của các tế bào vikhuẩn kháng thuốc và không có sự chuyển đổi lysogeny Không phát hiện thấy tác độngđáng kể nào của việc cấy thực khuẩn lên các quần xã vi khuẩn tự nhiên trong nước nuôitrồng thủy sản Tuy nhiên, cộng đồng vi khuẩn có liên quan đến đường ruột cá bị ảnh hưởngvừa phải khi bổ sung thực khuẩn thể Có tính đến điều này, nghiên cứu này cung cấp bằngchứng cho thấy thực khuẩn thể đã được thử nghiệm có thể chống lại bệnh nhọt hiệu quả và

an toàn trong quá trình sản xuất cá con [78]

 Nghiên cứu trong nước:

Đối với việc thử nghiệm chế phẩm thực khuẩn thể ở quy mô in vivo cũng có một số

nghiên cứu trên bệnh xuất huyết của cá tra, tuy nhiên chưa có nghiên cứu thử nghiệm nàođối với việc sử dụng phage điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra Năm 2017, tác giả Tuấn

Sơn Lê đã nghiên cứu hiệu quả kiểm soát của thực khuẩn thể lên chủng A hydrophila trên cá

tra Trong nghiên cứu tác giả có khảo sát tỷ lệ tử vong tích lũy của cá bằng cách tiêm thựckhuẩn thể Tổng cộng 360 con cá tra khỏe mạnh (30 g/ con) được chia thành 12 nhóm trong

100) Đối chứng dương bao gồm cá tiêm A hydrophila Đối chứng âm 1 và 2 là cá không

tiêm và cá được tiêm chất lỏng tách ra từ nước dùng có chứa vi khuẩn và môi trường tươngứng Chế phẩm thực khuẩn thể bao gồm hỗn hợp 2 phage Φ2 và Φ5 Tỷ lệ cá chết được ghilại 12 giờ trong tám ngày Gan và thận của cá chết và cá sống đều được nghiên cứu phân lập

vi khuẩn Việc phân lập vi khuẩn cho thấy rằng cá chết do A.hydrophila Kết quả: Đối chứng

âm tính 1 (cá không bị tiêm thuốc) và đối chứng âm tính 2 (cá được tiêm môi trường tăngtrưởng được lọc để loại bỏ tế bào vi khuẩn) do thấy cá không bị chết, cho thấy rằng môitrường đối chứng không bị nhiễm tác nhân nào bất lợi về sức khỏe của cá Cá da trơn ở đối

chứng dương tính (nhiễm A.hydrophila) không được xử lý bằng thực khuẩn thể thì tỷ lệ chết

bắt đầu vào ngày thứ 2 với tỷ lệ tử vong tích lũy 81,67 ± 2,36% Ngược lại, cá được xử lývới thực khuẩn thể cho thấy tỷ lệ tử vong thấp hơn ở mỗi MOI khác nhau (p <0,01) Trongkhi không quan sát thấy tỷ lệ tử vong ở các nhóm được điều trị bằng MOI 100, tỷ lệ tử vongtích lũy ở các nhóm khác là 45% (MOI 1) và 68,33 ± 2,36% (MOI 0,01) vào cuối tám ngàythí nghiệm [79].

Bên cạnh đó gần đây nhóm tác giả Dang T.H Oanh đã tiến hành khảo sát hiệu quả củachế phẩm thực khuẩn thể lên việc điều trị bệnh xuất huyết trên cá tra qua việc cho cá ănbằng thức ăn có phun chế phẩm phage ( 20 mL/kg) Tỷ lệ giải phóng thực khuẩn thể từ viênthức ăn vào nước là rất thấp, mật độ thực khuẩn thể trong nước xấp xỉ 1,0 PFU / mL hoặc

không thể phát hiện được Thí nghiệm in vivo đánh giá hiệu quả bảo vệ của thực khuẩn thể

PVN02 đối với bệnh tụ huyết trùng ở cá da trơn sọc dưa được thực hiện với 21 nhóm gồm1.260 con cá trong bể nhựa 50-L làm ba lần Cá da trơn được cho ăn hai lần mỗi ngày bằngthức ăn viên có phun thực khuẩn thể Các mật độ huyền phù vi khuẩn khác nhau được thêmvào bể trong 24 giờ Không có sự tồn tại của thực khuẩn thể, tỷ lệ chết cao nhất là 68,3 ±2,9% ở mật độ huyền phù vi khuẩn cao nhất Ngược lại, tỷ lệ tử vong ở mật độ huyền phù vikhuẩn cao nhất giảm đáng kể xuống còn 8,33 ± 2,9% hoặc 16,67 ± 2,9% ở liều thực khuẩnthể log 6,2 ± 0,09 hoặc log 4,2 ± 0,09 PFU / g Nghiên cứu này cung cấp một phương pháprất thực tế trong việc áp dụng liệu pháp phage để ngăn ngừa bệnh tật ở các trại nuôi cá datrơn sọc lớn [73]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 Chủng thực khuẩn thể - Chế phẩm thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể sử dụng trong các thí nghiệm của luận văn này có tên là M26 Thựckhuẩn thể M26 có thời gian một chu kì xâm nhiễm là 50 phút và hệ số nhân là 110 ± 16.Khoảng pH mà thực khuẩn thể chịu được từ 4 -11 và khoảng nhiệt độ mà thực khuẩn thể cóthể chịu đựng nằm trong khoảng 4 oC – 50 oC

Chế phẩm thực khuẩn thể được trường đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh

chuẩn bị bằng cách lên men chủng vi khuẩn E ictaluri sau đó bổ sung thực khuẩn thể M26

với MOI thích hợp sau đó lọc qua màng lọc và thu được chế phẩm

2.2 Chủng vi khuẩn

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính của thực khuẩn thể quy mô in vitro sử dụng là chủng vi khuẩn Ei1 nhận từ trường đại học Cần Thơ

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính ở quy mô in vivo

được phân lập từ mẫu cá tra bị bệnh gan thận mủ được phục hồi bằng cách cấy lên đĩa môi

định tính thuần Chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường TSB trong 36 giờ, ly tâm 5000vòng/phút trong 3 phút rút bỏ môi trường nuôi và rửa 2 lần bằng dung dịch 0.85% Mật độ vikhuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 610 nm và kết hợp đếm sốkhuẩn lạc trên môi trường TSA

2.3 Cá tra

Trong nghiên cứu này, cá tra sẽ được mua ở nhà cung cấp được cấp phép sau đó đượcchuyển về phòng thí nghiệm thuộc khoa Thủy Sản, đại học Cần Thơ để thử nghiệm Cá trakhỏe mạnh (khoảng 10 g/ trọng lượng cơ thể) không có triệu chứng bệnh gan thận mủ hoặcbất kỳ bệnh nào khác Cá sẽ được đặt trong một bể cá chứa đầy 500 lít nước máy đã khửClo, sục khí liên tục suốt để đảm bảo cung cấp đủ lượng khí cho cá sinh trưởng Thời gianthích nghi của cá sẽ kéo dài một tuần Trước khi thử nghiệm, một số lượng lớn cá tra ( n =

10) sẽ được chọn ngẫu nhiên và giải phẫu để xác nhận không có sự có mặt của A.

hydrophila, E ictaluri hoặc bất kỳ ký sinh trùng nào Quy trình thực hiện trên cá sẽ tuân thủ

nghiêm ngặt theo quy định của bộ y tế về chăm sóc và thao tác động vật thí nghiệm

2.4 Hóa chất và môi trường

Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) sử dụng để nuôi vi khuẩn

Môi trường TSA 0.5 % Agar sử dụng trong phương pháp Plaque Assay để định lượng

thực khuẩn thể

Bảng 2.1 Thành phần và lượng hóa chất môi trường TSA

Dung dịch đệm SM được sử dụng để pha loãng dung dịch chứa thực khuẩn thể

Bảng 2 2 Thành phần và lượng hóa chất dung dịch SM

Môi trường LB: được sử dụng trong phương pháp Plaque assay

Bảng 2.3 Thành phần và lượng hóa chất môi trường LB