Các kỹ thuật phân tích trong công nghệ sinh học thực phẩm nguyên tắc của phương pháp sắc ký

S c ký l ng hi u n ng cao High performance liquid chromatography HPLC • Phase động được bơm vào hệ thông với tốc độ dòng chảy cao high flow rate bởi áp suất cao 55 Mpa.. • Đường kính các

31/10/2011 8:58 SA 1 Nguy n H u Trí

Các k thu t phân tích trong Cơng

ngh Sinh h c Th c ph m

K thu t s c ký Chromatography Technology

S phân tách các ch t tan d a vào ái l c t ng i c a: ch t tan i

v i pha di ng và ch t tan i v i th n n.

M t ch t tan cĩ ái l c i v i pha di ng l n h n so v i ái l c v i

th n n s cĩ xu h ng di chuy n cùng pha so v i pha di ng.

Trong m t dung d ch cĩ n ch t tan, ch t nào cĩ ái l c v i pha di ng

l n nh t s cĩ th i gian l u nh nh t, s ra kh i c t s c khí s m

nh t.

S c ký h p th c (Adsorption chromatography)

S c ký trao i ion (Ion-exchange chromatography)

S c ký l c gel (Gel permeation chromatography)

S c ký ái l c (Affinity chromatography)

S c ký o pha (Reverse phase chromatography)

S c ký l ng cao áp (High performance liquid chromatography)

Kỹ thuật sắc ký

M u (sample): c n c l c tr c khi ch y s c ký.

Buffer: l c nh m lo i b t p nhi m tr c khi s d ng.

Pha ng (mobile phase): Dung mơi b m t reservoir vào c t (column) s c ký Nhi u h n m t reserovoir, pha

ng c b m vào Mixer (máy tr n) tr c khi vào c t.

Pha t nh (stationary phase): c gi l i trong c t b i mơt mi ng bơng th y tinh áy c t.

Các phân t sinh h c c tách ra t i c t s c ký.

Trong HPLC, Guard column c s d ng nh m b o v

c t s c ký.

Detector: UV b c sĩng 280 nm detect h u h t protein

UV 205 220 detect c nh ng protein hay peptide ít c u

t cĩ m ch vịng.

31/10/2011 8:58 SA 7 Nguy n H u Trí

Sắc ký lỏng (liquid chromatography)

Thành ph n c b n

Partition coefficient:

Cs: n ng m u trong pha t nh (Stationary phase) Cm: n ng m u trong pha ng (Mobile phase)

Sắc ký lỏng

Thơng s trong s c ký l ng

Retention time (tR): th i gian phân t sinh h c ra

kh i c t s c ký tính t lúc n p m u.

retention volume(VR):

Rf

Thơng s trong s c ký l ng

Resolution (R): Thơng s dùng ánh giá m c tách các phân t sinh h c trong m u.

W: r ng c a áy beat.

31/10/2011 8:58 SA 13 Nguy n H u Trí

Pha t nh (stationary phase)

Tách r a kh i c t (elution)

Mobile phase: ng ch m, cĩ pH, l c liên k t ion, tính phân c c thay i theo dãy Gi m h s K.

M i phân t sinh h c trong m u cĩ kh n ng ái l c riêng i v i pha t nh.

Open column chromatography

(low performance liquid chromatography)

S d ng áp su t khí quy n, phân tách th p

ng kính c a các h t trong pha t nh t ng i l n.

C t s d ng các v t li u r ti n Vd: plastic.

- phân tách th p.

S c ký l ng hi u n ng cao (High performance liquid chromatography

HPLC)

• Phase động được bơm vào hệ thông với tốc độ dòng

chảy cao (high flow rate) bởi áp suất cao (55 Mpa).

• Đường kính các hạt trong pha tĩnh nhỏ, chứa lỗ nhỏ li

ti giúp các phân tử sinh học đi vào, và đặc biệt chịu được áp suất cao (các hạt phải rắn hơn các hạt được dùng trong open column chromatography)

• Việc tách rửa tốt khi tốc độ pha động ổn định.

• Trong HPLC, pha động thường là hỗn hỡp của hai

thanh phần hoặc nhiều hơn -> mixer.

• Đường ống và cột sắc ký được làm bằng thép không

rĩ.

• Dung môi phải được khử khí và lọc trước khi sử dụng.

Size exclusion chromatography hay gel filtration Phân t sinh h c c gi trong pha dung mơi

su t quá trình s c ký.

Tách l c các phân t sinh h c d a trên kích

th c và hình dáng.

31/10/2011 8:58 SA 19 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 20 Nguy n H u Trí

S c ký l c gel (gel filtration)

Protein nh vào các h t bead

và c gi l i.

C t th y tinh Các h t gel polysaccharide.

Các protein l n b l ai ra

kh i h t và ra kh i c t s c ký

tr c protein nh h n.

S c ký l c gel (gel filtration)

Pha t nh g m các h t gel

khơng nh (x p).

Protein càng nh , càng

d vào h t gel và c

gi lâu h n.

Protein tách r a kh i c t

theo th t kh i l ng

phân t gi m d n.

S c ký l c gel (gel filtration)

ng d ng:

Xác nh kh i l ng phân t

Lo i b các phân t cĩ kích th c nh khơng

c n thi t Vd: Lo i b mu i kh i dung d ch protein tr c khi th c hi n s c ký trao i ion.

Tinh s ch protein

S c ký h p ph

Trong s c ký h p ph , ch t tan

và pha ng cùng tranh nhau v

trí g n trên pha t nh.

Pha t nh cĩ c u trúc m giúp

protein d dàng thâm nh p vào

các h t ti n v v trí g n k t

(binding site)

Tùy vào ki u liên k t gi a

protein và pha t nh:

S c ký trao i ion

S c ký ái l c

S c ký k n c

S c ký ng c pha

Sắc ký trao đổi ion

31/10/2011 8:58 SA 25 Nguy n H u Trí

Protein thay th counterion

Na+, Cl g n vào pha t nh

b ng l c hút t nh i n.

Khi ĩ Na+, Cl- c g i là

Ion exchange group hay

ion Exchanger.

S g n k t hồn tồn->

trung hịa i n

Sắc ký trao đổi ion

i n tích protein do i n tích các m ch nhánh (R side chain)

c u t mơi tr ng pH nh t nh quy t nh.

T i pH acid, h u h t Protein tích i n d ng và

ng c l i.

Cĩ 2 lo i ion exchanger:

Cation exchanger: cĩ kh

n ng g n k t ion d ng Anion exchanger: cĩ kh

n ng g n k t ion âm

M ch nhánh tích i n

g n vào: cellulose, Agarose, dextran, hay silica (HPLC)

31/10/2011 8:58 SA 31 Nguy n H u Trí

Một số ion exchanger thông dụng

Tách r a

Gradient n ng NaCl và KCl c dùng tách

r a protein ra kh i c t s c ký (C ng cĩ th dùng gradient pH c a buffer)

Non polar side chain: Ala,

Val, leu, Ile, Trp, Met, Phe,

Pro Th ng tâp trung t i lõi

protein.

Cĩ th tìm th y trên b m t

protein các protein khác

nhau cĩ tính k n c b

m t khác nhau.

n c.

Các lo i ligand

31/10/2011 8:58 SA 37 Nguy n H u Trí

Tách r a

Protein c n p vào c t s c ký ch a nhóm octyl

và phenyl v i s hi n di n 2M (NH 4 ) 2 SO 4

Tách r a: dùng gradient n ng gi m d n (2M 0)

(NH 4 ) 2 SO 4

Normal phase chromatography

Pha t nh: phân c c.

Pha ng: gradient nông dung moi phân c c

t ng d n.

Protein phân c c h n s

ra kh i c t sau và ng c

l i.

phase chro.) Pha t nh: các nhánh hydrocarbon (4,

C-8, C-18) c g n lên pha t nh.

M u c cho vào dung môi phân c c

nh : n c, methanol, acetronitrile ho c

h n h p.

Proteins s g n vào pha t nh theo t ng tác k n c theo các m c kh c nhau.

Tách r a: s dung gradient n ng t ng

d n acetonitrile và gradient n ng n c

gi m d n -> s t ng d n c a tính k n c trong pha ng

S c ký ái l c (affinity chro.)

Enzyme nh n bi t và

g n v i c ch t là m t

d ng ái l c.

-> lý thuy t xây d ng

s c ký ái l c.

Pha t nh: Affinity

pha t nh.

S c ký ái l c (affinity chro.)

31/10/2011 8:58 SA 45 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 46 Nguy n H u Trí

M t s ví d s c ký ái l c

Antigen ligand -antibody Protein A c c nh trên pha t nh.

IgG (immunoglobulin)s g n v i protein A t i vùng Fc: n ng mu i cao, Ph cao.

Tách r a: pH 2-4; IgG 1; IgG 2a; IgG 2b c phân tách ra kh i c t d a vào s khác nhau c a vùng Fc.

Qui trình ELISA

Modified from Specter, S C., R L Hodinka and S A Young Clinical Virology Manual, Third Edition ASM Press, 2000. 31/10/2011 8:58 SA 48 © Hank Morgan/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.Nguy n H u Trí

Figure 5.20: HIV ELISA test.

31/10/2011 8:58 SA 49 Nguy n H u Trí

M u xét nghi m

E E

30 phút, T th ng

C ch t

C ng h p

37 °C

R A

R

A

37 °C

K thu t ELISA gián ti p

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

30 phút/ 37 °C

M u XN

KN g n trên

gi ng

+

R A 3 X

R A 5 X

c chât

30 phút/ 37 °C 30phút/ T o phịng

Ng ng

ph n ng.

c

k t qu 450nm

E

C ng h p

+

K thu t ELISA SANDWICH

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

M u xét nghi m

E E

30 phút, T th ng

C ch t

C ng h p

37 °C

R A

K thu t ELISA c nh tranh

Phản ứng màu tỷ lệ ngh ịch với nồng độ kháng thể

KN & KT M u XN

B c 1: 60 phút/ 37 °C

+

R A 3 X

R A 5

B c 2 : 30 phút/ T o phịng 30phút/ T o phịng

C ng h p

+

E

?

Kháng nguyên và Kháng th

Tách chi t nucleic acid

1 Các ph ng pháp tách chi t nucleic acid

 Ph ng pháp tách chi t DNA

 Ph ng pháp tách chi t RNA tồn ph n và

mRNA

 Ly tâm

 Ph ng pháp s c ký

2 Các ph ng pháp nh tính và nh l ng thơ

nucleic acid

 Ph ng pháp o b ng quang ph k

 Ph ng pháp i n di

Tách chi t DNA

 thu nh n DNA tinh s ch c n lo i b nh ng thành ph n t p nhi m, mà quan tr ng nh t là protein.

 S tách chi t DNA d a trên nguyên t c hịa tan khác nhau c a các phân t khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/n c).

 M c ích là thu c các phân t nucleic acid tr ng thái nguyên v n t i a, khơng b phân h y b i các tác nhân c h c hay hĩa h c.

 Các nucleic acid c n c tách chi t trong i u ki n nhi t

th p c ch ho t ng c a các enzyme n i bào (DNase và RNase).

 Sau cơng o n tách chi t, nucleic acid tinh s ch n m trong

m t th tích dung d ch l n S t a k t h p v i ly tâm cho phép thu nh n nucleic acid d i d ng c n t a d b o qu n và khi c n cĩ th hịa l i trong n c theo n ng mong mu n.

31/10/2011 8:58 SA 55 Nguy n H u Trí

Tách chi t DNA

B c 1: phá màng t bào, màng nhân

B c 2: lo i protein

B c 3: thu h i nucleic acid

 Phá màng t bào, màng nhân: nghi n t bào, mô trong m t h n

h p ch t t y (SDS) và proteinase phá v màng t bào, màng nhân, gi i phóng DNA ra môi tr ng ng th i phân h y các protein liên k t v i DNA.

Ch t t y là phân t l ng c c, s k t h p v i protein màng và các phân t phospholipid làm phá v c u trúc màng.

Ch t t y ion hóa có tác d ng phá màng m nh, ch t t y không ion hóa có tác d ng phá màng nh h n.

 Lo i protein: l c m u trong dung d ch phenol:chloroform bi n tính protein ng th i không hòa tan nucleic acid Protein b bi n tính không hòa tan trong pha n c có ch a nucleic acid và sau khi

li tâm s t a thành m t l p n m gi a pha n c và pha phenol:chloroform Thu h i nucleic acid trong pha n c.

 T a nucleic acid: nh m thu nh n nucleic acid d i d ng cô c

b o v chúng kh i s phân h y c a các enzyme và khi c n có th hòa l i trong n c theo n ng mong mu n Có th t a trong ethanol ho c isopropanol Sau ó li tâm thu nh n l i nucleic acid C n t a c r a trong ethanol 70% lo i b các mu i

ho c các d u v t c a isopropanol.

Tách chi t DNA

Ly tâm phân o n (a)

và phân o n vùng

(b) phân tách các

trình t trong h n

h p d a trên kh i

l ng c a chúng.

Th i gian và l c ly

tâm c xác nh

cho t ng nhóm ph n

có t tr ng th p h n

tách.

Tách chi t DNA

Ly tâm ng t tr ng (isopycnic) phân tách các ph n t trong h n h p d a trên t

tr ng c a chúng Th i gian và l c ly tâm là

ly tâm có t tr ng v i giá tr i t th p n cao h n t tr ng c a các ph n t c n phân tách.

Ly tâm trên gradient liên t c CsCl: trong quá trình ly tâm, dung d ch CsCl s t

ng hình thành m t gradient ng t

tr ng v i t tr ng t ng d n t mi ng ng

xu ng áy ng D i tác ng c a l c ly tâm, các nucleic acid di chuy n trong ng

và n v trí có t tr ng b ng v i t tr ng

c a chính nó s ng ng l i và hình thành

m t l p c nh trong ng L p này c thu nh n l i sau ly tâm.

Tách chi t DNA

S c ký ái l c: trên poly U-Sepharose hay

oligodT-cellulose, dùng tinh s ch mRNA.

S c ký l c gel dùng trong phân tách các nucleic

acid và nucleotic t do sau quá trình t o m u dò

(probe) ánh d u.

S c ký trao i ion trên vi c t thu h i nh ng

l ng r t nh DNA.

S c ký l ng hi u su t cao: có phân gi i r t

oligonucleotide t ng h p, plasmid, phân tách các

o n DNA.

i n di:

- Gel agarose

- Gel polyacrylamide

density)

31/10/2011 8:58 SA 61 Nguy n H u Trí

M c tiêu:

 nh tính: s hi n di n, c u hình phân t , kích th c

 nh l ng: hàm l ng t ng i so v i thang hàm

l ng

 Chu n b : thu h i o n DNA (dùng t o dòng, )

Nguyên t c: d a vào c tính c u trúc c a các nucleic

acid: tích i n âm ng u trên kh p b m t c a m t

i n tr ng nên s di chuy n v c c d ng c a i n

tr ng.

Tính linh ng c a phân t khi di chuy n trong i n

tr ng ph thu c vào kh i l ng phân t và n ng

các ch t c u thành gel.

Ki u i n di: Agarose, polyacrylamide, i n di trong

tr ng xung(PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis)

i n di - Electrophoresis

Chu n b m u, gel (agarose, polyacrylamide ),

b n i n di, buffer, dung d ch i n di

N p m u

Ch y i n di Nhu m gel.

i n di trên gel Chu n b m u, gel (agarose, polyacrylamide ),

b n i n di, buffer, dung d ch i n di

N p m u

Ch y i n di

Nhu m gel.

Ch t nh m gel - Stain

i n di trên gel agarose

Gel agarose là lo i gel thông d ng nh t,

th ng dùng phân tách nh ng o n

có kích th c 0,5-20 kb.

i n di theo ph ng n m ngang

phân gi i thay i khi n ng

agarose hay lo i agarose thay i.

Phát hi n b ng phóng x t ghi, nhu m

ethidium bromide Ch t này có kh n ng

g n xen vào gi a các base c a nucleic

acid và s phát hu nh quang d i tia t

ngo i.

ng d ng: phát hi n 1 trình t DNA,

phân tích h n h p các trình t DNA

(Southern blot), chu n b nguyên li u

i n di bi n tính (Denaturing electrophoresis) SDS polyacrylamide gel

electrophoresis (SDS PAGE):

Gel: polyacrylamide SDS: M ch 12 cacbon k

n c.

-> che ph ph n k n c trên protein -> protein tích

i n âm (-).

31/10/2011 8:58 SA 67 Nguy n H u Trí

i n di trên gel polyacrylamide

c dùng tách các o n có kích

th c nh , d i 1000 c p base.

i n di theo ph ng th ng ng

phân gi i cao, phân bi t c nh ng

trình t ch cách nhau 1 nucleotide.

Ph ng pháp phát hi n: DNA phóng x

t ghi, xanh methylene, ethidium bromide,

protein xanh Coomassie, nhu m nitrate

b c.

ng d ng: tinh s ch các oligonucleotic

t ng h p, xác nh trình t DNA, tách các

trình t DNA có kích th c g n b ng

nhau, SDS-PAGE (phân tích protein)

quang ph k Cho phép nh l ng t ng i n ng nucleic acid

có trong m u.

Nguyên t c: d a vào s h p thu m nh ánh sáng t ngo i b c sóng 260 nm c a các base.

Giá tr m t quang b c sóng 260 nm c a các m u

o cho phép xác nh n ng nucleic acid trong m u

d a vào m i t ng quan:

M t n v OD 260nm t ng ng v i n ng :

 50 g/ml cho m t dung d ch DNA s i ôi

 40 g/ml cho m t dung d ch DNA hay RNA s i n

nh tính: s ch d a trên t s OD 260 /OD 280 , tính ch t

c a nucleic acid (m ch ôi/ n) (280 nm là b c sóng

ó các protein có m c h p th cao nh t.

C s c a s lai phân t

 Khi m t phân t DNA m ch ôi c un lên m t nhi t

v t quá nhi t nóng ch y (Tm) thì hai m ch s tách r i nhau do s phá v các liên k t H gi a hai

m ch.

 Sau khi hai m ch tách r i, n u nhi t ph n ng c làm gi m t t c ng v i i u ki n thí nghi m thích h p, chúng s b t c p tr l i Hi n t ng này c g i là s lai phân t

 c i m c a s lai phân t :

 c hi u tuy t i: s tái b t c p ch x y ra gi a hai trình t hoàn toàn b sung v i nhau.

Các trình t b sung có th là DNA hay RNA, d n n

s hình thành các phân t DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân t lai DNA-RNA

Các ki u lai phân t

Lai trên pha l ng

Lai trên pha r n

Lai t i ch

Lai trong pha l ng:

Các trình t c n lai n m trong pha l ng, là m t dung

d ch m S lai phân t x y ra khi các trình t này g p nhau do chuy n ng nhi t và khi nhi t môi tr ng

th p h n Tm Ph ng pháp này c s d ng phát

hi n các trình t t ng ng (gi a các loài hay trong

m t cá th ).

31/10/2011 8:58 SA 73 Nguy n H u Trí

Lai trong pha r n: M t trong hai trình t c n lai

th r n (màng lai) Phát

hi n phân t lai thông qua m u dò (probe) có

phóng x

Ba k thu t lai trên pha

Southern blot, Northern blot, Dot blot.

Lai t i ch :

Trình t nucleic acid c n tìm không c tách chi t ra

kh i mô hay t bào Quá trình lai v i m u dò ã c ánh d u và phát hi n các phân t lai c th c hi n ngay trên nhi m s c th , t bào hay lát c t mô.

Southern blot

Nguyên t c c a Southern blot là màng lai

nitrocellulose có kh n ng ti p nh n DNA ã c

bi t t lâu và ã c s d ng trong các nghiên

c u lai axit nucleic khác nhau vào nh ng th p niên

1950 và 1960.

u th p niên 1970, s ra i c a ph ng pháp

i n di trên gel ã cho phép các o n DNA c

c t b i enzyme h n ch có th c phân tách d a

trên c s kích th c c a chúng.

T ó b c phát tri n ti p theo c a ph ng pháp

là chuy n các o n DNA phân tách t gel lên màng

lai nitrocellulose.

Ð i h c Edingburgh vào n m 1975.

Southern blot bao g m các b c c b n sau:

C t DNA b ng enzyme h n ch thích h p.

Ði n di s n ph m c t trên gel agarose.

Làm bi n tính DNA ngay trên gel, DNA s i kép s c tách thành DNA s i n Ch DNA s i n m i có th chuy n lên màng lai.

Chuy n DNA ã bi n tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay màng nylon) Vi c chuy n DNA th ng c ti n hành b ng ho t tính mao d n trong kho ng vài ti ng ho c có th dùng m t thi t b

th m chân không Trong quá trình chuy n, v trí các o n DNA v n

c gi nguyên không thay i.

Lai DNA ã c c nh trên màng v i m u dò (probe) DNA có ánh d u Quá trình này d a trên nguyên t c b sung gi a DNA trên màng lai v i m u dò Ð ánh d u ng i ta th ng s d ng P32, biotin/streptavidin ho c m t m u dò phát quang sinh h c.

Ð nh v các phân t lai DNA-m u dò N u s d ng m u dò ánh

d u phóng x thì dùng ph ng pháp phóng x t ghi (autoradiograph) xác nh, n u s d ng biotin/streptavidin thì dùng ph ng pháp so màu ho c n u s d ng m u dò phát quang sinh h c thì phát hi n b ng s phát quang.

Southern blot

Northern blot Sau khi E M Southern mô t ph ng pháp Southern blot vào

n m 1975, ng i ta ã dùng m t ph ng pháp t ng t xác nh các o n RNA c bi t g i là Northern blot.

Northern blot bao g m các b c c b n sau:

RNA (RNA t ng s ho c ch mRNA) c phân tách b ng

i n di trên gel agarose.

RNA sau khi ã phân tách c chuy n lên màng lai (các phân t RNA gi nguyên v trí nh trên gel).

RNA c nh trên màng c lai v i m u dò DNA s i n (ho c RNA) có ánh d u phóng x ho c c g n v i m t enzyme (alkalin phosphatase ho c horseradish peroxidase)

t o thành phân t lai RNA-DNA (ho c RNA-RNA) s i kép.

V trí c a m u dò c phát hi n nh k thu t phóng x t ghi n u nó c ánh d u phóng x Trong tr ng h p m u

dò c g n v i enzyme thì em v i m t c ch t không màu Enzyme liên k t v i nó s bi n i thành m t s n ph m màu có th nhìn th y ho c phát ra ánh sáng mà s c phát

hi n b ng phim X quang m t cách tr c ti p.