CHUẨN hóa cây CON LAN hồ điệp (PHALAENOPSIS AMABILIS) có NGUỒN gốc từ tế bào đơn PHỤC vụ CÔNG tác NHÂN GIỐNG

Kh ảo sát ảnh hưởng của kích thước cây con lên khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng ở giai đoạn vườn ươm Cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro với các kích thước khác nhau đư

CHU ẨN HÓA CÂY CON LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS) CÓ NGUỒN GỐC

Tr ịnh Thị Lan Anh 1 , H ồ Thanh Tâm 2 , Lê Kim Cương 2 , Nguy ễn Bá Nam 2 , Nguy ễn Thị Thanh Hiền 3 ,

Võ Th ị Bạch Mai 1 , Dương Tấn Nhựt 2

1 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

2 Vi ện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3 Trường Đại học Tôn Đức Thắng

TÓM TẮT

Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis amabilis) là một trong những loài hoa có giá trị kinh tế cao nhưng khó nhân

giống Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp khác nhau trong nghiên cứu tái sinh cây lan Hồ Điệp như hình thành protocorm-like-body (PLB), nhân nhanh chồi, nuôi cấy callus Tuy nhiên, chưa có nhiều những nghiên

cứu về tái sinh cây con từ huyền phù tế bào đơn cũng như chuẩn hóa cây con in vitro Trong nghiên cứu này,

những chồi lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ tế bào đơn được chuẩn hóa thành những cây con hoàn chỉnh, đảm bảo tiêu chuẩn phục vụ cho công tác nhân giống Ảnh hưởng hàm lượng chất khoáng, mật độ mẫu cấy, tuổi cây con lên sự sinh trưởng trong điều kiện in vitro cũng như ảnh hưởng của kích thước cây in vitro lên khả năng sinh

trưởng và phát triển ở giai đoạn vườn ươm được khảo sát Sau 2 hai tuần, các cây con có nguồn gốc từ các tế bào đơn lan Hồ Điệp cảm ứng với môi trường nuôi cấy và bén rễ Sang tuần thứ tư có hiện tượng kéo dài lá và

rễ, gia tăng đường kính lá Kết quả nghiên cứu sau 3 tháng cho thấy môi trường ½MS bổ sung 15% nước dừa phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro, mật độ mẫu cấy thích hợp là 3 mẫu/bình, độ tuổi

thích hợp cho cấy chuyền là 3 tháng tuổi, kích thước cây con phù hợp là 3 cm Các cây con khoảng 4 cm là thích hợp nhất để trồng ra vườn ươm

Từ khóa: cây con, chuẩn hóa, lan Hồ Điệp, nhân giống, tế bào đơn, vườn ươm

MỞ ĐẦU

Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) là loài hoa có

màu sắc phong phú, giàu sức quyến rũ, đây là một

trong những loài hoa có giá trị kinh tế cao trên thị

trường hoa chậu và hoa cắt cành trên thế giới Tuy

nhiên, lan Hồ Điệp và lan Hài (Paphiopedium sp.) là

hai loài lan khó nhân giống nhất hiện nay Khó khăn

lớn nhất trong nhân giống vô tính Phalaenopsis là

nguồn mẫu rất hạn chế do chúng là loài đơn thân, sử

dụng chồi đỉnh để nhân giống như các loài lan khác

sẽ làm tổn thương cây mẹ Vì vậy, việc nghiên cứu

nhân giống cây lan Hồ Điệp rất được chú trọng Cho

đến nay, đã có nhiều phương pháp khác nhau trong

nghiên cứu tái sinh cây lan Hồ Điệp như hình thành

protocorm-like-body (PLB), nhân nhanh chồi, nuôi

cấy callus (Arditi and Ernst, 1993; Ishii et al., 1998;

Park et al., 2003) Tuy nhiên, không phải tất cả các

phương pháp này đều có thể sử dụng được cho vi

nhân giống thương mại vì sự hình thành PLB, sự tái

sinh cây con và tỷ lệ sống sót của cây con ở mỗi

phương pháp là khác nhau

Hầu hết các phương pháp nhân giống lan Hồ

Điệp hiện nay đều chú trọng đến sự hình thành PLB,

phát sinh phôi vô tính, tái sinh cây con từ PLB và phôi vô tính mà chưa có nhiều những nghiên cứu về tái sinh cây con từ huyền phù tế bào cũng như chuẩn

hóa cây con in vitro Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát sự sinh trưởng và phát triển những cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào nhằm chuẩn hóa cây con, tạo những cây đồng nhất, chất lượng cao, phục vụ công tác nhân giống

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

Ngu ồn mẫu

Nguồn mẫu được sử dụng trong thí nghiệm là các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn của lan Hồ

Điệp (Paphiopedium amabilis) có tại phòng Sinh học

Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên

cứu Khoa học Tây Nguyên

Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Tất cả các môi trường thí nghiệm (MS, ½MS) được chứa trong các bình thủy tinh loại 250 ml, thể tích môi trường là 40 ml/bình Môi trường được điều

chỉnh về pH = 5,3; sau đó toàn bộ môi trường được

hấp khử trùng trong autoclave ở nhiệt độ 121°C, áp

suất 1 atm trong thời gian 20 phút

B ố trí thí nghiệm

Kh ảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả

năng sinh trưởng của cây con trong điều kiện in

vitro

Các cây con 3 tháng tuổi, kích thước cây khoảng

3 cm được cấy vào môi trường MS và môi trường

½MS có bổ sung nước dừa với các tỷ lệ khác nhau

(10%, 15%, 20%) kết hợp với 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l

NAA; 30,0 g/l sucrose; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt

tính nhằm để khảo sát ảnh hưởng của việc thay đổi

hàm lượng nước dừa, hàm lượng khoáng đa lượng

lên khả năng sinh trưởng của cây con in vitro

Kh ảo sát ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền

lên kh ả năng sinh trưởng của cây con trong điều

ki ện in vitro

Các cây con 3 tháng tuổi, kích thước cây 3 cm

được cấy vào các bình có thể tích 250 ml trên môi

trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l

NAA; 20% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l

than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3 với các mật độ

khác nhau (1, 2, 3, 4, 5 cây/bình)

Kh ảo sát ảnh hưởng của kích thước cây con lên sự

sinh trưởng của chúng trong điều kiện in vitro

Các cây con 3 tháng tuổi với các kích thước

khác nhau (1, 2, 3, 4 cm/cây) được cấy chuyền sang

môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l

NAA; 20% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l

than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3

Kh ảo sát ảnh hưởng của tuổi cây con khi cấy chuyền

lên s ự sinh trưởng của chúng trong điều kiện in vitro

Các cây con có độ tuổi khác nhau (2, 3, 4 tháng

tuổi) được cấy vào các bình có thể tích 250 ml (kích

thước cây 3 cm, cấy 3 cây trong một bình) trên môi

trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l

NAA; 20% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l

than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3

Kh ảo sát ảnh hưởng của kích thước cây con lên khả

năng sinh trưởng và phát triển của chúng ở giai

đoạn vườn ươm

Cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro với các

kích thước khác nhau được chuyển ra trồng ex vitro

trong điều kiện vườn ươm của Viện Nghiên cứu

Khoa học Tây Nguyên Chúng tôi tiến hành theo dõi

sáu kích thước sau của cây in vitro trong điều kiện

vườn ươm: kích thước lớn: 7,23 ± 0,81 cm; cây có kích thước vừa: 5,47 ± 0,60 cm; kích thước trung bình: 4,17 ± 0,43 cm; kích thước nhỏ vừa: 2,73 ± 0,51 cm; kích thước nhỏ trung bình: 1,95 ± 0,37 cm; kích thước nhỏ nhất: 1,01 ± 0,23 cm

Cây con được trồng ra vỉ xốp, thời gian đầu được để ở nơi ít ánh sáng để tránh ánh nắng trực tiếp chiếu vào cây, tưới phun sương 2 lần/ngày (trong

tuần đầu) để giữ độ ẩm cho cây (khi tưới lưu ý không

để nước đọng nhiều trên cây con, vì như thế cây dễ

bị thối ngọn, thối rễ dẫn đến chết) Số lần tưới nước trong ngày nhiều, lượng nước cho mỗi lần tưới ít đối

với cây còn nhỏ Sau đó tưới 1 lần/ngày vào khoảng

từ 8 – 10 giờ trong ngày

Sau khi trồng trong vỉ xốp khoảng một tháng, cây được chuyển ra nơi có ánh sáng nhiều hơn lúc ban đầu (vẫn trong điều kiện vườn ươm có che chắn, che sáng 70%) Lúc này cây đã quen dần với điều

kiện ex vitro, lượng nước trong mỗi lần tưới tăng lên

nhưng số lần tưới giảm đi

Khi cây được hai tháng tuổi, chuyển cây từ vỉ

xốp trồng vào trong các chậu nhựa, các chậu này thường có lỗ nhỏ ở đáy chậu để đảm bảo sự thoát nước tránh cho cây không bị úng (với giá thể trồng cây lan Hồ Điệp trong các chậu nhựa là dớn New Zealand) Tiếp tục chăm sóc, tưới nước, nhổ cỏ, bón phân, phun thuốc diệt nấm, bệnh cho cây mỗi tuần

một lần Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển

của cây

Ch ỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần, mỗi lần

tiến hành trên 25 bình nuôi cấy với 3 mẫu/bình

Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm MicroSoft Excel® 2003 Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống

kê và biểu diễn dưới dạng trung bình của mẫu ± độ

lệch chuẩn

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau 2 hai tuần cấy chuyền, các cây con có nguồn

gốc từ các tế bào đơn lan Hồ Điệp cảm ứng với môi trường nuôi cấy và bén rễ Sang tuần thứ tư có hiện tượng kéo dài lá và rễ, gia tăng đường kính lá, các cây con ở tất cả các nghiệm thức đều rất khỏe, có bộ

lá xanh tốt, bộ rễ khỏe Tuy nhiên, sự gia tăng kích thước ở các nghiệm thức có khác nhau Sau ba tháng nuôi cấy tiến hành thu nhận kết quả

Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng

sinh trưởng của cây con trong điều kiện in vitro

Khi nuôi cấy các cây con trên môi trường ½MS

hoặc MS, việc bổ sung 15% nước dừa vào môi

trường nuôi cấy cho khả năng sinh trưởng của cây

con tốt nhất Cây con trên các môi trường có bổ sung

nước dừa với nồng độ 10, 15 và 20% cho thấy sự

khác nhau rõ rệt về các chỉ tiêu sinh trưởng Tuy

nhiên, nhìn chung về hình thái, màu sắc của các cây

con trên môi trường MS xanh đậm hơn, lá mướt hơn

Về mặt cảm quan, nuôi cấy trên môi trường ½MS

cho các cây con khỏe hơn, bộ rễ khỏe hơn, cây chắc

hơn, lá dày hơn, có màu sắc gần với các cây con bên

ngoài tự nhiên Ở nghiệm thức ½MS bổ sung 15%

nước dừa, cây sinh trưởng tốt nhất, các chỉ tiêu sinh

trưởng như trọng lượng tươi (2,939 g/cây), chiều cao

cây (6,294 cm/cây), chiều dài rễ (4,925 cm/rễ),

đường kính lá (1,938 cm/lá) đều cao nhất Các đặc

điểm hình thái cho thấy đây là cây rất khỏe với bộ rễ

khỏe, lá xanh bóng, dày, mép lá và mặt dưới của các

lá non có nhiều sắc tố màu tím (Bảng 1, Hình 1)

Trong nuôi cấy in vitro, thành phần khoáng có

vai trò quan trọng trong việc sinh trưởng và phát

triển của cây Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro cho thấy cây sâm Ngọc

Linh sinh trưởng phát triển trong môi trường SH tốt

hơn MS và ½MS (Nhut et al., 2009) Bên cạnh đó,

nước dừa cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây con in vitro, là nguồn cung cấp đạm dồi

dào do thành phần của nước dừa có chứa nhiều acid amin, acid hữu cơ, sucrose, fructose và glucose Nước dừa được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy lan (Ernst, 1967; Hegarty, 1955; Luận et al., 2012)

Tóm lại, trong thí nghiệm này, các cây con sinh trưởng trên môi trường ½MS tốt hơn trên môi trường

MS Các cây con sinh trưởng trên môi trường MS rất giàu khoáng, do đó, lá mướt và non hơn, nhưng điều

đó có thể làm cho cây khó thích nghi hơn khi ra ngoài vườn ươm, có thể lá sẽ nhanh mất nước hơn Ở

cả môi trường ½MS và môi trường MS khi bổ sung 15% nước dừa đều cho khả năng sinh trưởng tốt hơn; trong đó, nghiệm thức ½MS bổ sung 15% nước dừa

là tốt nhất Hơn nữa, môi trường ½MS lại cho hiệu

quả kinh tế cao hơn do nguồn chi phí cho thành phần khoáng trong môi trường giảm phân nửa

B ả ng 1 Ảnh hưở ng c ủa hàm lượng khoáng đa lượ ng k ế t h ợ p v ớ i s ự thay đổi hàm lượng nướ c d ừ a, NAA, BA, sucrose c ố

đị nh lên s ự sinh trưở ng c ủ a cây con sau 3 tháng nuôi c ấ y

Khoáng Nướ c

d ừ a

Tr ọng lượ ng tươi (g) S lá/cây ố lượ ng

S ố lượ ng

r ễ /cây

Chi ề u cao cây (cm)

Chi ề u dài

r ễ (cm)

Đườ ng kính

lá (cm) Đặc điể m

MS 10% 1,552± 0,59 3,20 ± 0,54 6,93 ± 2,21 3,03 ± 0,58 3,65 ± 0,92 1,387 ± 0,27 Cây khỏ e, s ứ c

s ố ng t ố t

MS 15% 2,939 ± 0,78 3,69 ± 0,68 9,63 ± 2,12 6,30 ± 0,99 4,93 ± 1,46 1,938± 0,35

Cây kh ỏ e, m ậ p,

m ặt dướ i lá có nhi ề u s ắ c t ố tím, phi ế n lá dày

MS 20% 1,776 ± 1,01 3,53 ± 1,03 8,17 ± 2,04 3,87 ± 1,10 4,02 ± 0,80 1,523 ± 0,32

Cây kh ỏ e, lá to tròn, m ặt dướ i mép

lá có nhi ề u s ắ c t ố

tím, phi ế n lá dày

½MS 10% 1,591 ± 0,46 4,20 ± 0,75 9,20 ±1,80 4,29 ±0,72 2,82 ± 0,66 1,407 ± 0,16

Cây kh ỏ e, ch ắ c,

g ố c cây to, lá

xanh đậ m, m ặ t

dướ i mép lá có nhi ề u s ắ c t ố màu tím, r ễ kh ỏ e

½MS 15% 1,799 ±0,41 4,30 ± 0,66 9,00 ± 1,88 4,49 ± 1,32 3,16 ± 0,76 1,624 ± 0,28

Cây kh ỏ e, r ễ

kh ỏ e, lá xanh

t ố t, m ặt dướ i mép lá có nhi ề u

s ắ c t ố màu tím

½MS 20% 1,475 ± 0,44 3,80 ± 0,83 8,14 ± 1,89 4,19 ± 0,90 3,03 ± 1,12 1,392 ± 0,18

Cây kh ỏ e, lá

xanh đậ m, m ặ t

dướ i mép lá có nhi ề u s ắ c t ố tím

Ghi chú: Số li ệ u trong b ảng đượ c trình bày là giá tr ị trung bình ± độ l ệ ch chu ẩ n

Ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên

kh ả năng sinh trưởng của cây con trong điều kiện

in vitro

Ở cùng thể tích bình nuôi cấy (bình thủy tinh

250 ml), cùng thể tích môi trường (40 ml), thì mật độ

càng thấp khả năng sinh trưởng của cây con càng

cao, khả năng sinh trưởng của cây con giảm dần khi

mật độ cây tăng dần, khả năng sinh trưởng có mối

tương quan nghịch với mật độ nuôi cấy (Bảng 2,

Hình 2)

Ở nghiệm thức 1 cây trong một bình, các chỉ tiêu

sinh trưởng đều cao nhất khi so sánh với các nghiệm

thức còn lại Ở mật độ này, các cây con sinh trưởng

rất mạnh Các đặc điểm hình thái như sau: cây rất

mập, phiến lá dày, có nhiều sắc tố màu tím ở mép lá

và mặt dưới của lá, cây rất khỏe, rễ khỏe lá dài xanh,

bóng mượt, phiến lá phẳng bóng, đặc biệt sắc tố này

có nhiều ở mặt dưới của các lá non Sở dĩ, các cây

trong nghiệm thức này sinh trưởng và phát triển tối

đa là do ở mật độ thấp (1 cây/bình), cây con trong

nghiệm thức này được cung cấp đầy đủ chất dinh

dưỡng và khoảng không gian Vì vậy, cây có điều

kiện để tiếp nhận nguồn ánh sáng chiếu đến lá nhiều

nhất nên khả năng quang hợp của cây tốt hơn, không

xảy ra hiện tượng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng hay

hiện tượng các cây che bóng lẫn nhau dẫn đến thiếu nhu cầu ánh sáng cần thiết cho quang hợp, không có

hiện tượng cạnh tranh về không gian khiến cho các cây không phải mọc chen chúc Điều này rất quan

trọng vì bản thân lan Hồ Điệp là loại tự che bóng rất cao do lá Hồ Điệp là dạng bản lớn, dày, không phân thùy, các phiến lá có kích thước lớn, chúng lại mọc song song thành hai hàng nên các lá phía trên thường che các lá phía dưới dẫn đến ánh sáng chiếu đến các

lá Hồ Điệp trên cùng một cây không giống nhau, các

lá phía trên được cung cấp ánh sáng nhiều hơn, đầy

đủ hơn, còn các lá phía dưới nhận được ánh sáng ít hơn và thường là ánh sáng tán xạ Các phần khác nhau trên cùng một lá cũng nhận được lượng ánh sáng chiếu đến khác nhau, thường phần lá xa trục thân nhận được nhiều ánh sáng hơn, còn các lá sát

trục thân nhận được ít ánh sáng hơn Do vậy, năng

suất quang hợp ở các phần khác nhau của cùng một

lá khác nhau và giữa các lá khác nhau cũng khác nhau, các phần lá phía ngoài và các lá phía trên quang hợp tốt hơn Chính vì vậy, khi mật độ cây càng cao sự che bóng càng nhiều thì cây sinh trưởng kém hơn chủ yếu do sự cạnh tranh về nhu cầu ánh sáng cần thiết cho quá trình quang hợp Ở nghiệm

thức 3 cây/1 bình, kết quả thí nghiệm cho thấy, nghiệm thức này cây con sinh trưởng vẫn rất tốt,

Hình 1 Ảnh hưởng c ủa hàm lượ ng khoáng k ế t h ợ p v ớ i t ỷ l ệ nướ c d ừ a lên s ự sinh trưở ng c ủ a cây con lan H ồ Điệp in vitro

sau 3 tháng nuôi c ấ y a 1 , a 2 , a 3 : môi trườ ng khoáng ½MS có b ổ sung 10, 15 và 20% nướ c d ừ a; b 1 , b 2 , b 3 : môi trườ ng khoáng MS có b ổ sung 10, 15 và 20% nướ c d ừ a

trọng lượng tươi (2,939 g/cây), số lượng rễ (9,63

rễ/cây), đường kính lá (1,94 cm/lá) có thấp hơn ở

nghiệm thức 2 cây/bình và 1 cây/bình, nhưng sự

chênh lệch là không nhiều Các chỉ tiêu khác như số

lượng lá (3,69 lá/cây), chiều cao cây (6,30 cm/cây),

chiều dài rễ (4,93 cm/rễ) thì ngược lại, cao hơn mật

độ 2 cây/bình, tuy sự chênh lệch không nhiều (Bảng

2) Các đặc điểm hình thái cho thấy các cây khỏe,

mập, rễ khỏe, lá xanh bóng, dày Sự chênh lệch

không nhiều về các chỉ tiêu sinh trưởng của các cây

con giữa các nghiệm thức 1 cây/bình và 2 cây/bình

cho thấy mặc dù mật độ nuôi cấy ảnh hưởng đến khả

năng sinh trưởng nhưng trong một giới hạn nhất định

nào đó, sự thay đổi mật độ nuôi cấy vẫn chưa ảnh

hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng của cây con,

cho nên kích thước cây con ở 3 nghiệm thức 1

cây/bình, 2 cây/bình và 2 cây/bình không khác nhau

nhiều Xét về hiệu quả kinh tế, mật độ cấy 3 cây/bình

cho hiệu quả cao hơn, tiết kiệm chi phí hơn

Khi tăng số lượng cây con lên 4, 5 cây trong 1

bình, các chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng đều giảm rõ

rệt và đều thấp hơn ba nghiệm thức trên khá nhiều

Chiều cao cây và chiều dài rễ gần bằng nhau, các cây

nuôi cấy với mật độ này có rễ rất dài Về đặc điểm

hình thái: cây khỏe, rễ khỏe, lá khỏe, xanh, bóng

mượt, phiến lá, dày, phẳng bóng, có nhiều sắc tố

màu tím ở mép lá và mặt dưới của lá, đặc biệt sắc tố

này có nhiều ở mặt dưới của các lá non

Kết quả của Mustafa và đồng tác giả (2011)

cũng ghi nhận khi tăng mật độ của mẫu cấy trụ

dưới lá mầm cây Linum usitatissimum L số chồi

và chiều cao chồi gia tăng, tuy nhiên khả năng sinh trưởng của cây cũng giảm đi Trong thí nghiệm của Hạnh và đồng tác giả (2013) cho thấy cây lan Kim Hài sinh trưởng tốt nhất ở mật độ 4 cây/bình, khi tăng mật độ thì sự sinh trưởng của cây kém dần

Thí nghiệm này cũng cho thấy mật độ cây con trong cấy chuyền rất quan trọng vì chúng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con Trong nhân

giống thương mại, cần tạo ra các cây con có chất lượng tốt, đồng nhất về mặt di truyền và mặt hình thái nhằm tạo ra hàng loạt cây giống chất lượng cao sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện vườn ươm Vì vậy, nghiên cứu tối ưu hóa môi trường

cấy chuyền cây con sẽ đáp ứng được các yêu cầu này Hơn nữa, việc nghiên cứu này cũng nhằm

mục đích tiết kiệm chi phí trong sản xuất mà vẫn đạt được chất lượng cây con khỏe mạnh như mong

muốn Vì vậy khi cấy chuyền cây con mật độ thấp hay cao đều không mang lại hiệu quả kinh tế Mặc

dù mật độ thấp cây sinh trưởng tốt hơn nhưng lại

tốn kém chi phí về nhân công cấy chuyền, chi phí

về bình, môi trường nuôi cấy và diện tích phòng, dàn nuôi cây Trong khi đó, ở mật độ cấy chuyền quá cao, cây con sinh trưởng kém hơn Vì vậy,

việc tìm hiểu mật độ cây con phù hợp cho mỗi loại bình nuôi cấy là cần thiết Đối với lan Hồ Điệp,

với bình nuôi cấy 250 ml, 40 ml môi trường, cấy 3 cây trên 1 bình là tốt nhất

B ả ng 2 Ảnh hưở ng c ủ a m ật độ cây khi c ấ y chuy ề n lên kh ả năng sinh trưở ng c ủa cây con trong điề u ki ện in vitro

Tr ọng lượ ng

tươi (g) S ố lá/cây S ố r ễ /cây Chi cây (cm) ề u cao

Chi ề u dài r ễ

1 5,933 ± 0,96 4,600 ± 0,80 12,200 ± 2,79 8,760 ± 0,94 6,900 ± 2,94 2,200 ± 0,26

Cây r ấ t m ập, lá xanh đậ m, phi ế n lá dày, nhi ề u s ắ c t ố tím ở

m ặt dướ i, cây, r ễ r ấ t kh ỏ e

2 3,545 ± 0,74 3,500 ± 0,67 9,700 ± 2,19 6,190 ± 0,85 4,370 ± 1,05 2,170 ± 0,22 Cây mậ p kh ỏe, lá xanh đậ m,

nhi ề u s ắ c t ố tím ở m ặt dướ i lá

3 2,939 ± 0,78 3,688 ± 0,68 9,625 ± 2,12 6,294 ± 0,99 4,925 ± 1,46 1,938 ± 0,35 Cây kh ỏ e, m ậ p, m ặt dướ i lá

có nhi ề u s ắ c t ố tím

4 1,832 ± 0,42 3,467 ± 0,50 7,733 ± 2,24 4,500 ± 0,64 4,360 ± 1,59 1,707 ± 0,28 Cây mậ p kh ỏ e, nhi ề u s ắ c t ố

tím

5 1,766 ±0,44 3,33 ± 0,60 8,667 ± 1,58 4,073 ± 0,90 3,613 ± 1,14 1,053 ± 0,33 Cây chắc, lá hơi cong queo, rễ

hơi héo, nhiề u s ắ c t ố tím

Ghi chú: NT: nghiệm th ứ c; s ố li ệ u trong b ảng đượ c trình bày là giá tr ị trung bình ± độ l ệ ch chu ẩ n

Hình 2 Ảnh hưởng c ủ a m ật độ cây khi c ấ y chuy ề n lên kh ả năng sinh trưở ng c ủa cây con trong điề u ki ện in vitro a: 1

cây/bình; b: 2 cây/bình; c: 3 cây/bình; d: 4 cây/bình; e: 5 cây/bình

Ảnh hưởng của kích thước cây con lên sự sinh

trưởng của chúng trong điều kiện in vitro

Các chỉ tiêu theo dõi cho thấy kích thước cây

con khi cấy chuyền cũng đóng vai trò quyết định đối

với quá trình sinh trưởng, kích thước quá nhỏ hay

quá lớn đều không cho khả năng sinh trưởng tối ưu

Nhìn chung, khả năng sinh trưởng của cây con tăng

dần khi kích thước tăng, tuy nhiên đến một giới hạn

nhất định thì giảm xuống, các cây con có kích thước

lớn khi cấy chuyền thường gia tăng kích thước bộ rễ

nhiều hơn

Ở nghiệm thức chiều cao cây 3 cm, mẫu cấy sinh

trưởng tốt nhất, các chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng như

trọng lượng tươi (2,939 g/cây), số lượng lá (3,688

lá/cây), số lượng rễ (9,625 rễ/cây), chiều cao cây

(6,294 cm/cây), chiều dài rễ (4,925 cm/rễ), đường

kính lá (1,938 cm/lá) đều cao nhất Các đặc điểm

hình thái cho thấy cây rất khỏe, bộ rễ khỏe, lá xanh

bóng, dày, mép lá và mặt dưới của các lá non có

nhiều sắc tố màu tím Như vậy, các cây con có kích

thước 3 cm khi cấy chuyền cho khả năng sinh trưởng

tối ưu nhất (Bảng 3, Hình 3)

Kết quả nghiên cứu của Luận và đồng tác giả (2012, 2013) cũng cho thấy các chồi lan Vân Hài

3 cm thích hợp nhất cho sự sinh trưởng phát triển

in vitro Qua thí nghiệm này, nhìn chung cây lan

Hồ Điệp ở tất cả các kích thước đều sinh trưởng tương đối tốt, cây tốt, khỏe, hình dạng, màu sắc bình thường Mặc dù nghiệm thức chiều cao cây 2

cm có các cây con sinh trưởng mạnh hơn, chiều cao cây từ lúc cấy chuyền đến thời điểm thu số

liệu tăng gấp 2,19 lần so với ban đầu, nhưng kích thước cây sau ba tháng còn hơi nhỏ, nên thời gian

để đạt tiêu chuẩn cây con có chất lượng tốt khi chuyển ra vườn ươm phải để cây sinh trưởng lâu hơn (tuy nhiên, có thể các chất dinh dưỡng và các

yếu tố cần thiết bổ sung trong môi trường nuôi cấy

đã cạn kiệt) hoặc phải cấy chuyền cây con Ở kích thước này (cây cao 4,38 cm) việc cấy chuyền cây

lại không cho khả năng sinh trưởng tối ưu nữa (xem nghiệm thức 4 cm) Vì vậy, nghiệm thức cho

khả năng sinh trưởng tốt nhất là kích thước cây con khi cấy chuyền là 3 cm, ở nghiệm thức này, các cây con sau khi cấy chuyền 3 tháng thì chiều cao cây tăng gấp 2,1 lần so với ban đầu

B ả ng 3 Ảnh hưở ng c ủa kích thướ c cây con lên s ự sinh trưởng trong điề u ki ện in vitro

Chi ề u

cao

ch ồ i

Tr ọ ng

lượng tươi

(g/cây)

S ố lá/cây S ố r ễ /cây

Chi ề u cao cây (cm)

Chi ề u dài r ễ (cm)

kính lá (cm)

Đặc điể m

1 cm 1,245 ±0,32 3,87 ± 0,81 6,40± 1,96 2,99 ± 0,60 2,96 ± 1,00 1,46 ± 0,26

Lá hơi tr òn, m ặt dướ i có nhi ề u s ắ c t ố tím, r ễ dài, cây

kh ỏ e

2 cm 1,654 ± 0,36 3,47 ± 0,72 6,33 ± 2,09 4,38 ±0,74 3,45 ±1,32 1,73 ± 0,22 Cây khỏ e, m ặt dướ i mép lá

nhi ề u s ắ c t ố tím

3 cm 2,939 ± 0,78 3,69 ± 0,68 9,63 ± 2,12 6,30 ± 0,99 4,93 ± 1,46 1,94 ± 0,35 Cây kh ỏ e, m ậ p, m ặt dướ i

lá nhi ề u s ắ c t ố tím

4 cm 2,204 ± 0,98 3,67 ± 0,70 8,60 ± 2,12 4,95 ±0,77 5,61 ± 1,73 1,62 ± 0,32

Cây bình th ườ ng, r ễ dài, nhi ề u lông hút, ít s ắ c t ố tím

ở m ặt dướ i lá

Ghi chú: Số li ệ u trong b ảng đượ c trình bày là giá tr ị trung bình ± độ l ệ ch chu ẩ n

Hình 3 Ả nh h ưở ng c ủa kích thướ c cây con lên kh ả năng sinh trưở ng c ủ a cây con lan H ồ Điệp in vitro a1 : 1 cm, a 2 : 2 cm,

a 3 : 3 cm, a 4 : 4 cm

Ảnh hưởng của tuổi cây con khi cấy chuyền lên sự

sinh trưởng của chúng trong điều kiện in vitro

Tuổi của cây con cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự

sinh trưởng của chúng Từ bảng 4 cho thấy các cây con

ở các độ tuổi khác nhau thì các bộ phận của chúng có

tốc độ sinh trưởng khác nhau Thông thường các cây

con có độ tuổi càng nhỏ khả năng sinh trưởng về chiều

cao cây, gia tăng đường kính lá, trọng lượng tươi nhiều

hơn, ngược lại các cây ở độ tuổi càng lớn, lại gia tăng

về chiều dài rễ Cụ thể như sau:

Ở nghiệm thức cây 3 tháng tuổi, trong các chỉ

tiêu thì chiều dài rễ (4,925 cm/rễ) thấp nhất, còn các

chỉ tiêu khác như trọng lượng tươi (2,939 g/cây), số

lượng lá (3,688 lá/cây), số lượng rễ (9,625 rễ/cây), chiều cao cây (6,924 cm/cây), đường kính lá (1,938 cm/lá) đều cao nhất Các cây con trong nghiệm thức này sinh trưởng tốt nhất, các đặc điểm hình thái sau

3 tháng như sau: cây rất khỏe, bộ rễ khỏe, lá xanh bóng, dày, mép lá và mặt dưới của các lá non có nhiều sắc tố màu tím Như vậy, các cây con ở độ tuổi

3 tháng khi cấy chuyền có cho khả năng sinh trưởng

tối ưu (Bảng 4, Hình 4) Kết quả này cũng phù hợp

với các nghiên cứu của Nhựt và đồng tác giả (2010) trong nhân giống Địa lan, lan Hài, nghiên cứu của

Luận và đồng tác giả (2012) trên đối tượng lan Vân Hài, trong các nghiên cứu này thì cây con 3 tháng

tuổi cho khả năng sinh trưởng tốt nhất

Hình 4 Ảnh hưởng c ủ a tu ổ i m ẫ u c ấ y lên kh ả năng sinh trưở ng c ủ a cây con lan H ồ Điệp in vitro a: cây con 3 tháng tuổ i, b: cây con 4 tháng tu ổ i, c: cây con 5 tháng tu ổ i

B ả ng 4 Ảnh hưởng c ủ a tu ổ i cây con khi c ấ y chuy ề n lên s ự sinh trưở ng c ủ a chúng tron g điề u ki ện in vitro

Tu ổ i cây

con

Tr ọng lượ ng

tươi (g/cây) S ố lá/cây S ố r ễ /cây Chi (cm) ề u cao cây

Chi ề u dài r ễ

lá (cm) Đặc điể m

3 tháng 2,939 ± 0,78 3,688 ± 0,68 9,625 ± 2,12 6,294 ± 0,99 4,925 ± 1,46 1,938 ± 0,35

Cây kh ỏ e, m ậ p,

m ặt dướ i lá có nhi ề u s ắ c t ố tím

4 tháng 2,209 ± 0,63 3,333 ± 0,70 9,067 ± 2,14 4,500 ± 0,92 5,273 ± 1,49 1,613 ± 0,22

Cây bình th ườ ng, lá

có nhi ều răng cưa,

r ễ dài hơi héo

5 tháng 2,138 ± 0,68 3,33 ± 0,79 7,600 ± 2,19 4,007 ± 0,70 5,527 ± 1,81 1,407 ± 0,38

Cây bì nh thườ ng, lá

cong, hơi già cỗ i, có nhi ều răng cưa, rễ

dài, b ị héo, nhi ề u lông hút r ễ

Ghi chú: Số li ệ u trong b ảng đượ c trình bày là giá tr ị trung bình ± độ l ệ ch chu ẩ n; NT: nghi ệ m th ứ c

Thí nghiệm này cho thấy việc xác định độ tuổi

của cây con khi cấy chuyền rất quan trọng, cây con

khi cấy chuyền khoảng 3 tháng tuổi cho khả năng

sinh trưởng tốt nhất Điều này có thể do các cây con

ở độ tuổi này có sức sống tốt, khả năng sinh trưởng

nhanh Trong khi đó, các cây con 4 tháng tuổi và 5

tháng tuổi khi cấy chuyền khả năng sinh trưởng của

chúng thấp hơn, có thể do việc để cây quá lâu trong

môi trường nuôi cấy khi đó đã cạn kiệt dinh dưỡng,

các yếu tố đảm bảo cho sự sinh trưởng của cây

không còn đáp ứng được, thay vì tiếp tục gia tăng

trọng lượng tươi một số cây lại gia tăng kích thước

rễ, số lượng rễ, còn các cơ quan như lá bị tiêu giảm

dần để giải phóng năng lượng nhằm duy trì sự sống

cho cây Một số cây lại xuất hiện các đặc điểm bất

thường về hình thái như xuất hiện răng cưa ở mép

lá Nếu để đến giai đoạn này mới cấy chuyền thì

khả năng phục hồi sinh trưởng rất thấp do chúng đã

bị stress dinh dưỡng trước khi cấy chuyền, các cơ

quan dinh dưỡng đã bị già nên khả năng sinh

trưởng thấp

Ảnh hưởng của kích thước cây con lên khả năng

sinh trưởng và phát triển của chúng ở giai đoạn

vườn ươm

Sau 3 tháng nuôi cấy in vitro, các cây con có

nhiều kích thước khác nhau được chuyển ra trồng ex

vitro trong điều kiện vườn ươm của Viện Nghiên cứu

Khoa học Tây Nguyên, từ đó xác định kích thước

của cây in vitro chuyển ra vườn ươm cho tỷ lệ sống

sót cao nhất, khả năng sinh trưởng, phát triển tốt

nhất Chúng tôi tiến hành theo dõi sáu kích thước sau

của cây in vitro trong điều kiện vườn ươm (Bảng 5,

6, Hình 5)

Từ các chỉ tiêu theo dõi được trình bày ở Bảng

5, 6, Hình 5 cho thấy khả năng sống sót và sinh

trưởng của các cây con in vitro khi đưa ra vườn ươm

có mối liên quan mật thiết với kích thước của chúng khi chuyển cây từ ống nghiệm ra ngoài Nhìn chung, cây có kích thước càng lớn, tỷ lệ sống sót và khả năng sinh trưởng càng tốt, sự gia tăng chiều cao cây, đường kính lá nhiều Nhưng ngược lại, các cây con

có kích thước càng nhỏ thì sau 2,5 tháng trồng và chăm sóc tỷ lệ chết của chúng rất cao, cây còi cọc,

yếu gần như không sinh trưởng, thậm chí các cây này còn có biểu hiện lụi dần, cụ thể là cây bị rụng

bớt lá nhưng lại không tạo thêm lá non mới

Trong thí nghiệm này, chúng tôi chia ra 6 kích thước cây con để theo dõi và nhận thấy rằng các cây con ban đầu có chiều cao cây từ 4 cm trở lên cho khả năng sống sót rất cao; trong khi các cây con có chiều cao cây dưới 3 cm thì ngược lại, chúng sinh trưởng

rất chậm, tỷ lệ chết rất cao Điều này có thể là do, các cây kích thước lớn có bộ lá xanhh tốt, cây khỏe,

bộ rễ khỏe, các lá già; do đó khi chuyển ra trồng ngoài vườn ươm chúng dễ dàng thích nghi hơn Điều

kiện ngoài vườn ươm khác biệt rất nhiều so với điều

kiện in vitro như môi trường rất nghèo dinh dưỡng

(dớn dùng để trồng lan chủ yếu đóng vai trò là giá

thể trơ), nhiều nguồn bệnh, thoáng khí… Ở điều kiện

vườn ươm cây thường dễ bị mất nước do trong giai đoạn in vitro nuôi cấy trong các hệ thống bình thủy

tinh kín, các khí khổng của lá cây luôn mở để tăng cường sự thoát hơi nước qua khí khổng Khi chuyển

ra ngoài vườn ươm, khí khổng vẫn duy trì tình trạng

mở nên cây bị thoát hơi nước liên tục làm cho bộ lá

bị héo dẫn đến tình trạng cây yếu dần nếu không cung cấp đủ nước cho cây Tuy nhiên, điều quan

trọng là nếu cây có khả năng chống chịu tốt, bộ rễ

khỏe sẽ đáp ứng được nhu cầu thiếu nước trầm trọng này; vì vậy, các cây in vitro có kích thước lớn, có bộ

rễ khỏe, khả năng chống chịu tốt nên cây nhanh

chóng phục hồi và nhanh bén rễ hơn khi được

chuyển ra ngoài vườn ươm Hơn nữa điều kiện bên

ngoài thoáng khí, cây có bộ lá lớn nên khả năng

quang hợp tốt, cây sinh trưởng nhanh và gia tăng

kích thước nhiều Giai đoạn đầu là giai đoạn thích

nghi với điều kiện môi trường ex vitro, cây con sinh

trưởng chậm Đây là giai đoạn chủ yếu để cây con

phục hồi những mất mát do việc chuyển từ môi

trường lý tưởng ra môi trường thực Giai đoạn sau,

khi đã thích nghi với môi trường mới, chế độ chăm

sóc hợp lý, cây con sinh trưởng rất mạnh, cây càng

lớn thì khả năng sinh trưởng càng tăng, tốc độ quang

hợp của cây ngày càng cao (tốc độ quang hợp tỷ lệ

thuận với diện tích lá và số lượng lá của cây) Đối

với các cây có kích thước quá bé, chúng rất nhạy

cảm với các thay đổi môi trường xung quanh, sự mất

nước liên tục làm cây bị héo nhanh chóng, bộ rễ yếu,

khả năng chống chịu kém; các cây này dễ bị chết do

mất nước, sâu bệnh tấn công, cằn cỗi do quá trình

quang hợp kém vì lá cây có kích thước nhỏ, môi

trường nghèo dinh dưỡng không được cung cấp

nguồn carbon trực tiếp nên một số cây còn lại cũng

có biểu hiện lụi dần

Kết quả chỉ ra rằng, các cây con có kích thước

7,23 ± 0,81 cm; 5,47 ± 0,60 cm; 4,17 ± 0,43 cm cho

tỷ lệ sống sót cao, các chỉ tiêu như chiều cao cây,

đường kính lá cao Các đặc điểm hình thái cho thấy

cây khỏe, lá to, dày, có nhiều sắc tố màu tím hồng ở

mặt dưới của lá, lá cây có màu xanh tự nhiên, không

còn xanh đậm như khi nuôi cấy in vitro Điều này có

thể do môi trường bên ngoài có ánh sáng tự nhiên

với cường độ cao hơn, có chứa các tia sáng thích hợp cho quá trình quang hợp khi so với ánh sáng của các bóng đèn huỳnh quang trắng trong phòng nuôi Dưới ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang, cây không tổng

hợp nhiều diệp lục (các cây ưa bóng có màu xanh

của lá đậm hơn so với các cây ưa sáng) Đối với cây con có kích thước còn lại, sau khi trồng và chăm sóc 2,5 tháng đa số đều bị chết, tỷ lệ sống sót rất thấp, kích thước cây càng nhỏ tỷ lệ chết càng cao, cụ thể

các cây con có kích thước 2,73 ± 0,51 cm có tỷ lệ

sống sót thấp nhất (14,74%), cây sinh trưởng rất

chậm, rất yếu, xấu, cằn cỗi, bị úa, lá bị chết Cây con kích thước 1,95 ± 0,37 cm, tỷ lệ sống sót 20,28%, cây sinh trưởng rất chậm, cây xấu cằn cỗi, yếu, bị úa,

lá bị chết Tương tự như vậy đối với cây con có kích thước 1,01 ± 0,23 cm, mặc dù tỷ lệ sống sót là 32,57% nhưng cây sinh trưởng rất chậm

Qua việc theo dõi sự sinh trưởng và phát triển cây con ngoài vườn ươm cho thấy để tăng tỷ lệ sống sót của cây con khi chuyển ra vườn ươm cần chú ý đến kích thước cây, các cây kích thước càng lớn, tỷ

lệ sống sót càng cao, khả năng sinh trưởng càng tốt Như vậy các cây giống tốt đạt chất lượng cao thì tiêu chí đầu tiên phải quan tâm đó là có kích thước từ 4

cm trở lên, lá bóng đẹp, dày, màu sắc tự nhiên, không có những biểu hiện bất thường về hình thái, sinh lý… Ngoài việc cây giống đạt tiêu chuẩn, chế

độ chăm sóc ngoài vườn ươm cũng đóng vai trò cực

kỳ quan trọng quyết định đến hình thái cây, khả năng

ra hoa và chất lượng hoa sau này

B ả ng 5 Các chỉtiêu ban đầ u c ủa cây con trướ c khi chuy ển ra vườn ươm để theo dõi kh ả năng sinh trưở ng

Lo ạ i cây

(cm)

Tr ọ ng

lượng tươi

(g)

S ố lá/cây Chi ề u cao

cây (cm) Đườ ng kính

lá (cm) S ố r ễ /cây Chi ề u dài

r ễ (cm) Đặc điể m 7,23 ± 0,81 4,302 ± 1,97 3,50 ± 1,01 7,23 ± 0,81 2,089 ± 0,34 8,56 ± 2,99 3,06 ± 1,44 Cây, rễ , lá to; phi ế n lá

dày; nhi ề u s ắ c t ố tím

5,47 ± 0,60 3,076 ± 1,17 2,78 ± 0,92 5,47 ± 0,60 1,717 ± 0,15 7,67 ± 2,19 4,370 ± 1,05 Cây khỏe, lá xanh đậ m,

r ễ dài, nhi ề u s ắ c t ố tím

4,17 ± 0,43 2,105 ± 0,55 2,99 ± 0,81 4,17 ± 0,43 1,628 ± 0,21 6,28 ± 2,08 4,307 ± 0,70 Cây khỏe, lá xanh đậ m,

r ễ dài, nhi ề u s ắ c t ố tím

2,73 ± 0,51 0,836 ± 0,30 2,72 ± 0,99 2,73 ± 0,51 1,167 ± 0,28 5,00 ± 1,76 3,82 ± 1,03 Cây nhỏ , y ế u, lá nh ỏ ,

m ỏ ng, xanh nh ạ t, r ễ dài

1,95 ± 0,37 0,462 ± 0,25 2,28 ± 0,56 1,95 ± 0,37 0,822 ± 0,24 3,83 ± 1,21 2,02 ± 0,62 Cây rấ t nh ỏ , y ế u, lá nh ỏ ,

m ỏ ng, xanh nh ạ t, r ễ nh ỏ

1,01 ± 0,23 0,134 ± 0,07 1,89 ± 0,66 1,01 ± 0,23 0,517 ± 0,08 2,67 ± 0,82 1,89 ± 0,75 Cây, rễ r ấ t nh ỏ , y ế u, lá

nh ỏ , m ỏ ng, xanh nh ạ t

Ghi chú: Số li ệ u trong b ảng đượ c trình bày là giá tr ị trung bình ± độ l ệ ch chu ẩ n

B ả ng 6 Các chỉ tiêu theo dõi sinh tr ưở ng c ủ a cây lan H ồ Điệ p ở điề u ki ện vườn uơm sau 2,5 tháng trồng và chăm sóc