BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY TRINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA TINH DẦU CÂY QUẾ TRÈN Cinnamomum Burmann
TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Quế (Cinnamomum Schaeff.)
1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Cinnamomum Schaeff
1.1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật của chi Cinnamomum Schaeff
Đây là mô tả về một cây dạng bụi, gỗ nhỏ hoặc lớn, đoạn thân thường không có cành; vỏ nhẵn hoặc nứt dọc, màu nâu xám hay nâu đỏ nhạt, toàn thân thường có dầu hoặc mùi thơm theo mức độ khác nhau Lá đơn, nguyên, thường mọc gần như đối, mọc cách hoặc vừa đối vừa cách hay sắp xếp kiểu xoắn ốc; phiến lá có các chấm hay tuyến chứa tinh dầu, thường có 3 gân chính, hiếm khi dạng lông chim, không có lá kèm Cụm hoa hình chùm, hình chùy hoặc gần dạng tán, mọc ở nách lá hay đầu cành Hoa lưỡng tính, rất ít khi đơn tính, mẫu 3, lá đài 6 dính nhau tạo thành ống ở phía dưới, thường có lông mịn; nhị hữu thụ 9, ít khi 6, thường xếp theo 3 vòng, bao phấn 4 ô, ít khi 2; bầu trên không có cuống, 1 ô, noãn ngược; nhụy mảnh Quả hình cầu, hình trứng hay dạng trụ, 1 hạt; đế quả có các thùy bao hoa tồn tại và dày lên bao quanh.
1.1.1.2 Phân bố chi Cinnamomum Schaeff ở Việt Nam Ở nước ta, số loài thuộc chi Long não rất phong phú và đa dạng Năm 1991, Phạm Hoàng Hộ đã mô tả tóm tắt cho 40 loài, năm 2003 tăng thêm 3 loài nâng tổng số là 43 loài và có hình vẽ minh họa Nguyễn Kim Đào (1994) đã thống kê được 42 loài, năm
2003 thống kê được thêm 2 loài và một thứ (forma) nâng tổng số loài thống kê được lên
44 loài và 1 thứ (chiếm 17,6% tổng số loài của chi Long não trên toàn thế giới và bằng 48,9% số loài ở khu vực Malesian) [14]
Chi Long não phân bố từ vùng đại lục châu Á đến khắp Đông Nam Á, Australia và khu vực Tây Thái Bình Dương Ở miền Nam châu Mỹ chỉ có một số ít loài, nhưng riêng khu vực Malesian đã phát hiện khoảng 90 loài, theo cuốn Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam 2001 của Lã Đình Mỡi [13].
1.1.2 Phân loại chi Cinnamomum Schaeff ở Việt Nam
Ở nước ta trước đây, một số tác giả đã nghiên cứu về họ Long não, nhưng hầu hết các công trình này chỉ mô tả các loài và chưa có sự tổng hợp, cũng như chưa phân loại khóa tra cho từng loài Điều này cho thấy thiếu dữ liệu hệ thống về nhận diện và phân loại trong họ Long não Vào năm 2016, luận văn thạc sĩ khoa học lâm nghiệp đã được thực hiện nhằm khắc phục hạn chế này bằng cách tổng hợp và phân loại các loài trong họ Long não, đóng góp cho sự hiểu biết khoa học và hỗ trợ công tác nhận diện loài.
Nghiên cứu phân loại chi Long não (Cinnamomum Schaeff.) tại Việt Nam đã đưa ra khóa nhận diện cho 22 loài thuộc chi Long não ở nước ta, góp phần đáng kể vào việc nghiên cứu phân loại thực vật Việt Nam nói chung và chi Long não nói riêng.
Khóa tra cho một số loài trong chi Long não (Cinnamomum Schaeff.) ở Việt Nam [12]
1A Lá mọc cách; gân lông chim hay gần như có 3 gân gốc, có điểm tuyến ở gân chính; thùy bao hoa sớm rụng ở quả
2A Phiến lá gần như 3 gân gốc ……… C camphora 2B Phiến lá gân lông chim
3A Cuống lá dài hơn 2 cm……… C longepetiolatum 3B Cuống lá ngắn hơn 2 cm……… C subpenninervium 4A Cụm hoa chùy, nhẵn
5A Quả hình bầu dục; gân bên 3 – 5 đôi
4B Cụm hoa hình chùy, có lông
5B Quả hình cầu; gân bên 5 – 7 đôi……… C parthenoxylon 6A Gân chính phẳng ở mặt trên, lồi ở mặt dưới; quả hình cầu, đường kính 8 –
10 mm……… C balansae 6B Gân chính lồi ở cả hai mặt; quả hình trứng, trứng ngược hay nón ngược, hiếm khi hình cầu, dài trên 10cm
7A Quả hình nón ngược, dài 1,6 cm……… C glaucescens 7B Quả hình trứng
1B Lá mọc đối hay gần đối; 3 gân ở gốc; thùy bao hoa tồn tại hay chỉ có phần dưới tồn tại ở giai đoạn quả
8A Đôi gân xuất phát từ gốc không kéo dài tới chóp lá, gân phụ 1-2 đôi
9A Cụm hoa chùy, có lông
10A Phiến lá có lông ở mặt dưới
11A Gân giữa của lá lõm hoặc phẳng ở mặt trên
12A Gân phụ 1 – 2 đôi ở gần chóp lá; phiến lá hình trứng, cỡ 11 – 17 x 4 – 8 cm……….…… C bonii 12B Gân phụ 2 – 3 đôi; phiến lá hình trứng ngược, cỡ 17 x 9 cm
11B Gân giữa lồi lên ở cả 2 mặt
Trong nhóm C polyadelphum và C tonkinensis, đặc điểm nhận diện cho thấy C polyadelphum có cụm hoa chùy dài 8–12 cm, lá hình trứng hoặc hình bầu dục dài 10–15 cm và rộng 4–6 cm với gân phụ 2–3 đôi; ngược lại, C tonkinensis có cụm hoa hình chùy ngắn 2,5–10 cm, lá hình bầu dục 8–10 cm x 2,5–4 cm và gân phụ 3–4 đôi Thêm vào đó, lá ở mặt dưới có bề mặt nhẵn.
14A Gân giữa lồi ở cả hai mặt
15A Lá dạng thuôn hẹp, cỡ 10 – 13 x 1,2 – 2,5 cm, 3 gân gốc và 5 – 6 đôi gân bên; cụm hoa hình chùy ở nách lá, dài 8 – 10 cm
….……… C burmannii var angustifolium 16A Phiến lá hình trứng hay hình bầu dục, cỡ 10 – 16 x 3 – 4 cm……… C curvifolium 16B Phiến lá hình giải hay hình giải mũi mác
15B Lá hình trứng thuôn, cỡ 4,5 – 7,5 x 3 – 5 cm, 3 gân gốc và 2 gân bên; cụm hoa hình chùy ở nách lá hay đỉnh cành dài 2 – 7 cm C burmannii 14B Gân giữa lõm ở mặt trên
17A Cụm hoa ngắn hơn 7 cm
18A Cuống hoa dài hơn 1 cm; phiến lá hình trứng – bầu dục, bầu dục mũi mác, cỡ 4 – 13 x 2 – 6 cm; nhị vòng thứ 3 có 2 tuyến, có chân
… ……… C subavenium 18B Cuống hoa ngắn hơn 1 cm; phiến lá hình bầu dục, cỡ 5 – 9 x 2 – 3 (5) cm; nhị vòng thứ 3 có 2 tuyến không có chân
17B Cụm hoa dài 7 – 9 cm……… C cambodianum 9B Cụm hoa nhẵn; phiến lá nhẵn cả 2 mặt
8B Đôi gân xuất phát từ gốc lá kéo dài đến chóp lá, không có gân phụ
19A Cụm hoa hình chùy có lông
20A Gân giữa phẳng hoặc lõm ở mặt trên
21A Cụm hoa dài hơn 10 cm
Trong bảng phân loại, 22A xác định C cassia có lá hình bầu dục hẹp hoặc hình mũi mác, kích thước khoảng 10–25 x 4–8 cm và gân mạng không nổi rõ ở mặt dưới; 22B xác định C iners có lá hình bầu dục–thuôn hoặc hình trứng, kích thước khoảng 10–30 x 5–9 cm với gân mạng có thể thấy rõ ở cả hai mặt hoặc không thấy rõ ở mặt trên; 21B cho biết cụm hoa ngắn hơn 10 cm.
23A Cuống lá dài hơn 1 cm……… C mairei 23B Cuống lá ngắn hơn 1 cm
20B Gân giữa phồng lên ở cả 2 mặt
24B Cuống lá dài 10 – 15 mm……… C loureirii 19B Cụm hoa hình chùy, nhẵn
25A Gân giữa phẳng hoặc lõm ở mặt trên
26A Đôi gân xuất phát từ gốc kéo dài tới chóp lá hay gần chóp lá
27A Cụm hoa hình chùy ở nách lá
28A Cụm hoa dài 6 – 8 cm; phiến lá hình trái xoan, cỡ 9 x 5 cm; thùy bao hoa hình chén cắt ngang, dài 4 mm; vỏ có mùi thơm đinh hương
…… ……… C caryophyllus 28B Cụm hoa dài 20 – 25 cm; phiến lá hình bầu dục thuôn, cỡ 10 – 44 x 3,5
– 15 cm; thùy bao hoa hình chén có xẻ thùy với đầu tròn; vỏ có mùi thơm quế……… C bejolghota 27B Cụm hoa ở đỉnh cành……… C verum 25B Gân giữa phồng lên ở cả 2 mặt
26B Đôi gân xuất phát từ gốc kéo dài bằng 3/4 chiều dài của lá
29A Phiến lá dài từ 10 cm trở lên; gân giữa lõm ở mặt trên……… C tamala 29B Phiến lá ngắn hơn 10 cm; gân giữa phẳng ở mặt trên
1.1.3 Thành phần hóa học chi Long não (Cinnamomum Schaeff )
Tinh dầu là lớp chất phong phú và được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Long não (Cinnamomum) Thành phần tinh dầu có thể được chiết xuất từ nhiều bộ phận của cây như lá, cành và vỏ thân Các loài thuộc chi Cinnamomum Schaeff chủ yếu là phenylpropanoid với các thành phần chính gồm safrol, eugenol, linalool, camphor, benzyl benzoate và cinnamaldehyde.
Thông tin trình bày trong Bảng 1.2 cho thấy hàm lượng tinh dầu và các nhóm thành phần, cùng với thành phần hóa học chủ yếu có mặt trong tinh dầu của một số bộ phận ở các loài đại diện cho chi Long não, nhằm giúp người đọc nắm bắt đặc điểm hóa học và sự khác biệt giữa các bộ phận cũng như tiềm năng ứng dụng của tinh dầu Long não trong y học, dược phẩm và công nghiệp thực phẩm.
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của tinh dầu chi Long não [31]
Loài Bộ phận Nhóm chất chính Cấu tử chính
(70,2%) patchouli alcohol (27,7%), benzyl benzoat (19,6%), β- selinen (7,2%)
Lá (5,4%) Este (75,4%) benzyl benzoat (50,2%), benzyl salicylat (23,4%), p- cymen (11,7%)
Lá (2,8%) Este (78,5%) benzyl benzoat (77,6%), benzyl alcohol (10,7%)
Lá (4,8%) Este (59,4%) benzyl benzoat (50,9%), α- phellandren (12,3%), benzyl salicylat (7,5%), p- cymen (7,0%)
(53,8%) linalool (17,3%), (E)- methyl cinnamat (17,1%), β-phellandren (9,0%), terpinen-4-ol (7,0%)
Vỏ (1,5%) Aldehyd (44,4%) cinnamaldehyd (44,2%), β- phellandren (8,0%), β- caryophyllen (6,9%)
Phenylpropanoid (65,0%) methyl eugenol (γ- muurolen (13,5%)) (45%), safrol (20%)
(31,0%) safrol (23,4%), γ-muurolen (13,5%), eugenol (7,6%), linalool (6,5%), terpinen-4- ol (5,3%)
Aldehyd (21,6%) tetradecanal (21,1%), acid octadecanoic (11,9%), safrol (8,1%), acid pentadecanoic (7,2%), acid hexadecanoic (6,5%) Cành
(65,6%) spathulenol (16,1%), β- eudesmol (8,1%), linalool (7,2%), β-selinen (7,1%), α-pinen (7,0%)
Các thành phần bay hơi như tinh dầu của các loài thuộc chi Long não được nghiên cứu nhiều; tuy nhiên, các thành phần không bay hơi vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi Chiết xuất vỏ loài C burmanni (Nees & T.Nees) Blume chứa các thành phần hóa học như: catechin, epicatechin, procyanidin B2, quercitrin, 3,4-dihydroxybenzaldehyde, acid protocatechuic, và acid cinnamic [24] Theo một nghiên cứu khác tại Indonesia, dịch chiết vỏ Quế trèn gồm: flavonoid, tanin, terpenoid, steroid, saponin, alcaloid [29] Các thành phần polyphenolic của dịch chiết lá C tamala (Hamm.) Nees & Eberm là 3,4’,5,7-tetrahydroxyflavon (kaempferol), 3,3’,4’,5,7–pentahydroxyflavon (quercetin) nonglycosidic, kaempferol-3-O-glucopyranosid, kaempferol-3-O-sophorosid, kaempferol 3,7 di-O-rhamnopyranosid, và quercetin 3-O-rutinoside glycosidic Singh và cộng sự (2002) đã công bố thành phần hóa học trong lá gồm kaempferol và quercetin, myricetin, kaempferol-3-O- rhamnosid và quercetrin (quercetin 3-rhamnosid) Prasad và cộng sự (2009) đã định lượng 3 thành phần flavonoid như quercetin, kaempferol, và quercetrin trong lá C tamala (Hamm.) Nees & Eberm Theo Mishra và cộng sự (2010), lá C tamala (Hamm.) Nees & Eberm có terpenoid, tanin, phenol/polyphenol, flavonoid, alcaloid, và saponin Chakraborty và Das (2010) cũng công bố thành phần trong lá C tamal (Hamm.) Nees & Eberm gồm phenol, ascorbat, và carotenoid [35].
1.1.4 Phân bố, thành phần hóa học tinh dầu, và giá trị sử dụng của Cinnamomum burmanni (Nees & T.Nees) Blume
Thế giới: Cinnamomum burmanni (Nees & T.Nees) Blume có vùng phân bố rộng
Quế trèn sinh trưởng tự nhiên ở hầu khắp các khu vực thuộc vùng Malesia đến miền Nam Trung Quốc, bao gồm Quảng Đông, Quảng Tây, Phúc Kiến và Giang Tây Ngoài ra, cây còn được tìm thấy ở Thái Lan, Philippines, Malaysia và Indonesia Tại Indonesia và Philippines, Quế trèn đã được trồng ở quy mô sản xuất hàng hóa.
Quế trèn mọc phổ biến ở Việt Nam, phân bố ở nhiều địa phương từ Bắc vào Nam, bao gồm Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Khánh Hòa, Gia Lai, Kon Tum và Lâm Đồng [13].
1.1.4.2 Thành phần hóa học tinh dầu
Hiện nay có khá nhiều nghiên cứu về loài Quế trèn (Cinnamomum burmanni (Nees
& T.Nees) Blume), đặc biệt là tại Indonesia Các bài nghiên cứu chủ yếu là về thành phần tinh dầu trong cây Quế trèn
+ Cảm quan tinh dầu: Tinh dầu không màu hoặc vàng nâu nhạt [13]
Hàm lượng tinh dầu của vỏ Quế trèn cho thấy sự phân bổ theo khu vực: tại Indonesia, tinh dầu trong vỏ Quế trèn có hàm lượng tương đối cao, dao động từ 1–4%; tại miền Nam Trung Quốc, hàm lượng này thường thấp, khoảng 0,4–0,6% (theo [13]) Tuy nhiên, một nghiên cứu khác tại Indonesia cho kết quả hàm lượng tinh dầu vỏ Quế trèn là 0,25% (theo [18]).
+ Thành phần chính trong tinh dầu:
Thành phần chủ yếu của tinh dầu quế ngoài cinnamaldehyd còn có 1,8-cineol, α-terpineol và camphor, và không có eugenol Theo phân tích của Ji Xia-duo và cộng sự (1991), thành phần hóa học trong tinh dầu vỏ quế trồng sinh trưởng tại Indonesia gồm các hợp chất chủ yếu sau: 1,8-cineol (51,4%), α-terpineol (12,5%), camphor (9,0%), terpinen-
Tinh dầu vỏ cây Quế trèn chứa một nhóm hợp chất đa dạng, với các thành phần có tỷ lệ được xác định và một số hợp chất chưa được xác định Các thành phần chiếm ưu thế gồm 4-ol (8,5%), borneol (1,8%), α-pinene (1,6%), β-caryophyllene (1,6%), para-cymene (1,0%), β-eudesmol (0,5%), camphene (0,5%), elemol (0,4%), myristicin (0,4%), β-pinene (0,4%), α-humulene (0,3%) và bornyl acetate (0,1%), ngoài ra còn một số hợp chất khác chưa xác định được [13] Theo một bài báo thuộc khoa Dược, Đại học Quốc gia Indonesia, các hợp chất chiếm ưu thế của tinh dầu vỏ cây Quế trèn là trans-cinnamaldehyde (56,10%), 1,8-cineol (16,5%) và α-pinene (3,44%) Trans-cinnamaldehyde là chất dễ bay hơi chiếm hàm lượng lớn nhất trong tinh dầu [18].
Tinh dầu trong vỏ Quế trèn thương phẩm trên thị trường thế giới (theo Lawewnce và đồng nghiệp, 1994) gồm các thành phần chủ yếu sau: (E)-cinnamaldehyd (62,7-
(1,0%-2,6%), terpinen-4-ol (1,3-2,3%), phenylpropanal (vết-1,4%), α-copaen (1,0-
2,3%), benzaldehyde (0,5-1,2%), linalool (vết-1,6%), coumarin (vết-0,4%) và một số hợp chất khác mà hàm lượng chỉ ở dạng vết hoặc không đáng kể [13]
Thành phần chủ yếu tinh dầu trong vỏ Quế trèn phân bố tại miền Nam Trung Quốc ngoài cinnamic aldehyd còn có eugenol và safrol [13]
Quế trèn tại Indonesia, tinh dầu cất từ lá lại có thành phần khác với tinh dầu vỏ Các thành phần đáng kể trong lá gồm: 1,8-cineol (28,5%), borneol (16,5%), -terpineol
(6,4%), p-cymen (6,1%), spathlenol (5,8%), terpinen-4-ol (4,1%), bornyl acetat (3,1%),
-caryophyllen (2,9%), -pinen (1,9%), cinnamyl acetat (1,5%), myristicin (1,2%), elemon (0,6%), -humulen (0,4%), linalool (0,4%), camphen (0,2%), -eudesmol (0,1%) và các thành phần khác chưa xác định được chiếm 8,6% (Ji Xiao-due và cộng sự, 1991) [13]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (lá, cành) có nguồn gốc ở Vườn Quốc gia Cúc Phương Mẫu nghiên cứu 6 tuổi, được trồng tại bảo tàng tài nguyên rừng Việt Nam (VFM), xã Vĩnh Quỳnh, huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội Tiêu bản thực vật khô gồm cuống lá, phiến lá và cành được lưu tiêu bản ở Bộ môn Thực vật, Đại học Dược
Ở Hà Nội, phòng tiêu bản có số hiệu HNIP/1865/22 (Phụ lục 2) Sau khi thu hái, mẫu cành và lá được làm khô tự nhiên trong bóng râm; mẫu lá và cành ở dạng tươi được dùng để chiết tinh dầu Một phần mẫu lá và cành được bảo quản bằng ethanol 90% để làm vi phẫu thực vật Phần còn lại của mẫu lá và cành được để khô tự nhiên, bảo quản trong túi nilon sạch, dùng để định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ khác và làm mẫu vi học bột cho lá và cành.
Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: cloramin B, nước javen, cloralhydrat 75%, đỏ son phèn, xanh methylen, glycerin, nước cất
Dùng trong định tính sơ bộ thành phần hóa học và sắc ký lớp mỏng
Hóa chất: các thuốc thử định tính (NaOH 10%, FeCl3 5%, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, acid picric…)
Dung môi: Ethanol, nước cất, chloroform, ethyl acetat, n-hexan…
Bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merk
Tất cả các hóa chất, dung môi đạt tiêu chuẩn DĐVN V
2.1.2.2 Dụng cụ, thiết bị, máy móc
Dụng cụ bằng thủy tinh: Cốc có mỏ, phễu, bình gạn, pipet, ống nghiệm, đũa thủy tinh…
Các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm: Thuyền tán, cối, chày, bát sứ, khay tráng men…
Cân kỹ thuật Sartorius TE412
Bộ dụng cụ cất tinh dầu theo dược điển Mỹ
Máy sắc ký khí kết hợp khối phổ Agilent Technologies
Hệ thống sắc ký bản mỏng bán tự động CAMAG (HPTLC)
Kính hiển vi LEICA DM 1000, máy ảnh kĩ thuật số SONY Cybershot.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu
2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học
Định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ có trong cành, lá
Xác định hàm lượng tinh dầu có trong cành, lá
Định tính các thành phần hóa học có trong tinh dầu cành, lá bằng sắc ký lớp mỏng
Xác định thành phần cấu tử của tinh dầu trong cành, lá bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan
Để ghi nhận và mô tả cây một cách có hệ thống, hãy quan sát và ghi nhận các đặc điểm thực vật như hình dáng, kích thước, màu sắc và mùi bằng mắt thường, đồng thời chụp ảnh để lưu trữ dữ liệu Thực hiện ở điều kiện có đủ ánh sáng tự nhiên, tốt nhất là ánh sáng mặt trời, nhằm đảm bảo hình ảnh rõ nét và độ chính xác cao trong nhận diện và so sánh giữa các mẫu cây.
2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học
Việc giám định tên khoa học của cây được thực hiện dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái và đặc điểm của bộ phận sinh sản, đồng thời so sánh với mô tả và hình ảnh trong tài liệu [41] Quá trình đối chiếu còn được thực hiện với khóa phân loại thực vật trong tài liệu [12], và có sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật để xác định tên khoa học của loài một cách chính xác.
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi
Đặc điểm vi phẫu: Mẫu dược liệu (lá, cành) được cắt, nhuộm, lên tiêu bản theo các bước như trong tài liệu [3]
Đặc điểm bột của dược liệu được xác định bằng quy trình nghiền nhỏ lá và cành bằng thuyền tán, rây để thu được bột mịn, sau đó lên tiêu bản và quan sát, mô tả chi tiết các đặc điểm của bột và chụp ảnh minh hoạ cho hồ sơ nghiên cứu.
2.3.4 Phương pháp hóa học Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học theo Phụ lục 1
2.3.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng Định tính thành phần tinh dầu thu được bằng SKLM
Mẫu tinh dầu cất được loại nước bằng Na2SO4 khan, sau đó pha loãng đến nồng độ 1/100 bằng cloroform để chấm sắc ký
Pha tĩnh: bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merck
Pha động: hệ dung môi khai triển: cyclohexan - EtOAc (9:1)
Sau khi khai triển sắc ký, sấy nhẹ bản mỏng để bay hơi hoàn toàn dung môi, đảm bảo sắc ký đồ khô và ổn định Quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ ở bước sóng 254 nm và 366 nm để đánh giá sự phân bố và hiện diện của các chất trên lớp TLC Phun thuốc thử anisaldehyde và chụp ảnh sắc ký đồ sau khi hiện màu ở ánh sáng thường, đồng thời ghi nhận hình ảnh ở cả hai bước sóng 254 nm và 366 nm để có kết quả so sánh rõ ràng.
2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu
Sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Mỹ (USP29)
Mẫu cành, lá của dược liệu sau khi thu hái được bảo quản trong túi nilon để trong bóng râm
Các mẫu dược liệu được chia nhỏ Cân chính xác một lượng mẫu nhất định đem đi cất tinh dầu, một lượng phù hợp đem xác định hàm ẩm
Cho dược liệu vào nồi cất, thêm nước ngập dược liệu khoảng 3-4 cm
Đầu tiên lắp đặt bộ dụng cụ cất tinh dầu và tiến hành quá trình cất kéo hơi nước bằng phương pháp chưng cất để thu được tinh dầu từ nguyên liệu thảo dược Quá trình cất kéo diễn ra cho đến khi thể tích tinh dầu không tăng lên nữa, thời gian ước tính khoảng 5-6 giờ Sau khi cất xong, đọc thể tích tinh dầu sau khi cất để đánh giá khối lượng và hiệu quả của quá trình chưng cất.
Xác định hàm lượng tinh dầu theo tỉ lệ phần trăm thể tích trên khối lượng dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:
Trong đó: H%: hàm lượng tinh dầu (%); X: độ ẩm của dược liệu (%); V: thể tích tinh dầu cất được (ml); M: khối lượng dược liệu cất (g)
2.3.7 Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ
GC-MS (Sắc ký khí kết hợp khối phổ) là hệ thống gồm thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu được tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký khí và sau đó sẽ được detector khối phổ nhận diện Hiện nay, phương pháp này được áp dụng phổ biến để định tính (dựa vào thời gian lưu) và định lượng (dựa vào chiều cao hoặc diện tích của peak) tinh dầu, mang lại khả năng nhận diện và định lượng các hợp chất một cách chính xác và nhạy cảm.
Hệ thống GC-MS được triển khai trên nền GC của Agilent Technologies 7890A và hệ MS của Agilent Technologies 5975C, kết hợp với cột sắc ký HP-5MS có chiều dài 30 m và đường kính 0,25 mm Khí mang helium được điều chỉnh lưu lượng nhằm tối ưu hóa hiệu suất phân tích và độ nhạy của hệ thống Với cấu hình này, GC-MS cho phép phân tích các hợp chất hữu cơ với độ phân giải và nhạy cao, đáp ứng các yêu cầu xác định thành phần và đặc tính mẫu trong nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp.
1ml/phút Tinh dầu được pha loãng với dung môi cloroform, thể tích tiêm mẫu 1 microlit, chia dòng 50:1 Cài đặt các thông số nhiệt độ thích hợp
Phổ được so sánh với thư viện Wiley, Flavor và Nist để phân tích kết quả
Pha loãng tinh dầu cất được bằng dung môi cloroform đến nồng độ 1/100 Cho vào lọ vial
Khởi động hệ thống sắc ký khí
Cài đặt chương trình nhiệt độ: 45 o C trong 3 phút, sau đó tăng dần lên 180 o C (tốc độ 5 o C/phút) và giữ nhiệt độ đó trong 4 phút, tiếp tục tăng đến tối đa 250 o C (tốc độ
10 o C/phút) và giữ trong 2 phút
Trong phân tích tinh dầu, việc xác định các thành phần được thực hiện dựa trên nguyên tắc so sánh độ trùng lặp của phổ khối với các chất có sẵn trong thư viện chuẩn Giá trị RI sau đó được so sánh với các dữ liệu có trong thư viện NIST và các cơ sở dữ liệu đã công bố RI được tính từ thời gian lưu thực tế của các peak trong mẫu phân tích và thời gian lưu của các alkan từ C9 đến C20 được tiến hành ở cùng điều kiện sắc ký; công thức tính RI được xác định dựa trên thời gian lưu tương đối so với dãy alkan đồng đẳng từ C9 đến C20 Kết quả RI giúp nhận diện nhanh chóng các thành phần chất có trong tinh dầu và tăng độ tin cậy của kết quả so với các nguồn dữ liệu chuẩn.
Trong đó: RTx: Thời gian lưu của chất phân tích;
R: Thời gian lưu của alkan liền trước pic phân tích;
RTn+1: Thời gian lưu của alkan liền sau pic phân tích; n: Số nguyên tử carbon của alkan liền trước pic phân tích
2.3.8 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Dựa vào các tài liệu tham khảo [28], tiến hành thử hoạt tính vi sinh vật bằng vật liệu và phương pháp như sau:
Xác định khả năng ức chế vi sinh vật là bước then chốt trong đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá và cành cây Quế trèn Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được sử dụng để đo lường khả năng ức chế vi sinh vật bằng cách quan sát vòng ức chế trên đĩa nuôi, từ đó ước tính hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Quế trèn [28].
Trong nghiên cứu này, các chủng vi khuẩn được hoạt hóa trong môi trường Luria Bertani lỏng ở 37°C, còn các chủng vi nấm được hoạt hóa trong môi trường Sabouraud lỏng ở 32°C, với thời gian hoạt hóa là 18 giờ.
Pha dịch vi sinh vật
Dịch vi sinh vật được pha loãng bằng môi trường cho đến đạt 0,5 độ McFarland Dùng tăm bông vô trùng cấy vi sinh vật lên bề mặt đĩa môi trường thạch dinh dưỡng.
Tinh dầu lá và cành cây Quế trèn được pha loãng 10 lần trong dung dịch DMSO
30% có bổ sung Tween 80 theo tỷ lệ 0,5% (v/v)
Thử nghiệm và đánh giá kết quả
Các đối chứng gồm dung dịch DMSO 30%, kháng sinh Streptomycin đối với vi khuẩn và kháng sinh Nystatin đối với vi nấm Tạo các giếng đường kính 6 mm trên môi trường thạch dinh dưỡng, bổ sung dịch chiết dược liệu và đối chứng Đĩa vi khuẩn được ủ ở 37 o C, đĩa vi nấm được ủ ở 32 o C trong 18 giờ Khả năng ức chế vi sinh vật của tinh dầu lá và cành cây Quế trèn được xác định qua sự xuất hiện của vòng vô khuẩn/vô nấm trên đĩa môi trường Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chủng vi sinh vật kiểm định:
(Các chủng vi sinh vật kiểm định do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp)
Vi khuẩn Gram (–): Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 6538
Nấm men: Candida albicans ATCC 10231
Luria-Bertani lỏng gồm pepton 10 g/L, cao nấm men 5 g/L và NaCl 10 g/L ở pH 7,5 Sabouraud lỏng gồm glucose 40 g/L, pepton 10 g/L ở pH 5,6 Các môi trường này được bổ sung thạch agar 16 g/L để tạo môi trường thạch, và các môi trường được khử trùng ở điều kiện vô trùng.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
Nghiên cứu về thực vật
Đây là một cây gỗ thường xanh cao từ 10 đến 20 mét, với đường kính thân khoảng 20 cm Vỏ thân màu nâu xám, thường bong thành từng mảng mỏng, thịt vỏ màu nâu và có mùi thơm đặc trưng Cành non nhẵn, màu xanh nhạt, đường kính khoảng 5 mm.
Lá mọc đối hoặc gần đối; phiến lá hình trứng thuôn, dài khoảng 14 cm, đầu lá nhọn, gốc hình nêm, mặt trên màu lục sẫm bóng, mặt dưới lục nhạt nhẵn Gân lá gồm 3 gân gốc; mặt dưới lồi, mặt trên lõm Cành mang lá dài khoảng 18 cm Cụm hoa chùy mọc gần đầu cành; cuống ngắn, đường kính khoảng 0,5 mm, mỗi cuống mang một hoa màu trắng vàng Hoa lưỡng tính: bao hoa 6 mảnh, màu vàng nhạt có vân, đỉnh nhọn, tổng bao hoa dài khoảng 5,5–6 mm; nhị 9, xếp thành 3 vòng, nhị ngắn, màu vàng xanh, bao phấn 4 ô; bầu thượng nhỏ, đầu nhụy vàng, tròn, đường kính khoảng 1,5 mm.
Hình 3.1 Ảnh chụp cây và một số bộ phận của cây Quế trèn
A Toàn cây; B Cành mang hoa; C, D, E Hoa;
F Đầu nhụy; G, H Bộ nhị; I Cuống hoa; J Cành; K, L Lá; M Thân
3.1.2 So sánh đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu với Cinnamomum burmanni
(Nees & T.Nees) Blume trong các tài liệu
Mẫu nghiên cứu được so sánh đặc điểm thực vật, đối chiếu với mẫu cây cùng loài theo thực vật chí Trung Quốc [41]
Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu với Cinnamomum burmanni
(Nees & T.Nees) Blume trong các tài liệu Đặc điểm Mẫu nghiên cứu Cinnamomum burmanni (Nees &
T.Nees) Blume theo thực vật chí
Dạng cây Cây gỗ thường xanh, cao 10-
Thân Đường kính thân khoảng
20cm Vỏ thân ngoài màu nâu xám, thường bong từng mảng mỏng, thịt vỏ màu nâu, có mùi thơm
Vỏ nhẵn, mặt ngoài màu nâu xám đến nâu sẫm, mặt trong màu đỏ, có mùi thơm
Cành Cành non nhẵn, màu xanh nhạt, đường kính khoảng 5mm
Cành non xanh lục hoặc xanh nâu, mảnh, có vân, bóng
Lá Cách mọc Đơn, nguyên, đối Lá mọc so le, ít khi mọc đối, cuống lá 0,5-1,2 cm, hình cầu lồi, lá phụ Phiến lá
Hình trứng thuôn, dài khoảng 14cm Đầu phiến lá nhọn, gốc hình nêm, mặt trên màu lục sẫm bóng, mặt dưới lục nhạt, nhẵn
Hình trứng hoặc thuôn dài đến hình mũi mác, xanh lục, mờ đục ở mặt ngoài, bóng ở mặt trước, 5,5–10,5 × 2–5 cm, nhiều lông
Gân lá Gồm 3 gân gốc Mặt dưới lồi, mặt trên lõm
Ba gân lá, gân giữa và các gân bên cao theo trục; các gân bên cách gốc lá từ 3 đến 8 mm Cụm hoa chùy mọc gần đầu cành; cuống ngắn, đường kính khoảng 0,5 mm, mỗi cuống mang một hoa màu trắng vàng.
Cụm hoa xim 3 ở ngọn, màu trắng xanh
Ngắn, đường kính khoảng 0,5mm, mỗi cuống mang một hoa, màu trắng vàng
Mảnh, dài 4-6mm, có lông xám
Bao hoa 6 mảnh, màu vàng nhạt, tổng bao dài khoảng 5,5mm-6mm Ống bao hoa ngắn, hình nón, các thùy bao hoa hình trứng thuôn dài, nhọn
Nhị Chỉ nhị Nhị 9, xếp thành 3 vòng, chỉ nhị ngắn, màu vàng xanh
Nhị 9, kích thước 2,5 (vòng 1, 2)- 2,7mm (vòng 3) Chỉ nhị ở vòng 3 có lông, có tuyến hình cầu, không cuống
Bao phấn 4 ô, xếp liền cạnh Bao phấn thuôn dài 4 ô, hướng ra ngoài hoặc vào trong Nhụ y
Bầu Thượng, nhỏ Bầu có ít lông, kích thước khoảng
1,5mm Đầu Màu vàng, tròn, đường kính khoảng 1,5mm Đầu nhụy có ít lông, kích thước khoảng 2mm
Drawing on the plant description, the accompanying image (Figure 3.1), and a table that compares morphological characteristics with Cinnamomum burmanni (Nees & T Nees) Blume, as documented in Thực vật chí, this section provides a concise, SEO-friendly reference for plant identification It outlines diagnostic traits such as leaf morphology and venation, flower and inflorescence structure, and fruit characteristics, enabling a clear comparison between the specimen and C burmanni according to flora literature.
Trung Quốc [41], cùng với việc tham khảo khóa phân loại chi Cinnamomum Schaeff trong luận “Nghiên cứu phân loại chi Long não (Cinnamomum Schaeff.) tại Việt Nam”
Qua sự trợ giúp của các chuyên gia thực vật, nghiên cứu cho thấy sự tương đồng và trùng khớp giữa các cơ quan dinh dưỡng và sinh sản của mẫu nghiên cứu với loài Cinnamomum burmanni (Nees & T.Nees) Blume; từ đó có thể kết luận đây là loài Cinnamomum burmanni thuộc chi Cinnamomum Schaeff và họ Long não (Lauraceae) Nguồn tham khảo [12].
Nghiên cứu đặc điểm về vi học vi phẫu dược liệu
3.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi, thấy các đặc điểm sau: (Hình 3.2.)
Gân chính có mặt trên hơi lồi và mặt dưới lồi tròn; từ trên xuống dưới quan sát thấy các đặc điểm sau: biểu bì trên gồm lớp cutin mỏng với các tế bào nhỏ hình chữ nhật xếp đều đặn; mô dày là các tế bào hình đa giác kích thước không đều, vách dày và nằm rải rác ở lớp mô mềm; mô mềm là những tế bào hình trứng hoặc đa giác có kích thước không đồng đều và vách mỏng; rải rác trong mô mềm có rất nhiều tinh thể calci oxalat hình kim; bao quanh các bó libe-gỗ là vòng mô cứng với tế bào vách dày hóa sợi, bên trong là libe và các bó gỗ xếp đều đặn.
Trong phiến lá, các tế bào biểu bì trên và dưới tạo thành một lớp với các tế bào đa giác có kích thước khác nhau rõ rệt giữa mặt trên và mặt dưới Dưới lớp biểu bì trên là mô giậu gồm một hàng tế bào dài và hẹp xếp sít nhau Dưới lớp biểu bì dưới là mô mềm, gồm các tế bào hình trứng hoặc đa giác xếp sít nhau và vách tế bào tương đối mỏng Dưới mô mềm còn có mô khuyết, là tập hợp các tế bào không đều, sắp xếp lỏng lẻo để mở ra những khoảng gian bào lớn Rải rác trong phiến lá là các bó sợi nối với các biểu bì.
Hình 3.2 Ảnh vi phẫu lá Quế trèn
1 Biểu bì; 2 Mô dày; 3 Mô mềm; 4 Tinh thể calci oxalat; 5 Bó sợi; 6 Libe; 7 Gỗ;
8 Mô giậu; 9 Mô mềm; 10 Mô khuyết
3.2.2 Đặc điểm vi phẫu cành
Quan sát vi phẫu dưới kính hiển vi (Hình 3.3.), thấy các đặc điểm sau:
Vi phẫu cắt ngang có thiết diện hình tròn, chia là 2 vùng rõ rệt Quan sát từ ngoài vào trong, thấy các đặc điểm sau:
Biểu bì phía ngoài có lớp cutin màu nâu, gồm các tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác xếp đều đặn Mô mềm vỏ chia làm hai vùng: ngoài đặc gồm 3–5 lớp tế bào hình đa giác xếp chặt, không hở gian bào; và trong rỗng gồm các tế bào hình tròn, bầu dục hoặc đa giác xếp lộn xộn, để hở ra các khoảng gian bào Dưới lớp mô mềm là các bó sợi vách dày, xếp quanh thành một vòng Bên trong là libe và mạch gỗ Ở phía giữa là mô mềm ruột, gồm các tế bào tròn hoặc bầu dục, vách mỏng, kích thước tương đồng và xếp sít nhau Rải rác khắp vùng tủy và vùng vỏ là các khối nhựa màu nâu đỏ.
Hình 3.3 Ảnh vi phẫu cành Quế trèn
1 Biểu bì; 2 Mô mềm vỏ ngoài; 3 Mô mềm vỏ trong; 4 Bó sợi;
Nghiên cứu về đặc điểm vi học bột dược liệu
Lá sau khi làm khô, được nghiền nhỏ rồi rây lấy bột mịn để làm tiêu bản Bột lá có màu xanh lục đậm, mùi thơm ngọt, hơi hắc
Quan sát bột lá trên kính hiển vi (Hình 3.4) cho thấy các đặc điểm sau: mảnh mang màu, mảnh mô mềm, mảnh mạch vạch, tế bào sợi, nhiều tế bào sợi và mảnh mạch xoắn, mảnh mạch mạng, mảnh mô mềm mang lỗ khí hình hạt đậu, mô mềm, và mô mềm mang tinh thể calci oxalat hình kim.
Hình 3.4 Một số đặc điểm bột lá Quế trèn
1 Mảnh mang màu; 2 Mảnh mô mềm; 3 Mạch vạch; 4 Tế bào sợi; 5 Mạch xoắn; 6
Mạch mạng; 7 Mô mềm mang lỗ khí;
8 Mô mềm; 9 Mô mềm mang tinh thể calci oxalat
Cành được làm khô, nghiền nhỏ và qua rây 180 lấy bột mịn để làm tiêu bản Bột cành có màu nâu nhạt, mùi thơm nhẹ
Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi (Hình 3.5) cho thấy các đặc điểm chính sau: tế bào sợi xếp thành bó (1); bó sợi mang các hạt tinh bột (2); mảnh bần (3,6); tế bào cứng (4).
5), hạt tinh bột (7, 8), mô mềm (9), mảnh mang màu (10,11), mảnh mạch vạch (12), mảnh mạch mạng (13)
Hình 3.5 Một số đặc điểm bột cành Quế trèn
1 Tế bào sợi; 2 Bó sợi mang tinh bột; 3 Bần; 4, 5 Tế bào cứng; 7, 8 Tinh bột; 9 Mô mềm; 10, 11 Mảnh mang màu; 12 Mạch vạch; 13 Mạch mạng
Định tính hóa học
Các nhóm chất trong dịch chiết của cây Quế trèn được định tính sơ bộ bằng các phản ứng hóa học
Kết quả được trình bày như trong Bảng 3.2
Chú thích: () :Phản ứng âm tính
Bảng 3.2 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong dịch chiết mẫu nghiên cứu
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả cành Quế trèn
Kết quả lá Quế trèn
Phản ứng với dd FeCl3 5% + +
Phản ứng với hơi amoniac + +
2 Coumarin Phản ứng mở, đóng vòng lacton - +
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt + +
4 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - -
Phản ứng với TT Dragendorff - -
Phản ứng với TT Bouchardat - -
5 Tanin Phản ứng với dd FeCl3 5% + -
Phản ứng với dd gelatin 1% + -
Phản ứng với dd chì acetat 10% + +
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - -
9 Đường khử Phản ứng với TT Fehling A và
10 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% + -
11 Polysaccarid Phản ứng với TT Lugol - -
12 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - +
13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc + -
Bằng các phản ứng hóa học, có thể sơ bộ đánh giá trong cành cây Quế trèn có chứa flavonoid, saponin, tanin, glycosid tim, đường khử, acid amin, caroten
Bằng các phản ứng hóa học, có thể sơ bộ đánh giá trong lá cây Quế trèn có chứa flavonoid, coumarin, saponin, glycosid tim, đường khử, chất béo, sterol.
Xác định hàm lượng tinh dầu trong các bộ phận của cây Quế trèn
Hàm lượng tinh dầu theo tỷ lệ phần trăm thể tích trên khối lượng dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:
H%= V.10 4 M.(100 – X) Trong đó: H%: Hàm lượng tinh dầu (%)
V: Thể tích tinh dầu cất được (ml)
M: Khối lượng dược liệu đem cất (g)
X: Độ ẩm của dược liệu (%)
Kết quả hàm lượng tinh dầu trong các bộ phận của cây được cho trong bảng sau:
Bảng 3.3 Hàm lượng tinh dầu trong các bộ phận của mẫu nghiên cứu
Bộ phận Lần cất M (g) X (%) V (ml) H (%) Htrung bình (%)
Trong quá trình cất tinh dầu, sau khi đun sôi khoảng 10 phút thì tinh dầu bắt đầu xuất hiện và lượng tinh dầu tăng dần trong quá trình cất
Tinh dầu lá có màu vàng nhạt, mùi thơm ngọt cay, hàm lượng 0,69% Tinh dầu cành vàng tươi, mùi thơm ngọt cay, hàm lượng 0,26%.
Sắc ký lớp mỏng tinh dầu các bộ phận của cây Quế trèn
Trong quá trình phân tích tinh dầu, sắc ký được triển khai trên các hệ khác nhau và hệ cyclohexan – EtOAc (9:1) cho kết quả tốt nhất Sắc ký đồ dịch chấm tinh dầu từ các bộ phận của mẫu nghiên cứu được trình bày tại Hình 3.6, trong khi kết quả định tính các thành phần tinh dầu của các bộ phận cây được báo cáo tại Bảng 3.4.
Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu các bộ phận của mẫu nghiên cứu
Lần lượt từ trái sang phải: 1 Lá; 2 Cành
Hệ dung môi khai triển: cyclohexan : EtOAc (9 : 1)
A Sắc ký đồ tinh dầu ở bước sóng 254 nm
B Sắc ký đồ tinh dầu ở bước sóng 366 nm
C Sắc ký đồ tinh dầu ở ánh sáng thường sau khi phun TT anisaldehyd
Bảng 3.4 Kết quả định tính các thành phần tinh dầu các bộ phận của mẫu nghiên cứu bằng SKLM
Trong bài phân tích, sắc ký đồ tinh dầu được tiến hành với hệ dung môi khai triển cyclohexan:EtOAc (9:1) và sau khi phun anisaldehyd để hiện màu cho các vết tương đối rõ ràng Các vết trên sắc ký đồ cho tinh dầu lá ít nhất 14 vết, còn tinh dầu cành ít nhất 8 vết; cả hai tinh dầu đều xuất hiện 4 vết giống nhau với R_f lần lượt là 0,116; 0,206; 0,270; 0,356 Trên sắc ký đồ tinh dầu cành có xuất hiện vết màu nhưng không có các chất nào (không có giá trị R_f) Ngoài ra, tinh dầu cành có 1 vết màu lớn với R_f là 0,226, chất đó chiếm tỷ lệ lớn trong tinh dầu.
Sắc ký khí kết hợp khối phổ tinh dầu
Tinh dầu được phân tích bằng kỹ thuật sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) Sắc ký đồ của tinh dầu từ các bộ phận của mẫu nghiên cứu được trình bày ở phụ lục 4 Các thành phần hóa học của tinh dầu, kèm thời gian lưu (phút) và hàm lượng (%) ở từng bộ phận của cây Quế được trình bày chi tiết trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 Thành phần cấu tử trong tinh dầu các bộ phận của mẫu nghiên cứu
Tên hóa học RI thực tế RI thư viện Thời gian lưu (phút)
Lá α-pinen 930,802 936 6,945 2,770 benzaldehyd 958,006 959 7,769 0,270 β-pinen 973,093 971 8,226 1,980 methyl heptenon 988,676 986 8,698 0,160 sabinen 991,053 997 8,770 0,160
1,8-cineol 1029,847 1030 9,960 0,550 benzyl alcohol 1033,972 1033 10,087 0,210 linalool 1100,101 1100 12,123 1,340 terpineol 1189,963 1190 14,782 0,560 cephrol 1229,643 1228 15,909 0,380 β-citral 1241,571 1241 16,243 4,550 geraniol 1257,964 1256 16,702 32,150 cinnamaldehyd 1269,464 1271 17,024 0,950 α-citral 1271,857 1279 17,091 5,940 α-copaen 1375,151 1375 19,872 0,310 methyleugenol 1405,215 1405 20,663 1,470 caryophyllen 1418,333 1418 20,995 3,090 cinnamyl acetat 1444,725 1446 21,663 0,570 α-humulen 1452,272 1454 21,854 0,380
(-)- alloaromadendren 1459,226 1461 22,030 0,210 bicyclogermacren 1495,18 1502 22,940 2,910 spathulenol 1574,888 1576 24,896 3,050 acid benzoic 1754,567 1760 29,305 30,210
Cành α-pinen 930,934 932 6,949 0,260 β-pinen 973,225 975 8,230 0,360 methyl heptenon 988,775 988 8,701 0,250 β-myrcen 990,987 992 8,768 0,250 benzen 1022,994 1025 9,749 0,390 dl-limonen 1026,859 1030 9,868 0,530
4-terpineol 1176,445 1178 14,382 1,100 α-terpinenol 1189,963 1191 14,782 1,790 β-citronellol 1229,714 1232 15,911 0,370 β-citral 1241,607 1244 16,244 1,990 geraniol 1258,286 1258 16,711 55,920 α-copaen 1375,377 1378 19,878 0,480 methyleugenol 1405,61 1402 20,673 4,250
29 caryophyllen 1418,57 1420 21,001 2,640 α-humulen 1452,627 1456 21,863 0,420 bicyclogermacren 1495,338 1498 22,944 0,400 benzen 1558,391 1562 24,492 0,390 spatulenol 1575,704 1576 24,916 1,840 trans-isoelemicin 1651,814 1654,2 26,768 2,630 benzyl benzoat 1753,69 1753 29,283 1,430
Dựa trên kết quả từ Bảng 3.5, các thành phần trong tinh dầu của các bộ phận cây quế được phân chia thành các nhóm cấu trúc kèm hàm lượng tương ứng, và toàn bộ dữ liệu này được trình bày đầy đủ trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6 So sánh thành phần tinh dầu trong các bộ phận của mẫu nghiên cứu
Nhóm chất Thành phần Lá Cành
4-terpineol 1,100 terpineol 0,560 cephrol 0,380 β-citronellol 0,370 geraniol 32,150 55,920 α-citral 5,940 β-citral 4,550 1,990
Các chất khác benzaldehyd 0,270 methyl heptenon 0,160 0,250 benzen 0,390 benzyl alcohol 0,210 acid benzoic 30,210 benzyl benzoat 1,430 cinnamaldehyd 0,950 cinnamyl acetat 0,570 methyleugenol 1,470 4,250 trans-isoelemicin 2,630
Nhận xét: Từ kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu, cho thấy:
Tinh dầu lá và tinh dầu cành: mỗi bộ phận đều chứa ít nhất 29 cấu tử khác nhau Ngoài các thành phần được đề cập ở trên, tinh dầu lá còn chứa một số thành phần khác như δ-3-carene (0,960%) và eremophilen.
(1,990%), 1,2,9,10-tetradehydroaristolan (0,44%), cyclohexen (0,29%), thành phần khác của tinh dầu cành là: citral (3,58%), δ 3-caren (0,43%), 3-buten-1-ol (0,25%), aromandendren (2,39%), δ-gurjunen (0,28%), 4-(4-isobutylphenyl)-2-penten (0,39%)
• Mỗi tinh dầu có một số cấu tử với hàm lượng cao Cụ thể như sau:
- Lá: α-pinen (2,77%), β-pinen (1,98%), linalool (1,34%), β-citral (4,55%), geraniol (32,15%), α-citral (5,94%), methyleugenol (1,47%), caryophyllen (3,09%), bicyclogermacren (2,91%), spathulenol (3,05%), eremophilen (1,990%), acid benzoic (30,21%) Trong đó, thành phần có hàm lượng cao nhất là geraniol (32,15%)
- Cành: 1,8-cineol (4,06%), β-linalool (10,93%), 4-terpineol (1,10%) , α- terpinenol (1,79%) , β-citral (1,99%), geraniol (55,92%), citral (3,58%), methyleugenol (4,25%), caryophyllen (2,64%), spatulenol (1,84%), aromandendren (2,39%), trans- isoelemicin (2,63%), benzyl benzoat (1,43%) Thành phần hàm lượng cao nhất là geraniol (55,92%)
The essential oil from leaves and branches contains 14 identical components, with citral and geraniol as the hallmark compounds present in high concentrations in both leaf and branch oils It also includes α-pinene, β-pinene, methyl heptenone, dl-limonene, 1,8-cineol, linalool, terpineol, α-copaene, δ-3-carene, methyleugenol, caryophyllene, and α-humulene.
Leaf essential oil contains the common components typically found in essential oils and also includes additional constituents such as benzaldehyde, sabinene, benzyl alcohol, cephrol, cinnamaldehyde, cinnamyl acetate, (-)-alloaromadendrene, bicyclogermacrene, eremophilene, 1,2,9,10-tetradehydroaristolan, cyclohexene, and benzoic acid.
The essential oil from branches shows distinctive chemical profiles when additional constituents are present Notable components include β-myrcene, benzene, borneol, β-citronellol, 3-buten-1-ol, aromadendrene, δ-gurjunene, 4-(4-isobutylphenyl)-2-penten, trans-isoelemicin, and benzyl benzoate, which together influence aroma, quality, and potential therapeutic properties.
Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu
Việc thử hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá và cành được thực hiện theo phương pháp đã nêu tại mục 2.3.8; kết quả được trình bày trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu mẫu nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Tinh dầu lá Tinh dầu cành
Chú thích: (–) không xác định (không biểu hiện hoạt tính tại nồng độ thử nghiệm)
Cả 2 mẫu tinh dầu đều có biểu hiện hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn gram (+) S aureus và nấm men C albicans
Trên vi khuẩn gram (–) P aeruginosa, các tinh dầu không có tác dụng.
Bàn luận
Mẫu nghiên cứu được phân tích và mô tả đặc điểm hình thái, đặc biệt là các đặc điểm ổn định ít bị ảnh hưởng bởi điều kiện sinh thái như thân, lá, vị trí cụm hoa và các bộ phận hoa; sau đó các đặc điểm hình thái này được đem so sánh với đặc điểm hình thái của loài Cinnamomum burmanni (Nees) nhằm làm rõ sự tương đồng và khác biệt để hỗ trợ nhận diện loài.
& T.Nees) Blume được mô tả trong thực vật chí Trung Quốc [41] cho thấy mẫu nghiên cứu có đầy đủ đặc điểm của loài Cinnamomum burmanni (Nees & T.Nees) Blume
So sánh Quế trèn với quế lá hẹp hay re lá hẹp (Cinnamomum burmannii (Nees)
BL var angustifolium (Hemsl.) Allen.) Đây là dạng quế lá hẹp hiện phân bố ở miền Bắc Việt Nam, Trung Quốc và Ấn Độ [1]
Theo sách Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ, Quế lá hẹp được mô tả là một đại mộc với nhánh mảnh, màu nâu đen và không lông Lá có phiến thon hẹp, dài 10-13 cm, rộng 1,5 cm, hai đầu nhọn, gân phụ 5-6 cặp, bề mặt rất mịn và cuống dài khoảng 6 mm Hoa phát hoa ở nách lá, có cọng dài khoảng 1 cm và có lông rất mịn, nụ 3 mm, hoa xanh và bầu noãn không lông.
Như vậy, Quế trèn và Quế lá hẹp khác nhau ở cả bộ phận sinh dưỡng và bộ phận sinh sản
Quế trèn Quế lá hẹp
Bộ phận sinh dưỡng Phiến lá dài khoảng 14cm Đầu phiến lá nhọn, gốc hình nêm, có 3 gân gốc
Phiến thon hẹp, dài 10- 13cm, rộng 1,5 cm, hai đầu đều nhọn, gân-phụ 5-
Bộ phận sinh sản - Hoa có phủ lông rất mịn
Vi phẫu cành Quế trèn cho thấy các đặc trưng của chi Long não khi có nhiều tinh thể calci oxalat hình kim tập trung ở vùng vỏ và libe Vi phẫu lá Quế trèn cũng thể hiện những đặc điểm tiêu biểu của chi này như sự hiện diện của tế bào tiết và tế bào chứa tinh bột ở vùng mô mềm, đồng thời chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình kim Bột cành và lá Quế trèn có các đặc điểm tương đồng với chi Long não, đặc biệt là sự có mặt của tinh thể calci oxalat, và bột cành còn chứa nhiều tế bào cứng.
Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi phẫu và đặc điểm vi học của bột lá và cành cho thấy cây mang các đặc trưng thực vật tiêu biểu của họ Long não (Lauraceae) và chi Quế (Cinnamomum Schaeff.) Vì vậy, có thể sử dụng hình ảnh thực vật và phân tích vi học làm tư liệu phục vụ cho công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu này.
3.9.2 Về thành phần hóa học
Tinh dầu là thành phần điển hình của họ Long não nói chung và chi Quế nói riêng, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng dược liệu Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về tinh dầu và thành phần tinh dầu Quế trèn tại Việt Nam Khóa luận này có thể làm cơ sở cho các nghiên cứu phát triển, ứng dụng và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu trong tương lai.
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng tinh dầu ở các bộ phận mẫu nghiên cứu lần lượt là 0,26% ở thân–cành và 0,69% ở lá; phân tích GC-MS các thành phần cấu tử của tinh dầu cho thấy thành phần chủ yếu là các hợp chất monoterpenoid và sesquiterpenoid, trong đó monoterpenoid chiếm tỷ lệ cao, khoảng từ 46,4% đến 78,2%; tinh dầu từ lá và cành chủ yếu là các monoterpenoid, gồm cả các loại chứa oxy và sesquiterpenoid loại không chứa oxy; ngoài ra, tinh dầu lá có hàm lượng các thành phần khác khá cao, khoảng 33,84%.
Thành phần chính của lá mẫu nghiên cứu gồm geraniol (32,15%), axit benzoic (30,21%), α-citral (5,94%) và β-citral (4,55%), cho thấy sự khác biệt lớn so với thành phần chính của tinh dầu lá Quế trèn ở Indonesia, nơi các hợp chất chủ đạo là 1,8-cineol (28,5%), borneol (16,5%) và α-terpineol.
Phần thành phần hóa học của lá Quế cho thấy nhiều hợp chất có hàm lượng khác nhau, với các con số được ghi nhận lần lượt là 6,4% cho một thành phần, p-cymen 6,1%, spathlenol 5,8% và terpinen-4-ol 4,1% (theo nguồn [13]) Thành phần có hàm lượng cao nhất ở mẫu lá nghiên cứu là geraniol 32,15%, khác với mẫu từ Indonesia có 1,8-cineol lên tới 28,5% (theo nguồn [13]) Sự khác biệt này được giải thích do điều kiện trồng, địa điểm và thời gian thu hái, cũng như giống cây ở các cá thể khác nhau Ngoài ra, ở lá Quế còn có các thành phần có hàm lượng cao khác, cho thấy sự đa dạng thành phần hóa học giữa các mẫu và chịu ảnh hưởng của điều kiện sinh học và môi trường lên hợp chất.
33 trèn tại Indonesia giống với thành phần của mẫu nghiên cứu gồm: terpineol, spathlenol,
-caryophyllen, -pinen, cinnamyl acetat, -humulen, linalool [18]
Phân tích GC-MS các thành phần cấu tử trong tinh dầu cho thấy các hợp chất phổ biến nhất gồm α‑pinene, β‑pinene, methyl heptenon, dl‑limonen, 1,8‑cineol, linalool, terpineol, α‑copaen, δ‑3‑carene, methyleugenol, caryophyllen và α‑humulene Trong đó, các hợp chất pinene, 1,8‑cineol, linalool và terpineol xuất hiện khá nhiều ở một số loài thuộc chi Cinnamomum Schaeff Đây là những công bố đầu tiên ở Việt Nam về hàm lượng và thành phần của các cấu tử trong tinh dầu cây Quế.
Cinnamomum burmanni (Nees & T.Nees) Blume
Ngoài ra, qua đánh giá sơ bộ bằng các phản ứng hóa học:
Trong phân tích thành phần, các nhóm chất flavonoid, saponin, glycosid tim và đường khử cho thấy nhiều phản ứng dương tính hoặc phản ứng dương tính rất rõ, vì vậy có thể kết luận sự có mặt của các nhóm chất này trong cây với độ tin cậy khá cao Các nhóm chất khác cũng cho phản ứng dương tính nhưng mức độ rõ ràng chưa đạt, nên độ tin cậy thấp hơn; do đó cần tiến hành thêm các phản ứng hóa học khác để định tính chính xác.
Theo một nghiên cứu tại Indonesia, các nhóm chất chính có trong dịch chiết vỏ Quế trèn gồm flavonoid, tanin, terpenoid, steroid, alcaloid và saponin Các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào dịch chiết vỏ Quế trèn, trong khi dịch chiết lá và cành ít được quan tâm Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có nghiên cứu đánh giá đầy đủ các nhóm chất có trong dịch chiết cây Quế trèn.
3.9.3 Về hoạt tính kháng vi sinh vật
Cây Quế trèn có nhiều hoạt tính sinh học như: hoạt tính kháng khuẩn; có khả năng chống viêm, giảm đau, và chống tiểu đường; cải thiện tình trạng rối loạn dung nạp glucose và điều chỉnh hoạt động đáp ứng miễn dịch; khả năng chống oxy hóa, chống khối u, chống huyết khối, ngăn ngừa và điều trị sâu răng, viêm nha chu, và một số tác dụng khác
Theo một nghiên cứu, cành Quế trèn có hoạt tính kháng vi sinh vật đối với 5 loại vi khuẩn gây bệnh phổ biến qua thực phẩm như Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và Salmonella anatum [32]
Một bài báo khác của Shan và cộng sự đã đánh giá khả năng kháng của một số chủng vi sinh vật đối với tinh dầu Quế Trèn, cho thấy hiệu quả phụ thuộc vào hàm lượng phenol có trong tinh dầu Ngoài ra, tinh dầu Quế Trèn cũng được đánh giá có tác dụng ức chế trên vi khuẩn gram (+) tốt hơn trên vi khuẩn gram (–) [33].
A study by Shan B and colleagues on antibacterial and antioxidant properties shows that the cinnamon tree exhibits antimicrobial activity against Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, and Salmonella enterica [34].