Giáo trình Thí nghiệm hóa hữu cơ: Phần 2

Phần 2 cuốn giáo trình Thí nghiệm hóa hữu cơ đã trình bày các nội dung: Tổng hợp tert-pentyl chloride, sắc ký cột, tách các chất lỏng bằng phương pháp chưng cất, tổng hợp hương liệu isopentyl acetate, sắc ký lớp mỏng. Mời các bạn bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

BÀI 4 TÁCH CÁC CHẤT LỎNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT

Mục tiêu bài thí nghiệm: Sau khi học xong bài này, sinh viên có

• Đánh giá được kết quả khi chưng cất cùng một hỗn hợp chất lỏng

sử dụng hai phương pháp chưng cất khác nhau.

4.1 NHỮNG KIẾN THỨC LIÊN QUAN CẦN ĐỌC TRƯỚC

Nhiệt độ sôi của các cấu tử ở một áp suất nhất định khác biệt nhau càng nhiều thì sự phân tách càng dễ thực hiện Tùy vào sự chênh lệch nhiệt

độ sôi giữa các chất lỏng cần chưng cất mà lựa chọn kỹ thuật chưng cất phù hợp Phạm vi áp dụng kỹ thuật chưng cất được trình bày trong Bảng 2.4.1

Bảng 2.4.1: Các tiêu chí của các kỹ thuật chưng cất

Kỹ thuật chưng cất Các tiêu chí

Kỹ thuật chưng cất đơn

(Hình 2.4.2)

- Các chất lỏng trộn lẫn vào nhau

- Nhiệt độ sôi chất lỏng < 150oC ở 1 atm

- Độ chênh lệch nhiệt độ sôi giữa các chất

- Nhiệt độ sôi chất lỏng < 150oC ở 1 atm

- Độ chênh lệch nhiệt độ sôi giữa các chất

Hình 2.4.1: Cân bằng lỏng - hơi của hệ hai cấu tử tan lẫn vào nhau

Hình 2.4.2: Hệ thống chưng cất đơn trong phòng thí nghiệm

Hình 2.4.3: Hệ thống chưng cất phân đoạn trong phòng thí nghiệm

Bước 1: Cho một hỗn hợp gồm 50 mL ethanol và 50 mL nước cất

vào bình cầu 250 mL; Thêm 2 viên đá bọt vào bình cầu;

Bước 2: Lắp hệ thống chưng cất đơn như Hình 2.4.2, mở hệ thống

nước hoàn lưu;

Bước 3: Tiến hành gia nhiệt từ từ để chất lỏng bắt đầu sôi Duy trì

quá trình sôi của chất lỏng Theo dõi nhiệt kế, ghi nhận nhiệt độ khi giọt chất lỏng đầu tiên hứng được trong ống đong (ống thu nhận chất lỏng), lúc này cần điều chỉnh bếp để đạt tốc độ chưng cất mong muốn (10 giọt/phút);

Bước 4: Ghi nhận nhiệt độ chưng cất như một hàm theo thể tích

chất lỏng thu được Mỗi 5 mL chất lỏng hứng được, ghi nhận nhiệt độ một lần;

Bước 5: Chưng cất đến khi còn khoảng 20 mL chất lỏng trong bình

cầu thì tắt bếp, ngừng chưng cất Sau khi hệ thống đã nguội hẳn thì tắt nước

hệ thống hoàn lưu

4.4.2 Chưng cất phân đoạn

Thực hiện tương tự thí nghiệm chưng cất đơn với hệ thống chưng cất được ráp như Hình 2.4.3

4.4.3 Xây dựng đồ thị và phân tích kết quả

Bước 1: Xây dựng đồ thị nhiệt độ theo thể tích của phương pháp

chưng cất đơn và chưng cất phân đoạn trên cùng một hệ trục

Bước 2: Giải thích kết quả thu được đối với từng phương pháp Bước 3: Nhận xét và giải thích sự khác biệt về kết quả thu được khi

sử dụng hai phương pháp chưng cất khác nhau

Bước 4: Kết luận.

4.5 NƠI ĐỔ CHẤT THẢI VÀ CHẤT THU HỒI

Ethanol sau khi chưng cất được chuyển vào bình thu hồi ethanol (45

mL đầu tiên thu được từ hỗn hợp chất lỏng)

Phần chất lỏng thu được ở giai đoạn tiếp theo và chất lỏng còn lại trong bình cầu được đổ vào bồn rửa

Đá bọt được thu hồi và để vào nơi để dụng cụ thí nghiệm

4.6 CÂU HỎI

Câu 1: Hãy trình bày nguyên tắc kỹ thuật chưng cất, và phân biệt

chưng cất đơn và chưng cất phân đoạn

Câu 2: Nêu một vài ứng dụng của kỹ thuật chưng cất trong thực tế.

Câu 3: Tính phần mol của từng cấu tử trong hỗn hợp sử dụng trong

kỹ thuật chưng cất đơn và chưng cất phân đoạn ở bài thí nghiệm này

Câu 4: Tại sao trong bài thí nghiệm chỉ thu hồi 45 mL ethanol mà

không thu hồi được toàn bộ 50 mL như lượng ban đầu?

Câu 5: Đề xuất tối thiểu một phương pháp để kiểm tra độ tinh khiết

của chất lỏng sau khi chưng cất từ những kiến thức đã từng được học

Câu 6: Tại sao trong bài thí nghiệm này, chất thải được đổ bỏ trực

tiếp vào bồn rửa mà không bỏ vào bình đựng chất thải hữu cơ?

Câu 7: Một sinh viên thực hiện thí nghiệm chưng cất tương tự như

bài thí nghiệm trên nhưng sử dụng acetone thay vì ethanol Dự đoán kết quả thu được trong hai trường hợp sử dụng chưng cất đơn và chưng cất phân đoạn Có xảy ra sự khác biệt lớn không? Hãy giải thích

Câu 8: Để tách một hỗn hợp gồm hexane và nước, một sinh viên

đề nghị sử dụng kỹ thuật chưng cất phân đoạn Đề xuất này có phù hợp không? Hãy giải thích

Câu 9: Có thể sử dụng kỹ thuật chưng cất để tách một hỗn hợp nhiều

hơn hai chất lỏng được không? Hãy giải thích

Câu 10: Trong quá trình chưng cất phân đoạn, nhiệt độ khác biệt

như thế nào trong cột chưng cất phân đoạn theo chiều từ dưới lên trên? Giải thích

Câu 11: Trong quá trình thực hiện thí nghiệm chưng cất, sinh viên

vừa thu được giọt chất lỏng đầu tiên thì phát hiện ra chưa bỏ đá bọt vào bình cầu chưng cất Trong trường hợp đó bạn sinh viên nên làm gì? Vai trò của đá bọt là gì?

Câu 12: Một sinh viên thực hiện thí nghiệm chưng cất thì nhận thấy

kết quả nhiệt độ trên thang nhiệt kế không ổn định Hãy đưa ra một vài lý

do và đề nghị biện pháp khắc phục

Câu 13: Tại sao không ghi nhận nhiệt độ sôi của chất lỏng đến khi

chưng cất hết chất lỏng trong bình mà dừng lại khi bình còn khoảng 20 mL chất lỏng?

BÀI 5 TỔNG HỢP HƯƠNG LIỆU ISOPENTYL ACETATE

Mục tiêu bài thí nghiệm: Sau khi học xong bài này, sinh viên có

khả năng:

• Trình bày được quy trình tổng hợp isopentyl acetate.

• Tổng hợp được isopentyl acetate thông qua phản ứng giữa acetic acid và isopentyl alcohol.

• Áp dụng được kỹ thuật chiết để tách isopentyl acetate ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng.

• Áp dụng được kỹ thuật chưng cất để tinh chế isopentyl acetate.

5.1 NHỮNG KIẾN THỨC LIÊN QUAN CẦN ĐỌC TRƯỚC

5.2.1 Ester và phản ứng tạo ester

Ester là dẫn xuất của carboxylic acid với cấu trúc tổng quát là RCOOR’

Ester được điều chế bằng nhiều cách Phương pháp thông dụng là chuyển carboxylic acid thành ester bằng cách xử lý với alcohol, xúc tác acid Quy trình này được gọi là phản ứng ester hoá Fischer (Hình 2.5.1)

Hình 2.5.1: Phản ứng tổng hợp tạo ester từ carboxylic acid và methanol

Phản ứng tạo ester từ carboxylic acid và alcohol xảy ra qua 06 bước (Hình 2.5.2) (1) Chuyển proton: dưới tác dụng của xúc tác, nguyên tử oxygen của alcohol bị proton hoá và sau đó proton này được chuyển sang nhóm carbonyl của carboxylic acid Sự proton hoá này làm tăng tính ái điện tử của carbon nhóm carbonyl (2) Cộng ái nhân: cặp electron tự do trên nguyên tử oxygen sẽ tấn công vào carbon nhóm carbonyl của acid thông qua phản ứng cộng ái nhân (3) Chuyển proton: phân tử alcohol trung hoà sẽ tách proton từ sản phẩm trung gian ở Bước (2) (4) Chuyển proton: Một trong hai nhóm -OH trong sản phẩm trung gian ở Bước (3) sẽ

bị proton hoá thông qua quá trình chuyển proton từ phân tử alcohol đã bị proton hoá (5) Tách H2O: nhóm -OH bị proton hoá chuyển thành nhóm -O+H2, là một nhóm xuất tốt, sẽ được tách loại (6) Chuyển proton: điện tích dương trong sản phẩm trung gian sẽ được trung hoà thông qua quá trình chuyển proton, từ đó hình thành sản phẩm cuối cùng ester

Hình 2.5.2: Cơ chế tổng quát phản ứng ester hoá Fischer

Theo cơ chế trên thì Bước (2) khi alcohol tấn công vào nhóm carbonyl của carboxylic acid là bước quan trọng Yếu tố lập thể đóng vai trò quyết định lên tốc độ ester hoá Tốc độ hình thành ester giảm khi chướng ngại lập thể tăng:

CH3COOH > CH3CH2COOH > (CH3)2CHCOOH > (CH3)3CCOOHYếu tố lập thể của alcohol cũng đóng góp quan trọng vào tốc độ ester hoá Thứ tự ester hoá của acetic acid và các alcohol như sau:

CH3OH > CH3CH2OH > (CH3)3CCH2OHPhản ứng ester hoá Fischer là quá trình chuyển nhóm acyl từ acid sang alcohol Acid chloride và acid anhydride là các tác nhân cung cấp nhóm acyl hiệu quả vì chúng chứa các nhóm xuất tốt hơn so với carboxylic acid Ngoài ra, các dẫn xuất này có khả năng phản ứng cao trong giai đoạn tấn công ái nhân của alcohol vào nhóm carbonyl

Vì sản phẩm của phản ứng ester hoá Fischer có sự hiện diện của nước, nên lựa chọn xúc tác có tính hút nước hoặc các kỹ thuật loại nước nhằm nâng cao hiệu suất ester hoá Ngoài ra, phản ứng ester hoá Fischer

là thuận nghịch nên việc dùng dư một trong hai tác chất ban đầu cũng giúp nâng cao hiệu suất Thực tế, dùng tác chất nào dư liên quan đến vần đề an toàn và kinh tế

5.2.2 Ester và isopentyl acetate

Ester là dẫn xuất của carboxylic acid Do một số loại ester có mùi trái cây hay mùi hoa, nên ester thường được sử dụng như phụ gia tạo mùi thơm trong thực phẩm Các hợp chất dễ bay hơi trong trái cây hoặc hoa thường là hỗn hợp của nhiều chất, nhưng trong đó ester thường là thành phần chính, nhiều khi là hỗn hợp các ester

Isopentyl acetate hay còn gọi là isoamyl acetate, là chất lỏng không màu, ít tan trong nước, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ Isopentyl acetate tinh khiết hoặc hỗn hợp gồm isopentyl acetate, amyl acetate và một số chất dễ bay hơi khác được gọi là dầu chuối Ngoài

ra, isopentyl acetate còn được dùng làm dung môi sơn và chất dẫn dụ côn trùng

Isopentyl acetate là sản phẩm của isopentyl alcohol và acetic acid trong môi trường H2SO4 (Hình 2.5.3)

OH O

HO

O O

Isopentyl alcohol Acetic acid Isopentyl acetate

Hình 2.5.3: Phản ứng tổng hợp isopentyl acetate từ isopentyl alcohol và

Bước 1: Ráp hệ thống gồm bình cầu được cố định vào giá đỡ bằng

kẹp, phía dưới đặt nồi gia nhiệt chứa môi chất là glycerol, dưới cùng là máy khuấy từ gia nhiệt Cho cá từ vào bình cầu

Bước 2: Cho vào bình cầu đáy tròn 20 mL isopentyl alcohol và 25

mL acetic acid Khuấy từ để hai chất lỏng trộn lẫn vào nhau

Bước 3: Thêm từ từ 5 mL H2SO4 đậm đặc vào bình cầu, vừa thêm vừa khuấy từ

Bước 4: Lắp hệ thống sinh hàn phía trên bình cầu như Hình 2.5.4

Mở nước hoàn lưu, tiến hành đun bếp khuấy từ gia nhiệt ở 120oC và khuấy

từ liên tục trong 1 giờ kể từ khi hỗn hợp trong bình cầu bắt đầu sôi Sau khi phản ứng kết thúc, tắt điện và đợi hệ thống đã nguội hẳn thì tắt nước

hệ thống hoàn lưu

Hình 2.5.4: Hệ thống tổng hợp isopentyl acetate

5.4.2 Tách isopentyl acetate bằng kỹ thuật chiết

Bước 1: Sau khi đun hoàn lưu kết thúc, hỗn hợp phản ứng được

để nguội đến nhiệt độ phòng Chuyển toàn bộ hỗn hợp sau phản ứng vào phễu chiết

Bước 2: Thêm vào phễu chiết 50 mL nước cất Lắc phễu chiết vài

lần Để yên phễu chiết trên giá để hỗn hợp tách thành hai pha Loại pha dưới Thực hiện thêm một lần rửa pha trên với 25 mL nước cất

Bước 3: Thêm 25 mL dung dịch NaHCO3 5% vào pha trên đang nằm trong phễu chiết Lắc Mở khoá giải phóng áp suất hơi trong phễu chiết Lưu ý sau vài lần lắc, phải mở khoá phễu chiết cẩn thận, từ từ, hướng ra xa; tất cả các thao tác được tiến hành trong tủ hút Để yên phễu chiết trên giá để hỗn hợp tách thành hai pha Loại pha dưới Thực hiện thêm hai lần rửa pha trên với dung dịch NaHCO3 5% (2x25 mL)

Bước 4: Thêm 5 mL dung dịch NaCl bão hoà vào pha trên đang nằm

trong phễu chiết Lắc Để yên phễu chiết trên giá để hỗn hợp tách thành hai pha Loại pha dưới Chuyển pha hữu cơ ở pha trên vào bình tam giác 50 mL

Bước 5: Cho Na2SO4 khan vào bình tam giác, lắc đều, để yên 15 phút

Bước 6: Gạn lớp hữu cơ vào bình cầu đáy tròn 100 mL.

5.4.3 Tinh chế isopentyl acetate bằng kỹ thuật chưng cất

Bước 1: Lắp hệ thống chưng cất đơn như Hình 2.4.2 Lưu ý: thêm

vài viên đá bọt vào bình cầu Bình hứng được đặt trong bể nước đá

Bước 2: Thu nhận phân đoạn khi nhiệt kế chỉ từ 135-143oC Dừng đun khi trong bình cầu còn khoảng 2-5 mL chất lỏng Khoá nước hệ thống hoàn lưu khi hệ thống chưng cất đã nguội

Bước 3: Ghi nhận đặc điểm sản phẩm về màu và mùi Ghi nhận thể

tích hoặc khối lượng sản phẩm để tính hiệu suất

5.5 NƠI ĐỔ CHẤT THẢI VÀ CHẤT THU HỒI

Isopentyl acetate tổng hợp được chuyển vào chai thu hồi isopentyl acetate

Glycerol trong bể gia nhiệt phản ứng được giữ nguyên trong bể

5.6 CÂU HỎI

Câu 1: Hãy trình bày quy trình tổng hợp isopentyl acetate.

Câu 2: Hãy giải thích vai trò của sulfuric acid trong phản ứng tổng

hợp isopentyl acetate

Câu 3: Hãy cho biết tỷ lệ mol của isopentyl alcohol và acetic acid

trong quy trình thực nghiệm tổng hợp isopentyl acetate Vì sao dùng tỷ lệ này?

Câu 4: Vì sao phản ứng ester hoá cần được thực hiện trong điều kiện

đun hoàn lưu?

Câu 5: Hãy cho biết vai trò của dung dịch NaHCO3 5% trong giai đoạn tách isopentyl acetate ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng bằng kỹ thuất chiết? Hãy viết các phương trình phản ứng có thể xảy ra Có thể thay dung dịch NaHCO3 bằng dung dịch NaOH cùng nồng độ được không?

Câu 6: Trong giai đoạn chưng cất isopentyl acetate, vì sao phải thu

sản phẩm tại nhiệt độ 135-143oC? Hãy cho biết những chất nào có thể thu

được ở các phân đoạn có nhiệt độ thấp hơn 135oC và cao hơn 145oC?

Câu 7: Trong giai đoạn chiết isopentyl acetate ra khỏi hỗn hợp sau

phản ứng, vì sao loại bỏ lớp chất lỏng pha dưới, chỉ thu nhận lớp chất lỏng pha trên?

Câu 8: Vì sao phải dùng thêm dung dịch NaCl bão hoà trong giai

đoạn chiết isopentyl acetate ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng? Hãy cho biết

lý do dùng Na2SO4 khan trong tiến trình tinh chế sản phẩm?

Câu 9: Đề xuất một số kỹ thuật xác định độ tinh khiết của sản phẩm

isopentyl acetate thu được?

BÀI 6 SẮC KÝ LỚP MỎNG

Mục tiêu bài thí nghiệm: Sau khi học xong bài này, sinh viên có

6.1 NHỮNG KIẾN THỨC LIÊN QUAN CẦN ĐỌC TRƯỚC

Lực liên phân tử trong các hợp chất hữu cơ

Các kỹ thuật đo lường thể tích và khối lượng Kỹ thuật lọc Kỹ thuật đun nóng

6.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

6.2.1 Sắc ký phân bố

Sắc ký phân bố là một phương pháp phân tách vật lý trong đó các thành phần của hỗn hợp được phân bố giữa hai pha: pha tĩnh và pha động Pha động di chuyển theo một hướng xác định và đi ngang qua pha tĩnh Hỗn hợp cần tách được nạp vào một đầu của pha tĩnh Các chất trong hỗn hợp tương tác với pha động và pha tĩnh Tuỳ thuộc mức độ tương tác mà các hợp chất di chuyển với tốc độ khác nhau và do đó có thể tách khỏi nhau

Sự tương tác này liên quan đến các lực liên phân tử Một chất

có lực tương tác mạnh hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn so với chất có lực tương tác yếu hơn Đồng thời, khả năng của một chất hoà tan và di chuyển cùng với pha động cho phép nó di chuyển dễ dàng hơn trong pha tĩnh

Pha tĩnh được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) và sắc ký lỏng (Liquid Chromatography

- LC) là silica gel, đây là dạng silica hạt mịn (SiO2) liên kết với một lớp mỏng các phân tử nước Liên kết hydro và tương tác lưỡng cực - lưỡng cực giữa các phân tử làm cho các hợp chất hữu cơ phân cực bị giữ bởi silica gel mạnh hơn các hợp chất hữu cơ không phân cực Do

đó, dung môi pha động kéo các hợp chất phân cực đi chậm hơn so với các hợp chất không phân cực Theo cách tương tự, dung môi phân cực

di chuyển trên bảng TLC hoặc qua cột LC nhanh hơn so với dung môi không phân cực

6.2.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC) đã trở thành một kỹ thuật phân tích được

sử dụng rộng rãi bởi vì nó đơn giản, rẻ tiền, nhanh chóng và hiệu quả; ngoài ra, nó chỉ cần sử dụng vài miligam mẫu nguyên liệu TLC đặc biệt hữu ích để xác định số lượng hợp chất có trong hỗn hợp, để giúp xác định xem hai hợp chất có là trùng nhau hay không, và để theo dõi quá trình phản ứng

Để thực hiện phân tích TLC, một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu được hoà tan trong dung môi thích hợp và được đưa lên bề mặt chất hấp phụ, gần một đầu của bảng TLC Sau đó, bảng TLC được đặt trong một buồng kín với cạnh gần điểm vừa được chấm mẫu nhúng trong dung môi pha động, hay còn gọi là dung môi triển khai (Hình 2.6.1) Dung môi dâng lên qua pha tĩnh bằng tác động mao dẫn, gọi là quá trình triển khai sắc ký

Hình 2.6.1: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng

Khi dung môi dâng lên bảng TLC, các hợp chất trong mẫu được tách

ra do kết quả của nhiều trạng thái cân bằng giữa các pha động và pha tĩnh Hợp chất càng liên kết mạnh với chất hấp phụ trong pha tĩnh thì nó càng

di chuyển chậm trên bảng TLC (Hình 2.6.2) Khi pha tĩnh là silica gel, dung môi triển khai sẽ di chuyển các chất không phân cực lên bảng TLC một cách nhanh nhất, các chất phân cực di chuyển rất chậm hoặc không

di chuyển

Hình 2.6.2: Quá trình triển khai sắc ký lớp mỏng

Tấm TLC được lấy ra khỏi bình triển khai khi dung môi dâng lên đến vạch kết thúc, cách mép cạnh trên bảng TLC khoảng 0,5 cm Sau đó, bảng TLC được đặt trên nắp bình giải ly, để khô

Để quan sát các vết trên bảng TLC, có thể sử dụng thuốc thử tạo ra các vết màu Ngoài ra, có thể soi bảng TLC dưới ánh sáng tử ngoại nếu bảng TLC có chỉ thị huỳnh quang để quan sát các chất có khả năng hấp thu tia cực tím

Giá trị R f trong TLC Trong các điều kiện thí nghiệm không đổi, một

hợp chất nhất định luôn đi được một khoảng cách cố định so với khoảng cách di chuyển của dung môi (Hình 2.6.3) Tỷ lệ khoảng cách này được gọi là Rf

Hình 2.6.3: Tấm TLC đã được triển khai và hiện vết

Để tính giá trị Rf, hãy đo khoảng đường hợp chất di chuyển và khoảng đường dung môi di chuyển (xem Hình 2.6.3) Đo từ trung tâm của vết Các giá trị Rf cho hai chất thể hiện trên bảng TLC được triển khai trong Hình 2.6.3 được tính như sau:

Chọn lựa dung môi triển khai TLC Nhìn chung, nên sử dụng dung

môi triển khai không phân cực cho các hợp chất không phân cực và dung môi triển khai phân cực cho các hợp chất phân cực (theo Bảng 2.6.1) Tuy nhiên, việc chọn một dung môi phù hợp thường là một quá trình thử và sai, có thể dùng một hỗn hợp dung môi để đạt được sự phân tách tốt Một dung môi không làm cho bất kỳ hợp chất nào, trong hỗn hợp cần phân tích, di chuyển khỏi vạch xuất phát là dung môi không đủ phân cực (Hình 2.6.4a) Trong khi đó, một dung môi làm cho tất cả các chất trong hỗn hợp di chuyển đến vạch kết thúc là dung môi quá phân cực (Hình 2.6.4b) Một dung môi thích hợp để phân tích TLC cho các

vết với giá trị Rf là 0,20-0,70, với các giá trị lý tưởng trong phạm vi 0,60, như trong Hình 2.6.4c.

0,30-Bảng 2.6.1: Độ phân cực tương đối của các dung môi TLC thường dùng

và các nhóm hợp chất hữu cơ

Các dung môi triển khai

thường dùng Độ phân cực tăng dần Các nhóm hợp chất hữu cơ

Acetone tuyệt đối

Ethanol tuyệt đối

Methanol

Acetonitril

Nước

AlkaneAlkeneHydrocarbon thơmEther, halocarbonAldehyde, ketone, ester

AmineAlcoholCarboxylic acid

Hình 2.6.4: Chọn lựa dung môi triển khai TLC

- Xác định dung môi phù hợp cho sự tách hỗn hợp bằng sắc ký cột.

- Theo dõi tiến trình sắc ký cột

- Theo dõi tiến trình phản ứng hoá học

6.2.3 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preperative Thin Layer Chromatography

- prep.TLC) dùng để tách định lượng các hợp chất ra khỏi hỗn hợp Kỹ thuật này thường được sử dụng với bảng TLC được tráng dày (1 mm) và kích thước lớn 20x20 cm, mỗi lần có thể triển khai được 0,2 – 0,5 g mẫu chất Để quan sát được vết sau khi đã triển khai bảng TLC có thể dùng đèn UV hoặc cắt 2 mép dọc bảng để hiện vết bằng thuốc thử và định hình vị trí mẫu chất trên bảng Dùng spatula cạo chất hấp phụ chứa mẫu chất trong vùng đã định vị Dùng dung môi thích hợp để giải hấp chất hữu cơ ra khỏi chất hấp phụ và làm bay hơi dung môi để thu được hợp chất tinh khiết

Các giai đoạn thực hiện TLC phân tích định tính:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị vi quản

Giai đoạn 2: Chuẩn bị bảng TLC

Giai đoạn 3: Chuẩn bị dung môi.

Giai đoạn 4: Chấm mẫu chất lên bảng TLC

Giai đoạn 5: Triển khai bảng TLC

Giai đoạn 6: Hiện hình vết trên bảng TLC

Giai đoạn 7: Tính toán Rf

Tiến trình chi tiết:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị vi quản

Bước 1: Dùng hai tay cầm hai đầu ống vi quản, dùng các đầu ngón

tay vừa se tròn, vừa hơ nóng đoạn giữa của vi quản đến khi mềm dẻo

Bước 2: Đưa ống vi quản tránh khỏi ngọn lửa rồi kéo từ từ hai đầu

ống ra xa khỏi nhau đến khi đạt khoảng cách 4-5 cm

Bước 3: Giữ yên cho đến khi thủy tinh nguội và đặc cứng lại Bẻ đôi

thu được 2 ống vi quản

Giai đoạn 2: Chuẩn bị bảng TLC

Bước 1: Dùng viết chì và thước để chia bảng TLC 20x20 thành 4

phần 20x5, dùng kéo để cắt bảng

Bước 2: Dùng viết chì và thước kẻ một đường thẳng cách mép dưới

bảng 1 cm làm vạch xuất phát của dung môi

Bước 3: Kẻ nhẹ một đường thẳng cách mép trên bảng 0,5 cm làm

vạch kết thúc

Bước 4: Tuỳ theo số lượng mẫu cần chấm mà cắt bảng TLC với

chiều rộng phù hợp Dùng bút chì đánh dấu các vị trí chấm mẫu sao cho các vị trí cách nhau và cách mép bảng TLC khoảng 0,5 - 1,0 cm

Giai đoạn 3: Chuẩn bị dung môi giải ly

Bước 1: Dùng ống đong pha 10 mL hệ dung môi hexane : acetone

(7:3, v/v)

Bước 2: Cho vào bình giải ly có đặt sẵn một tấm giấy lọc, nghiêng

đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc

Bước 3: Đậy nắp bình giải ly và để yên.

Giai đoạn 4: Chấm mẫu chất lên bảng TLC

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

(1) Cân khoảng 1 g lá mồng tơi khô cắt nhỏ rồi cho vào cối sứ, dùng

chày nghiền nhuyễn; thêm 0,5 g Na2SO4 khan và 10 mL acetone, khuấy trộn đều (lượng acetone lấp xấp mẫu) Gạn dịch chiết vào ống nghiệm Dùng thêm 2 mL acetone để tráng rửa phần bã và chày cối và chuyển tất cả dịch acetone vào ống nghiệm (thực hiện tráng rửa 2 lần)

(2) Cho 1 g Na2SO4 khan vào dịch chiết acetone Lắc đều

(3) Gạn phần dịch chiết, bỏ phần chất rắn, chuyển dịch chiết vào cốc

50 mL Làm bay hơi dung môi trên bếp cách thủy, thu được phần cặn làm mẫu chấm bảng TLC

Bước 2: Hoà tan phần cặn bằng 0,5 mL hexane,

Bước 3: Chấm đầu ống vi quản vào dung dịch mẫu,

Bước 4: Chạm nhẹ đầu vi quản vào bảng TLC tại điểm trên vạch

xuất phát Nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi bảng TLC để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính 1 mm,

Bước 5: Tùy thuộc nồng độ mẫu mà chấm vài lần vào một điểm đến

khi thấy vết có màu vàng rõ Trước khi chấm lần kế tiếp cần làm bay hơi dung môi tại vết đã chấm,

Bước 6: Sấy nhẹ làm bay hơi dung môi,

Bước 7: Nếu cần khảo sát nhiều mẫu khác nhau, chấm mỗi mẫu một

vết trên vạch xuất phát của bảng TLC Các vết cách nhau 0,5 - 1,0 cm Hai vết ở ngoài bìa phải cách gờ cạnh 1 cm

Giai đoạn 5: Triển khai bảng TLC

Bước 1: Đặt bảng TLC vào bình giải ly, cạnh đáy của bảng TLC

chạm vào đáy của bình và ngập trong dung môi Vạch xuất phát và các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi

Bước 2: Đậy nắp bình giải ly và để yên.

Bước 3: Chờ đến khi mực dung môi thấm dần và dâng lên đến vạch

kết thúc thì nhấc bảng TLC ra khỏi bình giải ly và sấy khô bảng TLC

Giai đoạn 6: Hiện vết trên bảng TLC

Bước 1: Quan sát bằng mắt thường

(1) Quan sát sự hiện màu các vết.

(2) Chụp ảnh lại để lưu trữ.

Bước 2: Phát hiện bằng đèn tử ngoại (UV)

(1) Đặt bảng TLC dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và quan sát (2) Chụp ảnh lại để lưu trữ.

(3) Dùng viết chì khoanh những vết có màu tối trên nền sáng.

Bước 3: Hiện vết bằng dung dịch vanillin/H 2 SO 4 (với chất không màu)

(1) Nhúng bảng TLC vào bình đựng dung dịch H2SO4 50% Cạ nhẹ bảng trên thành bình để phần acid dư về lại bình Đặt mặt nhôm của bảng TLC lên tờ giấy thấm để ráo acid

(2) Đặt bảng TLC lên mặt bếp gia nhiệt để hơ nóng.

(3) Quan sát sự hiện màu các vết.

(4) Chụp ảnh lại để lưu trữ.

Giai đoạn 7: Tính toán R f

Bước 1: Dùng thước đo khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm từng

vết trên bảng TLC

Bước 2: Đo khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch kết thúc

Bước 3: Tính toán Rf theo công thức đã trình bày ở phần lý thuyết

Bước 4: Xem các vết hiện trên TLC đã trong giới hạn Rf phù hợp chưa Nếu chưa, thực hiện quy trình tương tự lần thứ hai với hệ dung môi giải ly do nhóm tự đề xuất

Bước 5: So sánh kết quả TLC với các hệ dung môi giải ly đã thực

hiện Nhận xét

6.4.2 TLC phân tích định lượng

Các giai đoạn thực hiện TLC phân tích định lượng:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị vi quản.

Giai đoạn 2: Chuẩn bị bảng sắc ký lớp mỏng điều chế (prep.TLC) Giai đoạn 3: Chuẩn bị dung môi.

Giai đoạn 4: Chấm mẫu chất lên bảng prep.TLC.

Giai đoạn 5: Triển khai bảng prep.TLC.

Giai đoạn 6: Phát hiện vết trên bảng prep.TLC.

Giai đoạn 7: Tách chất cần tinh chế.

Giai đoạn 8: Kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC

Tiến trình chi tiết:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị vi quản

Thực hiện thao tác kéo vi quản tương tự như phần TLC phân tích định tính Nhưng lưu ý một số vấn đề sau:

- Sử dụng ống vi quản có đường kính lớn

- Sau khi kéo ống vi quản, bẻ phần đầu thủy tinh thừa sát vào trong sao cho đầu ống vi quản có kích thước lớn hơn để mẫu dễ dàng thoát ra với lượng lớn

Giai đoạn 2: Chuẩn bị bảng TLC điều chế

Thực hiện công đoạn chuẩn bị bảng prep.TLC tương tự như phần TLC phân tích định tính Nhưng lưu ý một số vấn đề sau:

- Chuẩn bị 1 bảng prep.TLC có kích thước 5 cm x 10 cm (có thể dùng bảng có kích thước lớn hơn trong các trường hợp mẫu khó tách)

- Kẻ vạch xuất phát cách mép dưới bảng 1,5 cm

- Kẻ vạch kết thúc cách mép trên bảng 0,5 cm

Giai đoạn 3: Chuẩn bị dung môi

Bước 1: Từ kết quả TLC của các thí nghiệm trước, chọn ra hệ dung

môi phù hợp để tách các chất (các vết) ra khỏi nhau Sử dụng hệ dung môi này cho prep.TLC

Bước 2: Đặt một tấm giấy lọc vào bình giải ly,

Bước 3: Cho vào bình giải ly lớn 20 mL hệ dung môi đã chọn,

nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc

Bước 4: Đậy nắp bình giải ly và để yên.

Giai đoạn 4: Chấm mẫu chất lên bảng prep.TLC

Bước 1: Dùng mẫu dịch chiết lá mồng tơi đã chuẩn bị ở phần trước Bước 2: Chấm ống vi quản vào dung dịch mẫu, để mẫu chất dâng lên

tối đa trong ống vi quản

Bước 3: Chạm nhẹ đầu vi quản vào bảng prep.TLC tại vạch xuất

phát Đặt nghiêng ống vi quản và kéo một đường thẳng dọc theo vạch xuất phát (yêu cầu thao tác kéo đều, thẳng, vạch dứt khoát) Lặp lại 3 lần

Bước 4: Sấy nhẹ làm bay hơi dung môi.

Giai đoạn 5: Triển khai bảng prep.TLC

Bước 1: Đặt bảng TLC vào bình giải ly, cạnh đáy của bảng prep.

TLC chạm vào đáy của bình và ngập vào dung môi Vạch xuất phát và các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi

Bước 2: Đậy nắp bình giải ly và để yên.

Bước 3: Chờ đến khi mực dung môi di chuyển đến vạch kết thúc thì

nhấc bảng prep.TLC ra khỏi bình giải ly và sấy khô

Giai đoạn 6: Phát hiện vết trên bảng prep.TLC

Bước 1: Phát hiện bằng đèn tử ngoại (UV)

(1) Đặt bảng TLC dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và quan sát (2) Dùng viết chì khoanh vùng có màu tối.

Bước 2: Phát hiện hình vết bằng dung dịch vanilin pha trong acid

(1) Cắt rìa 2 mép ngoài của bảng prep TLC với khoảng cách mép

bảng 0,5 cm

(2) Nhúng 2 rìa mép bảng TLC vào bình đựng dung dịch vanilin

pha trong acid Thực hiện bước hiện hình tương tự với TLC phân tích định tính

(3) Đặt 2 rìa mép vào vị trí ban đầu và đánh dấu vùng hiện màu (4) Căn cứ vào mép này và vùng chuyển màu mờ mờ trên bảng để

định hình vùng chất cần tách

Lưu ý: nếu thực hiện đúng thì vùng này trùng với vùng đánh dấu

bằng viết chì khi soi đèn UV

Giai đoạn 7: Tách chất cần tinh chế

Bước 1: Dùng dao nhọn hoặc mũi nhọn của spatula khắc vào bảng

prep.TLC theo dấu viết chì

Bước 2: Cạo silica gel hấp phụ theo từng vùng chất và để vào các hũ

bi riêng cho từng chất

Bước 3: Cho 10 mL hỗn hợp hexane : acetone (7:3, v/v) vào hũ bi

chứa chất màu vàng và 10 mL hỗn hợp acetone : methanol (8:2, v/v) vào

hũ bi chứa chất màu xanh, đun cách thủy 2 phút

Bước 4: Chuẩn bị 2 pipet Pasteur có nhét bông cotton ở đầu mũi Bước 5: Dùng các pipet Pasteur này đưa vào hút dung dịch trong

từng hũ bi và chuyển vào từng hũ bi sạch

Bước 6: Thêm hỗn hợp dung môi tương ứng từng mẫu vào từng hũ

bi chứa silica gel để giải hấp triệt để Hút lấy dịch lọc và chuyển vào hũ bi đựng mẫu chất tương ứng

Bước 7: Đuổi dung môi trên bếp khuấy từ gia nhiệt (đặt trong tủ hút

khí độc) để thu chất tinh khiết

Giai đoạn 8: Kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC

Bước 1: Dùng TLC để kiểm tra hiệu quả của quá trình tách bằng

cách chấm mẫu dịch trích và các chất sau khi tách bằng prep.TLC trên cùng một bảng TLC (5 x 3 cm)

Bước 2: Triển khai TLC với hệ dung môi phù hợp.

Bước 3: Quan sát màu sắc các vết ở điều kiện thường và dưới đèn

UV 254 và 365 nm

Bước 4: Chụp hình và lưu kết quả

Bước 5:Tính toán Rf các vết

Bước 6: Nhận xét.

6.5 NƠI ĐỔ CHẤT THẢI VÀ CHẤT THU HỒI

Bảng silica gel sau khi sử dụng và bột silica gel sau khi giải hấp được chuyển vào hộp thu hồi tương ứng

Chất thải là dung môi hữu cơ được đổ vào thùng chứa chất thải hữu

cơ không halogen

Giấy lọc bỏ vào thùng chất thải rắn

6.6 CÂU HỎI

Câu 1: Hãy trình bày nguyên tắc tách các hợp chất hữu cơ bằng kỹ

thuật sắc ký

Câu 2: Trong quá trình phân tích TLC trên bảng TLC silica gel,

2-propanol được sử dụng làm dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng, hai mẫu chất A và B di chuyển cùng với mực dung môi và kết quả đạt Rf =1 Bạn có thể kết luận rằng chất A và chất B giống hệt nhau không? Nếu không, cần thực hiện thêm thí nghiệm nào?

Câu 3: Với hợp chất A, khi được triển khai bảng TLC trong diethyl

ether giá trị Rf của A là 0,34; trong pentane giá trị Rf của A là 0,44 Trong khi đó, hợp chất B có giá trị Rf là 0,42 trong pentane và Rf là 0,60 trong diethyl ether Dung môi nào sẽ tốt hơn để tách hỗn hợp A và B bằng TLC? Hãy giải thích

Câu 4: Một sinh viên cần phân tích hỗn hợp chứa alcohol và ketone

bằng TLC silica gel Hãy tham khảo Bảng 2.6.1 và đề xuất dung môi phù hợp cho hỗn hợp này

Câu 5: Xem xét các hợp chất butylcyclohexanol và

4-tert-butylcyclohexanone Nếu sử dụng TLC silica gel pha thường, hợp chất nào trong hai hợp chất sẽ có giá trị Rf cao hơn khi dùng ethyl

acetate làm dung môi triển khai? Chất nào sẽ có giá trị Rf cao khi dùng dichloromethane làm dung môi triển khai? Hãy đưa ra lời giải thích trong từng trường hợp.

Câu 6: Sau khi cô lập xong hợp chất hữu cơ, có thể dùng kỹ thuật

TLC để xác định gần đúng mức độ tinh sạch của chất được cô lập không? Hãy cho biết cách tiến hành?

Câu 7: Giả sử một hỗn hợp phản ứng có hai tác chất ban đầu là

A và B A phân cực hơn B Sau 2 giờ tiến hành phản ứng, có thể dùng

kỹ thuật TLC để kiểm tra tiến trình phản ứng được không? (Gợi ý: đã tạo thành sản phẩm hay chưa? A và B còn hay đã phản ứng hết?) Giả

sử sản phẩm C phân cực hơn A và B và dung môi X có thể tách tốt cả

3 chất A, B và C, hãy so sánh và giải thích giá trị Rf của từng chất trên bảng TLC với dung môi giải ly là X? Hãy vẽ hình vị trí các vết hiện trên bảng TLC

Câu 8: Một sinh viên chấm một mẫu chất chưa biết trên bảng TLC

và triển khai bảng trong dung môi dichloromethane Chỉ có 1 vết xuất hiện với Rf=0,95 Điều này có thể khẳng định chất trên là tinh khiết không? Cần làm gì để xác định độ tinh khiết của mẫu?

Câu 9: Hai sinh viên A và B được giao mỗi người một mẫu chất

chưa biết Cả hai mẫu đều là không màu Cả hai sinh viên đều dùng bảng TLC như nhau và triển khai cùng hệ dung môi giải ly Mỗi người đều thu được kết quả là một vết với Rf=0,75 Làm cách nào để chứng minh hai mẫu

đó là một?

BÀI 7 SẮC KÝ CỘT

Mục tiêu bài thí nghiệm: Sau khi học xong bài này, sinh viên có

khả năng:

• Trình bày được nguyên tắc chung của sắc ký cột.

• Áp dụng được kỹ thuật sắc ký cột để tách và tinh chế các hợp chất hữu cơ

7.1 NHỮNG KIẾN THỨC LIÊN QUAN CẦN ĐỌC TRƯỚC

Lực liên phân tử trong các hợp chất hữu cơ

Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh là chất hấp phụ rắn được nhồi vào cột Một dung môi giải ly được sử dụng như pha động Khi dung môi giải

ly xuống cột, sự phân tách xảy ra bởi nhiều trạng thái cân bằng của các hợp chất giữa các pha tĩnh và pha động Sự tương quan về độ phân cực của hai pha này xác định thứ tự các hợp chất trong ra khỏi cột quá trình giải ly Với một chất hấp phụ phân cực như silica gel thì hợp chất kém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước tiên sau đó đến chất phân cực hơn Quá trình phân tách một hỗn hợp bằng sắc ký lỏng được trình bày trong Hình 2.7.1

Hình 2.7.1: Quá trình phân tách hỗn hợp bằng sắc ký lỏng

7.2.2 Chọn lựa dung môi giải ly

Việc chọn lựa dung môi giải ly cho sắc ký cột có thể tham khảo

từ kết quả sắc ký lớp mỏng với cùng chất hấp phụ Một hệ dung môi làm di chuyển hợp chất cần tách trên sắc ký lớp mỏng TLC với Rf xấp

xỉ 0,3 sẽ là một dung môi giải ly tốt cho sắc ký cột Để tách các chất

ra khỏi hỗn hợp thì nên chọn hệ dung môi giải ly trên TLC sao cho độ chênh lệch Rf là 0,2

7.2.3 Xác định kích thước cột

Kích thước của cột được sử dụng để phân tách trong sắc ký cột

LC phụ thuộc vào lượng mẫu cần tách Để phân tách một hỗn hợp mức

độ khó vừa phải, nên sử dụng silica gel gấp khoảng 10 - 20 lần trọng lượng so với lượng mẫu cần tách Trường hợp khó tách có thể sử dụng lượng chất hấp phụ nhiều hơn và có thể giảm lượng chất hấp phụ nếu mẫu dễ tách hơn Nếu sử dụng chất hấp phụ quá ít, cột sẽ bị quá tải và

sự phân tách sẽ kém Nếu sử dụng quá nhiều chất hấp phụ, quá trình sắc ký sẽ mất nhiều thời gian hơn, đòi hỏi nhiều dung môi rửa giải hơn

và kém hiệu quả hơn

Chiều cao cột silica gel thường trong khoảng 10 - 20 cm, tỷ lệ chiều cao chất hấp phụ so với đường kính trong của cột là 8 : 1 hoặc

10 : 1

7.2.4 Chuẩn bị cột sắc ký

Sau khi đã chọn được kích thước cột, xác định lượng chất hấp phụ cần thiết và chọn lựa được dung môi triển khai sắc ký cột, tiếp theo sẽ là giai đoạn nhồi cột Chất hấp phụ có thể được đưa vào cột bằng phương pháp nhồi khô hoặc phương pháp nhồi sệt

Phương pháp nhồi cột với chất hấp phụ khô Đặt một phễu thuỷ tinh

đuôi rộng vào đầu cột và khoá cột lại Đổ từ từ chất hấp phụ khô vào cột đã chứa đầy dung môi Cẩn thận rắc chất hấp phụ để đảm bảo rằng chất hấp phụ rơi đồng đều xuống đáy tạo mặt ngang đều nhau

Hình 2.7.2: Cột sắc ký đã được nhồi xong

Phương pháp nhồi cột sắc ký với chất hấp phụ dạng sệt Cách nhồi

cột dạng sệt ưu điểm hơn nhồi cột khô ở điểm ngăn ngừa sự hình thành vón cục hoặc bọt khí trong cột Bọt khí có thể hình thành khi nhiệt sinh ra bởi sự tương tác giữa các dung môi phân cực và bề mặt của chất hấp phụ.Đặt một phễu đuôi rộng vào đầu cột và đổ đầy một nửa cột với cùng dung môi giải ly đầu tiên Chất hấp phụ được ngâm trong bình tam giác

có chứa cùng dung môi nạp cột Khuấy đều và đợi cho đến khi hỗn dịch nguội và trương nở tối đa Lắc xoáy bình tam giác chứa dung môi và chất hấp phụ dạng sệt và đổ từ từ hỗn hợp này vào cột Trong quá trình nhồi cột, vẫn mở khoá cột để dung môi chảy từ từ vào bình tam giác Thêm dung môi khi cần thiết để mức dung môi không bao giờ hạ xuống dưới mức chất hấp phụ trong suốt quá trình nhồi cột Hình 2.7.2 mô tả cột sắc ký đã nhồi chất hấp phụ

7.2.5 Chuẩn bị và nạp mẫu

Tuỳ thuộc theo mẫu dễ tan hoặc khó tan trong dung môi triển khai đầu tiên trong sắc ký cột mà nạp mẫu ướt hoặc nạp mẫu khô

Nạp mẫu ướt: Nếu mẫu tan được trong dung môi đầu tiên triển

khai sắc ký cột thì pha mẫu tạo dung dịch đậm đặc rồi vào đưa vào đầu cột Nếu mẫu là chất lỏng (không có dung môi) có thể được đưa trực tiếp vào cột

Nạp mẫu khô: Nếu mẫu không hoà tan nhiều trong dung môi rửa giải

thì sử dụng một lượng nhỏ dung môi phân cực hơn để hoà tan mẫu và hấp thụ mẫu trên lượng nhỏ silica gel Trộn đều mẫu và silica gel đến khi đạt được dạng bột mịn và tơi Nếu hỗn hợp dạng sệt hoặc vón cục thì cần thêm silica gel để hấp phụ cho đủ mẫu chất Đưa mẫu đã hấp phụ trong silica gel vào đầu cột tương tự như nhồi cột khô

7.2.6 Giải ly cột

Giải ly cột bằng cách sử dụng một loạt các dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần

Thay đổi dung môi giải ly trong quá trình triển khai Một hỗn hợp

gồm hai dung môi thường được sử dụng để triển khai sắc ký cột Nếu việc thay đổi dung môi được thực hiện quá đột ngột, có thể tạo ra sự toả nhiệt

do thay đổi tương tác giữa dung môi và chất hấp phụ gây hiện tượng nứt cột hấp phụ Để tránh hiện tượng này khi thay đổi dung môi lần lượt pha dung môi phân cực vào dung môi kém phân cực vớic các nồng độ lần lượt

là 1%, 2%, 5%, 10%, 25%, 50% và 100%

Phân đoạn dung dịch giải ly Nếu các hợp chất cần tách có màu thì

việc hứng các chất khác nhau là một vấn đề đơn giản, chỉ cần dựa vào màu sắc của các chất là có thể tách riêng chúng ra khỏi nhau Trong trường hợp các chất cần tách không có màu, cần hứng dung môi ra khỏi cột bằng các bình tam giác hoặc ống nghiệm có dung tích bằng nhau, gọi là các phân đoạn Kích thước của các phân đoạn giải ly hứng cuối cột phụ thuộc vào từng thí nghiệm cụ thể Các phân đoạn nào cho kết quả TLC giống nhau được gom lại chung

7.4 TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM

7.4.1 Các giai đoạn thực hiện sắc ký cột

Giai đoạn 1: Chuẩn bị các vật dụng cần thiết.

Giai đoạn 2: Chuẩn bị mẫu nạp cột.

Giai đoạn 3: Chọn hệ dung môi giải ly.

Giai đoạn 4: Nhồi cột.

Giai đoạn 5: Nạp mẫu vào đầu cột

Giai đoạn 6: Giải ly sắc ký cột.

Giai đoạn 7: Kiểm tra bằng TLC và gộp các phân đoạn.

7.4.2 Tiến trình chi tiết

Giai đoạn 1: Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết

Bước 1: Chuẩn bị pipet 5 mL sạch và khô làm cột sắc ký

Bước 2: Cho một cục bông cotton nhỏ vào cột, dùng cọng kẽm dài

đưa cục bông cotton vào cuối cột (trước khoá);

Giai đoạn 3: Chọn hệ dung môi giải ly (tham khảo)

Dùng TLC để chọn hệ dung môi phù hợp cho CC Hệ dung môi phù

hợp là hệ dung môi tách được các vết trong hỗn hợp xa nhất

Chọn hệ dung môi với tỷ lệ sao cho vết phân cực hơn có Rf khoảng

0,3.*(hệ này sẽ dùng để giải ly chất phân cực hơn và triển khai TLC kiểm

tra kết quả) Gợi ý: thử với các dung môi n-hexane, acetone, ethyl acetate

Giai đoạn 4: Nhồi cột

Bước 1: Cho 2 g silica gel vào cốc nhỏ và rót hexane vào khuấy đều

tạo hỗn hợp sệt, để yên 5 phút cho silica gel trương nở trong hexane

Bước 2: Cho hexane vào 1/2 cột Khóa cột lại Đặt ống nghiệm hứng

dưới cột

Bước 3: Dùng pipet Pasteur chuyển từ từ hỗn dịch silica gel sệt vào

cột, mở khoá cho cột chảy liên tục Dùng thêm dung môi vào cốc tráng rửa

để chuyển toàn bộ silica gel vào cột

Bước 4: Gõ nhẹ vào thành cột để đảm bảo không có bọt khí trong cột

và làm lớp silica gel trên bề mặt cột phẳng

Bước 5: Tiếp tục thêm dung môi vào đầu cột, không để khô cột Để

cột chảy liên tục một thời gian cho ổn định trước khi nạp mẫu

Giai đoạn 5: Nạp mẫu vào đầu cột

Bước 1: Hoà tan mẫu chiết lá mồng tơi trong 1 mL hexane Giữ lại

một vài giọt dịch chiết lá để so sánh kết quả TLC;

Bước 2: Mở khoá cột để dung môi chảy xuống đến mức sát bề mặt

lớp silica gel

Bước 3: Dùng pipet hút dịch chiết đưa vào đầu cột bằng cách ria tròn

đều quanh thành cột

Bước 4: Mỗi lần chuyển từng lượng nhỏ mẫu vào đầu cột thì mở

khoá để lớp dịch chiết chảy xuống thấm vào lớp silica gel Khoá lại ngay khi lớp dịch chiết vừa thấm hết

Bước 5: Thêm dung môi để tráng rửa bình chứa mẫu nhằm đảm

bảo chuyển toàn bộ mẫu vào đầu cột Mỗi lần dùng từng lượng nhỏ dung môi Thực hiện nhiều lần đến khi lớp dung môi đầu cột sạch không còn màu xanh của mẫu Thêm dung môi sạch đầy đầu cột và bắt đầu mở khoá để giải ly

Giai đoạn 6: Giải ly sắc ký cột

Bước 1: Tiến hành giải ly cột bắt đầu với hexane Dùng các ống

nghiệm hứng các phân đoạn với dung tích 5 mL mỗi ống nghiệm