Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển quảng trị

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC — G8G8 Lũ SDS0 — KH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội ĐÊ TÀI Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kế.

—-G8G8 Lũ SDS0-—

K'H

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội

ĐÊ TÀI:

Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh

vật liên kết hải miên vùng biến Quáng Trị.

Giáo viên hướng dẫn 1

Giáo viên hướng dẩn 2

Sinh viên thực hiện

Lóp

: T.s Vũ Thị Thu Huyền : Th.s Trần Thị Kim Dung : Phạm Vũ Vưong : 13-01

Hà Nội, 05-2017

MÓ ĐÀU 1

PHÀN 1: TÒNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về hái miên: 3

1.2 Vi sinh vật liên kết hài miên: 4

1,3 Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học thu nhận được từ vi sinh vật liên kết hải miên: 8

1,4 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết với hãi miên ở Việt Nam: 10

6Tnu rvien việiĩĐại ì nọc MO Ha Nọỉ 1.5 Vai trò polyketide synthase: 12

1.6 Vector tách dòng pCR2.1 invitrogen 15

PHÀN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị đã được phân lập 18 2.1.2 Các thiết bị và sinh phẩm 18

2.1.3 Trang thiết bị 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 21

2.2.1 Phương pháp tách DNA tổng vi sinh vật liên kết hái miên: 21

2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ bằng quang phổ kế : 23

2.2.5 Tách chiết plasmid: 28

2.2.6 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose (thôi gel): 31

2.2.7 Tinh sạch vector tái tồ hợp,- 33

2.2.8 Xác định trình tự gen bằng máy tự động: 34

PHẦN 3: KẾT QUÁ 36

3.1 Kết quà tách DNA tổng số: 36

3.2 Kết quà khuếch đại gen (PCR) 37

3.3 Kết quả thu nhận gen polyketide synthase từ gel agarose (thôi gel).39 3.4 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợpvào tế bào khã biến 40

3.5 Kết quả tách plasmid 41

3.6 Ket quả giải trình tự 42

PHẦN 4: KÉT lĨỊKÌvi(?n viện Đạ' học Mo‘ Hà 47 PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHÁO 48

Amp Ampicillin

DNA Deoxyribonucleotid Acid

DEPC Diethylpyrocarbonat

dNTP Deoxyribonucleotid 5' -triphosphatesEtBr Ethidium bromide

EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid

NRPS Non ribosomal peptide synthases

PCR Polymerase Chain Reaction

Hình 1.1 Mầu hải miên thu nhận từ biển Quàng Trị Việt Nam 3

Hình 1.2.Phàn ứng tong hợp polyketide được và sinh tống hợp tiền chất doxorubicin, e-rhodomycinone 14

Hình 1.3.So đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vector pCR®2.1 17

Hình 2.1 Trình tự cắt của enzyme giới hạn EcoR 1 30

Hình 3.1 Điện di đồ sàn phấm DNA tống so vi sinh vật liên kết hài miên 36

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phấmPCR trên gel agarose 1 % 39

Hình 3.3.Kết quả điện di sản phấm PCR đã tinh sạch sau thôi gel 40

Hình 3.4.Hình ánh đĩa nuôi cấy sau biến nạp 41

Hình 3.5.Điện di đô sàn phâm tách plasmid 42

Hình 3.6.Hình ánh so sánh trình tự nucleotide gen PKS thu được trên genbank Th«viêfi"ViệnĐạthọe"MỞHàNợi 45

Hình 3.7.S0 sánh trình tự acid amin đã dịch mã từ trinh tự nucleotide với các trình tự acid amin đã công bố trên genbank 46

Bảng 1 Các enzymes biển được phát hiện từ các nguồn mctagenomics: 6

Bảng 2 : Thành phần và các vị trí vector tách dòng pCR®2.1: 16

Bàng 3 Thành phần phàn ứng PCR: 38

Bàng 4.Chu trình nhiệt của phàn ứng PCR: 38

Bàng 5 Thành phần phàn ứng và chu trình nhiệt: 43

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

MỞ ĐẦU

1 Dặt vấn đề:

Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương, nơi có nguồn đa dạng sinh học vô cùng phong phú.Một vài năm trước đây nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên biển ờ Việt Nam còn rất mới, nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất từ nguồn sinh vật biến nham phục vụ sàn xuất thực phấm chức năng hoặc dùng làm nguyên liệu nghiên cứu thuốc đang ở giai đoạn đàu Sinh vật biền là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao như kháng khuấn, kháng nấm, kháng sinh, chống sốt rét, chống ung thư, kìm hãm HIV, điều biến cung cấp nhiều loại thuốc mới, các chế phấm có giá trị cao phục vụ nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm trong nước và xuất khẩu

Đại dương chứa trên 500.000 loài động vật không xương sống và cá loài rong, tao.Môi trường biên là một kho làng các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mà nhiều chất cho thấy những đặc điếm cấu trúc chưa hề gặp ớ các hợp chất thiên nhiên trên cạn.Một số loài tạo họp chất sinh học từ nguồn thức

ăn, trong khi một số khác tự tồng họp mới, một số chất do vi sinh vật liên kết sinh ra, một số khác đòi hỏi phái có sự kết họp giữa vật chù và vi sinh vật Cấu trúc, tính chất các hợp chất cùa mầu có thế bị tác động bời vùng phân bố mẫu hoặcbởi các yếu tố địa lý và mùa vụ

Hài miên được biết là nguồn giàu các sàn phấm tự nhiên giá trị như polyketides, nonribosomal peptids và alkaloids Các nhà khoa học tin rằng rất nhiều sàn phẩm của hải miên thực tế là do vi sinh vật liên kết hải miên sinh

ra Vùng biến Quảng Trị là nơi phát hiện và đánh giá là khu vực hải miên sinh nhiều hoạt chất thiên nhiên và phong phú Bới vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết

hải miên vùng biến Quãng Trị.” nhằm xác định vi sinh vật liên kết hải miên

là một nguồn thu polyketide synthase hiệu quá và có ứng dụng trong thực tế

2 Mục tiêu

Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị thành công và tìm hiếu các írng dụng của polyketide synthasetrong nghiên cứu và sản xuất

3 Nội dung nghiên cứu

Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hái miên vùng biên Quăng Trị

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

PHẦN 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về hải miên:

Hãi miên (hay còn gọi là bọt biền hoặc sea sponge) là những động vật rất đơn giàn sống ở sàn đại dương Chúng gan thường xuyên vào một nơi nào

đó, và di chuyến nước qua cơ thế chúng, lọc ra những sinh vật nhò li ti đế làm thực phấm Những chỗ nước đi qua là một cấu trúc lỗ sàng và là những gì làm cho cơ thể chúng hữu ích

Hình 1.1: Mầu hài miên thu nhận từ biến Quàng

Trị Việt Nam

Bên trong nhiều loài hải miên là nơi cư trú của cả cộng đồng vi sinh vật bao gồm vi khuân cô, vi khuân, nấm và virus Sinh khối vi sinh vật có thể chiếm tới 35% khối lượng hải miên Những loại hái miên này được phân loại như là hái miên có hàm lượng vi sinh vật cao và nồng độ vi sinh vật trong mô loại hái miên này khoáng 108 - 1O10 tế bào/lg, nồng độ này cao hơn 2 - 4 lần

vi sinh vật cùng loại tìm thấy trong mầu nước biển Đối với loại hái miên có hàm lượng vi sinh vật thấp nồng độ vi sinh vật trong mô loại hái miên này vào khoảng 105 - 106 tế bào/lg; tương đương với lượng vi sinh vật tìm thấy trong mầu nước biển

Hài miên có vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng cùa các hệ thống rạn san hô Các nhà khoa học tin rang chúng có thể là những nhân tố quan trọng làm thay đối chất lượng nước theo hướng xấu hoặc tốt Các nhà khoa học phân tích hải miên thớ nhanh như the nào và lượng nitrogen chúng thài ra trong quá trình này Hài miên thu thập vi sinh vật trong khi lọc nước quanh chúng, những vi sinh vật này được tin tướng rằng có thế làm rất nhiều việc Các vi khuẩn này có thề có khã tăng tạo ra các dạng nitrogen từ khí nitơ trong nước có thế làm chất dinh dường cho hải miên Chúng cũng có thể có khả năng chuyển hóa ammonium khi hái miên thớ thành khí nitơ, sau đó giãi phóng vào khí quyển.Quá trình này sẽ làm giám hàm lượng nitrogen dư thừa trong các rạn san hô, cũng ngăn cản những thay đổi có hại của hệ sinh thái.Các nhà khoa học tin rằng việc chuyến hóa khí nitơ thành nitrogen có ích cũng có lợi cho việc sống sót cùa các cơ thể khác trong biển.

Hãi miên biên được đáph giá là mở vàng trong những năm gần đây về

sự đa dạng của các chất trao đổi thứ cấp của chúng Tác dụng sinh học của các chat trao đối mới từ hái miên được báo cáo trong hàng trăm bài báo khoa học hải miên trong tương lai có tiềm năng cung cấp thuốc chống các bệnh quan trọng như ung thư, một số bệnh do virus, sốt rét và viêm nhiễm Hài miên sản sinh ra rất nhiều các hợp chất hóa học với khung cacbon khác nhau,

và chúng cản trở phát sinh bệnh tại các thời điếm khác nhau Việc một bệnh nào đó có thế bị chống lại ở các thời diem khác nhau làm tàng khá năng phát triền các loại thuốc chọn lọc cho các đích đặc hiệu

1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên:

Người ta tính được rằng vi khuẩn biển cực kỳ nhiều, đạt mật độ đen 106/ml nước biển, và là sinh khối biển và các chất trao đối nhiều nhất Môi trường biển, gồm cà lớp dưới bề mật, người ta tin là chứa khoảng 3,67x1 o'(' vi

sinh vật và với gần 71% bề mặt trái đất cùa 361 triệu km2 được bao phũ bời đại dương, môi trường này là khu vực rộng lớn tiềm năng cùa đa dạng vi sinh vật và công nghệ sinh học có thế khai thác hay “công nghệ sinh học xanh” Tiềm năng chưa khai thác này làm tăng mối quan tâm nghiên cứu vi sinh vật biến, với mục đích không những cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin hơn

về vai trò chính cùa chúng trong mạng lưới thức ăn biển và chu trình hóa địa sinh (biogeochemical) trong hệ sinh thái biền, mà còn khai thác khả năng của chúng để sản xuất các enzymes mới và các chất trao đối/các hợp chất có tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học Môi trường biến rất đa dạng và vi sinh vật biến phơi nhiễm áp suất, nhiệt độ, độ mặn, dinh dưỡng cực đoan Những enzymes tách chiết từ những vi sinh vật trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và sinh hóa đa dạng cho phép quần thế vi sinh vật thích nghi và phát triển mạnh trong các điều kiện đó Như vậy có thố khai thác các enzymes do vi sinh vật biến tống hợp có các hoạt tính xúc tác sinh

học khác thường có khà năng hoạt động dưới các điều kiện cực đoan.Với các chất xúc tác sinh học, một loạt các hydrolytic enzymes được tách dòng gần đây từ DNA metagenomic vi khuẩn nước biền antarctic, trong khi lipase mới có hoạt tính ở nhiệt độ thấp được tách từ thư viện metagenomic

vi khuấn của bùn biển Baltic Báo cáo gần đây về việc xác định enzymes mới khi tách dòng 2 gen alkane hydrolase từ thư viện metagenomic từ bùn sâu trong Pacific và 2 gen này biêu hiện thành công, có hoạt tính trong chúng Pseudomonas fluorescens (Kenedy et al., 2008) Jeon và cs (2011) đã nhận dạng một số gen mã hóa cho lipolytic enzymes từ các mầu môi trường biến khác nhau, đã biếu hiện và tinh sạch các enzymes này trong hệ E.coli Từ các metagenomes mầu bùn sâu dưới biến, đã nhận dạng và mô tã đặc điểm cùa esterases mới (Baharum et al., 2010)

Bảng 1 : Các enzymes biển được phát hiện từ các nguồn metagenomics (Kenedy et al., 2010 ; Felczykowska et al., 2012)

Hoạt tính Môi trường Hoạt tính Môi trường

Esterase Trầm tích sâu dưới biển

Vịnh biển

Nước biến bè mặt

Trầm tích biển Bắc cực

Trầm tích biển Nam TQ

Lipase Vùng thủy triều nông

Trầm lích sâu dưới biền Trầm tích bien Baltic

Chitinase Cừa sông

Biển Bắc cực

Amidase Trầm tích biền

Amylase Lỗ thúy nhiệt dưới biến Alkane

Hydroxylas e

Hydrocarbon ri raTrầm tích biển sâu

Nước biến Nam Trung

viện Viện Đại 1 1ỌC Mở Hà Nội

Môi trường biển rất đa dạng và vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất, nhiệt độ,

độ mặn, dinh dưỡng cực đoan Những enzymes tách chiết từ những vi sinh vật trong những môi trường như the rõ ràng có những tính chất sinh lý và sinh hóa đa dạng cho phép quần thế vi sinh vật thích nghi và phát triển mạnh trong các điều kiện đó Như vậy có thế khai thác các enzymes do vi sinh vật biến tổng họp có các hoạt tính xúc tác sinh học khác thường, có khá năng hoạt động dưới các điều kiện cực đoan Rất nhiều hái miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh vật có thế chiếm đến 50% thế tích hải miên, và

con số này lớn hơn 2-3 lần so với lượng vi khuân trong nước biến (Wang 2006), và cộng đồng này đặc hiệu cho hài miên Rất nhiều sàn phẩm cùa hài miên được cho là thực tế do vi khuẩn liên kết sinh ra và rất nhiều báo cáo đã chứng minh già thuyết này Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt là vi sinh vật liên kết với các cơ thế khác bởi mối tương tác giữa chúng khá phức tạp.

Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã kháo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng sinh hải miên ớ các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giã thấy rằng vi khuân liên kết hải miên bền vững theo không gian và thời gian Nhưng một số tác giá khác lại thay đối già tthuyết này Ví dụ, mặc dù

Cymbastela concentrica có cộng đồng vi sinh vật ít thay đối giữa các khoáng cách địa lý nhỏ, nhimg cộng đồng vi sinh vật của Cymbastela concentrica vùng ôn kết khác với cộng dong vi sinh vật trong Cỵmbastela concentrica ttừ nước vùng nhiệt đới của Australia (Hill et al., 2006: Ouyang et al., 2009).Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bang các phương pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S rRNA gene sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người ta nhận thấy cộng đồng vi khuấn liên kết với hãi miên có tới hơn 25 phyla, trong đó

có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia, ngoài các thành viên cùa domain Archaea Các quần thế vi sinh vật khác sống trong hãi miên là fungi và microalgae Rất ít biết về virus trong hái miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola. Có 2 con đường đê hải miên tạo nên vi khuân liên kết, một là hấp thu vi khuân đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hài miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thắng vi

Trang 7

khuân liên kết thông qua giao từ (gametes) cùa hải miên bằng cách đưa cả vi khuân vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et

vật như vi khuẩn và nam Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomanl

peptide synthetases (NRPS) tỊiạm gi^vào săn xuất rat nhiều các sán phẩm tự nhiên NRPS liên quan dến tạo ra một số thuốc chống khối u ức chế miền dịch, kháng khuấn , kháng nấm kháng virus quan trọng nhất hiện nay và hàng trăm sàn phấm tự nhiên , gồm các chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS (Brakhage, 2013)

Michael và đồng nghiệp năm 2007 cũng đã nghiên cứu về sự liên kết của vi sinh vật với hải miên biển Nghiên cứu của nhóm tác giá cho thấy hải miên biên thường chứa các cộng đồng vi khuẩn đa dạng và phong phú, bao gồm cà vi khuân, vi khuan cổ, vi táo và nấm Trong một số trường họp, vi sinh vật chiếm 40% khối lượng cùa hải miên và có đóng góp quan trọng vào quá trình trao đổi chất thứ cấp cùa hái miên (ví dụ : thông qua quang họp hay

co định ) Nghiên cứu cũng chi ra ràng hải miên là một trong những nhà sản xuất các chất chuyên hoá hoạt tính sinh học nhiều nhất thế giới và trong một

số trường hợp, các hợp chất này là do các vi khuấn tạo ra chứ không phái hải

miên Nhóm nghiên cứu đã xem xét và sứ dụng một số phương pháp tiếp cận như nuôi cấy phân tách tế bào và phương pháp metagenonứcs đề nghiên cứu

về vi sinh vật liên kết với hái miên

Từ hai loài hài miên biến Mycale mytilorum và Tendania anhelens đã phân lập được 10 chủng Streptomyces, trong đó có 4 chùng có hoạt tính đối kháng Aeromonas hydrophyla và Vibrio sp Các hợp chất kháng khuấn có bàn

chất là polyene (Dharmaraj et el., 2009) Yung và cộng sự (2010) đã sử dụng metagenomics có chức năng sàng lọc các protein kháng khuấn mới từ vi sinh vật liên kết hải miên Cymbastela concentrica và đã chọn được 2 clones có hoạt tính kháng 5 aureus 2, Alteramonas sp CCSH174 và K pneumoniae Dòng CcAbl có hoạt tính đoi kháng Staphylococcus aureus và Alteramonas

sp chùng CCSHỈ74 ( vòng kháng khuẩn 0,5cm và 0,6cm tương ứng) Dòng CcAbl và CcAb2 đều thuộc lớp Gammaproteobacteria Các tác giá cũng nhận diện được cạc enzym thụý phân mới từ cộng đồng vi sinh vật liên kết hãi miên và phần lớn chúng thuộc Alpha- và Gammaproteobacteria phan lớn các chất kháng khuẩn được nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những phân

tử nhỏ, ví dụ như palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A và 8,

indirubin và indigo, kết quả nhận được cho rằng có thề các hydrolases như là

những nguồn thay thế có hoạt tính kháng khuấn từ vi sinh vật liên kết hài miên.Đen năm 2013, Grasa và cộng sự đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với hải miên Ket quả nghiên cứu cho thấy vi sinh vật liên kết hải miên đóng vai trò chú yếu trong việc bão vệ vật chù chống lại các loài ăn thịt

do chúng sản sinh các chất trao đối thứ cấp có hoạt tính sinh học Các sản phẩm sinh học này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế miền dịch và cũng có hoạt tính để chữa các bệnh tim, hô hấp và tiêu hoá.Những năm trở lại đây, vi sinh vật liên kết với hài miên ngày càng nhận được nhiều chú ý vì những đóng góp đáng kể của chúng để thu sinh khối, chu

Trang 9

trình sinh địa và tiềm năng trong công nghệ sinh học Tuy nhiên, sự hiếu biết cũa chúng ta về các vi sinh vật liên kết hãi miên bị giới hạn trong một vài loài hải miên và tại một số khu vực địa lý nhất định Năm 2015, Jasmin và các cộng sự đã có báo cáo lần đầu tiên sự đa dạng vi sinh vật sống chung của hai loài hài miên là Cinachữa hang và Haliclona pigmentifera ờ các nước xung quanh hệ sinh thái rạn san hô của vịnh Mannar nằm dọc theo bờ biển phía đông nam Ãn Độ 25 chủng vi sinh vật trong thư viện gen 16S rRNA của những hài miên đã được nhóm lại thành 8 phyla riêng biệt, trong đó có 4

phyla liên kết bên trong lõi của hải miên ỵ-Proteobacteria, Chloroflexi, Plantomycetes và Deferribacter là các nhóm nòng cốt trong c cavernosa, các

nhà khoa học quan sát thấy sự đa dạng OTU lớn hơn ớ c cavernosa ( H 1 2,07) so với H Pigmentifera ( H 1 1,97) phân tích UniFrac khắng định sự khác biệt trong tính đa dạng vi khuẩn giứa các loài hài miên khác nhau và ờ những vùng sinh song khác nham

Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hãi miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hài miên, xứ lý (processing) chất thài trao đối chất và sản sinh các chất trao đối thứ cấp Có già thuyết là các vi sinh vật biến liên kết với hái miên là các nhà sán xuất gốc các hợp chất hoạt tính sinh học Bằng chứng thí nghiệm đầu tiên ùng hộ giá thuyết này là của Faulkner và cs, xác định vị trí của các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải

miênTheonella swinhoei Với mục đích này, quần thế tế bào được tách bằng

ly tâm và nghiên cứu bằng hóa học Bằng cách đó đã có thẻ định vị được cytotoxic macrolide swinholide A và peptide thcopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị dưỡng và vi khuấn sợi dị dường, tương ứng (Thomas et al., 2010;

Penesian et al., 2011).

1.4 Tinh hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết vói hải miên ở Việt Nam:

Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xúc tiến một số chương trình nghiên cứu và giám sát đa dạng sinh học động vật biến, đặc biệt là sự hợp tác lâu năm với Viện hàn lâm khoa học Nga và các chuyến đi biển dài ngày của tàu Oparin nham thu thập các mầu vật tại vùng biến ở Việt Nam Viện Công nghệ sinh học đã có báo cáo phân lập định danh vi sinh vật từ các mẫu nước biển và nghiên cứu khã năng phân huỷ hydratcacbon khà năng sinh các chất

có hoạt tính bề mặt nhàm ứng dụng trong các ngành công nghiệp và xử lý môi trường, hoạt tính ức chế E.Coli, Staphylococcus aureus, F Oxisporum của vi khuấn phân lập từ bùn biển (Lại Thuý Hiền và cs., 2003 ;Thi Tuyen Do et al., 2012) Từ các mẫu nước biển của các thành phố Quáng Ninh, Nha Trang, Cửa Lò, Vũng Tàu đã phân lập và tuyển chọn được các chúng vi khuấn có khả năng sinh protease cao (Quyền Đình Thi et al.,2007) Đồ Mạnh Hào và Phạm Thế Thư (2010) đã nghiên cứu vi sinh vật học cùa các mẫu nước và trầm tích vùng ven biến Hải ,Phòng và đã phân lập được 65 chùng vi khuấn

Thư viện viện Đại nốc ivi^llaTNQi

điển hình thuộc 31 loài, 16 chi, 8 họ và 2 bộ một số đề tài nghiên cứu có định hướng ứng dụng vi sinh vật biến như: ‘Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khă năng tống hợp các chất kháng sinh từ một số vùng biến của Việt Nam' của Viện Công nghệ sinh học từ 2006-2008 đã đánh giá tính đa dạng và lựa chọn các vi sinh vật biền có hoạt tính kháng sinh từ vùng đất ngập mặn ven bờ biển Việt Nam và tìm hiếu khả năng ứng dụng trong nuôi trồng thuỳ sàn, bảo vệ môi trường, y dược, đề tài KC.09.09/06-10: ‘Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc

tế bào và chống oxy hoá từ sinh vật biến nham tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng’ từ 2007-2008 của Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên nhằm xây dựng danh mục sinh vật biền có kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hoá và quy trình công nghệ tách chiết các chất có hoạt tính sinh học và tạo ra một số sân phấm có giá trị dược dụng

Bên cạnh đó, những nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ động vật biên như hái miên, san hô mềm cũng được tiến hành ở một

số cơ sở nghiên cứu Từ hãi miên Spongia sp của Việt Nam đã tách chiết được sesquiterpene quinones với hoạt tính chống oxy hoá ( Utkina & Denisenko 2011), C29-Sterols từ hải miên lanthella sp Có đặc tính chong ung thư (Nguyen Huu Tung et al„ 2009) Cembranoid diterpene mới được phân lập từ san hô mềm kích thích sự biệt hoá của dòng tế bào MC3T3-E1 (Nguyen Xuan Cuong et el., 2008) từ hải miên biển Việt Nam Xestospongia testudinaria đã phân lập được 3 C29 sterol mới, xác định cấu trúc và khả năng

ức chế sự bám dính của Pseudoalteromonas spp Và Polaribacter sp (Xuan Cuong Nguyen et al., 2013) Viện Hoá sinh biển có hợp tác với các nước khác trong lĩnh vực nghiên cứu về biến như: « Nghiên cứu tìm kiếm các họp chất

có hoạt tính sinh học cao từ các đối tượng san hô mềm và hãi miên thu thập tại Quàng Ninh và Hạ Long, ỵiệt Nam » với K.QRDI Hàn Quốc Nghiên cứu thành phần hoá học của một số loài hãi miên và vi sinh vật cộng sinh thuộc biến Việt Nam với đối tác phía Pháp là Bão Tàng lịch sử thiên nhiên quốc gia Pháp, Paris.Các nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hài miên tại Việt Nam còn hạn chế và việc nghiên cứu các nhóm gen sinh các họp chất sinh học có giá trị trong hệ vi sinh vật liên kết hái miên ở trong nước còn đang trong giai đoạn bắt đầu

1.5 Vai trò polyketide synthase:

Polyketide là một họ các chất chuyền hóa bậc hai được hình thành bời sự xúc tác cùa enzyme polyketide synthase (PKSs).Khung cacbon của polyketide được khử và biến đổi bởi những domain khác nhau trong PKSs cùng với các enzyme ketoreductase, dehydratase và enoylreductase Có 3 loại PKSs khác nhau đã được biết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức

năng PKSs loại II là phức hợp cúa nhiều enzyme, cựng tạo nên cấu trúc cùa chuỗi polyketide và PKSs loại III.

Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia vào sàn xuất rất nhiều các sãn phấm tự nhiên NRPS dính đến tạo một số thuốc chống khối u, ức chế miền dịch, kháng khuấn, kháng nấm, kháng virus quan trọng nhất hiện nay có và hàng trăm các sàn phấm tự nhiên, gồm hợp chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS (Brakhage, 2013).Polyketides là một nhóm lớn các sản phấm tự nhiên có cấu trúc đa dạng thể hiện một loạt các hoạt động sinh học và dược học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống cholesterol, chống ung thư, chống ung thư và các tính chất

ức chế miễn dịch Mặc dù cấu trúc đa dạng, tất cà các polyketides được lắp ráp bới các vòng lặp tiếp nối các ngưng tụ Claisen tiếp nối giữa một dần xuất malonate thioesterilĩed và một thioester acyl Các enzyme xúc tác cho sự ngưng tụ này được gọi là các phàn ứng tống hợp polyketide (PKSs)

7 1 QU vicit V icji iTiti 11UU tviu riu INUI

Đã có rat nhiều đánh giá về các enzyme liên quan đến từng loại PKS và hiện nay phần lớn trên thế giới đều đang sử dụng các biện pháp thu nhận các dòng gen mã hoá polyketide synthase từ vi sinh vật cũng như áp dụng các biện pháp sinh học trong việc tống hợp polyketide synthase

Có thề tìm thấy trong hải miên D dissoluta và Theonella swinhoei các hợp chất chống ung thư discodermolide, onnamide, và theopederin Ngoài ra, vi khuân Salinispora phân lập từ hải miên p clavata được nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin, được sàn xuất bới hệ PKS

cs (2010) đã sử dụng metagenomics chức năng đề sàng lọc các protein kháng khuấn mới từ vi sinh vật liên kết hài miên Cymbastela concentrica và đã chọn được 2 clones có hoạt tính kháng s aureus 2, Alteromonas sp CCSH174 và

K pneumoniae Dòng CcAbl có hoạt tính đối kháng Staphylococcus aureus

và Alteromonas sp chủng CCSH174 (vòng kháng khuấn 0.5 và 0.6 cm, tương

ứng) Dòng CcAbl và CcAb2 đều thuộc )ớp Gamniaproteobacteria Các tác già cũng nhận diện được các enzyme thủy phân mới từ cộng dồng vi sinh vật liên kết hái miên và phần lớn chúng thuộc Alpha- và Gammaproteaobacteria Phan lớn các chất kháng khuân được nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những phân từ nhô, ví dụ như palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A

và B, và indirubin và indigo Kết quả nhận được cho rằng có thề các hydrolases như là những nguồn thay thế có hoạt tính kháng khuẩn từ vi sinh vật liên kết hải miên

1.6 Vector tách dòng pCR2.1 invitrogen

Đế tách dòng một đoạn DNA, đoạn đó cần phãi được đính vào vector tách dòng Có nhiều loại vector: plasmid, phage, cosmid, YAC Người ta chọn sử dụng vector dựa vào kích thước cùa đoạn DNA cần tạo dòng và mục đích tạo dòng Trong số các loại vectbr hiện nay thì plasmid được sử dụng rộng rãi nhất, về chức năng, người ta chia vector thành hai loại lớn là vector tạo dòng (cloning vector) và vector biếu hiện (expression vector)

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCR 2.1 đế tách dòng gen mã hoá PKS thu nhận được từ vi sinh vật liên kết hải miên

Trang 15

đã được cat mở vòng do có hai đau dính, mỗi đầu có một base Thimin.Vector

pCR®2.1 có kích thước 3,9kb, được thiết kế có gán một operon chuyến hoá đường lactoza là operon-lac Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này

là gen cấu trúc mã hoá cho 0-galactosidase có vùng đa cắt với 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: EcoRỈ, Hind III, Nsi Ỉ.Kpni, Sacỉ, BamHỈ, Speỉ BstX I,

EcoR V, Notỉ, Aval, PaeR71, Xho 1, Xha I, Apa I Trong đó EcoR 1 và BstX I

có hai vị trí cắt các enzyme còn lại chi có một vị trí cắt Với vị trí vùng cắt gắn đa vị như vậy, sản phấm p-galactosidase có thề được tạo ra(nểu vector không được gắn đoạn ngoại lai) hoặc không được tạo ra(nếu vector gắn đoạn ngoại lai) Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thế lựa chọn tế bào mang vector tái tổ hợp với tần suất cao Ngoài ra, vector pCR®2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là Ampicillin và Kanamycin với nồng độ ức chế tối thiêu

rtní II r/in I I Crrrrl I I CCA AGC TTG G~A CCG AGC TCG GAT CCA CTA 33T ~CG AAC CAT GGC *CG AGC CTA G“ GAT

LacZa gene bases 1-545

M13 Reverse pnming site bases 205-221

T7 promoter bases 362-381

M13 (-20) Forward priming site, bases 389-404

H origin bases 546-983

Kanamycin resistance ORF bases 1317-2111

Ampicillin resistance ORF bases 2129-2989

n> IO origin bases 3134 3807

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn cùa vector pCR®2.1

Trang 17

Ethidium bromide, tryptone, agar, X-gal, Ampicilin, cao nấm men (yeast extract), chloroform, agarose, TAE, isoamylalcohol, EDTA, ethanol, các enzym giới hạn (EcơRl ZtamHI,'Xhbiị Èìầe Èóá chất này hầu hết do hãng Invitrogen, Fennentas, Applies Biosystem cung cap.

Dung dịch 3 : ( Sol III)

+ Đệm axetat kali 3M, pH 5.5

+ Dung dịch chloroform: isomaylalcohol ( 24:1 )

+ Dung dịch TE (lOmM Tris-HCl pH 8.0; 1 mM EDTA )

+ Môi trường nuôi cấy vi khuan (LB, g/1):

Yeast extract: 10g

Trypton : 10g

NaCl : 10g

pH 7,4 ( chinh OH 5N) Đối với môi trường thạch cần bố sung 2% agarose

+ Dung dịch dùng cho điện di :

Dung dịch đệm điện di TAE 1X: Lấy từ dung dịch gốc TAE 50X:

Axit acetic glacial 28,6 ml

0,5 M EDTA pH 8,0 50 ml

Nước khừ ion vừa đủ 500 ml

Gel Agarose 1%: Cân 1 gram agarose, bổ sung 100 ml đệm TAE IX Đun tan agarose trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút.Đe nhiệt độ hạ xuống khoáng 50°C rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu

+ Ethidium bromide( EtBr ) dung dịch gốc: 10mg/ml Hòa 1 gam EtBr vớià 100ml HjO Quấy bằng máy khuấy từ cho tan đều Giữ trong lọ ờ nhiệt độ phòng Khi dùng pha 20 pl dung dịch gốc trong 100 ml đệm TAE IX

+ Đệm tra mầu ( Loading buffer) 5X:

Tris-HCl 1 M pH 8,0 1 ml

EDTA 0,5 M pH 8,0 0.2 ml

Bromphenol Blue 1% 2 ml

+ Bộ kittách metagenomic DNA

Máy khuấy từ ( RotoLab OSI)

Máy ly tâm ( Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ)

Tù lạnh sâu -20°C,-75°C ( Sanyo, Nhật Bán)

Máy khuấy trộn Vortex ( RotoLab OSI)

Máy hút chân không ( Speed Vac Sc 110-Savant)

Máy quang phố ( Shimadzu Nhật Bàn)

Máy soi chụp ảnh gel ( Bio-Rad)

Cân phân tích 10'4 g ( Mettler Toledo).

Bộ nguồn điện di ( Bio-Rad)

Tủ cấy vô trùng ( Sanyo)

Pipettman các loại ( Gilson)

Nồi khử trùng ( Nhật Bàn)

Cân điện 102 g ( Mettler Toledo)

Máy ly tâm lạnh ( Sorvall Biofuge Fresco)

Bộ điện di ( Advance Tech, Nhật Bàn)

Máy xác định trình tự tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ)

2.2 Phưomg pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phuong pháp tách DNA tổng vi sinh vật liên kết hải miên:

Dại học Mở Hà Nội

Thu nhận mẫu hải miên bàng phương pháp Scuba, tại biến Quảng trị

Mầu Hài miên mang lên ngay lập tức được đựng trong hộp vô trùng có chứa cồn tuyệt đối, giữ lạnh và đưa về phòng thí nghiệm

- Lấy 5g hái miên, rứa qua nước muối sinh lý 0,9% cắt nhỏ hải miên

- Nghiền trong nước muối sinh lý 0,9%

- Vortex nhẹ 10 phút

- Lọc lay dịch

- Ly tâm 250xg 3 phút, loại cặn thu dịch

- Ly tâm dịch 1500 X g/3p loại dịch thu cặn

Tách DNA tổHỊỊ so theo kit:

- Cân 200-300 mg cặn vào một ống hình nón 50ml và thêm 10 ml đệm chiết với Tween 20 Trộn bằng vortexing ớ tốc độ tối đa trong 1 phút đế phân tán

và phân rã cặn

- Ly tâm ở tốc độ 1.600 X g trong 4 phút.Đổ chất lỏng vào một ống falconmới.Giữ lại cặn.(Thêm 20 ml dung dịch đệmchiết còn lại với Tween 20 (mồi lần chiết) vào cặnvà trộn bàng cách vortexing ở tốc độ tối đa trong 1 phút): Thực hiện lại btrớc này 2 lần

Thu dịch toàn bộ dịch sau mồi lần chiết vào ong falcon mới

Đổ trên bề mặt thu thập được (50 ml) qua bốn lớp lọc Miracloth (Calbiochem)

Lọc sơ bộ mẫu qua màng lọc Millipore 1,2-pm

Đi qua bộ lọc được thu thập thông qua màng lọc 0,45 pm (Bộ máy lọc thích họp để bẫy khối lượng vi khuẩn trên bộ lọc).Giữ màng lọc

Dùng kẹp và kéo cat ethanol 70%, lấy màng ra khòibộ lọc, cắt màng trong một nửa, và đặt mỗi nứa (tròn bên xuống) dọc theo phía (gần đáy) cùa ống tĩnh mạch vô trùng 50 ml Phan trên bề mặt của bộ lọc can phải đối mặt với trung cùa ống

Chuấn bị bộ lọc đệm lọc bàng cách thêm 1,5 pl Tween 20 đến 1,5 ml của đệm lọc rửa ngay trước khi sừ dụng Thêm 1,5 ml đệm lọc rứa chứa chứa 0,l%Tween 20 đến phần lọc trong ống

Vortex ống ở tốc độ thấp để thiết lập lại các mảnh lọc, sau đó tăngđể tốc độ cao nhất trong khoảng 2 phút đề rửa sạch các vi khuẩn bị mắc kẹt trênmàng

Chuyến tế bào huyền dịch đen một ống ly tâm sạch, sau đó ly tâm ống

ở 14.000 X g trong 2 phút Vứt bỏ lớp trên

Thêm 300 |X1 TE, sau đó thêm 2 pl Ready-LyseLysozyme Solution và

I pl RNase A tạo tế bào huyền phù Trộn, và ly tâm.ủ ớ 37 °C trong 30 phút.Thêm 300 pl dung dịch Meta-Lysis (2X) và 1 pl Proteinase K vào ống Trộn bởi vortexing.ủ ờ 65 ° c trong 15 phút

Làm mát đến nhiệt độ phòng, sau đó đặt trên đá trong 3-5 phút

Thêm 350 pl MPC Protein Precagitation Reagent vào ống và trộn bang vortexing mạnh trong 10 giây.

Đố các mảnh vụn bàng cách ly tâm lạnh trong 10 phút ở tốc độ tối đa.Chuyến chất trên lên một ống vi tinh cỡ 1.7 ml và bở dịch đi.Thêm

570 pl isopropanollên trên bề mặt Trộn bằng cách đào ngược ống vài lần

Ly tâm lạnh trong 10 phút ở ở tốc độ tối đa

Nhẹ nhàng dùng pipet hút hết isopropanol bỏ đi mà không đụng vào mành DNA

Thêm 500 pl 70% ethanol Sau đó ly tâm trong 5 phút ờ tốc độ tối đa, trong máy ly tâm lạnh.Nhẹ nhàng dùng pipet hút het isopropanol bỏ đi mà không đụng vào mãnh DNA Làm khô ở nhiệt độ phòng.Hòa tan lại trong 50

ml TE

2.2.2 Phuong pháp xác định hồng độ bằng quang phố kế :

Phương pháp quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng

độ DNA có trong mầu, đồng thời kiếm tra được độ sạch của mẫu mà ta tách chiết Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ờ bước sóng 260 nm cùa các bazơ purin và primidin Từ giá trị mật độ quang học (OD - Optical Density) ờ bước sóng 260 nm của mẫu đo cho phép xác định nồng độ axit nucleic trong mẫu

Một đơn vị OD tương ứng với nồng độ là:

50 mg/ml cho dung dịch có DNA sợi đôi

40 mg/ml cho dung dịch có RNA hay DNA sợi đơn

Nồng độ DNA hay RNA được tính theo công thức sau:

Công thức tính nồng độ DNA sợi đôi:

CADN = OD260 X 50 X d

CADN : nồng độ DNA sợi đôi