Phuong phap hoa ly kiem nghiem môn kiểm nghiệm ĐH Dược

Chương 3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM MỤC TIÊU Trình bày được khái niệm chung về phương pháp tách, sắc ký Trình bày được các pp định lượng bằng HPLC PP chuẩn ngoại, chuẩn.

Chương 3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM

MỤC TIÊU

- Trình bày được khái niệm chung về phương pháp tách, sắc ký

- Trình bày được các pp định lượng bằng HPLC: PP chuẩn ngoại, chuẩn nội

- Trình bày được nguyên lý cơ bản của phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS và ứng dụng để định tính, định lượng.

1 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH

1.1 Khái niệm

Các phương pháp tách là nhóm các phương pháp vật lý, hoá học, hoá lý nhằm tách một

hỗn hợp phức tạp gồm nhiều chất thành các hỗn hợp đơn giản hơn và từ đó tách riêng ra từng chất

Tuỳ theo hỗn hợp cần tách là đồng nhất hay không đồng nhất mà lựa chọn các phương pháp tách thích hợp

1.2 Các phương pháp tách thường dùng

1.2.1 Phương pháp lọc

Pp đơn giản, nhưng hiệu quả để tách pha rắn ra khỏi pha lỏng

- Kỹ thuật lọc: Có thể lọc ở áp suất thường hoặc lọc ở áp suất giảm Vật liệu thường dùng làgiấy, bông thuỷ tinh, phễu lọc thuỷ tinh xốp,

1.2.2 Phương pháp ly tâm

Là phương pháp dùng lực ly tâm để làm lắng kết tủa xuống Tốc độ lắng phụ thuộc vào lực

ly tâm

1.2.3 Phương pháp chia cắt pha

- Có thể thực hiện bằng cách: chọn lọc cơ học (dựa vào hình dáng, kích thước, màu sắc,

để tách các chất),

1.2.4 Phương pháp chiết

tách lấy một chất (hay một nhóm chất) từ một hỗn hợp nghiên cứu trong dung môi A Cơ sởcủa phương pháp là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa 2 pha A và B không hoà lẫn vàonhau Đại lượng đặc trưng là hệ số phân bố Kp.

Trong đó: CB: là nồng độ chất tan trong dung môi B; CA: là nồng độ chất tan trong dung môi A

thì Kp là hằng số

lỏng - lỏng hoặc chiết lỏng - rắn

1.2.4.1 Chiết lỏng - lỏng

Có 3 cách:

- Chiết đơn: Chiết một lần, trong phòng thí nghiệm chiết bằng bình gạn, lắc tay hoặc máy Hiệu suất chiết thấp.

- Chiết lặp (chiết nhiều lần): Sau lần chiết 1, trong dung dịch còn chất tan, thêm dung môimới chiết tiếp.Nếu cùng một lượng dung môi ta chiết nhiều lần tốt hơn chiết ít lần

Chiết nhiều lần tốn thời gian, thường chọn tối ưu 3 lần

- Chiết ngược dòng: Cho dung môi và dung dịch cần chiết đi ngược chiều nhau, hai pha tiếpxúc chặt chẽ, pha trộn và di chuyển ngược chiều nhau Đây là một quá trình liên tục

Trong kiểm nghiệm chiết lỏng - lỏng được ứng dụng rất nhiều và thường dùng một pha là nước và một pha là dung môi hữu cơ

1.2.4.2 Chiết lỏng - rắn

Thường có 2 cách:

- Dùng pha rắn (như Al2O3, nhôm silicat, than, ) để chiết lấy các chất từ một pha lỏng, chủyếu nhờ sự hấp phụ

- Dùng pha lỏng để chiết lấy các chất từ mẫu phân tích là chất rắn.

2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

2.1 Khái niệm về phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng ở 2 pha không hoà lẫn vào nhau và luôn tiếp xúc với nhau, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh và một pha di chuyển gọi là pha động trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hếtlớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ

Hệ quả là các chất bị hấp phụ nhiều (có ái lực lớn) với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn các chất bị hấp phụ ít (có ái lực yếu) và chúng có thể tách ra khỏi nhau

2.2 Phân loại các phương pháp sắc ký

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc ký thành 2 nhóm lớn: sắc ký khí

và sắc ký lỏng Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa pha động và pha tĩnh, hoặc cách

bố trí pha tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành nhóm nhỏ hơn

- Quá trình sắc ký thường gồm 3 giai đoạn chính: Đưa mẫu thử lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh, phát hiện các chất và xử lý kết quả.

2.3 Một số phương pháp sắc ký

2.3.1 Sắc ký lớp mỏng

2.3.1.1 Khái niệm

Về bản chất là sắc ký lỏng- rắn trong đó:

- Pha tĩnh rắn được trải thành lớp mỏng đồng đều trên bản kính, nhựa hay kim loại

- Pha động là dung môi đơn hoặc đa thành phần

- Chấm dung dịch mẫu nghiên cứu lên bản mỏng (cách rìa bản mỏng 2 - 3cm)

-Chạy sắc ký bằng cách đặt bản mỏng vào pha động theo hướng phần có vết chấm ở

dưới Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyển động qua lớp hấp phụ, các cấu

tử sẽ di chuyển theo hướng pha động nhưng với vận tốc khác nhau đưa đến việc tách các cấu tử ra khỏi nhau, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

 Ứng dụng

- định tính,

- Thử độ tinh khiết,

- Có thể định lượng

 Ưu điểm :

- Thiết bị đơn giản, dễ tiến hành, thời gian phân tích nhanh, khá chọn lọc

2.3.1.2 Đại lượng đặc trưng

 Hệ số lưu giữ Rf

 Hệ số lưu giữ tương đối Rtd

Trong đó c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết sắc ký chất được chọn làm

chuẩn đối chiếu được sắc ký trên cùng bản mỏng với mẫu thử

Độ phân giải Rs

R S > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5

2.3.2 Sắc ký trao đổi ion

Là một dạng của sắc ký lỏng - rắn

Ở đây pha tĩnh là một chất có khả năng trao đổi ion (cation và anion)

+ Với cationid:

+ Với anionid:

 ứng dụng:

- Tách ion, Định lương, Tinh lọc nước

2.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phân tách các chất trên pha tĩnh chứa trong cột, nhờ sự di chuyển của pha động lỏng dưới

* Phương pháp chuẩn ngoại:

- Là PP cơ bản nhất, nồng độ mẫu thử được tính thông qua sự so sánh Pic (chiều cao hoặcDt) của mẫu chuẩn và mẫu thử được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

- Chuẩn hóa 1 điểm ( điểm chuẩn)

- Chuẩn hóa nhiều điểm (đường chuẩn)

* Phương pháp chuẩn nội.

- N/tắc: thêm vào mẫu chuẩn và thử cùng lượng một chất tinh khiết rồi tiến hành sử lý mẫu (nếu có), tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này gọi là chuẩn nội

- Chất chuẩn nội phải có t/c sau:

+Pic phải tách hoàn toàn với Pic thử

+Có cấu trúc hóa học tương tự

+Có nồng độ xấp xỉ với chất thử

+Ko phán ứng với thành phần mẫu

+Tinh khiết cao, dễ kiếm]

-Cisc và Sisc lần lượt là nồng độ chất chuẩn nội và diện tich píc chuẩn nội ở mẫu chuẩn.

- Định lượng thành phần trong mẫu thử

+ Chuẩn 1 điểm: Chuẩn nội được thêm vào cả hai mẫu chuẩn và thử sử lý mẫu và tiến hành sắc ký

St St Cc Sisc St Cc Sisc

Ct= - Cist Fx = - Cist =

Sist Sist Cisc Sc Sist Sc

Trong đó:Ct và St lần lượt là nồng độ thử và diện tích píc thử

Cist và Sist lần lượt là nồng độ chuẩn nội và diện tich píc chuẩn nội ở

mẫu thử

+ Chuẩn nhiều điểm: dãy chuẩn có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả có cùng nồng độ chuẩn nội Tến hành sắc ký, lập tương quan giữa tỷ số diện tích pic của chuẩn trân chuẩn nội (Sc /Sis)với tỷ số nồng độ chuẩn trên chuẩn nội (Cc / Cis) Sắc ký mẫu thử đựơc thêm chuẩn nội như thang chuẩn, tính tỷ số diện tích St /Sist áp đường chuẩn suy

ra nồng độ chất thử Ct

3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI - KHẢ KIẾN

Là phương pháp phân tích xác định các chất dựa trên cơ sở sự hấp thụ các bức xạ điện từ vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) của các phân tử chất nghiên cứu

3.1 Định luật cơ bản về sự hấp thụ ánh sáng (Định luật Lambert- Beer)

3.1.1 Định luật

Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ là Io qua một dung dịch có chiều dày

L(cm), nồng độ C Sau khi bị hấp thụ, cường độ chùm tia còn lại là I

Hình 3.1 Sơ đồ ánh sáng truyền qua dung dịch

+ Độ truyền qua

+ Mật độ quang D (độ hấp thụ A, độ tắt E)

Với K là hệ số hấp thụ

- Nếu C tính bằng mol/l ta có D= K.C.l được gọi là hệ số hấp thụ phân tử (K=D khi C=1mol/l

và l=1cm) đặc trưng cho bản chất của chất nghiên cứu trong dung dịch chỉ phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng đơn sắc

- Nếu C tính theo % (KL/TT ) ta có: D = E1%1cm.C.l và E1%1cm là hệ số hấp thụ riêng (hệ

số tắt riêng)

- Nếu dung dịch hấp thụ ánh sáng cao thì độ truyền qua thấp, mật độ quang cao và ngược lại

3.1.2 Điều kiện áp dụng định luật

Là đường biểu diến sự phụ thuộc của mật độ quang D của chất nghiên cứu vào bước sóng ánh sáng

Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV – VIS của vitamin B12

3.2.2 Ứng dụng:

- Định tính và thử tinh khiết : Các cực đại hấp thụ và tỷ số giữa các cực đại hấp thụ là các đặc trương định tính của các chất

- Định lượng

3.2.3 Một số điều kiện khi áp dụng

- Tia sáng đơn sắc ( tốt nhất có λmax)max)

- Vùng đo mật độ quang từ 0,2- 0,8

- Vùng nồng độ tuân theo định luật Lambert - Beer

- Loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng

3.3 Các bộ phận cơ bản của máy đo quang phổ UV-VIS

Các máy có nhiều loại và cấu tạo khác nhau, song đều có một sơ đồ chung:

Hình 3.3 Sơ đồ cấu tạo của máy quang phổ UV-VIS

3.4 Các cách xác định nồng độ dung dịch trong phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

3.4.1 Phương pháp trực tiếp

kết quả nồng độ Cx

 E1%1cm có thể có trong bảng tra cứu (hoặc tự xác định từ chất chuẩn gốc)

Phương pháp chỉ có kết quả tin cậy khi:

- Máy được chuẩn hóa về các thông số kỹ thuật ( bước sóng, độ hấp thụ, độ ổn định….)

- Tiến hành đo ở điều kiện tiêu chuẩn ( cùng điều kiện đo E1%1cm )

3.4.2 Phương pháp so sánh (điểm chuẩn)

Theo ĐL lambert-Beer khi đo độ hấp thụ của dd chuẩn so sánh (s) vad dung dịch mâu thử ( X) tao có

As = K.L.Cs

Do đó Cx = Cs Ax/As

3.4.3 Phương pháp đường chuẩn

có nồng độ biết trước C1, C2, C3, C4, C5 đem đo mật độ quang tương ứng D1, D2, D3,D4, D5 Vẽ đồ thị D - C

Đồ thị mối tương quan D-C

Đo mật độ quang dung dịch cần xác định CX được DX Từ giá trị Dx dự vào đồ thị tính ra được Cx

Yêu cầu:

+ Đường chuẩn phải thẳng.( tuyến tính)

+ CX phải nằm trong khoảng (C1- C5