Định lượng bằng HPLC docx Pha tĩnh trong HPLC 1 Yêu cầu của pha tĩnh Phải trơ và phải bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay chất p.Định lượng bằng HPLC docx Pha tĩnh trong HPLC 1 Yêu cầu của pha tĩnh Phải trơ và phải bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay chất p.
Trang 1Pha tĩnh trong HPLC [1]
Yêu cầu của pha tĩnh:
- Phải trơ và phải bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay chất phân tích, để đảm bảo cơ chế tách theo đúng bản chất chính của pha tĩnh, hay không gây mất chất phân tích cần tách
- Pha tĩnh phải có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những điều kiện sắc ký nhất định của hệ pha HPLC đã chọn
- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là độ xốp, không được biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao hay dung môi của quá trình chạy sắc ký
- Cân bằng động học của sự tách sắc ký phải xảy ra nhanh, tuận nghịch và lặp lại tốt Có thế mới thu được kết quả phân tích tốt, pic sắc ký cân đối và gọn
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất số đĩa lý thuyết mới cao
Pha động trong HPLC [1]:
Pha động: là hệ dung môi dùng để rửa giải các chất tan Xi (chất phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký Pha động có thể chỉ là một dung môi hoặc cũng có thể là hỗn hợp nhiều dung môi Ngoài ra có thể chứa hệ đệm, chất tạo phức (phối tử), chất diện hoạt…Với mỗi loại sắc ký sẽ có một hệ dung môi rửa giải riêng phù hợp với nó, để có thể thu được hiệu quả tách là tốt nhất
Yêu cầu của pha động:
- Phải trơ với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kỳ một tính chất nào trong quá trình sắc ký Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp cho quá trình tách chất
- Pha động phải hòa tan chất phân tích Xi Có như thế mới làm cho chất mẫu được đưa vào pha động và vận chuyển tốt tốt từ đầu cột tách cuối cột tách và tránh gây tắc cột
- Pha động phải bền vững theo thời gian, không thay đổi, có thành phần không bị phân hủy hay thay đổi trong suốt quá trình sắc ký và có thể kiểm soát chính xác được (chạy chế độ gradient dung môi)
- Phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số cho kết quả phân tích
- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, tùy bản chất từng loại sắc ký
- Phải phù hợp với Detector Vd với detector UV/ UV-VIS thì pha động phải trong suốt trong vùng phổ đó hoặc dùng detector huỳnh quang thì pha động phải không có tính chất huỳnh quang
- An toan, ít độc, rẻ tiền, dễ kiếm…
Trang 2Quá Trình Tách [1]
Các tương tác trong quá trình tách sắc ký xảy ra giữa chất phân tích Xi, pha tính SP, pha động MP
Frủa giải= F1+ F2 + F3
F1 : lực lứu giữ của pha tĩnh gây lên chất phân tích: F1lớn tzan lưu tăng và ngược lại F1: phụ thuộc vào
bản chất pha tĩnh: loại pha tĩnh (quyết định tính phân cực/ không phân cực của pha tĩnh ảnh hưởng đến sự phân bố của chất phân tích cũng như lực tương tác giữa chất phân tích
và pha tĩnh), độ xốp (ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ của pha tĩnh), vị trí nhóm hoạt động sắc ký trên bề mặt pha tĩnh vd: OH, NH2 … (các nhóm chức này ảnh hưởng đến lực tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh vd liên kết hydro, van der waals, lực hút tĩnh điện…), kích thước hạt nhồi diện tích bề mặt tiếp xúc giữa chất phân tích và pha tĩnh, hình dạng hạt nhồi ảnh hưởng đến tính phức tạp của dòng dung môi pha khi qua cột Bản chất của chất phân tích: độ phân cực , tính acid base (quyết định dạng tồn tại lực liên kết, sự phân bố), kích thước (trong sắc ký loại cỡ) và khối lượng phân tử, các loại nhóm chức trong phân tử (quyết định tính tân dầu thân nước tương tác pha tĩnh), các
phân tử , hằng số/hệ số phân bố…
Môi trường: pH ảnh hưởng đến liên kết của các acid/base , nhiệt độ: ảnh hưởng đến khả năng hấp thu, dễ làm phá vỡ liên kết yếu như liên kết Hydro, liên kết van der waals
F2: lực lôi kéo của pha động gây lên chất phân tích F2 lớn thời gian lưu giảm và ngược lại F2 phụ thuộc vào
Bản chất và thành phần của dung môi pha động (độ phân cực), tốc độ dòng (ảnh hưởng tới sự tách thông qua phương trình Vandeemton- p.tr tính bề dày đĩa lý thuyết)
Bản chất của chất phân tích: như phân tích trên
Với sắc ký tảo đổi ion và cặp ion thì F2 còn phụ thuộc vào pH pha động, lực ion của pha động, tính chất trao đổi ion, chất và ion tạo cặp
Trang 3F3: lực tương tác giữa pha tĩnh và pha động quyết định tốc độ di chuyển của pha động trong cột ảnh hưởng tới thời gian lưu.thông thường khi lựa chọn điều kiện sắc ký người ta sẽ lựa chọn pha tĩnh/động sao cho F3nhỏ F3phụ thuộc vào
Sự khác biệt về bản chất hóa học giữa pha động và pha tĩnh (độ phân cực)
Độ nhớt
Nhiệt độ (ảnh hưởng thông qua độ nhớt)
⇨ Từ các loại tương tác tác trên cho thấy Frủa giảiphụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất và đặc trưng của các pha tĩnh, kiểu cấu trúc xốp, độ xốp, bề mặt hoạt động vcác nhóm chức hoạt động, kích thước hạt nhồi và hình dạng hạt
- Bản chất dung môi tạo ra pha động và thành phần của chúng, tốc độ di chuyển của pha động khi chạy sắc ký
- Tính chất của đối ion và ion tạo cặp (trong sắc ký ion)
- pH pha động
- Chất hoạt động bề mặt, chất tạo phức, chất làm chậm, chất điện ly có trong mẫu
- Nhiệt độ cột tách
⇨ Trong 3 trên thì F3 đóng vai trò thứ yếu Do đó, hai yếu tố quan trong nhất là bản chất pha tĩnh và pha động
● Ứng với mỗi chất phân tích trong một điều kiện sắc ký cụ thể sẽ có F1 và F2 khác nhau dẫn đến Frủa giải khác nhau tốc độ di chuyển trong cột là khác nhau thời gian lưu khác
● Lưu ý: có trường hợp các chất phân tích khác nhau nhưng F1và F2 của hai chất lại xấp xỉ nhau (đồng phân đối quang) hoặc F1 và F2 khác nhau nhưng Frủa giảilại xấp xỉ khi đó thời gian lưu giữa các chất này xấp xỉ nhau không được khẳng định hai chất là một khi mới chỉ có thời gian lưu trùng nhau Hay nói một cách khác tiêu chí tzan lưu chỉ có ý nghĩa trong “chẩn đoán loại trừ”
Định tính bằng HPLC [1]
Trong một hệ pha và điều kiện sắc ký nhất định thì mỗi chất tan Xi sẽ có một thời gian lưu tRi khác nhau Chính đại lượng này là một tính chất/ thông số đặc trưng cho chất phân tích Xi và được dùng để phát hiện (một cách “định tính”) các chất trong hỗn hợp mẫu phân tích
❖ Nguyên tắc:
B1: Chuẩn bị mẫu chuẩn và tiến hành chạy sắc ký thu lấy sắc ký đồ Xác định thời gian lưu của từng chất chuẩn
B2: Chuẩn bị và tiến hành chạy sắc ký mẫu phân tích (mẫu thử) thu lấy sắc ký đồ xác định thời gian lưu của từng pic trên sắc ký đồ của mẫu phân tích
Trang 4B3: Từ thời gian lưu của từng pic trên sắc ký đồ của mẫu phân tích, đem so sánh với thời gian lưu của từng sắc ký đồ trên mẫu chuẩn từ đó sẽ xác định được sơ bộ trong mẫu phân tích có những thành phần nào (nếu chúng có thời gian lưu xấp xỉ với thời gian lưu của chất chuẩn)
❖ Tuy nhiên, ngay cả khi có thời gian lưu của một thành phần nào đó trong mẫu thử ~ thời gian lưu của chất chuẩn tương ứng thì cũng không thể khẳng định chắc chắn 100% thành phân đó có cùng bản chất hóa học với chất chuẩn này
Do có hiện tượng nhiều chất khác nhau nhưng có cùng thời gian lưu khi chạy trên cùng điều kiện sắc ký, mặt khác thời gian lưu cũng chỉ là một trong số các tính chất đặc trưng của chất phân tích nên chưa thể đại diện hết cho chất phân tích
Muốn nhận biết được chất phân tích thì cần sử dụng thêm các tính chất đặc khác như phổ (chồng phổ xác định hệ số march/ xác định độ tinh khiết pic…)
ĐỊNH LƯỢNG HPLC [1]
Dựa trên hai phương trình cơ bản: S = k.Cb và H = k.Cb
- H là chiều cao; S là diện tích pic; C là nồng độ; k là hằng số thực nghiệm; b lag hằng số bản chất 0 < b≤ 1)
Khi b = 1 mối quan hệ giữa H-C hay S-C là tuyến tính khi đó S= k.C ; H = k.C
Trong hai mối quan hệ này thì quan hệ S = f(C) có khoảng tuyến tính rộng hơn nên thực tế hay được sử dụng
1 Các phương pháp định lượng.
1.1 Phương pháp đường chuẩn
❖ Nguyên tắc:
B1: Pha một dãy mẫu chuẩn của chất phân tích X có nồng độ C0 C5 và các mẫu phân tích (mẫu thử) CX1, CX2…trong điều kiện phù hợp với C0 là mẫu trắng
B2: Chọn các điều kiện (quy trình sắc ký) để chạy và ghi sắc ký đồ của dãy mẫu chuẩn và các mẫu phân tích (mẫu thử)
B3: Xác định chiều cao hay diện tích píc của pic sắc ký trong các mẫu chuẩn và mẫu thử
B4: Dựng đường chuẩn theo quan hệ Hi-Cihoặc Si-Ci
B5: Từ các giá trị Hx hay Sx của mẫu phân tích áp vào đường chuẩn tương ứng để xác định được các nồng độ tương ứng CX1, CX2…
- Phù hợp để xác định một loạt các mẫu có cùng đối tượng phân tích
- Đơn giản, nhanh và dễ thực hiện
Trang 5- Có thể định lượng cùng một lúc nhiều chất trên một sắc ký đồ của mẫu nhiều thành phần
phẩm…) chúng ta KHÔNG THỂ chuẩn bị được một một dãy mẫu chuẩn phù hợp với mẫu phân tích về nền mẫu, thành phần hóa học và vật lý của các chất như mẫu thực ( vì không biết thành phần cũng như tỷ lệ của nền mẫu) do đó không đánh giá được hết ảnh hưởng của nền mẫu sai số đặc biệt là khi phân tích các thành phần có hàm lượng thấp Trong TH đó có hai cách giải quyết (cải biến nền mẫu/ tốt nhất là phương pháp thêm chuẩn)
1.2 Phương pháp thêm chuẩn
Trong trường hợp thành phần nền mẫu phức tạp (chưa biết) và hàm lượng chất phân tích nhỏ thì nên sử dụng phương pháp thêm chuẩn để loại trừ ảnh hưởng của thành phần nền mẫu hạn chế sai số
Nguyên tắc:
B1: Dùng ngay chính một dung dịch mẫu thử để làm nền pha chế một dãy mẫu chuẩn của chất phân tích Cụ thể là nếu mẫu phân tích mà chất phân tích có nồng độ CX, chúng ta lấy thể tích nhất định của mẫu ví dụ là V1 ml vào 6 bình định mức đánh số C0 C5 và pha dãy chuẩn Sau
đó bằng cách gia thêm vào mỗi mẫu trong mỗi bình một lượng chính xác nồng độ của chất phân tích Xitheo cấp số cộng ΔC trong vùng tuyến tính
Chất phân tích Xi
(ΔC thêm, ppm)
B2: Tiếp theo tiến hành chạy sắc ký tất cả các mẫu chuẩn và mẫu thử Ghi lại sắc ký đồ và tính các giá trị Hx, SX của chất phân tích X trong mẫu thử
B3: Dựng đừng chuẩn H- ΔC hay S- ΔC
B4: Ngoại suy đường chuẩn để xác định giá trị CX
❖ Ưu điểm: loại trừ được ảnh hưởng của thành phần mẫu phân tích và cho kết quả chính xác trung thực khi phân tích các chất có hàm lượng thấp (lượng vết) trong mẫu có thành phần phức tạp
Trang 6❖ Tuy nhiên, trong thực tế trước khi quyết định sử dụng phương pháp thêm chuẩn cần phải định lượng lại một số mẫu chuẩn (mẫu đã biết nồng độ) để đánh giá độ đúng và độ chính xác của phương pháp
1.3 Phương pháp chuẩn 1 điểm
Khi đã có vùng tuyến tính của một chất, trong nhiều trường hợp chúng ta không cần thiết phải dựng đường chuẩn, vì mẫu chuẩn rất đắt, nên chỉ cần một mẫu chuẩn để tính toán nồng độ của chất X trong mẫu thử, vì thế phương pháp thêm chuẩn 1 điểm ra đời Phương phâp này áp dụng trong hai tình huống:
+ Khi có chất chuẩn: Tiến hành chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử, chạy sắc ký trong cùng một điều kiện
⇨ CX= Cch* 𝑆𝑡ℎử
𝑆𝑐ℎ
Cách này khó khăn khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp và không biết chính xác, thì khó chuẩn bị được một mẫu chuẩn có thành phần và nền mẫu giống như mẫu thử nên nhiều khi thường mắc sai số do ảnh hưởng của các thành phần và nền mẫu
+ Khi không có mẫu chuẩn (dùng cách thêm chuẩn)
Lấy hai lượng mẫu thử như nhau (để có hai mẫu), một mẫu để nguyên và một mẫu thêm một lượng chính xác ΔCX của chất X vào Rồi xử lý trong cùng điều kiện sau đó chạy sắc ký, ghi sắc ký đồ và như thế chúng ta có:
Mẫu không thêm: SX= k.CX
Mẫu thêm chuẩn; St.ch= k(CX+ ΔCX)
𝑆
𝑡.𝑐ℎ
𝐶
𝑋
𝐶
𝑋 + Δ𝐶
𝑋
❖ Ưu điểm: loại bỏ ảnh hưởng của thành phần và nền mẫu do mẫu thử và mẫu thêm chuẩn
có cùng thành phần và nền mẫu
❖ Tuy nhiên phương pháp này chỉ cho kết quả đúng khi mẫu thêm chuẩn và mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính
❖ Một điểm cần lưu ý: chỉ áp dụng được khihệ số chắn trục tung khác 0 không đáng kể
Vì khi đó ta mới có SX= k.CX
1.4 Chuẩn hóa diện tích
❖ Nguyên tắc: dựa trên cơ sở tổng diện tích của tất cả các pic sắc ký của các chất có trong mẫu có sắc ký đồ ( không tính pic dung môi) lằ 100% Khi đó
%Xi= 𝑆𝑖 * 100%
∑𝑆
𝑖
Trang 7❖ Ưu điểm: nhanh, không cần chất chuẩn
❖ Nhược điểm: Chỉ là phương pháp tính gần đúng vì đã bỏ qua một số yếu tố gây sai số sau:
Một số chất thực tế có tồn tại trong mẫu phân tích nhưng detector lại không phát hiện được
Nếu độ nhạy của detector kém hoặc bị giảm độ nhạy thì pic của những chất có nồng
độ thấp có thể sẽ không được phát hiện trên sắc ký đồ (mặc dù chúng vẫn có trong mẫu phân tích) sai số
Hệ số đáp ứng của các chất đối với detector khác nhau nhiều:
%Xi= 𝑓𝑖 *𝑆𝑖
∑𝑓
𝑖 *𝑆
𝑖
filà hệ số đáp ứng của chất Xi
Muốn xác định được fiphải có chất chuẩn và có 2 cách xác định
Cách 1: chuẩn hóa 1 điểm:
Dùng 1 dung dịch chuẩn có nồng độ Cch chạy sắc ký đồ xác định Sch fi= 𝐶𝑖
𝑆𝑖
Trong mẫu có bao nhiêu thành phần thì dùng bấy nhiêu chất chuẩn xác định được một bộ hệ số fi Từ đó xác định được hàm lượng
Tuy nhiên cách này chỉ sử dung được khi hệ số chắn trên trục tung không đáng kể ( điểm cắt nằm gần gốc tọa độ) [2]
Cách 2: chuẩn hóa đa điểm
Dùng một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ C0,C1… chạy sắc ký đồ xác định Sch lập đường chuẩn fi= độ dốc của đường chuẩn
Cách này áp dụng khi hệ số chắn trục tung đáng kể (điểm cắt nằm xa gốc tọa độ) [2]
Trang 8Sử dụng chuẩn ngoại:
Yêu cầu: phải có chất chuẩn (chỉ cần 1 chuẩn)
Ưu điểm: chỉ cần cân 1 lần nên ít nguy cơ mắc sai số do cân hơn phương pháp chuẩn nội (phải cân 2 lần 1 chuẩn nội + 1 chuẩn ngoại), sự tách trên sắc ký đồ dễ đạt được hơn chuẩn nội vì coi như mẫu chỉ có một thành phần)
Nhược điểm: mắc sai số trong quá trình cân và sử lý mẫu
Sử dụng chuẩn nội:
Yêu cầu phải có 2 chất chuẩn (1 chuẩn ngoại + 1 chuẩn nội) chất chuẩn nội phải tách khỏi chất phân tích/ chất chuẩn ngoại trên sắc ký đồ cần khảo sát nghiêm ngặt hơn so với chuẩn ngoại Thời gian lưu gần chất phân tích
Ưu điểm: Hạn chế sai số do sự mất mẫu trong quá trình sử lý mẫu cũng như sai số do cân + khi tiêm sắc ký cho kết quả lặp lại tốt
Nhược điểm: không phải chất nào cũng tìm được chuẩn nội
1 a Luận Phạm Luận (2016), "Phương Pháp phân tích sắc ký và chiết tách ", pp.
2. B Harshad V Paithankar (2013), "Hplc method validation for pharmaceuticals: A review ", International Journal of
Universal Pharmacy and Bio Sciences, pp.