Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp enzym endolysin có hoạt lực diệt vi khuẩn staphylococcus aureus của dòng thực khuẩn thể NA6

Nghiên céu các � c �iÃm sinh hÍc và kh£ n�ng sinh tÕng hãp Enzym Endolysin có ho¡t lñc diÇt vi khu©n Staphylococcus Aureus cça dòng thñc khu©n thà NA6 pdf VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌ.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

Dề tài:

NGHIÊN cú u CÁC ĐẶC ĐIẾM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG SINH TÔNG HỢP ENZYM ENDOLYSIN CÓ HOẠT LỤC DIỆT VI KHUẨN

STAPHYLOCOCCUS AURELS CỦA DÒNG THỤC KHUẤN THÉ NA6”.

Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hồng Hải Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Dung

Lớp : CNSH 13-02

Hà Nội-2017

Khóa luận tôt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC

PHẦN I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát chung về tình hình ngộ độc thực phẩm hiện nay 3

1.2 Vi sinh vật gây bệnh Staphylococcus aureus 8

1.2.3.6 Tần suất của các Staphylococcus aureus mang gcn sinh độc tố 20

Sinh viên: Nguyễn Thị Dung

1.3 Tổng quan về enzym endolysin 21

1.3.4 ứng dụng của endolysin trong công nghệ sinh học thực phẩm 26

1.4 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khẳ năng sinh enzym

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 30

2.2 Hóa chất và thiết bị 30

2.3 Phuong pháp nghiên cứu 30

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuấn cúa thực khuẩn thể

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

2.3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy, thành phần môi trường tới sự phát triển và hoạt tính cúa dòng thực khuấn the NA6 33

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Ket quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh Staphylococcus

3.1.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus

3.2 Xác định nguồn sinh enzym endolysin có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus của dòng thực khuẩn thể NA6 373.2.1 Đánh giá khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh cùa dòng

3.2.2 Xác minh endolysin qua khã năng kháng endolysin của dòng

3.3 Nghiên cứu ảnh huởng của pH, nhiệt độ đến sự phát triển và

hoạt tính của dòng thực khuẩn thể NA6 42

Sinh viên: Nguyễn Thị Dung

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Những đặc tính của s aureus, s epidermidis và Micrococci 11

Bảng 2: Các đặc điểm của endolysin để ứng dụng trong thực phẩm 23

Bảng 3: Đường kính vòng phân giài vi khuấn s aureus của dòng thực

Bảng 4: Kiểm tra khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh của dòng

Bảng 5: Xác minh cndolysin qua khả năng kháng cndolysin cùa NA6 39

Bảng 6: Độ tưong đồng các đoạn gen của dòng thực khuân thế NA6 41

Bảng 7: Ánh hướng của nhiệt độ đến sự phát triển và hoạt tính của dòng

Bảng 10: Ảnh hưởng của các nguồn Nitơ đến sự phát triển và hoạt tính

Sinh viên: Nguyễn Thị Dung

Khóa luận tôt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hình thái Staphylococcus aureus 9

Hình 2: Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương dưới kính hiển vi 9

Hình 3: Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 13

Hình 4: cấu trúc điến hình của vách peptidoglycan của vi khuẩn

Hình 5: Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn Staphylococcus aureus 35

Hình 6: Hoạt tính đối kháng với vi khuấn gây bệnh s aureus của

Hình 7: Khá năng ức chế vi khuẩn s.aureus cúa TKT NA6 khi nuôi ở 35°c 43 Hình 8: Khả năng phát triển và ức chế vi khuẩn gây bệnh s.aureus

của dòng TKT NA6 trên môi trường TSB có bổ sung 0,5% lactose 46

Sinh viên: Nguyễn Thị Dung

LỜI MỎ ĐÀU

Hiện nay ngộ độc thực phẩm đã và đang là mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới Nguyên nhân là do con người sử dụng các loại thực phấm đã bị nhiễm các loài vi khuấn gây bệnh hay độc tố của chúng Mặc dù đã có công nghệ hiện đại, các phương pháp thực hành sán xuất tốt (GMP), kiếm soát chất lượng và vệ sinh cũng như an toàn sản xuất và đánh giá rúi ro (HACCP), nhưng sổ lượng các trường hợp bị ngộ độc và bị bệnh do thực phấm vẫn tăng lên trong suốt thập kỷ qua Ớ châu Âu, mồi năm ước tính có hơn 380.000 người dân bị bệnh do sử dụng các sản phấm thực phấm nhiễm vi khuẩn, các loại vi khuấn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella và

Listeria [16]

Staphylococcus aureus là tác nhân phố biến gây nhiễm trùng bệnh viện cũng như trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ mác và từ vong cao trên toàn thế giới 5 aureus khi nhiễm độc thức ăn, đồ uống do tiếp xúc giữa người mang mầm bệnh sẽ có thể dần đến và viêm ruột cấp do các thức ăn có chứa độc tố ruột của 5 aureus, gây mất nước và điện giãi có thể dẫn tới sốc 5 aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuấn bệnh viện, những chủng s

aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả năng kháng lại nhiều kháng

sinh s.aureus còn gây hội chứng sổc nhiễm độc do tiết ra độc tố gây sốc Theo một số cơ quan quản lý thực phẩm châu Âu, các vi sinh vật gây bệnh phổ biến

có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, s

aureus và Listeria cùng với một số loài khác Sử dụng các chất hóa học đế bảo quàn thực phẩm ít được chấp nhận vì nhiều chất bảo quản hóa học đã làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số các chất báo quản sinh học được biết hiện nay, endolysin hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học do nó có khả năng diệt và ức chế các vi sinh vật gây bệnh

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồn gốc từ thực khuấn the (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn thề Các enzyme này làm giám độ mạnh cơ học của thành tế bào dần đến dung giải

tế bào và giãi phóng ra các thực khuẩn thế thế hệ tiếp theo Do đó khi có mặt endolysins chúng có thế phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào cùa mọi vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, do vậy chúng được coi như là một chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đối đặc điếm càm quan, kết cấu của thực phấm và rất an toàn cho con người

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp enzym endolysin

có hoạt lực diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng thực khuẩn thể

NA6”.

MỤC ĐÍCH CỦA ĐÈ TÀI:

Nghiên cứu các đặc điếm sinh học và khà năng sinh tống hợp enzym endolysin để dòng thực khuẩn thể NA6 có hoạt lực diệt vi khuẩn gây bệnh

Staphylococcus aureus cao nhất

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

1 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh s aureus của dòng thực khuẩn

thể NA6

2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học cúa dòng thực khuấn the NA6

3 Ảnh hường của các loại môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nitơ, muối khoáng ) đến khá năng sinh tổng hợp enzym endolysin và hoạt tính kháng khuấn cúa dòng thực khuẩn the NA6

4 Ánh hưởng của pH, nhiệt độ đến sự phát triền và hoạt tính của dòng thực khuẩn the NA6

PHÀN I: TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về tình hình ngộ độc thực phấm hiện nay

đủ, chưa phản ánh thật sự tầm quan trọng cua vấn đề Tì lệ mắc bệnh hàng năm

là bao nhiêu thì không rõ, nhưng theo thống kê của các cơ quan y tế Hoa Kỳ, chỉ riêng tại Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 6.500.000 đến 81.000.000 lượt bệnh mỗi nãm Ớ Á châu, nhiều trận dịch ngộ độc thức ăn gần đây được ghi nhận tại Nhật

và điều này làm cho nhiều quốc gia khác phải lo ngại

Từ tháng 3 dến tháng 5 năm 2010, một biến cố ngộ dộc do vi khuẩn

E.coỉi nhiễm từ cải Romaine lettuce đã xảy ra tại Michigan, New York, Tennessee và Pennsylvania, Hoa Kỳ Thú phạm là một chúng E.coli mới, đó là

E.coli 0145 Đây là một chủng loại hiếm thấy nên ít được các nhà khoa học quan tâm đến E.coli 0145 cũng gây bệnh tương tự như E.coli 0157:H7 Biến cố

trên đã làm cho vài chục người ngã bệnh

Vào trung tuần tháng 5 năm 2011, Châu Âu chấn động vì dịch bệnh ngộ độc thực phấm do E.coli 0104, một chủng làm hủy hoại xuất huyết niêm mạc ruột Enterohemorrhagic E.coli EHEC Đây là một loại rất hiếm thấy từ xưa nay Người ta nghi rằng nguồn lây nhiễm là từ dưa leo hữu cơ organic sản xuất từ vùng Almeria và Malaga, thuộc Tây Ban Nha và được nhập vào các quốc gia Châu Âu Tính đến 30/5/2011, Đức là quốc gia bị nặng nhất với gần 400 nguời bệnh và đã có 14 tứ vong và Đan Mạch có 11 tử vong Ngoài ra, dịch bệnh cũng được thấy xuất hiện tại Thụy Điển, Anh Quốc, Hà Lan

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

Vi khuẩn là một trong nhũng nguyên nhân gây ngộ độc thực phấm nhiều nhất Tại nước Anh, trong 2000 ca bị ngộ độc thực phấm riêng lẻ do vi khuẩn thì

Campylobacter jejuni chiếm 77,3 %, Salmonella 20,9 %, Escherichia coli

0157:H7 1,4 %, các vi khuấn còn lại gây ra ít hơn 0,1 % số ca Triệu chứng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn thường chỉ xuất hiện sau 12-72 giờ hoặc hơn nữa sau khi ăn thức ăn bị nhiễm khuấn

Hoa Kỳ: theo các số liệu của FoodNct từ năm 1996 đến 1998, CDCP ước tính ràng hàng năm có 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca trên 10 vạn dân), trong đó: 325 nghìn nhập viện (111/10 vạn dân); 5 nghìn chết (1,7/10 vạn dân) Ton thất gây ra bới sự sụt giảm năng suất cùng chi phí điều trị năm 1997 là

35 tì Mỳ kim

Pháp: số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1999-2000 cho thấy: 32% số vụ là do sản phẩm sữa và đặc biệt là phô mai, 22% do thịt, 15% do xúc xích, bánh pate; 11% do cá và hài sản; 11% do trứng và sản phẩm trứng; 9,5% do gia cầm Ngộ

độc do s.aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonelỉ.

Những thực phầm bị nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá,

gà và sàn phẩm của chúng, rau cải, trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kcm, phomai, thực phàm lên men [39]

Đài Loan: s aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến năm 1995, Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phấm do tụ cầu tại một trường trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu [48], Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy s aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm [44]

Ớ Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998 số trường hợp ngộ độc do tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tống số các vụ ngộ độc thực phấm do vi khuấn Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân sau khi ăn trưa tại căng tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì

có bicu hiện bệnh, trong đó có 8 trường hợp phải nhập viện

Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc thực phấm do s aureus cũng rất khác nhau ở mồi quốc gia Chẳng hạn ở Mỹ, 50% số vụ ngộ độc được báo cáo từ năm 1969-1990 là từ các sàn phấm thịt, các món ăn từ thịt và đặc biệt là thịt muối; 22% trường hợp là do gia cầm, các món ăn từ gia cầm, 8% từ sữa và sản phấm sữa; 7% do cá và tôm cua, ghẹ; 3,5% do trứng, số vụ ngộ độc báo cáo

từ năm 1975-1982 cho thấy: 36% do thịt; 12,3% do salad; 11,3% do gia cầm; 5,1% do bánh nướng, bánh bao và chi có 1,4% do sữa và sàn phấm hải sản 17,1% thực phấm liên quan vụ ngộ độc không được biết Sự khác biệt này là do thói quen ăn uống cũng rất khác nhau theo từng nước Tụ cầu gây ra khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phấm; và hàng năm, Mỹ mất khoáng 1,5 tì đôla cho những vụ ngộ độc do tụ cầu Trong các loại độc tố gây ra các vụ ngộ độc thì SEA là loại độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất (77,8%), SED (37,5%) và SEB (10%) (Normanno G.và ctv, 2005) Ngoài vấn đề viện phí còn phải mất nhiều thời gian làm việc cũng như sản phẩm lao động của người bệnh, và cả việc phải loại bỏ những sản phâm bị nhiễm

Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bão quán thực phẩm không tốt Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi Việc báo quản thực phấm ớ nhiệt

độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt độ rất lớn, từ 7-48°C Điều đáng lo ngại độc tổ được tạo ra trong suốt quá trình phát

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

triền của tụ cầu nhung lại không gây ảnh huởng đến cảm quan của thực phẩm,

do đó ít được chú ý [34],

1.1.2 Tình hình ngộ dộc thực phâtn tại Việt Nam

Ờ Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phấm hay xảy ra, đặc biệt là ngộ độc tập thế, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm) Theo một thống kê năm

2008, mồi năm ở Việt Nam có khoảng 250- 500 ca ngộ độc thực phẩm với 7.000

- 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tứ vong Có 8 triệu người ngộ độc thực phẩm mồi năm tại Việt Nam Đây là công bố của Tố chức Y tế thế giới (WHO) về tinh hình ngộ độc thực phấm tại Việt Nam Tuy nhiên chi có 8.000 người được thống

kê, phát hiện, bàng 1% số người ngộ độc thực phẩm trên thực tế

Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong

số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là Staphylococcus aureus (Nguyễn Đồ Phúc và cs, 2003)

Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự phòng đã có TI

vụ ngộ độc thực phấm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuấn, chiếm 66% (Nguyền Lý Hương và cs, 2005)

Từ dừ liệu của Hội nghị tồng kết dự án bảo đàm chất lượng vệ sinh an toàn thực phàm cùa Cục vệ sinh an toàn thực phẩm năm 2006, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 164 vụ (tăng 14,6% so với năm 2005), làm 7.135 người

bị ngộ độc (tăng 65,8% so với năm 2005), trong đó có 64 vụ (38,8%) là do vi sinh vật gây ra (Hội nghị tống kết dự án đảm bảo an toàn vệ sinh thực phấm, tháng 3/2007, Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y tế)

Qua các cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố

Hồ Chí Minh trong những năm qua Đáng chú ý hơn cả là ớ các mẫu bánh mi thịt nguội là 16/30 mầu (53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mầu (90%) (Nguyễn

Đồ Phúc và cs, 2003; Nguyễn Lý Hương và cs, 2005)

Một số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta liên quan đến s aureus và độc tổ

ruột của chúng đó là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất

và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM vào ngày 27/7/2006 trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa) Ba giờ chiều cùng ngày, nhiều cán bộ sinh viên đau đầu, tiêu chảy, ói mửa, tất cả 105 người phải vào bệnh viện đế cấp cứu Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, lại đề lâu nên đã nhiễm tụ cầu trùng vàng và đã sinh độc tố enterotoxin Enterotoxin do tụ cầu tạo ra là loại độc tố cực mạnh gây ngộ độc cấp tính Mấy năm gần đây, những vụ ngộ độc thức ăn do tụ cầu được phát hiện và nói đến nhiều hơn (Đỗ Thị Hòa, 2006)

Ớ Thành phố Hồ Chí Minh vụ ngộ độc xảy ra tại Trường Tiếu học Thanh Đa-Khu phố 11 Cư xá-Thanh Đa, P.27, Q Bình Thạnh ngày 03/5/2006, có khoảng 20 cháu bị ngộ độc Các món thức ăn gồm có cơm, canh cãi thảo, thịt

bò, thịt heo kho tiêu, bánh flan Sau khi ăn khoáng 30 phút các cháu có triệu chứng đau bụng, nôn ói, nhức đầu Qua xét nghiệm cho thấy trong mẫu chất nôn

đã có độc tố tụ cầu nhóm A

Vụ ngộ độc ở nhà trẻ Hồng Nhung, thị trấn Đông Dương - H Phú Quốc, Kiên Giang ngày 2/9/2006 Thức ăn gồm có yaourt, cơm, thịt xào Các triệu chứng cũng tương tự như nôn ói, đau bụng Ket quả kiềm tra cho thấy phần lớn các mẫu

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

thực phẩm đầu nhiễm s aureus từ 101 vi khuẩn/gam cho đến 107 vi khuẩn /gam Trong đó độc tố được phát hiện có trong mầu yaourt, độc tố nhóm c [4]

Ngộ độc thực phẩm không chỉ xãy ra ờ nước ta mà còn xảy ra ở nhiều nước trên thế giới kể cả những nước phát triển Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phấm ănh hướng rất lớn đến sức khòe con người và kinh

tế, làm 1,5 tỉ lượt người bệnh, ở các nước công nghiệp 30% dân số bị ngộ độc thực phẩm hàng năm

1.2 Vi sinh vật gây bệnh Staphylococcus aureus

1.2.1 Giới thiệu về Staphylococcus

Staphylococcus là loại cầu khuẩn, bao gồm cả giống hiếu khí

Micrococcus, Pianococcus và Deinococcus, giống kị khí tùy nghi {Staphylococcus, Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pedio coccus, Aerococcus và Gemella') và giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Coprococcus và Sarcina) Họ Micrococcaceae gồm bốn giống:

Micrococcus, Stomacoccus, Pianococcus và Staphylococcus Những đặc tính khác nhau của cầu khuấn Gram (+) gồm: sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, kị khí tùy nghi hay vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện cytochromes, sản phấm lên men từ quá trinh kị khí, peptidoglycan, axit eichoic trong thành tế bào vi khuấn [47]

Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài thường

gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính Tên

Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus

(hạt).Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5-l,5pm,

có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3-4 tế bào) hoặc chùm không theo một trật tự nào cà Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quá trình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào

quá nhiều Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ớ giai đoạn pha ốn định Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như tryptic soy agar (TSA)

có the màu kem đến màu hồng sáng

s aureus là loài phố biến nhất trong giống Staphylococcus Trong điều

kiện kị khí sự phát triền của vi khuẩn cần có amino acid và vitamin, nhưng trong điều kiện hiếu khí cần có them uracil và các nguồn carbon, 5 aureus phát triển tốt nhất ớ điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35°c, nhưng

có thế phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến 45°c khoảng pH có thể phát triến từ 4,5 đến 9,3, nhrrng pH tối thích khoáng 7,0 đến 7,5

1.2.2 Staphylococcus aureus

1.2.2.1 Hình thái, đặc điênt sinh hóa

Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất chung cùa Staphylococcus, s aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 pm, tế bào xếp thành hình chìim nho, không di động Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

s aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:

catalaseH2O2 - ► H2O + O2Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tat cả các dòng s

aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường

chứa đến 15% muối NaCl [5]

Một số dòng s aureus có khá năng gây tan máu trên môi trường thạch máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chủng đều có vòng tan máu hẹp hơn so với đường kính khuân lạc Hầu hết các dòng s aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ớ nhiệt độ phòng, sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà

vi sinh vật này có the bẻ gãy và sử dụng [14]

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng cứa s aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm (do khá năng khứ potassium tellurite K2TeO3 và khá năng thủy phân lòng đỏ trứng cùa lethinase) [34, 44], Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuấn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) [34]

Đa số các dòng s aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15°c, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35-37°C.[5]

Bảng 1 Những đặc tính của 5 aureus, s epidernùdis và Micrococci

Đặc tính • s aureus s epidermidis Micrococci

-1.2.2.2 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đồi tùy thuộc vào từng dòng s aureus có khá năng phát triển trong khoáng nhiệt độ rất rộng, từ 7-48°C, với nhiệt độ cực thuận là 30-45°C; khoảng pH 4,2-9,3, với

độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ 33-55%, tụ cầu vần phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và

Salmonella bị ức chế Ngoài ra, chúng còn có khá năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm Chính nhờ những đặc điểm trên giúp s aureus có sự phân bố rộng, chù yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi cùa người và động vật máu nóng s aureus được cho là vi khuấn khá mạnh có thế sống tốt bên ngoài kí chủ Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuấn Tuy nhiên, s aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60°C từ 2-50 phút tùy

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

VRSA (Vancomycin Resistant Staphylococcusaureus) (Kenneth Todar , 2005) [28]

Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm

2005 cho thấy các chủng 5 aureus phân lập từ bệnh phấm cho thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006) [4],

1.2.2.4 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mú và gây độc

ở người Thường xảy ra ở những chồ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh nhiễm nghicm trọng như viêm phối, viêm vú, vicm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiều và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim s aureus cũng là nguyên nhân chủ yếu của việc nhiễm trùng vết mố và những vụ nhiễm trùng do dụng cụ y khoa s aureus còn gây ngộ độc thực phẩm do tạo độc tố ruột enterotoxin trong thực phẩm, và gây hội chửng shock độc tố do chúng tạo ra siêu kháng nguyên trong máu (Kenneth Todar, 2005) [28],

Hình 3 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

s aureus tạo nhiều yếu tố độc lực:

- Protein be mặt: thúc đấy việc bám dính vào tế bào chù Ngoài ra, hầu hết các dòng đều tạo protein gắn kết fibronogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính các khối máu và mô bị chấn thưong Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường gặp ớ những dòng gây bệnh viêm xương túy và viêm khớp

- Yeu tố xâm lấn (hemolysins, leukocidin, kinase, hyaluronidase): giúp vi khuẩn lan ra trên mô, phân hủy màng tế bào eukaryote

I.2.2.5 Các yếu tố chong lại sự tự vệ của tể hào chủ

♦ Capsule polysaccharide: còn gọi là microcapsule do ta chi có thể nhìn

thấy chúng dưới kính hiến vi điện tứ Trong các mẫu bệnh phẩm, s aureus có thề tạo ra một lượng lớn polysaccharide nhưng khả năng này sẽ giảm nhanh khi đưa chúng vào nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Chức năng gây độc của vỏ capsule không rõ lắm mặc dù chúng có thể ngăn chặn sự thực bào

♦ Protein A: là protein bề mặt có thế gắn phân tứ IgG nhờ vùng Fc Trong huyết thanh, vi khuẩn sẽ gắn các phân tử IgG sai hướng làm phá húy sự opsonin hóa và sự thực bào Các chùng s aureus đột biến thiếu protein A cho sự thực bào trong ống nghiệm hiệu quả hơn, và những đột biến trên mẫu nhiễm sẽ làm giảm độc tính

* Leukocidin: s aureus tạo độc tố rõ nhất trên các bạch cầu đa nhân Sự thực bào là một cơ chế quan trọng chống lại sự nhiễm tụ cầu, do đó leukocidin là một yếu tố gây độc

* Exfoliative exotoxin: gồm hai loại ETA và ETB Chúng gây hội chứng phỏng da ở trè sơ sinh (Scalded Skin Syndrome) và gây chốc lở (Bullous Impetigo) ở cả trẻ em và người lớn

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

1.2.2.6 Khả năng gây bệnh

Tụ cầu vàng thường ký sinh ở da và mũi họng Vi khuấn này gây bệnh cho những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khã năng gây nhiều bệnh khác nhau (Lê Huy Chính, 2001) [1]:

- Nhiễm khuân da:

Do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thề xâm nhập qua lồ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây nên các nhiễm khuấn sinh mủ : mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ớ trẻ em và người suy giảm miễn dịch Đinh râu có thể gây nên những biến chứng nguy hiểm

- Nhiễm khuân huyết:

Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuấn, đặc biệt là nhiễm khuấn ngoài da, từ đây

vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết Đây là một nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuấn đường huyết tụ cầu đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc

Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương

1.2.2.7 Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus

Những triệu chứng thường gặp: Staphylococcus aureus được xem là một

trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chí sau

Salmonella và Clostridium perfringens (Rosec J.P và cs, 1996; Fueyo J.M và cs,

2000 [19]; Viktoria A và cs, 2001 [54]) Triệu chứng thường gặp ớ các vụ ngộ độc do tụ cầu là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, có hay không có tiêu chảy, ngoài

ra còn có thê bị đau đầu, chuột rút, thay đối huyết áp Triệu chứng ngộ độc xáy

ra nhanh, từ 3-6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm và độ nhạy với độc tố cũng như sức khỏe của từng người Thường thì các triệu chứng chi kéo dài trong một thời gian ngắn, khoảng 6-8 giờ (Trần Linh Thước, 2002) [5] và hết bệnh sau 1-2 ngày (Bremer P.J và ctv, 2004)[8] Tuy nhiên khoáng 10% trường hợp người bệnh bị mất nhiều nước cần phải nhập viện để truyền dịch

Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đe lại hậu quả không nhó Theo đánh giá của tố chức Y tế thế giới, hàng năm Việt nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phấm ở nước ta ngày càng gia tăng Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người

tử vong (Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu và cs, 2003)[2]

1.2.3 Độc tố ruột enterotoxin của Staphylococcus aureus

1.2.3.1 Đặc điểm •

Staphylococcal enterotoxin (SE) là những chuồi protein đơn có trọng lượng phân tứ thấp, từ 25000-29000 dalton, mồi chuỗi có những vị trí kháng nguyên chuyên biệt Đặc điếm chính trong cấu trúc của độc tố là vòng cystein ở giữa phân tử Vai trò của những vòng cystcin chưa được biết rõ Tuy nhiên, người ta chứng minh được chính những vòng cystein này giúp ôn định cấu trúc

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

phân tử và có thể góp phần vào việc kháng sự phân giải protein Theo sau vòng cystein là chuỗi acid amin cần thiết, ban đầu người ta nghĩ rằng trình tự này là vị trí hoạt động, nhưng những thí nghiệm thay the amino acid vẫn chưa xác nhận được điều này

1.2.3.2 Tính chất

SE là những protein đơn giản, hút ầm, dễ tan trong nước và nước muối, là những protein cơ bản, độ đắng điện pl là 7-8,6, trừ SEG và SEH có độ đắng điện

pl tuần tự là 5,6 và 5,7 DÍI có một mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vần

có sự khác nhau giữa các trình tự amino acid làm cho các độc tố có các vị trí kháng nguyên khác nhau (Scott E.M và cs, 2000)[ 47],

SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamid và tyrosine Hầu hết có vòng cystine tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn Chúng có tính ồn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong đường tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng Chúng còn kháng với chymotiypsine, rennin và papain (Yves Le Loir và cs, 2003) [56], Đặc biệt, tính ben nhiệt là một trong nhũng tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an toàn thực phấm Chúng không bị phân hủy ở 100°C trong 30 phút (Trần Linh Thước, 2002) [5], thậm chí ở 121°c trong 28 phút thì những SE vẫn giữ đươc hoạt tính sinh học (khi thí nghiệm trên mèo) (Naomi Balaban và Avraham Rasooly, 2000) [37], tính kháng nhiệt cúa SE trong thực phấm cao hơn

so với trong môi trường nuôi cấy (Yves Le Loir và cs, 2003) [56],

1.2.3.3 Phân loại •

số loại SE khác nhau ở nhiều tài liệu khác nhau tùy thuộc vào năm phát hiện và vai trò cùa các SE trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu (Yves Le Loir và cs, 2002) [56], Do số lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại

và sắp xếp chúng Năm 1962, người ta đã đưa ra hệ thống sắp xếp các độc tố

theo bảng chữ cái (Mary Sandel K và McKillip J.L., 2002) [34], Đầu tiên 5 loại

SE được tìm thấy và phân loại dựa vào tính kháng nguyên của chúng, đó là độc

tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố c (SEC), độc tố D (SED) và độc tố E (SEE) Trong đó, SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3 Sau đó, các SE mới cùng với các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và SEU (seg- ser, seu) (Jogensen H.J., 2004) [27],Không có độc tố SEF vì F là kí tự dùng đế chỉ TSST-1 (Scott E.M và cs, 2000[47]; Fueyo J.M., 2000 [19]) Tuy nhiên sự liên quan giữa các SE mới này đen các vụ ngộ độc thi chưa rõ, hiện nay hầu hết các bộ test thương mại chi thích hợp đe xác định các độc tố từ SEA den SEE là các độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc (Capucine Letetre và cs, 2003 [11]; Jorgensen FI.J và cs, 2004 [27]), và theo Rosec J.p.và Gigaud 0.(2002) [45] thì có khoảng 5% các vụ ngộ độc do tụ cầu là do các độc to enterotoxin mà

ta chưa biết gây ra

Trong các loại độc tố trên thì SEA thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc

do tụ cầu (Tsen H.Y., 1996 [50]; Naomi Balaban và Avraham Rasooly, 2000 [37];Capucine Letetre và cs, 2003 [11]) Các dòng s aureus tạo độc tố SEA có tần số cao nhất trong các mẫu thực phàm (61,5%) và trên những người khỏe mạnh (53,6%).Ngoài ra, Vemozy C.R và cs (2004) [53] cũng nhận thấy rằng SEA là nguyên nhân cúa 75% các vụ ngộ độc do tụ cầu, tiếp đến là SED, SEC và SEB, các vụ dịch do SEE thường rất ít gặp

Ị 2.3.4 Các yếu tổ ánh hưởng đến sự phát triến và việc tạo độc tố SE của tụ cầu

Mặc dù SE được tạo ra ở khoảng điều kiện rất rộng nhưng cũng giong như

sự phát triển cùa tụ cầu, cũng có những giới hạn về nhiệt độ, độ ẩm và độ pH làm giảm hay ức chế sự tạo độc tố của 5 aureus Thường thì tụ cầu phát triển đến 106 cfti/g thì có thể tạo SE (Simeão L.C., 2002 [48]; Yves Le Loir và cs,

2003 [56]) Các dòng tụ cầu khác nhau cần các amino acid khác nhau cho sự

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

phát triển và tạo độc tố (Yves LeLoir và cs, 2003) [56], Valine thì cần thiết cho

sự phát triển, arginine và cystine can thiết cho cá sự phát triển lẫn việc sinh độc

tố Các amino acid khác thì có nhu cầu khác nhau tuỳ tùng chủng (Onoue và Mori, 1997) [42]

Điều kiện thích hợp nhất đế tạo độc tố là pH trung tính và giám hay bị ức chế ở pH acid, thường là khi pH < 5 và độ ẩm thấp (dưới 0,86) (Rosamund M.B

và Lee W.H., 1995) [44] Ngược lại pH kiềm cũng làm giám khá năng tạo độc tố SEB, SEC và SED Bên cạnh đó, Braga L.c và cs (2004) [7] cũng đã tìm thấy rằng dịch chiết từ lựu, ngoài tác dụng kháng khuấn còn có thế ức chế tạo độc tổ enterotoxin

Glucose cũng là một thành phần ức chế sự tạo độc tố, đặc biệt là SEB và SEC (Yvcs Le Loir và cs, 2003) [56] do sự trao đối glucose làm giảm pH Ngoài

ra, nồng độ muối cao (trên 12%) cũng làm ức chế sự tạo độc tố Đặc biệt, s

aureus rất nhạy với vi sinh vật cạnh tranh Đặc tính này được chứng minh trong các thực phẩm lên men Genigeorgis (1989) đã chứng minh rằng khi các vi sinh vật cạnh tranh có trong sữa với mật độ cao sẽ làm giảm ti lệ phát triển cũng như tạo độc tố cúa tụ cầu (Yves Le Loir và cs, 2003) [56],

1.2.3.5 Những hoạt tính của dộc tố SE

Các độc tố tụ cầu SE thuộc họ độc tố gây sốt, làm biểu hiện miễn dịch

và tăng nhanh số lượng tế bào T không chuyên biệt Trong số các siêu kháng nguyên đó thì chỉ có SE là có hoạt tính gây nôn Hoạt tính siêu kháng nguyên

và hoạt tính gây nôn là hai chức năng của hai protein riêng biệt nhưng sự liên

hệ giữa hai hoạt tính này vần chưa được làm rõ Tuy nhiên trong hầu hết trường hợp, hai hoạt tính này tồn tại song song nhau, những đột biến làm mất hoạt tính siêu kháng nguyên cũng làm mất hoạt tính gây nôn (Yves Le Loir và

cs, 2003) [56],

1.2.3.6 Tần suất của các chủng s aureus mang gen sinh độc tố

Việc kiếm soát vi sinh vật trong thực phấm được thực hiện một cách thường xuyên Trong số các chủng s aureus phân lập được trong thực phẩm, thì

tỳ lệ các chủng mang gen sinh độc tố ước tính khoảng 25% (Bergdoll, 1989) Tuy nhiên, điều đó cũng còn phụ thuộc vào từng loại thực phẩm và từng nước khác nhau Chẳng hạn như ở Đan Mạch, các chùng s aureus phân lập từ vú bò

bị viêm chì có 1/414 chủng mang gcn sinh độc tố (Larscn và cs, 2000) [30], Ớ Minas Gerais, Brazil, các chùng 5 aureus phân lập từ vú bê bị viêm thì có 54/127 chủng có khả năng sinh độc tố (Cardoso và cs, 1999) [12], chiếm tỷ lệ 42,5% ớ Pháp, trong số 61 chủng phân lập từ phô mai thì có 15,9% chúng mang gen sinh độc tố (Rosec và cs, 2002) [45] Nhưng đây là những nghiên cứu về cách chúng có khá năng sinh độc tố từ A đến E, không bao gồm một số chúng mang gen sinh độc tố mới phát hiện sau này

Ớ Singapore, đã nghiên cứu khả năng tạo độc tố của các chủng s aureus trên các thực phấm nước giải khát và thức ăn nhanh cho thấy trong 111 mầu kiềm tra có nhiễm s aureus trong đó khi xác định khả năng sinh độc tố chiếm tỷ

lệ 33/111(29,7%) , trong đó chúng có độc tố SEA:4, SEB:13, SEC:8, SED 6, SEA- C:2 chủng Tỷ lệ SEC là phổ biến (24%) (Ng D.L.K và Tay L„ 1993) [38]

Trong những năm gần đây , ơ Đức, nghiên cứu các chúng s aureus phân lập từ sữa bò bị viêm vú cho thấy có tới 72,8% chủng mang gen độc tố từ nhóm SEA den SEJ Sự gia tăng tỷ lệ chúng mang gcn sinh độc tố là do một số gcn mới được phát hiện Các chùng mang gen G, 1 và J thường tìm thấy trong các chủng phân lập từ vú gia súc bị viêm

Norway , đã kháo sát tạp nhiễm 5 aureus trong sữa bò bán thành phẩm, cho thấy có 36/163 (22%) chùng S' aureus phân lập có khả năng sinh độc tố ruột

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

trong đó SEB: 2, SEC: 28, SED: 4 và SEA- C: 2 chủng Như vậy ở Norway tỷ lệ xuất hiện độc tố SEA không có Tỷ lệ SEC là phố biến (77,8%) (Jorgensen H.J V

à cs, 2005)[27]

Hiện nay tại Việt Nam cũng đang triển khai các kỳ thuật sinh học phân tử trong việc xác định vi khuẩn s.aureus và xác định độc tố ruột bàng kỳ thuật ELISA Ket quả cho thấy có 19/72 chủng s.aureus (26,8%) chủng có khả năng sinh độc tố, trong đó độc tố SEA, SEB là 42%, SEC là 11% và chúng mang hai gen SEA và SED là 5% (Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn thị Kê, Trần Linh Thước, 2006)[3]

1.3 Tổng quan về enzym cndolỵsin

1.3.1 Giới thiệu về enzym endolysin

1.3.1.1 Khái niệm •

Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thùy phân có nguồn gốc từ thực khuẩn the (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của thành tế bào vi khuấn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn thể Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dần đến dung giải tế bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo Do đó khi có mặt cndolysins chúng có the phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào của mọi vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, do vậy chúng được coi như là một chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn cho con người

(glycosidases) có tác dụng thủy phân liên kết p~ 1 -4 glycosidic ở một nửa phân tử đường cứa vách tế bào (c) N-acetylmuramoyl-L-alaninc amidases có tác dụng tách liên kết amide nối nửa phân tứ đường và peptide của vách tế bào vi khuẩn (d) L-alanoyl-D-glutamatc endopeptidases và interpcptidcbridge-specific endopeptidases có tác dụng là cầu nối đặc hiệu giữa các peptide của peptidoglycan trong vách tế bào (Hình 4) (Fenton và cs, 2010) Domain liên kết

ớ đầu c cúa hầu hết các lysin có trách nhiệm gắn enzym với một cơ chất đặc hiệu trong vách tế bào vi khuẩn thông qua liên kết không cộng hóa trị của các gốc carbohydrate

Hình 4 Cấu trúc điển hình của vách peptidoglycan của vi khuẩn Gram dương Các vị trí phân cắt của các loại endolysin được đánh dấu từ 1 đến

4, trong đó (1) N-acetyl muramidases; (2) N-acetyl-P-D-glucosaminidases; (3) N-acetylmuramoyl-L-alanine amidases; (4) L-alanoyl-D-glutamate endopeptidases và interpeptide bridge-specific endopeptidases

1.3.1.3 Tính chat của endolysin

Một số loại endolysin có hoạt tính ốn định trong thời gian dài như Cpl-1 hoạt tính bền ở 4°c trong 6 tháng và ở 37°c trong 3 tuần (Loeffler và cs,2003)

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

[31], Endolysin K.Z144 và ELI88 vẫn duy trì hoạt tính khi bảo quàn Ở4°c trong

4 Hiệu quả loại bở biofilm trên bề mặt thực phẩm (ví

dụ như đối với tế bào vi khuẩn Gram dương)

4 Kéo dài thời gian bảo quán

- Hiệu quả đối với tác nhân gây bệnh kháng kháng sinh

4-3 Chấp thuận ciia CO’ quan quản lý thực phẩm

4 Được người tiêu dùng và cơ quan quăn lý chấp nhận

+

4 Tác động kinh tế/thị trường

4 Tạo ra bằng công nghệ protein

1.3.2.4 Vai trò và ứng dụng

Trong nông nghiệp, cndolysin có thế sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

đế phòng trừ một số bệnh hại cà chua do Streptomyces scabies, Clavibacter

michiganensis và Xanthomonas campestris Trong chế biến sữa, endolysin sử

dụng như chất báo quán thực phấm dùng đế tiêu diệt các loài vi khuẩn bền nhiệt (như Bacillus spp và Paenibacillus spp.) và vi khuẩn chịu lạnh như Pseudomonas spp., giúp sữa thanh trùng không thối hỏng và kéo dài thời hạn của sản phẩm

Đối với vật nuôi, endolysin có thế dùng để kiểm soát các bệnh đường ruột

ớ gia súc, gia cầm mà không làm thay đối hệ vi sinh đường ruột (như lysin Ply2626 kiểm soát vi khuẩn gây bệnh c perfringens ở gia cam) (Zimmer và cs, 2002) [58], Ngoài ra, cndolysin có thế kiếm soát vi khuấn gây bệnh viêm vú ở tuyến vú của gia súc lấy sữa, phòng trừ nhiễm chéo thực phấm trong quá trình lấy sữa và giết mố gia súc (ví dụ như endolysin Ply700 và LysH5 kiếm soát vi khuẩn gây bệnh Streptococcus uberis và s aureus) (Celia và cs, 2008; Obeso và

cs, 2008) Trong công nghiệp lên men, endolysin như Ply511 có thể được sử dụng đế kiểm soát vi khuấn Listeria monocytogenes làm hỏng sữa (Gacng và cs, 2000) [22] hoặc sừ dụng lysine CTP1 để kiểm soát vi khuẩn Clostridium trong quá trinh chế biến phomat (Mayer và cs, 2010) [35],

1.3.3 Tông hợp nhân tạo endolysin kháng khuân

Trong tự nhiên, endolysin dung giải hiệu quả và nhanh chóng tế bào vi khuẩn chủ nhằm đàm bào sự tồn tại của thực khuẩn thể Tuy nhiên, trong thực tế vần có thể cái thiện được tác dụng cùa endolysin để sử dụng trong thực phẩm hoặc trong điều trị bệnh ở người bằng công nghệ protein Công nghệ này bao gồm việc trao đổi các domain hoặc đột biến ngầu nhiên làm thay đối đặc điếm liên kết và dung giải peptidoglycan

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

Tái to họp domain

Cấu trúc của cndolysin thực khuẩn the cùng với hiểu bict về cấu trúc tinh thể và tin sinh giúp chúng ta có thể thiết kế được các tổ hợp protein chức năng gồm nhiều module có nguồn gốc duy nhất (Schmelcher và cs, 2010) [46] Mồi domain trong các cấu trúc dung hợp như vậy có chức năng riêng cho thấy kỳ thuật phân tử có thể tạo ra các công cụ mới có đặc điểm mong muốn để phát hiện

và kiểm soát mầm bệnh Ngoài ra, cũng có các thế tái tố hợp tự nhiên như endolysin PlyPSA từ thực khuẩn thể của vi khuẩn Listeria hoặc endolysin Pal từ thực khuẩn thể của phế cầu khuấn cho thấy rằng truyền gen ngang do quá trình trao đối tái to hợp của các module endolysin xảy một cách tự nhiên trong quan thể thực khuẩn thể hoặc giữa thực khuẩn thể và vi khuẩn chù (Hendrix, 2002) [25], Endolysin PlyPSA có đặc điểm của domain gắn với vách tế bào (CBD) và tương đồng với lysine cùa thực khuẩn thể vi khuẩn Listeria, trong khi đó domain

có hoạt tính enzyme (EAD) liên quan đến domain amidase tử thực khuẩn thế của

Bacillus và Clostridium Các phát hiện này củng cố cho ý tưởng tạo ra các chất kháng khuẩn và công cụ chấn đoán nhân tạo Diaz và cs (1990) [15] đã đặt nền móng cho kỳ thuật phân tử endolysin bằng cách chứng minh rằng trao đối các domain chức năng giữa autolysin LytA từ phế cầu khuấn và lysine Cpl-1 của thực khuẩn thể đã thay đổi hoạt tính xúc tác và đặc điếm điều khiển của enzyme

tổ hợp này Croux và cs đã tạo ra cấu trúc dung hợp gồm EAD của autolysin Lyc

từ vi khuấn Clostridium acetohutylicum và domain liên kết choline (ChBD) của

lysin Cpl-1 làm cho tổ hợp này tác dụng đến vách tế bào phế cầu khuẩn có chứa choline và mất hoạt tính đối với vách tế bào vi khuấn Clostridium Manoharadas

và cs (2009) đã tạo ra một thể dung hợp của endolysin thực khuẩn thề P68 từ vi

khuẩn Staphylococcus aureus Endolysin này được tinh sạch và có hoạt tính

kháng sinh chống lại s aureus