Giải trình tự gen ADN ty thể vùng cytochrome b ứng dụng trong giám định phân biệt ADN ty thể người và một số động vật

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 0O0 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dê tài Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội GIẢI TRÌNH TỤ GEN ADN TY THÊ VÙNG CYTOCHROME B ỦNG DỤNG TRONG GIÁM DỊNH PHÂN BIỆT ADN TY.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- 0O0

GIẢI TRÌNH TỤ GEN ADN TY THÊ VÙNG CYTOCHROME B - ỦNG DỤNG TRONG GIÁM DỊNH PHÂN BIỆT ADN TY THÉ NGUÒĨ VÀ

MỘT SÓ DỘNG VẬT

Giáo viên hướng dẫn : ThS Hà Hữu Hảo

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Yên

HÀ NỘI - 2017

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hưóng dẫn : ThS Hà Hữu Hảo

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Yên

HÀ NỘI - 2017

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Đào Thị Hồng Vân

đã đã tận tình giúp đỡ và giúp em được thực tập tại Viện Pháp y quốc gia.

Và với tất cả lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến: Các thầy cô giáo trường Viện đại học Mờ Hà Nội đã giúp em có được những kiến thức trong quá trình học tập tại trường.

ThS Hà Hĩru Hâo - Trường khoa Y - Sinh học, Viện Pháp y quốc gia

đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy và tạo điều kiện cho em được tham gia lớp học đào tạo chuyên môn về giám định ADN cúa TS.Nguyễn Đức Nhự - Viện trưởng Viện Pháp y quốc gia, cùng Khóa đào tạo về phân tích ADN ty thế do các chuyên gia Phòng thí nghiệm nhận dạng ADN người thuộc quân đội Hoa

Kỳ giảng dạy.

Trong quá trình thực tập, làm việc và thực hiện luận văn, em đã nhận

iTiii' viền V lên Đại nọc MO 1 la Nọị "

được sự giúp đỡ và chi bào của các cán bộ Viện Pháp y quốc gia đã tạo điều kiện cho em có thời gian học tập, giúp em tiếp cận được với các kỹ thuật trong phòng nghiên cứu đổ hoàn thành luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, Ngày 15 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Yên

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC TÙ VIẾT TẤT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐÈ 1

PHẦN I TÓNG QUAN 3

1.1 Tông quan về ADN và giám định ADN 3

1.1.1 ADN và cấu trúc cúa ADN 3

1.1.2 Giám định ADN 3

1.2 Ty thế và ADN ty thể 4

1.2.1 Ty thế 4

1.2.2 ADN tyTtỉỉẳi: Y.iệii V.iện.Đại.iiọ£ Mó:.I.IÀ.N.Ội 6

❖ Vai trò việc nghiên cứu ADN ty thế 6

❖ Cơ sở khoa học của di truyền ADN ty thể 8

❖ Cấu trúc ADN ty thể 10

1.3 Cytochrome B 11

1.4 Tình hình nghiên cứu gen Cytb trong và ngoài nước 13

1.4.1 Tình hình nghiên cứu gen Cytb ở nước ngoài 13

1.4.2 Tinh hình nghiên cứu gen Cytb ở Việt Nam 14

PHÀN II VẠT LIỆU VÀ PHU ONG PHÁP NGHIÊN CÚC 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Hóa chất và thiết bị sứ dụng 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Tách chiết ADN 16

2.2.3 Phản ứng PCR 20

2.2.5 Giái trình tự ADN 22

2.2.6 Xử lý và thống kê số liệu 24

PHÀN III KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 25

3.2 Kết quà khuếch đại ADN ty thể vùng Cytb 26

3.3 Kết quả giải trình tự gen Cytb trên các mẫu nghiên cứu 28

3.4 Kết quả so sánh ADN ty thề vùng Cytb của người và một số động vật 29

3.4.1 Kết quả so sánh trình tự gen Cytb của các mẫu nghiên cứu so với trình tự tham khảo trên Genbank 29

3.4.2 Kết quà so sánh trình tự gen Cytb giữa người và một số động vật 44

KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

1 Kết luận 55

2 Kiến nghị Thtrviệi-i-V-iện-Đại-họe-MỚ-Hả-Nội 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

ADN Axit deoxyribonucleic

D-Loop Displacement loop

EDTA Ethylenedianinetetraacetic acid

HV1 Hypervariable 1 (Vùng siêu biến 1)

HV2 Hypervariable 2 (Vùng siêu biền 2)

HV3 Hypervariable 3 (Vùng siêu biến 3)

mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thế)

PCR Polymerase chain reaction ( Phàn ứng chuỗi trùng hợp)

Rcrs

ĩ

Revised Cambridge Reference Sequence

(Trinh tò thám khảo 'cửá Cambridge đẩ được chinh sửa)

Bp Base pair (Cặp base)

Cytb Cytochrome B

Hình 1 : cấu trúc chung của một gen điến hình 3

Hình 2:MÔ hình ty thể 5

Hình 3: cấu trúc hệ gen ty thể 8

Hình 4: Sơ đồ phă hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ty thể 10

Hình 5: Vị trí gen Cytb trong ADN ty thể 116| 11

Hình 6: Chương trình thiết lập phần mềm giải trình tự 24

Hình 7: Điện di ADN tổng số trên gel agarose 0.8% 25

Hình 8: Điện di sàn phẩm PCR vùng Cytochrome B trên gcl polyacrylamide27 Hình 9: Kct quả giải trình tự mẫu L2CB theo hướng dần cùa hãng ABI (Mỹ)28 Hình 10: Ket quà giải trình tự của mẫu L2CB 29

Hình 11: So sánh các trình tự nucleotide thu được từ mẫu cùa người với trình tự tham khảo trên Genbank 34

Hình 12: So sánh các trình tự nucleotide thu được từ mầu của bò với trình tự tham khảo trên GĨtaịêụ Vien Dai JA2.C Mớ Hà Nôi 38

Hình 13: So sánh các trình tự nucleotid thu được từ mẫu của chó với trình tự tham khảo trên Genbank 40

Hình 14: So sánh các trình tự nucleotid thu được từ mẫu của lợn với trình tự tham kháo trên Genbank 43

Hình 15: So sánh các trình tự nucleotid từ bò, chó, lợn nghiên cứu với trình tự nucleotid người (Homo sapiens JN034136.1) 53

Bảng 1: Trình tự các cặp mồi dùng khuếch đại vùng Cytb 20

Bảng 2: Thành phần PCR 20

Bàng 3: Chu trình nhiệt được thực hiện dùng cho máy PCR 21

(Eppendorf-Đức) 21

Báng 4: Thành phần hóa chất điện di 21

Bảng 5: Thực hiện PCR với BigDye Terminator kít [12]: 23

Bảng 6: Chu trình nhiệt PCR: 23

Bảng 7: Tinh sạch sán phẩm PCR sử dụng BigDye Xterminator purification kit [10]: 23

Bảng 8 Ti lệ phần trăm trình tự đa hình giữa các mẫu nghiên cứu với trình tự loài tương ứng trên Genbank 43

Bảng 9: Ti lệ phần trăm trình tự đa hình giữa mầu người với bò, chó, lợn 54

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Trong vòng 20 năm trở lại đây, sinh học phân tử và công nghệ gen đã phát triền mạnh mê và đem lại một trong những thành tựu vĩ đại nhất cho khoa học và công nghệ cuối thế kĩ 20 đầu thế ki 21, đó là việc giải trình tự hoàn chinh bộ gen người Từ đó sinh học phân tử cũng trở thành công cụ đắc lực cho nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau như: kháo cổ học, nhân chủng học, di truyền y học và đặc biệt trong giám định các vụ án hình sự Ngày nay, phương pháp giám định gen đã được sử dụng rộng rãi ờ nhiều quốc gia khác nhau, đưa ra những bằng chứng đáng tin cậy nhất cho việc phá án, giúp đem lại sự công bằng cho xã hội.

Có hai phương pháp giám định gen là phân tích ADN trong nhân tế bào

và phân tích ADN ty thế Phân tích bộ gen trong nhân tế bào là phương pháp

có nhiều ưu điểm nhưng bên cạnh đó cũng có nhiều hạn chế là đòi hỏi phải thu đươc ADN nhân nguyên ỵẹn^của mầu phân tích Tuỵ^nỊýên, trong trường hợp mẫu phân tích đã bị phân húy không thè thu được ADN trong nhân tê bào thì phương pháp duy nhất được áp dụng là phân tích ADN ty thẻ Với các đặc trưng nổi bật cùa ADN ty the như: di truyền theo dòng mẹ, có kích thước tương đối nhỏ nên ben vững trong thời gian rất dài có the lên tới hàng nghìn năm, cùng so lượng bản sao rất lớn trong tế bào cấu trúc ADN mạch vòng,

và được bão vệ bời các cấu trúc đặc biệt như keratin ở tóc, và hydroxyapatite

ở xương hoặc răng Vì vậy, phân tích ADN ty thế trờ thành công cụ không thể thiếu trong khoa học y học và khoa học điều tra.

Trong công tác giám định pháp y, khi phân tích những dấu vet sinh học không rõ nguồn gốc, thì một trong những việc quan trọng đầu tiên cần tiến hành là phải xác định mẫu vật đó có nguồn gốc từ con người hay từ một động vật nào khác Đôi khi việc xác định được nguồn gốc loài cùa mầu phân tích trong một số trường hợp sẽ đóng vai trò quyết định đen khã năng kết luận vụ việc (như các tai nạn giao thông liên quan đến động vật, các tai nạn do bị

điểm hình thái đặc trưng, dập nát, bị phân húy do đổ lâu trong những điều kiện không thuận lợi (chẳng hạn các mẫu xương lâu nãm đã bị phân hủy do chôn trong điều kiện ngập nước, bị phân hủy do tính axit cùa đất, vi khuấn, ánh sáng, nhiệt độ ) nhiệm vụ này nhiều khi không thê thực hiện được bang các phương pháp nhận biết thông thường Vì vậy để nhận biết những trường hợp như trên thì việc có được một phương pháp nhận biết nguồn gốc loài của mẫu giám định một cách hiệu quà là hết sức cẩn thiết.

Vì vậy tôi thực hiện đề tài: “Giải trình tự gen ADN ty thế vùng Cytochrome B - ứng dụng trong giám định phân biệt ADN ty thể người

và một số động vật” Với mục tiêu chính:

- Hoàn thiện kỹ thuật khuếch đại ADN ty thế vùng Cytochrome B.

- Phân tích đặc điếm đa dạng di truyền trên ADN ty thể vùng Cytochrome B cùa cặc mẫu pghien^cdu từ đó ứng dụng trọng phân biệt ADN người và một sô động vật.

1.1 Tổng quan về ADN và giám định ADN

1.1.1 ADN và cấu trúc của ADN

ADN là một loại vật chất di truyền tồn tại trong tất cả các tế bào cùa cơ thế được truyền từ the hệ này sang thế hệ khác, được lưu trữ trong tế bào còn sống thậm chí cả khi tế bào đã chết.

Cấu trúc của ADN:

Mồi ADN có hai mạch polinucleotit, nhưng chi có mạch gốc (3'—>5') mang thông tin mã hóa cho các axit amin mạch còn lại được gọi là mạch bố sung Mỗi gen mã hóa protein gồm 3 vùng trình tự nucleotit.

Mạch mã góc 3’

Mạch bố sung 5’

thúc

Hình 1 : cấu trúc chung của một gen điển hình

Vùng điều hòa: Nằm ờ đầu 3’của gen mang tín hiệu đặc biệt giúp ARN polimeraza nhận biết và liên kết đê khới động quá trình phiên mã và chứa trình

tự nucleotit điều hòa quá trình phiên mã.

Vùng mã hoá: mang thông tin mã hóa các axit amin.

Vùng kết thúc: nằm ở đầu 5' cùa mạch mã gốc mang tín hiệu kết thúc phiên mã.

Giám định ADN là phân tích, so sánh những đoạn ADN tách chiết được từ tế bào cơ thê gồm: máu chân tóc, mô, tinh dịch, dấu vết sinh học chứa ADN Khi phân tích và so sánh gen của tế bào sống hay đã chết đều có thể xác minh được sự giống nhau và khác nhau của gen, qua đó có the kết

các cá thể, sứ dụng kỹ thuật sinh học phân tử.

Có hai phương pháp giám định ADN là phân tích ADN trong nhân tế bào và phân tích ADN ty thề Phân tích bộ gen trong nhân tế bào là phương pháp có nhiều ưu điềm nhưng bên cạnh đó cũng có nhiều hạn chế là đòi hỏi phải thu đươc ADN nhân nguyên vẹn của mẫu phân tích Tuy nhiên, trong trường hợp mầu phân tích đã bị phân hủy không thổ thu được ADN trong nhân tế bào thì phương pháp duy nhất được áp dụng là phân tích ADN ty thế.

Giám định ADN đã được ứng dụng trong giám định pháp y - hình sự trong các lình vực:

- Giám định ADN đế xác định quan hệ huyết thống nham xác định mối quan hệ huyết thống trong các vụ việc dân sự (tìm bố - con, xác định quyền làm cha, trách nhiệm nuôi con trong hoặc ngoài giá thú, thất lạc người thân vv ) Giám định.ADN với rriục đích.xin thị thực di dân.

- Giám định ADN Pháp y nhàm truy tìm thu phạm, tung tích nạn nhân, hung thú hiếp dâm, giết người

- Giám định ADN xác định danh tính hài cốt liệt sì, mồ má thân nhân bị thất lạc hoặc tranh chấp.

- Giám định ADN đế phân biệt loài nhằm xác định những mẫu sinh phàm thu được tại hiện trường vụ việc là có nguồn gốc từ con người hay của một loài động vật nào khác từ đó tìm ra bang chứng vụ việc.

1.2 Ty thể và ADN ty thể

1.2.1 Ty thể

Ty thế được phát hiện và mô tả đầu tiên bởi Altman từ năm 1894 và đến nãm 1897 Benda đặt tên là mitochondria, cấu trúc siêu hiển vi của ty thể

vào năm 1953.

Hình 2:MÔ hình ty thể

Hình dạng chung của ty thế trong các loại tế bào khác nhau thì rất khác nhau và thường có dạng sợi, hạt hoặc cả sợi và hạt trong một tế bào Ví dụ: trong tế bào gan, ty thể có thể thay đối từ dạng hạt sang sợi và ngược lại; còn trong tế bào biếu bì ruột, dạng, sợi nằm ở phần ngọài, dạng hạt nằm ở phần trong.

Kích thước cùa chúng cũng rất thay đổi, ớ đa sổ tế bào ty thế có chiều dày tưong đối cố định khoáng 0,5pm, chiều dài thì thay đối và tối đa là 7pm.

Số lượng ty thổ trong các loại tế bào khác nhau thì khác nhau và ở các trạng thái sinh lý khác nhau cũng khác nhau Ví dụ: trong tế bào gan chuột có đến 2.500, còn trong tinh trùng một so sâu bọ chi có 5 - 7 ty thế Ty thế được cấu tạo bới 2 lớp màng giống màng tế bào.

- Màng ngoài: dày 60Ả, bão đàm tính thấm của ty thề.

- Màng trong: dày 60Â Từ màng trong hình thành nên các mấu lồi ăn sâu vào trong xoang ty thể gọi là tấm hình răng lược (crista) Màng trong chia xoang ty thồ thành 2 xoang.

+ Xoang ngoài nằm giữa màng trong mà màng ngoài rộng khoáng 60 - 80Â và thông với xoang của các vách răng lược.

ty thể gọi là matrix.

Chat nền thường là đồng nhất, nhưng đôi khi quan sát thấy có các sợi móng hoặc các hạt nhó có mật độ điện từ cao, các hạt này là nơi đính các cation hai hoá trị, đặc biệt là Mg+? và Ca+2 Các tấm hình răng lược là những vách ngăn không hoàn toàn, số lượng các tấm răng lược không giống nhau ờ những tế bào khác nhau và ở các loài khác nhau Mặt trong của màng trong có những khối hình cầu đường kính 80 - 100Ả đính vào bề mặt cùa tấm hình răng lược nhờ một cái cuống dài 30 - 50Ẳ - gọi là hạt cơ bãn Trong một ty thể có tới 104 - 105 hạt cơ bản (Vermander - Moran 1963) Hạt cơ bán có 3 chức năng:

- Thực hiện phán ứng oxy hoá khử, giải phóng e

- Vận chuyến e' đen để tồng hợp ATP.

- Thực hiện phàn ứng phân giải ATP và cung cấp năng lượng cho các

hoạt động của tế ^[4ịjện Viện Hại Ị-|ỌC Vlơ Hà Nội

❖ Cấu trúc ADN ty thề

ADN ty thế là phân tứ ADN tồn tại ở trong ty the, một cơ quan sinh năng lượng nằm trong tế bào chất (ngoài nhân), đây là phân từ ADN có cấu trúc mạch vòng, có chiều dài 5pm Trong tế bào, mtDNA chiếm từ 1 - 5% ADN cùa tế bào Ví dụ, trong tế bào gan người, số phân từ mtDNA trong một

ty thể là 5, mồi phân tử chứa khoảng 16600 cặp nucleotit, chúng nằm trong chất nền định khu cạnh các mào và thường liên kết với mào mtDNA tự tái băn theo kiểu bán bảo thú nhờ hệ ADN polimeraza có trong chất nền ty thề và xảy ra ở gian kỳ của chu kỳ tế bào mtDNA có dạng mạch vòng và không liên kết với histon, điều này làm cho mtDNA khác với ADN của nhân tế bào mtDNA là một trong những nhân tố quy định tính di truyền tế bào chất |5|.

strand) và một chuỗi nhẹ giàu cytosin (L- strand) Chuồi nặng chứa 12 trong

số 13 gen mã hoá polypcptit, 14 trong số 22 gen tRNA và cả 2 gcn rRNA Vùng không mã hoá trên ADN ty thê được gọi là vùng điều khiển hay vùng D-loop, kích thước khoáng 1121 bp, chứa điếm khởi đau sao chép của chuồi nặng và các promoter phiên mã cùa chuồi nặng và chuồi nhẹ [8 18, 19 ] Trên phân tử ADN ty thể cũng có vùng siêu biến, tức là có sự thay đối trình tự bazơ nitơ đặc trưng cho nhóm cá thề Khi dựa vào sự khuếch đại của phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), phương pháp phân tích ADN ty thế xác định huyết thống tập trung vào vùng điều khiến hoặc các vùng nhó quan tâm nằm trong vùng điều khiển Chu yếu những vùng quan tâm này được miêu tả như vùng siêu biến I (HV1), vùng siêu biến 11 (HV2), và vùng siêu biến III (HV3) đây là những vùng đa hình chủ yếu, có tốc độ tiến hóa cao Chính vì vây, nhận dạng ADN ty thế người thường dựa trên sự khác nhau về trình tự cúacác vùng siêtĩị^p Viện Đại học Mơ Hà Nội

Kích thước của hệ gen ty thế (mtADN) ờ phần lớn động vật có xương sống vào khoảng 16.8 kb tuy nhiên có thế sai khác đôi chút do có những đoạn chèn vào, hoặc do mất đoạn, hoặc có những trình tự lặp lại nối tiếp.

Bộ gen ty thế của tế bào động vật gồm các exon, cấu trúc tương đối giống nhau và phân bố tương đối không đồng đều có kích thước khoáng

16000 - 19000 bp Đối với các tế bào động vật có vú, ADN ty thế chi chiếm khoảng dưới 1 % tổng số ADN cùa tế bào, mồi ty thế có chứa một số bản sao cùa ADN và bởi vì mồi tế bào chứa nhiều ty the nên số lượng ADN ty thể có thế rất lớn.

Ờ người bộ gen cùa ty thể rất ồn định, có chút đa hình mang tính chúng tộc Và điều độc đáo nhất là tuy cũng là một phân tử ADN sợi kép hình vòng như vi khuấn nhưng điều khác là cà hai vòng đơn đều có gen mã hóa độc lập với nhau Mồi ADN ty thể có 16.569 cặp bazơ (nucleotide) [9] là một phân tử

bào Bao gồm 37 gen, mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide tham gia vào chuỗi

hô hấp tế bào, 22 gen tRNA và 2 gen rRNA.

Hình 3: cấu trúc hệ gen ty thể

(Forensic DNA typing 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press) Vào năm 1981,cấu trúc ADN ty thế người lần đầu tiên, đại diện cho người da trắng đã được Anderon và cộng sự Cambridge (Anh) giải trình tự và công bố, tại phòng thí nghiệm của Fredrick Sanger 19], Sau đó được Anderon

và cộng sự chinh sửa lại vào năm 1999 [1()| Đây được coi như là trình tự tham chiếu cho các trình tự khác Trong mồi tế bào chứa khoảng 500 ty thể, trong mỗi ty thế chứa 2-10 bản sao mtDNA, như vậy có hàng nghìn bán sao mtADN trong khi chi có 1 bán sao ADN nhân trên một tế bào.

Cho đen nay, đã có trên 300 trình tự hoàn chinh cùa bộ gen ty the người thuộc các chúng tộc và dân tộc khác nhau được nghiên cứu và đăng ký trong các Ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL(EBI)/Genbank/DDBJ.

❖ Cơ sở khoa học của di truyền ADN ty thế

con người, ty thể đóng vai trò rất quan trọng Mồi tế bào người chứa đến năm trăm ty thẻ trong bào tưong Quá trình sao mã cùa mtADN xày ra ở trong ty thế và độc lập với nhau Hay hệ gen cùa ty the (mitochondria genome) độc lập với hệ gen nhân (nuclear genome) cùa tế bào, chúng có khá năng tự sao chép

mà không can phụ thuộc vào quá trình phân chia cùa tế bào, tuy nhiên giữa hệ gen ty thế và hệ gen nhân đều có mối quan hệ rất chặt chẽ với nhau [17], Hệ gen ty thế chịu ành hưởng điều hòa cùa hệ gen nhân cho nên quá trình hoạt động, phân chia của ty thể phụ thuộc một phần vào sự chi huy của hệ gen nhân tế bào.

Hệ gen ty thề là một cấu trúc tạo bời ADN hai sợi khép kín, có cả ờ nam và nữ giới nhưng chỉ có nữ giới mới truyền ADN ty thề của mình cho những người con và thế hệ sau (mẹ, con gái, dì, bà ngoại, ) Ví dụ dien hình nhất là tinh trùng Giao tử này có thể mang một ít ty the ớ phần sát đuôi như

là một nguồn năng lượng đế cho tinh trùng hoạt động trên hành trình dài tìm đến với trứng Khi một tinh trùng nào đó may mắn gắn được với trứng trong quá trình thụ tinh thì đuôi của nó cũng rụng đi Hệ quà là cơ thế mới được tạo thành chi chứa ty thế của mẹ truyền cho Như vậy, không giống với ADN của nhân tế bào, vật chất di truyền cùa ty thế không có hiện tượng chộn lẫn qua mồi the hệ trình tự ADN của gen ty thế thường ôn định qua một thời gian dài trong lịch sự tiến hóa và sự khác biệt trình tự của gen ty thế giữa các thành viên có quan hệ di truyền theo dòng mẹ là rất hiếm Vì vậy đặc tính di truyền theo dòng mẹ là một đặc tính quan trọng cùng với số lượng bản sao lớn mà ADN ty thế đã được ứng dụng trong giám định Trong quần the người ADN

ty thế di truyền nghiêm ngặt theo dòng mẹ, trong tất cà các tế bào cùa các mô

và tổ chức của cơ thể đều có chứa ADN ty thồ với cấu trúc như ADN ty thế của mẹ Mặt khác, toàn bộ trứng của một người mẹ sinh ra trong các thời điểm khác nhau đều có chứa trình tự bazơ - nitơ trong ADN ty thề giống nhau Trong quá trình thụ tinh, gần 99% ty thê của hợp tử nhận được từ tế bào

mẹ sẽ có trình tự nucleotide cùa ADN ty thế đong nhất với nhau.

Hình 4: Sơ đồ phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ty thể

Không chỉ vậy, ADN ty thế còn có đặc tính độc nhất là tốc độ tiến hóa cao So với hệ gen nhân, ADN ty thế đột biển cao gấp 5-10 lần Chính vì điều này mà nó có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu sự đa dạng về quần thê và

đa dạng các tộc người.

❖ Vai trò việc nghiên cứu ADN ty thể

ADN ty thể của người là một phần quan trọng đầu tiên cùa bộ gcn người được giái mã Trình tự ADN cùa mtDNA cũng đã được xác định cho một số lượng lớn các sinh vật và cá thể, bao gồm cả một số sinh vật đã tuyệt chủng.

Việc so sánh các trình tự ADN ty thể đóng vai trò trong nghiên cứu phát sinh chủng loài học (phylogenetics), trong đó nó cho phép các nhà sinh

cùa các quần thế, và như vậy nó rất quan trọng trong lĩnh vực nhân chùng học

và sinh học.

Đặc biệt trong công tác giám định pháp y - hình sự đối với những mầu sinh học lâu năm thì việc nghiên cứu ADN ty the là hết sức quan trọng trong việc nhận dạng mẫu sinh học.

1.3 Cytochrome B

Trong ADN ty thể có gen Cytb chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp polypeptide Nó là một protein vận chuyến điện tử trong chuỗi hô hấp bên trong ty thể Protein này có vai trò quan trọng trong hoạt động sinh lý của tế bào và cơ thể động vật vì nó liên quan đến việc tạo năng lượng để cung cấp cho các hoạt động sống.

Cytb là một trong 37 gen cùa hệ gen ty thể, có chiều dài khoảng 1140bp [32] và được đặt giữa hai vùng ND6 và vùng DLoop Phân cách bời hai vị trí: tRNA Glu và tRNA Thr.

14816F

Hình 5: Vị trí gen Cytb trong ADN ty thể [16]

Đê xác định định loài có thê dựa vào phương pháp điện di protein, miễn dịch hoặc sắc ký Tuy nhiên phương pháp dựa vào protein có nhiều hạn chế là không được đặc hiệu và số loài thường bị hạn che Phân tích trình tự gen Cytb

là một phương pháp lý tưởng đế xác định loài cũng như nguồn gốc mẫu sinh phấm [15, 31, 33] Sờ dì Cytb được sừ dụng phố biến nhất trong việc xác định

loài cho các mẫu giám định là vì nó có những đặc điếm rất độc đáo so với các

qua các thế hộ của loài với nhau.

Với một lượng lớn động vật, gen Cytb đã được giải trình tự ADN hoàn chỉnh và đầy đủ, so sánh trình tự gen Cytb giữa các loài cho thấy gen này có tính đa hình cao giữa các loài Giữa các cá thế trong cùng một loài gần như không có sự thay đồi về trình tự gen Cytb 113,16,18, 21,22, 23, 25, 26 ].

Mặt khác, gen Cytb nam hoàn toàn trên ty the [7] nên nó mang những đặc điêm riêng biệt so với các hệ thống ADN trong nhân như không có hiện tượng tái tổ hợp, mồi tế bào có hàng nghìn bàn sao mtDNA khiến cho việc thu nhận và phân tích ADN vùng Cytb dề dàng hơn phân tích ADN trong

nhân rất nhiều Điều này đặc biệt có giá trị trong các trường hợp giám định với mẫu đã bị phân hủy nhiều [30], Bên cạnh đó, gen Cytb có tốc độ đột biến

nhanh hơn 4 - 5 lần so với ADN trong nhân do nó không có intron, thiếu các

cơ chế bào vệ khói các tác nhận ọxi hóa bên trong ty thế [27J Những đặc tính này của gen Cytb cho phép tiên hành việc khuêch đại đoạn gen đặc hiệu của

gen đó rồi phân tích tiếp bằng phương pháp đọc trình tự hoặc phân tích RFLP [7, 20].

Trong phân tích trình tự gen vùng Cytb trên hệ gen ty thế giúp phân biệt một mẫu sinh phấm là của người hay cùa một loài động vật nào khác Cũng như ở người, ở động vật với số lượng bản sao lớn cho phép phân tích ADN ty thể từ các mẫu đặc biệt (những mẫu chứa rất ít ADN nhân hoặc mẫu đã bị phân húy mạnh) Việc nghiên cứu và phân tích gen Cytb đóng vai trò quan trọng trong nhiều lình vực như: đa dạng sinh học, nghiên cứu tiến hóa loài, trong lĩnh vực y học (nghiên cửu di truyền bệnh), thực phẩm (xác định nguồn gốc các loại thịt,cá ), nhân chủng học, khoa học hình sự Đặc biệt trong lĩnh vực pháp y việc xác định nguồn gốc mẫu sinh phấm, dấu vết sinh học là một phương pháp giám định trợ giúp đắc lực cho công việc điều tra.

1.4.1 Tinh hình nghiên cún gen Cytb ỏ’ nước ngoài

hiểu kĩ nhất trong các gen ty thể nên tính đến nay trong Genhank đã có tới hơn 8000 trình tự gen Cytb của các loài động vật có xương sống đã đươc lưu

lại [17].

- Năm 2000, bằng cách tách chiết ADN và phân tích trình tự cúa gen Cytb w.Parson và cộng sự nghiên cứu nhận dạng 44 loài động vật khác nhau, bao gồm 5 nhóm có xương sống lớn là động vật có vú, chim, bò sát, lưỡng cư và các loài cá [251.

- Năm 2001, đe phân biệt nguồn gốc cùa các mẫu sinh học thuộc những loài có quan hệ gần gùi với nhau nhóm của Hsieh đã nghiên cứu và chỉ ra chi

với một đoạn trình tự gcn Cytb có chiều dài 273 bp cũng đù để đưa ra kết quả

- Matsuda và cộng sự (2005) đã chi ra răng có thể xác định nguồn gốc con người cùa một mẫu sinh học bang cách dựa vào việc khuếch đại một đoạn trình tự mtADN 119].

- Năm 2006, L Cainé và cộng sự nghiên cứu nhận dạng các mẫu sinh phẩm chưa rõ nguồn gốc dựa trên gen Cytb ờ Bồ Đào Nha 114].

- Năm 2007, Nakaki và cộng sự nghiên cứu nhận dạng một số loài động vật như người, chó, mèo bằng cách sử dụng kết hợp một phàn ứng mờ rộng mồi đơn[24].

Trong một số báo cáo đã chi ra rằng một đoạn trình tự dài khoảng 385

bp trên gcn Cytb có mặt một cách rộng rãi trong nhiều loài động vật có xương sống thuộc các nhóm khác nhau Một số chuyên gia khác còn sử dụng đoạn trình tự có chiều dài hơn 402 bp để xác định loài động vật và đoạn đó cho thấy sự khác biệt ít hơn 3% giữa bất cứ loài nào [29],

Trong khoa học pháp lý Cytb đã được ứng dụng chú yếu tập trung vào:

■ Phát hiện các sản phấm làm lừ thịt cùa các loài động vật bị cấm buôn bán theo công ước quốc tế buôn bán về động vật hoang dã.

■ Trong các nghiên cứu về phát sinh chùng loại.

Trên the giới, mới chi có một vài công bố cùa các tác giả về nghiên cứu

Cytb đế phát hiện nguồn gốc mầu từ người nhưng chưa có quy trình chuẩn.

1.4.2 Tinh hình nghiên cứu gen Cytb ở Việt Nam

Cho đến nay các nghiên cứu về về Cỵtb ớ Việt Nam vẫn chưa nhiều, các công trình nghiên cứu còn hạn chế, chi tập trung vào việc nghiên cứu đa dạng và bảo tồn một số loài động vật.

Các công trình nghiên cứu được cồng bố:

- Năm 2007, Nguyễn Anh và cộng sự nghiên cứu xác định trình tự gen

mã hóa Cytb cùa hệ gen ty thế và đánh giá mối quan hệ di truyền của một số

Tnu vien Viện Daiiioc Mợ Ha Nội

loài cá Song nuôi thã tại các vùng biên Việt Nam [1].

- Nãm 2008 Nguyễn Minh Tâm và cộng sự nghiên cứu trình tự Cytb của Sao la 131.

- Năm 2013, Nguyễn Mạnh Hà và cộng sự nghiên cứu khả năng sinh trướng và sự đa hình cũa gen Cytb của gà Bò và gà Mía phục vụ cho công tác

báo tồn giống [2].

Việc nghiên cứu gen Cytb là rất quan trọng, tuy nhiên ở nước ta lình

hình nghiên cứu về gen này còn hạn chế trên người, và một số loài động vật như bò chó, lợn Chính vì vậy đây là đề tài chủ yếu nghiên cứu về giãi trình

tự gen ADN ty the vùng Cytb từ đó ứng dụng trong giám định phân biệt ADN

ty thể người và một số động vật.

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Tôi tiến hành phân tích ADN trên các trường hợp đến giám định tại Viện Pháp y quốc gia và các mẫu ADN động vật thu thập tír các nguồn khác nhau như: mẫu máu, mẫu lông tóc, mẫu mô, mẫu xương.

- Cờ mầu: 35 mẫu.

* Tiêu chuẩn lựa chọn:

- Mầu ADN người: Thu thập mẫu máu, mẫu xương các trường hợp đến giám định ADN ty thể tại Viện Pháp y quốc gia (15 mẫu) Mầu được ký hiệu từNlCB đếnN15CB.

- Mầu ADN động vật: thu thập mầu máu, mẫu lông, mầu mô, mẫu xương từ các cơ sớ khác nhau trên địa bàn Hà Nội.

+ Bò: 10 mẫu (Ký hiệu mầu từ B1CB đến B10CB)

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

+ Lợn: 05 mẫu (Ký hiệu mầu từ L1CB đến L5CB)

+ Chó: 05 mầu (Ký hiệu mầu từ ChlCB đến Ch5CB)

+ Máy ly tâm lạnh (Hermle - Đức).

+ Máy ly tâm nhanh (Eppendorf- Đức).

+ Máy đo pH.

+ Nồi hấp tủ sấy (ALT - Nhật Bán).

+ Máy lắc ốn nhiệt (Labnet - Mỹ).

+ Máy đo nồng độ ADN (Genova Nano Spectrophotoneter Accessory - Bibby Scientific - Anh).

+ Máy PCR (Eppendorf - Đức).

+ Bộ điện di polyacrylamide (Thermo scientific).

+ Máy giải trình tự gen Applied Biosystems 3500 - Mỹ.

+ Các thiết bị khác tại Khoa Y - Sinh học, Viện Pháp y quốc gia.

Tùy theo từng loại mẫu: máu, mô hay xương sẽ tiến hành tách chiết ADN theo Quy trình giám định ADN [6].

Quy trình tách chiết đối với từng loại mẫu như sau:

Bước 1 Chuấn bị mẫu:

- Nếu vết máu khô trên thẻ lưu mẫu: Lấy dao tách khoảng % diện tích vòng tròn trên thẻ thành những mánh nhỏ cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng.

- Neu vết máu khô trên gạc hoặc vật chứa khác: cắt khoảng 0,5 cm2 vết máu khô thành từng mãnh nhở cho vào ống eppendorl’ 1.5 ml vô trùng.

- Neu máu tươi: Lấy khoảng 5 - 50 pl máu tươi cho vào ống eppendorf 1.5 ml vô trùng.

10 giây Để ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút.

đế làm sạch mẫu).

Bước 5 Bổ sung 150-200 pl dung dịch chclex 10%, 10-15 pl dung dịch

proteinase K (lOmg/ml).

Bước 6 Ù ở nhiệt độ 56°c trong 30-60 phút.

Bước 7 Đun sôi mầu trong 8 phút.

Bước 8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó hút dịch nồi

sang một ống eppendorf 1.5ml mới và báo quản ờ nhiệt độ -20°C.

eppendorf 1.5ml.

Bước 2 Bổ sung Iml đệm PBS vào trong ống eppendorf, vortex đều 5-

10 giây, Đe ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút.

Bước 3 Ly tâm ở nhiệt độ phòng 12.000 vòng/phút, 5 phút.

Bước 4 Hút bó dịch nổi, giữ lại cặn (Lặp lại bước 2-4 từ l đến 2 lần

để làm sạch mẫu).

proteinase K (10mg/ml).

Bước 6 ủ ở nhiệt độ 56°c trong vòng 30 - 60 phút.

Bước 7 Đun sôi mẫu trong 8 phút.

Bước 8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó hút dịch nối

sang một ống eppendorf 1,5ml mới và bảo quán ớ nhiệt độ -20°C.

Bước I Trích < 10 mg mẫu mô cho vào ống eppendorf 1.5 ml.

Bước 3 Cho thêm 20 pl proteinase K, vortex khoáng 15 giây.

mầu ly giái hoàn toàn.

Bước 5 Bo sung thêm 200 pl AL vortex khoảng 15 giây.

nhiệt độ phòng 15-25 °C trong 5 phút.

(trong ống 2 ml) Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bò ống chứa dịch.

Bước 9 Cho thêm 500 pl Buffer AWL Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột

sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch.

Bước 10 Cho thêm 500 rtl Buffer AW2 Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt

cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bở ống chứa dịch.

Bước 12 Đặt cột vào ống 1,5 ml Loại bỏ ống chứa dịch Cho thêm từ

20-100 pl dung dịch AE vào giữa trung tâm màng lọc.

tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút.

Tách chiết ADN bằng Qiamp® DNA micro kits

Bước 1 Chuẩn bị mẫu: Làm sạch mẫu bằng cơ học, sau đó dùng cưa cưa

nhó thành các miếng khoáng từ 2-3cm rồi nạo sạch phần phân hủy bên ngoài

và bên trong ống xương.

Bước 3 Rứa sạch EDTA bằng Nước cất khứ ion sau đó gọt xương bàng dao mổ thành những mẩu nhó cho vào ống eppendorf 1,5ml.

Bước 4 Bổ sung 500pl đệm ATL + lOOpl Proteinase K + 20pl DTT IM,

vortex 5 giây.

Bước 5 ủ ờ nhiệt độ 56°c, từ 10-12 giờ (hoặc qua đêm).

Bước 7 ủ ớ nhiệt độ 70°C/10 phút.

Bước 9 Chuyền toàn bộ dung dịch ly giải sang cột QIAamp MinElute

(trong ống 2 ml) Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch.

Bước 10 Cho thêm 500j.ll Buffer AW1 Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột

sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bò ống chứa dịch.

sang ống 2 ml vồ trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch.

Bước 12 Ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3 phút và để khô hoàn toàn.

20 - 100 pl dung dịch AE vào giữa trung tâm màng lọc.

- Chuẩn bị agarose gel 0,8 % (100 ml đệm TBE IX + 0,8 gram agarose).

- Đun sôi trong lò vi sóng, sôi 1 phút cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

- Đưa cốc agarose ra khói lò vi sóng, lắc kỳ Đe nguội còn 50 - 60°C.

- Tra hồn hợp 5-7 pl mẫu + 2 pil loading dye vào giếng.

- Chạy điện di trong đệm TBE 1X.

- Điện di sao cho ADN di động theo chiều từ cực âm đến cực dương (6 v/cm theo khoáng cách giữa hai điện cực).

- Quan sát mẫu nghiên cứu trên bàn soi gei và chụp ảnh.

Phàn ứng PCR được thực hiện bằng cặp moi 14816F và 15773R được thiết kế để khuếch đại vùng Cyth.

Bảng 1: Trình tự các cặp mồi dùng khuếch đại vùng Cytb

ADN khuôn (0.1-

0.3ng/|Xl)

0.1 -0.3ng/phản ứng

l-3pl Nước deion Bồ sung nước sao cho tồng thế tích đạt 25

pl

On định sản phẩm

Giữ mẫu

96°c - lOphút

95°C- Iphút 50°C - Iphút 72°c - Iphút

Chạy điện di phát hiện sàn phẩm PCR trên gel Polyacrylamide 6% [26]

Bảng 4: Thành phần hóa chất điện di.

+ 100 ml Ethanol 100% + nước cat den đũ 1 lít) trong 5 phút.

37% trong 10 phút.

+ Rửa trong nước cất khoáng 10 giây.

+ Ngâm trong dung dịch NaOH 15% có bổ sung 1,5 ml formaldehyde 37% đến khi hiện băng.

Bước 2: Chuẩn bị mẫu phân ứng.

Bước 3: Đặt cột vào ống thu, ghi tên mỗi mẫu sinh phẩm một cột Bước 4' Chuyến toàn bộ dung dịch cùa mẫu đã được chuẩn bị lên cột

và ú ớ nhiệt độ phòng trong 1 phút.

Bước 5: Ly tâm toàn bộ ống trong cột ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong

I phút Loại dịch qua cột Đặt cột lại ống thu.

Bước 6: Rửa cột bằng cách thêm 700pl dung dịch màng (đã được thêm

95% công 100°).

Bước 7: Ly tâm toàn bộ ống nghiệm trong 14.000 vòng/phút trong 1

phút.

Bước 8: Loại bỏ dịch qua cột, đặt cột lại ống thu.

Bước 9: Lập lại việc rửa bàng cách bổ sung 500 pl dung dịch rửa màng

Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút, ử ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút (đế bốc hơi het Ethanol còn dư).

Nuclease - Free Water (tra vào chính giữa cùa cột không đụng mũi pipet vào màng cột), ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút.

Bước 11: Bỏ cột, thu ống thu có chứa ADN Bào quân ớ 4D hoặc -20D.

Spectrophotometer Micro Volume Accessory (Bibby Scientific - Anh) Nồng độ ADN (ng/pl) = 50 X Độ hấp thụ ớ bước sóng 260.

Bảng 5: Thực hiện PCR vói BigDye Terminator kit 1121:

Ready Reaction Premix 2,5X 4 pl

BigDye Sequencing Buffer 5X 2pl

Lắc trên máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 25 phút.

Ly tâm nhanh, load mẫu lên khay mẫu, đưa khay vào máy giải trình tự gen.

I I Application Type [Sequ encing •! Capillary Length: 50 Polymei

I DyeSet |Z _ E Disable Name Fitter

Instrument Protocol Properties

• Run Module iUpidSeqjO.POP? I * Run Module im«rApilhry air only available rn the test.

H • Protocol Name YSH.Sequeang I Lotted _ _ J Description:

0vPnT.mpe.-o.eCO 60 RonVptar w<*» 1» p^v-urd**! » VoR.R.t™ «• 1» RunTime (.ee.j: lÓOoT RrnRon 1.™ <.«.» 90 Ton l.«l 3 1

Apply loAsay , Severn lev.01

tự này sè làm dữ liệu đầu vào cho phần mềm ApE dùng đề so sánh với trình

tự tham khảo trên ngân hàng gen quốc tế.

Các trình tự thao kháo sử dụng cho các loài: người, bò, chó, lợn lần lượt tưong ứng là: Homo sapiens (JN034136.1), Bos taurus (GU249573.1), Canis lupus (JF489119.1), Sus scrofa (ABO 15081.1).

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Đe tách chiết ADN đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng Phương pháp tách chiết ADN bằng chelex là phương pháp khá phổ biển để tách chiết ADN từ các mầu vật có nguồn ADN dồi dào như máu, mô, tóc Đối với mầu xương việc tách chiết ADN bang Qiamp DNA micro kits Chất lượng ADN thu được sau tách chiết và tinh sạch ảnh hưởng đến kết quà quá trình nghiên cứu Vì vậy, trong nghiên cứu này, các mầu ADN tông số sau khi tách chiết được điện di kiếm tra trên gel agarose 0,8%, tiến hành nhuộm với GeIRedIM Nucleic Acid Gel Stain (Biotium - Mỹ) và bàng ánh sáng lục trên bàn soi gel đế phát hiện băng của từng mầu.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Hình 7: Điện di ADN tổng số trên gel agarose 0.8%

Giếng số 1 - 8: ADN tổng số từ các mầu máu người (1,2), máu bò (3,4), máu chó (5,6) và máu lợn (7.8).

Giếng số 9: ADN tống số K562 (Promega - Mỹ).

Giếng số 10 - 13: ADN tống số từ các mẫu tóc người (10), mô bò (11), mô chó (12) và mô lợn (13).

Giếng số 14,15: ADN tồng số từ mẫu xương người.