Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có chất chuẩn nhằm bổ sung vào quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra và quản lí chất lượng dược liệu, chúng tôi tiến hành đề tài:
TỔNG QUAN
Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn)
Trong các phép thử định tính, định lượng, xác định tạp sử dụng các kỹ thuật: sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao, quang phổ hồng ngoại, quang phổ tử ngoại khả kiến, quang phổ huỳnh quang… đều dựa vào chất chuẩn.
Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học, vật lý và sinh học Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau [5]:
- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại
- Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang
- Các phép thử định tính tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký
- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật
- Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích trọng lượng
- Các phép thử sinh học
- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng
Các chỉ tiêu chung của chất đối chiếu bao gồm [12]:
- Mất khối lượng do làm khô
Trong những năm gần đây, một số chất chuẩn đối chiếu hóa học từ dược liệu với mức tinh khiết cao đã được sản xuất trên thế giới tại các nước như Mỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật Bản để phục vụ kiểm nghiệm dược liệu và thuốc đông dược Chất chuẩn quốc gia chiết xuất từ dược liệu được xem như tài sản quốc gia, không bán hoặc chỉ bán với mức giá rất cao, và quy trình thiết lập chuẩn thường được bảo hộ và giữ bí mật.
Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
Tam thất có tên khoa học là Panax notoginseng (Burk) F.H Chen, họ Nhân sâm (Araliaceae) Dược liệu tam thất là rễ củ đã phơi khô của cây tam thất
Tam thất là cây thuốc được trồng lâu đời ở Trung Quốc, phân bố chủ yếu tại tỉnh Vân Nam Hiện nay người ta biết có khoảng 14 loài Panax trồng và mọc hoang Ở Việt Nam, cây Tam thất được trồng ở các tỉnh giáp biên giới với Vân Nam, như Lào Cai.
Đây là một loại cây thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 0,5 m với thân đơn; lá kép hình chân vịt, cuống lá dài, mỗi lá thường có 3-5 lá chét, mép lá khía răng cưa nhỏ, trên gân chính có lông cứng biến thành gai Cụm hoa tán đơn có màu xanh nhạt; quả khi chín màu đỏ và hạt hình cầu Có thể xuất xứ từ Vân Nam và được ghi nhận ở các địa phương như huyện Mường Khương, Bát Xát, Cao Bằng (Thông Nông) và Hà Giang (Đồng Văn).
Bộ phận dùng: Rễ (Radix)
Thu hoạch và chế biến cây thường diễn ra sau 4–5 năm, có khi đến 7 năm mới thu hoạch Củ được thu hái vào mùa thu trước khi cây ra hoa, đào lên, rửa sạch, tách riêng rễ và nhánh, rồi phơi sấy cho đến khô với độ ẩm khoảng 12% [3], [10].
Tính vị, quy kinh: Vị đắng, hơi ngọt, tính ấm Quy vào 2 kinh can, thận
Hoá ứ chỉ huyết là phương pháp dùng khi xảy ra chảy máu, gồm các trường hợp như chảy máu do bị thương, ho ra máu, chảy máu cam và băng huyết; đồng thời áp dụng khi sau sinh huyết nhiều hoặc khi vừa có ứ huyết vừa xuất huyết.
Hóa ứ chỉ thống: dùng trong các trường hợp huyết ứ mà dẫn đến đau đớn, các trường hợp chấn thương, sưng đau do huyết tụ
Hóa ứ tiêu ung nhọt: dùng trong huyết ứ hoặc ung nhọt sưng đau Ngoài ra còn dùng khi bị rắn độc [4][10]
Thành phần hóa học chính của Tam thất là các saponin thuộc nhóm dammaran, chiếm 4,4–12% tổng hợp, với phần aglycon gồm hai chất 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)-protopanaxatriol như ở Nhân sâm Các saponin thường gặp trong rễ củ Tam thất là các hợp chất dammaran có cấu trúc aglycon tương tự như Nhân sâm.
- Các saponin có phần aglycon là 20(S) protopanaxadiol: G-Rb1, G-Rb2, G-Rd, Gy- XVII, N-R4, N-Fa
- Các Saponin có phần aglycon là 20(S) protopanaxatriol: G-Re, G-Rg1, G-Rg2, G- Rh1, 20Glc-G-Rf, N-R1, N-R2, N-R3, N-R6
Trong đó các saponin chính là N-R1, G-Rg1, G-Re, G-Rb1, G-Rc, G-Rb2, G- Rb3 và G-Rd
Các bộ phận khác của cây như rễ con, lá hoa đều có saponin nhóm dammaran
Hàm lượng saponin toàn phần trong Tam thất là cao nhất trong số các loài panax sử dụng làm thuốc Saponin toàn phần trong củ có thể lớn hơn 8% [3]
1.2.2 Nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất
Tam thất chứa saponin toàn phần được điều chế từ nguyên liệu chính là rễ và thân rễ của loài Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen, và được quy định trong Dược điển Trung Quốc.
Quy trình bắt đầu bằng nghiền nhỏ dược liệu, đun hồi lưu với ethanol 70% để chiết xuất, lọc lấy dịch chiết và thu hồi dung môi bằng chân không Dịch chiết được đưa lên cột sắc ký đã nhồi sẵn chất hấp phụ vô polar hoặc phân cực yếu, mang là styrene đồng trùng hợp, rửa giải bằng nước và ethanol 80% Loại bỏ nước, giữ lại dung dịch rửa giải ethanol 80%, rồi bốc hơi ở điều kiện chân không đến khi khô.
Về cảm quan, nguyên liệu có màu gần trắng hoặc vàng nhạt, vị đắng nhẹ và hơi ngọt
Trong phép thử định lượng thành phần Saponin toàn phần của tam thất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hàm lượng tối thiểu các thành phần saponin được xác định như sau: Re không ít hơn 2,5%, R1 không ít hơn 5%, Rg1 không ít hơn 25%, Rb1 không ít hơn 30%, Rd không ít hơn 5%, và tổng các saponin Re, R1, Rg1, Rb1 và Rd chiếm tối thiểu 75% tổng saponin toàn phần.
1.2.3 Tổng quan về nhóm hoạt chất saponin triterpenoid nhóm Dammaran
Nhóm dammaran có aglycon gồm 4 vòng: A, B, C (6 cạnh), D (5 cạnh) và mạch nhánh 8 carbon Do có nhóm OH đính vào C-20, khi tác dụng với axit mạch nhánh dễ bị đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, ví dụ phản ứng oxy hóa bằng iodat, người ta thu được hai genin chính của saponin Nhân sâm là protopanaxadiol và protopanaxatriol Phần đường liên kết với OH ở carbon C-3 hoặc C-20 để tạo thành glycoside.
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của genin 20(S)
Các saponin điển hình của nhóm này là các saponin phân lập được trong nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng)
1.2.4.1 Đặc điểm và tính chất
17-[(2S)-6-methyl-2-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl) oxan-2- yl] oxyhept-5-en-2-yl]-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H- cyclopenta[a]phenanthren-6-yl] oxy]-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl) oxan-3-yl] oxy-6-methyloxane-3,4,5-triol
- Re có công thức hóa học như sau:
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Re
+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà
+ Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol và methanol Độ tan trong nước là 1 mg/ml Tan trong DMSO
+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203nm
1.2.4.2 Tác dụng dược lý của G-Re
G-Re là phối tử chức năng của thụ thể glucocorticoid (GR) Nó có thể hoạt động như một chất chủ vận một phần đối với GR, ức chế sự liên kết của dexamethasone—một glucocorticoid tổng hợp—với GR, và có thể chuyển vị 100% khi ginsenoside dư thừa [14].
+ Ginsenoside Re, một phytosterol chính của Panax ginseng, ức chế sự tích tụ
Trong quá trình thiếu máu cục bộ cơ tim và tái tưới máu, Ca2+ tích tụ trong ty thể là kết quả của sự ức chế kênh Ca2+ do nitric oxide (NO) gây ra, đồng thời K+ kích hoạt các kênh trong tế bào cơ tim để điều chỉnh dòng Ca2+ và chức năng của tế bào cơ tim trong giai đoạn này.
Ginsenoside Re kích hoạt tổng hợp NO nội mô qua eNOS để giải phóng NO, từ đó kích hoạt dòng chỉnh lưu K+ chậm Sự kích hoạt của eNOS diễn ra qua đường dẫn phi gen của các thụ thể androgen, thụ thể estrogen-alpha và thụ thể progesterone, trong đó tín hiệu được kích hoạt theo trình tự: c-Src kích hoạt PI3K, sau đó Akt và cuối cùng là eNOS [20].
Tổng quan về phương pháp phân lập, tinh chế
Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau:
- Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa lẫn nhau
- Tách bằng sắc ký cột
- Tách qua cột sắc ký nhiều lần với chất hấp phụ là polyamid, cellulose, silica gel, C-18, sephadex LH-20,
- Kết tinh lại trong dung môi thích hợp
- Tách bằng sắc ký lỏng điều chế [6], [19].
Tổng quan một số phương pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 6 1 Sắc ký cột
Trong sắc ký cột, pha tĩnh được nén vào ống cột và pha động chảy qua nhờ áp suất hoặc trọng lực Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động và đưa vào đầu cột; khi pha động liên tục được bổ sung, nó đẩy mẫu di chuyển xuống theo chiều cột và tiến hành phân bố giữa hai pha Sự khác biệt về vận tốc di chuyển giữa các thành phần làm cho chúng phân tách thành các vùng riêng biệt dọc theo cột Quá trình tách hoàn tất khi đủ lượng pha động được thêm vào cột để các thành phần tách ra hoàn toàn và có thể thu hồi [1].
Cột thủy tinh là ống hình trụ bằng thủy tinh, có chiều dài từ 30 tới 70 cm và đường kính từ 1 tới 5 cm; ở đầu dưới có vòi thủy tinh có khóa để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi.
1.4.1.3 Hóa chất dùng làm cột
+ Cột phân bố: Các chất dùng làm cột phân bố là: xenlulose, kieselguhr (cellite), gel của acid silic không hoạt hóa
+ Cột hấp phụ: Các chất thường dùng là: oxid nhôm, silica gel, polyamid, CaCO3, MgO, than hoạt
Trong sắc ký cột, các hóa chất dùng cho hệ thống phân tích phải được chuẩn hóa để dễ sử dụng và đảm bảo độ tin cậy của kết quả Ví dụ, silica gel 60 Merck được quy định kích thước hạt từ 0,063–0,200 mm nhằm tạo sự đồng đều của pha rắn trong cột Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm trong cột, hình thành một khối đồng nhất và ổn định cho hiệu suất sắc ký.
Trong sắc ký cột, nhiều dung môi và hệ dung môi theo tỷ lệ quy định có thể được dùng cho quá trình tách chất Tuy nhiên, đối với các dung môi có độ sôi quá thấp (ether), hoặc có mùi khó chịu, hoặc độc hại, không nên dùng làm dung môi rửa trong loại sắc ký này.
Các dung môi thường dùng trong sắc ký cột là: n-hexan, cloroform, aceton, ethanol, methanol, butanol, nước
Sau khi rửa giải, dụng cụ dùng để hứng là ống nghiệm (thường là 20 ml) Các ống nghiệm được đánh số từ 1 trở đi và sắp xếp sẵn trong các giá theo thứ tự để khỏi nhầm lẫn trong quá trình tập hợp Các phân đoạn sau khi phân tích và tập hợp chung, tùy theo thể tích mỗi phân đoạn mà xử lý bằng cách cất thu hồi trong bình cầu ở áp suất giảm hoặc cho bốc hơi tự nhiên trên nồi cách thủy.
1.4.1.5 Ứng dụng Ứng dụng chủ yếu của phương pháp sắc ký cột là tách các chất ra khỏi hỗn hợp Tùy thuộc bản chất của chất phân tích để lựa chọn cột tách và pha động rửa giải thích hợp với mục đích thu được chất phân tích có độ tinh khiết cao
* Định tính, định lượng, đánh giá độ tinh khiết và xác định cấu trúc
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là một kỹ thuật sắc ký trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được trải thành lớp mỏng, mịn và đồng nhất trên nền thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo; pha động là một hệ dung môi đơn chất hoặc hỗn hợp dung môi được phối hợp với nhau theo tỉ lệ xác định Quá trình sắc ký diễn ra khi pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt các chất cần tách; trong suốt quá trình di chuyển, các thành phần của mẫu thử di chuyển theo hướng của dung môi động với các tốc độ khác nhau dẫn đến sự tách và phân bố khác nhau trên lớp mỏng Kết quả thu được sắc ký đồ trên lớp mỏng, nơi các thành phần của mẫu thử phân bố dọc theo đường đi của dung môi động Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hoặc phối hợp nhiều cơ chế [1], [5], [11].
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu chất phân tích có màu) hoặc soi tử ngoại ở các bước sóng 254 nm, 366 nm, hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng bằng densitometer — một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích Tùy thuộc bản chất của chất cần phân tích, ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích [1].
1.4.2.2 Các đại lượng đặc trưng
Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong sắc ký Nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách di chuyển của pha động trên bề mặt tách chất, cho phép so sánh mức độ di chuyển giữa các chất dưới cùng điều kiện Giá trị Rf thường nằm trong khoảng từ 0 đến 1 và phụ thuộc vào dung môi, thành phần pha động và đặc tính của chất phân tích Việc đo Rf giúp nhận diện và phân tích các hợp chất một cách nhanh chóng, đồng thời hỗ trợ tối ưu hóa điều kiện sắc ký và đánh giá tính đồng nhất của mẫu.
Trong phân tích, dR là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết phân tích, được đo bằng centimet (cm) dM là khoảng cách từ điểm xuất phát tới mức dung môi pha động, đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng centimet (cm) Hai tham số này xác định vị trí của vết phân tích và mức dung môi trong quá trình phân tích bằng dung môi pha động, đồng thời ảnh hưởng đến độ chính xác và khả năng so sánh kết quả giữa các lần đo.
Rf có giá trị từ 0 đến 1
Việc ổn định giá trị Rf phụ thuộc vào nhiều yếu tố và gặp nhiều khó khăn về mặt kỹ thuật Vì vậy, quá trình phân tích thường được tiến hành song song với chất chuẩn và trong cùng điều kiện sắc ký để bảo đảm tính nhất quán của kết quả Việc đồng thời sử dụng chất chuẩn với điều kiện sắc ký tương tự giúp giảm biến động và nâng cao tin cậy của phân tích Rf.
Dựa vào giá trị Rf, mỗi hệ dung môi pha động có một giá trị Rf đặc trưng Trong định tính, kết quả Rf được so sánh với chất chuẩn đã chạy sắc ký ở cùng điều kiện để nhận diện chất phân tích.
SKLM (Sắc ký lớp mỏng) được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng cách quan sát các vết lạ xuất hiện ngoài vết chính khi khai triển dung dịch mẫu trên các hệ dung môi khác nhau Đây là một ứng dụng rất phổ biến của SKLM, giúp nhận diện tạp chất và đánh giá mức độ tinh sạch dựa trên sự phân tách và vị trí của các vết trên đĩa sắc ký.
Bằng các biện pháp chính xác hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể áp dụng SKLM để định lượng
1.4.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tách chất phân tích bằng cách chúng di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển của các chất phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa pha tĩnh và pha động, tức là ái lực tương đối của chúng đối với hai pha Vì thế, thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột được xác định bởi các yếu tố này Thành phần pha động cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.3.2 Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký
Thời gian lưu (tR) là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký cho đến khi nó được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó Thời gian lưu cung cấp thông tin định tính trên sắc ký đồ của một chất tan trong điều kiện sắc ký đã được thiết lập, phản ánh đặc tính di chuyển và tương tác của chất với pha trong hệ thống sắc ký và giúp nhận diện chất dựa trên tR ở điều kiện sắc ký nhất định.
Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế Re
Re dễ tan trong dung môi phân cực như ethanol và methanol, nên thường dùng ethanol hoặc methanol làm dung môi chiết xuất và kết hợp các phương pháp chiết lỏng-lỏng, siêu âm, cô đặc và kết tinh để tối ưu quá trình tách chiết Để phân lập Re, người ta thường áp dụng phương pháp sắc ký cột với các pha tĩnh khác nhau, điển hình như silica gel pha thường và silica gel pha đảo, nhằm tăng độ tinh khiết và hiệu quả tách Re khỏi các hợp chất nhiễu.
1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Theo Dược điển Việt Nam, chuyên luận Tam thất (Radix Panacis notoginseng) hiện ở mức độ khá đơn giản, tập trung vào các chỉ tiêu cơ bản như mô tả, vi phẫu, bột, định tính (phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng), độ ẩm, tro toàn phần và chất chiết có trong dược liệu; vẫn chưa có chỉ tiêu định lượng [5].
Nghiên cứu năm 2016 của Nguyễn Thị Thúy và cộng sự đã tiến hành chiết xuất và phân lập các thành phần hoạt chất của củ tam thất (Panax notoginseng) trồng ở Tây Bắc Việt Nam, trong đó các hợp chất chính được xác định là G-Rg1, G-Rb1, G-Re, G-Rd và G-Rc [9].
Mẫu củ Tam thất (500 g) sau khi rửa sạch, phơi khô, xay nghiền nhỏ được chiết bằng ethanol, sau đó tách phân bố bằng hexan, ethyl acetate, butanol Tiến hành tách sắc ký cột phân đoạn chiết butanol (40 g) trên cột silica gel và rửa giải bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần gồm diclorometan – methanol (20:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL), thu được 5 phân đoạn ký hiệu là F1–F5 Từ phân đoạn F2 (3,3 g) chạy sắc ký cột silica gel với hệ pha động cloroform – methanol – nước (5:1:0,1, v/v/v, 2,5 L) thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn là F2.1–F2.4, và tinh chế phân đoạn nhỏ F2.2.
(380 mg) bằng sắc ký cột pha đảo YMC C-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải methanol – nước (6:5, v/v, 1,5 L) thu được hợp chất Re (65 mg)
Năm 2017, Bùi Thị Thu Hà và các cộng sự tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn n-butanol từ cao chiết 80% methanol của rễ củ tam thất, trước và sau khi chế biến Qua phân tích, nhóm đã phân lập được các ginsenosid Rg1, Re, Rd, Rb1, Rg3 và Rh1 từ phân đoạn này, làm sáng tỏ sự biến đổi thành phần hóa học do chế biến và xác định các hợp chất ginsenoside quan trọng của tam thất.
Phõn tỏch cao n-BuOH (30 g) bằng sắc kớ cột silica gel (40-60 àm) và giải hấp phụ bằng hệ dung môi gradient diclorometan – methanol (100% – 30%, v/v), thu được
7 phân đoạn (P1 – P7) Phân đoạn P3 (3,57 g) được rửa bằng dung môi aceton sau đó kết tinh lại thu được ginsenosid Re (77 mg)
Qua tham khảo các tài liệu cho thấy đến nay ở nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào về phân lập và tinh chế Ginsenoside Re từ nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất nhằm làm chất chuẩn Điều này cho thấy tiềm năng nghiên cứu trong lĩnh vực phân tích và dược liệu, đồng thời gợi ý hướng đi để xây dựng quy trình phân lập và tinh chế Ginsenoside Re từ tam thất, tăng tính chuẩn hóa và hỗ trợ ứng dụng chất chuẩn cho phân tích chất lượng.
1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước
Các Saponin nhóm dammaran có mặt trong tam thất đã được nghiên cứu và chiết tách khá nhiều và từ rất sớm
Năm 1999, Wei Guang Ma cùng cộng sự đã phân lập được các saponin trong đó có Re từ rễ tam thất khô được trồng ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc [22]
Rễ khô (119 g) được tán thành bột, sau đó chiết bằng methanol nóng dưới áp suất giảm, thu được 10 g cặn Cặn này được rửa bằng nước để loại bỏ tạp chất, loại bỏ chất béo bằng hexan và tiếp tục chiết bằng n-butanol Lấy lớp butanol, cô khô để thu phân đoạn glycosidic thô Phân đoạn glycosidic thô được sắc ký trên cột nhựa polymer có độ xốp cao Diaion HP-20 (Nippon Rensui Co.), rửa giải bằng methanol 10%, 30%, 60% trong nước, sau đó là methanol để cho 4 phân đoạn (1–4) Phân đoạn 3 (methanol 60%, khoảng 4 g) được tách ra trên cột silica gel và rửa giải với hệ chloroform – methanol – nước (7:3:0,5), thu được Rg1 tinh khiết (1 g) và bảy phân đoạn (B1–B7) Tinh chế lại phân đoạn B2 trên cột Lobar sắc ký RP-18 (40–63 μm, 1,5 × 15 cm, Merck) với hệ methanol – nước 1:1 để thu được các hợp chất tinh khiết, gồm 35 mg R1 và 12 mg của một hợp chất tinh khiết khác.
In 2012, Kouichi Yoshizaki and Shoji Yahara isolated triterpenoid saponins from the leaves of Japanese ginseng, including two novel compounds, chikusetsusaponin LM1 and chikusetsusaponin LM2, along with three known saponins—ginsenoside Re, ginsenoside Rg1, and ginsenoside F3 [15].
Lá khô của P japonicus (106,8 g) được chiết bằng dung dịch MeOH 50% nóng và sau đó bằng MeOH nóng, làm bay hơi dung môi ở áp suất giảm được dịch chiết methanol (36,7 g); dịch chiết methanol (36,7 g) được đưa lên cột sắc ký pha đảo gel polystyrene [nước → methanol – nước (độ phân cực giảm dần) → methanol] để phân đoạn 1 đến 9 Phân đoạn 2 (3025 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo [methanol – nước (độ phân cực giảm dần) → methanol] cho 19 phân đoạn Phân đoạn 3 (2580 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo [methanol – nước (độ phân cực giảm dần) → methanol] cho 22 phân đoạn Phân đoạn 4 (3,1 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo [methanol – nước (độ phân cực giảm dần) → methanol] cho 18 phân đoạn Phân đoạn 5 (1745 mg) được tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo [methanol – nước (độ phân cực giảm dần) → methanol] để có 24 phân đoạn Phân đoạn 2 – 15 (342 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thuận [chloroform – methanol – nước (7:3:0,4, v/v/v)] cho ginsenoside Rg1 (4,79 mg) và ginsenoside Re (3,189 mg) Phân đoạn 2 – 16 (156 mg) được trộn với phân đoạn 3 – 7 (184 mg) và được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thuận [chloroform – methanol – nước (8:2,5:0,2, v/v/v)] cho ginsenoside Rg1 (4,51 mg) và ginsenoside Re (3,139 mg).
Trong năm ấy, hai tác giả trên đã phân lập saponin từ quả của cây P japonicus được thu hoạch ở các vùng khác nhau [16] Quá trình phân lập cho thấy sự xuất hiện của các saponin khác nhau tùy theo vùng trồng, cho phép so sánh thành phần hóa học của quả từ từng địa phương Cụ thể, họ đã thực hiện phân tích và mô tả các loại saponin được chiết xuất từ quả P japonicus, từ đó làm sáng tỏ đặc điểm thành phần hóa học và tiềm năng ứng dụng của chúng trong dược liệu.
Quả khô của P japonicus thu hái ở tỉnh Kumamoto (17,6 g) được chiết bằng methanol nóng ở 50% và sau đó bằng methanol nóng ở 90%, tạo dịch chiết methanol (4,0 g) sau khi bay hơi dưới áp suất giảm; dịch chiết này được đưa lên cột sắc ký gel polystyrene pha đảo (H2O → MeOH – H2O, 30:70 → 40:60 → 50:50 → 60:40 → 70:30, v/v → MeOH) để cho phân đoạn 1–8 Phân đoạn 5 (615 mg) được tách bằng cột silica gel pha đảo (MeOH – H2O, 50:50 → 55:45 → 60:40 → 65:35 → 70:30 → 75:25, v/v) để cho 17 phân đoạn Phân đoạn 5-3 (96 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường (CHCl3–MeOH – H2O, 8:2,5:0,2, v/v) để tạo ra 7 phân đoạn Phân đoạn 5-3-4 (63 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo (MeOH – H2O, 51:49 → 52:48 → 53:47, v/v) để thu được ginsenoside Re (12,57 mg).
Phân lập saponin từ quả tươi của P japonicus thu hái ở tỉnh Miyazaki (34 g) được thực hiện bằng chiết MeOH 60% trong nước, tiếp đến bằng MeOH nóng; quá trình cô quay dưới áp suất giảm đã thu được dịch chiết methanol 4,3 g Dịch chiết methanol (4,3 g) được đưa lên sắc ký cột gel polystyrene pha đảo với hệ [H2O → MeOH – H2O (30:70 → 40:60)].
→ 70: 30, v / v) → MeOH] để đưa ra phân đoạn từ 1 đến 7 Phân đoạn 4 (235mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo [MeOH – H2O (70:30, v / v)] để cho
Phân đoạn 4-2 (143 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo [MeOH – H2O (60:40 → 63:37, v/v) → MeOH] để tạo ra 6 phân đoạn Phân đoạn 4-2-1 (72 mg) tiếp tục được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường [CHCl3 – MeOH – H2O (7:3:0,5 → 7:3,2:0,5, v/v)], thu được ginsenoside Rg1 (13,3 mg) và ginsenoside Re (12,25 mg).
Năm 2014, trong một nghiên cứu khác, Li-feng Han và cộng sự đã đề xuất quy trình phân tách và tinh chế saponin trong tam thất Rễ khô (5 kg) được chiết hồi lưu với ethanol 70%, thu được 480,2 g dung dịch chiết Dung dịch này hòa tan vào nước, cho qua cột D101 CC, rửa giải lần lượt bằng nước, sau đó là ethanol 50% và cuối cùng là ethanol; dịch ethanol được hứng và cô đặc thành cặn khoảng 120 g Cặn này được đưa qua cột silica gel, rửa bằng cloroform, sau đó thực hiện phân giải với hệ chloroform – methanol (100:3→100:7) rồi hệ chloroform – methanol – nước (10:3:1→7:3:1→6:4:1, lớp dưới), thu được các phần tinh chất.
Trong quá trình phân tích, có 12 phân đoạn được tách lần lượt bằng silica gel pha đảo C18 CC và silica gel CC kết hợp với sắc ký điều chế, cho thu được 20 saponin khác nhau Phân đoạn 10 (3,6 g) sau khi cho qua cột bằng silica gel pha đảo C18 CC, silica gel CC và sắc ký điều chế thu được G-Re (108,1 mg).
Qua các tài liệu tham khảo được, chúng tôi dự kiến đưa ra quy trình thực nghiệm phân lập và tinh chế Re như sau:
Vài nét về phân tích định lượng ginsenosid Re
Hiện nay có nhiều bài báo cũng như dược điển đưa ra phương pháp phân tích xác định sự có mặt của G-Re trong dược liệu, các chế phẩm đông dược cũng như trong các dịch sinh học Các kỹ thuật phân tích đã được áp dụng để xác định sự có mặt của
Ngành sắc ký hiện nay rất đa dạng, từ những kỹ thuật đơn giản như sắc ký lớp mỏng đến các phương pháp phức tạp hơn như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector khác nhau Trong thực tế, một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến là HPLC kết hợp detector DAD, cho phép xác định sự có mặt của G-Re một cách chính xác với lượng mẫu phân tích tối thiểu và có thể áp dụng rộng rãi tại hầu hết các phòng kiểm nghiệm Dưới đây là một số chương trình sắc ký tham khảo để phân tích G-Re.
Bảng 1.1: Một số điều kiện phân tích Re
Tác giả Cột sắc ký Pha động Tốc độ dòng
Thời gian (phút) Acetonitrile (%) Nước (%)
1ml/phút UV (203nm) Không
Thời gian (phút) Acetonitrile (%) Nước (%)
Prontosil C18 Aqua, 5 àm, 250 x 2,0 mm (Bischoff, Leonberg, Germany)
Thời gian (phút) Acetonitrile (%) Nước (%)
Zorbax SB-C18 (250mm×4,6mm i.d., 5àm) hoặc Zorbax SB- C18
Nước (A) and acetonitrile (B) với chương trình gradient như sau:
Quy trình thiết lập chuẩn đối chiếu DĐVN
Quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu DĐVN do VKNTTƯ xây dựng dựa trên quy chuẩn thiết lập chất chuẩn trên thế giới nhằm đảm bảo tính chuẩn xác và đồng nhất trong quá trình kiểm nghiệm Các bước chính gồm: xây dựng quy chuẩn kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu, đánh giá nguyên liệu, đóng gói chất đối chiếu, kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói, kiểm tra thành phẩm và đánh giá liên phòng thí nghiệm, xử lý số liệu, lập hồ sơ, chứng chỉ, dán nhãn, bảo quản và kiểm tra định kỳ [12].
1.7.1 Xây dựng thường qui kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu
Quy trình kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu bao gồm các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử dùng để kiểm tra chất lượng của chất chuẩn đối chiếu Quy trình được xây dựng nhằm đánh giá nguyên liệu làm chất chuẩn, kiểm tra độ đồng nhất, đánh giá thành phẩm, thực hiện đánh giá liên phòng thí nghiệm và tiến hành kiểm tra định kỳ chất chuẩn đối chiếu để đảm bảo tính ổn định và tin cậy của kết quả đo lường.
1.7.2 Đánh giá nguyên liệu Đánh giá nguyên liệu được tiến hành theo thường qui kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu Yêu cầu nguyên liệu dùng để sản xuất chất đối chiếu phải đạt các qui định trong thưởng qui kỹ thuật thiết lập chất đối chiếu đó
1.7.3 Đóng gói chất chuẩn đối chiếu
Chuẩn bị buồng đóng và vệ sinh dụng cụ đóng lọ, bao gồm phễu, cơi thủy tinh, thìa xúc, lọ thủy tinh và lọ đựng nguyên liệu, phải được làm sạch; lau toàn bộ mặt trong của buồng đóng bằng ethanol 96% nhằm đảm bảo an toàn, khử khuẩn và hiệu quả cho quy trình đóng.
Chuẩn bị lọ trước khi đóng, đánh số thứ tự từng lọ để đảm bảo sự ổn định trong buồng đóng Đóng lọ ở nhiệt độ khoảng 25 °C, độ ẩm tương đối trong buồng đóng đạt 0–10% Dùng thìa và dụng cụ thủy tinh để phân phối nguyên liệu vào từng lọ với lượng đóng đủ cho các phép thử Đậy nút ngay sau mỗi lần đóng lọ.
1.7.4 Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói
- Lấy mẫu: số lượng lọ lấy để đánh giá độ đồng nhất ít nhất là n +1 (n là tổng số lọ | đóng được) hoặc lấy ít nhất 10 lọ
- Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói: Xác định hàm lượng của hoạt chất trong từng lọ theo thưởng qui kỹ thuật thiết lập chất chuẩn
+ RSD giữa các lọ < 1,0%; điều kiện đóng gói ổn định, lô sản xuất đồng nhất
+ RSD giữa các lọ > 1,0%; tiến hành lấy mẫu lại để kiểm tra
- PTN 1: Kiểm tra đầy đủ các chỉ tiêu chất lượng
- PTN 2: Kiểm tra chỉ tiêu định lượng
- Xử lý kết quả phân tích trong từng PTN: loại giá trị thô, tính giá trị trung bình, RSD
- Đánh giá kết quả phân tích 2 PTN: áp dụng test-F và test-T
- Tính giá trị công bố trên CoA của chất chuẩn và độ không đảm bảo đo của giá trị công bố.
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Nguyên liệu của đề tài là saponin toàn phần chiết từ tam thất, được mua trên thị trường Để đánh giá chất lượng, mẫu được kiểm tra sự có mặt của ginsenoside Re và tiến hành định lượng sơ bộ hàm lượng G-Re theo chuẩn DĐTQ 2015 bằng phương pháp HPLC, nhằm xác định mức tồn tại và nồng độ của G-Re trong saponin toàn phần.
- Tên La tinh: Panax Notoginsenosides
- Công ty sản xuất: World-Way Biotech InC (Trung Quốc) Địa chỉ: Room 2901, 1st Building of Vaya Garden, 35 Melin street, Yuhua District, Changsha, 410019, China
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi sử dụng các thiết bị và dụng cụ được quản lý theo hệ thống quản lý chất lượng đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Hóa Học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm các thiết bị được kiểm định, hiệu chuẩn và bảo dưỡng định kỳ để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Xevo TQD (Waters)
- Máy đo phổ hồng ngoại NILOLET LEXUSB 670FT-IR
- Cân kỹ thuật SARTORIUS BSA 224S
- Cân phân tích METTLER TOLEDO GmbH MS105 (d = 0,01mg)
- Tủ bảo quản lạnh TOSHIBA
- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S100
- Cột sắc ký Inertsil RP – 18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)
- Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck)
- Bản mỏng Silica gel 60 RP - 18 F254S (Merck)
- Silica gel nhồi cột cỡ hạt 63- 200 àm (Merck)
- Silica gel RP – 18 nhồi cột cỡ hạt 75 àm (YMC)
- Silica gel RP – 18 nhồi cột cỡ hạt 150 àm (YMC)
- Nồi cỏch thủy, bộ cất quay chõn khụng BĩCHI V-850
- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45 μm
- Bộ dụng cụ sinh hàn
- Pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác
2.1.2.2 Dung môi, hóa chất Đạt tiêu chuẩn phân tích, đáp ứng yêu cầu sử dụng trong phòng thí nghiệm đạt chứng nhận về hệ thống quản lý chất lượng theo ISO/IEC 17025 và GLP:
Bảng 2.1: Dung môi, hóa chất sử dụng cho đề tài
TT Tên dung môi, hóa chất
1 Ethanol tuyệt đối Merck Tinh khiết phân tích
2 Cloroform Merck Tinh khiết phân tích
3 Methanol Merck Dùng cho HPLC
4 Ethanol Merck Tinh khiết phân tích
5 Ethyl acetat Merck Tinh khiết phân tích
6 Acid sulfuric Merck Tinh khiết phân tích
7 Acetonitril Merck Dùng cho HPLC
8 Nước cất Viện Kiểm Nghiệm Dùng cho HPLC
9 Dicloromethan Merck Tinh khiết phân tích
10 Aceton Merck Tinh khiết phân tích
Bảng 2.2: Chất chuẩn sử dụng cho đề tài
Chuẩn Nguồn gốc Số lô Hàm lượng
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Phân lập và tinh chế ginsenosid Re từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất
- Nghiên cứu tìm quy trình phân lập và tinh chế G-Re từ nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất
- Phân lập và tinh chế G-Re
2.2.2 Định tính, định lượng đánh giá độ tinh khiết và xác định sơ bộ cấu trúc của chất chiết được
- Xác định sơ bộ cấu trúc của G-Re tinh chế được
- Đánh giá độ tinh khiết của G-Re tinh chế được
- Định tính, định lượng G-Re tinh chế được.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp phân lập và tinh chế Re từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất
Phân lập thô được thực hiện bằng cách hòa tan mẫu thử trong methanol, sau đó phân lập bằng phương pháp sắc ký cột pha thuận với pha tĩnh silica gel Merck và khảo sát hệ dung môi chạy cột thích hợp; các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) để xác định phân đoạn chứa G-Re, phân đoạn này được chọn và đem bốc hơi chân không để thu được cặn khô; kiểm tra G-Re.
Phân lập G-Re được thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), sau đó mẫu được so sánh với chuẩn G-Re về giá trị Rf và màu sắc của vết thu được Hàm lượng G-Re phân lập được được xác định bằng HPLC để định lượng chính xác nồng độ của hợp chất này trong mẫu.
Mẫu thử được hòa tan bằng methanol và phân lập bằng phương pháp sắc ký cột pha đảo với hạt C18 của Merck làm pha tĩnh, đồng thời khảo sát hệ dung môi chạy cột để tối ưu Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, lựa chọn phân đoạn chứa G-Re và tiến hành bay hơi chân không để thu được khô Phân đoạn đã phân lập được kiểm tra bằng TLC và so sánh với chuẩn G-Re về giá trị Rf và màu sắc vết thu được Hàm lượng G-Re phân lập được xác định bằng HPLC.
Mẫu thử được hòa tan trong methanol, sau đó được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là hạt C18 của YMC, nhằm khảo sát hệ dung môi chạy cột thích hợp Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC); lựa chọn phân đoạn chứa G-Re và tiến hành bốc hơi chân không để lấy khô Phân tích G-Re tinh chế được bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chuẩn G-Re về giá trị Rf và màu sắc vết thu được Hàm lượng G-Re tinh chế được xác định bằng HPLC.
Các phương pháp sử dụng trong phân lập và tinh chế được ghi trong bảng sau:
Bảng 2.3: Các phương pháp phân tích G-Re sử dụng trong đề tài Điều kiện sắc ký lớp mỏng (SKLM) Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp pha thuận (DĐVN V) [40]
- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)
-Phát hiện vết: dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol, sấy ở 105 0 C trong 5 phút
- Cột sắc ký RP-18, 5àm (25cm x 4,6 mm)
- Detector diode array với bước sóng phát hiện 203 nm
Pha động: Acetonitril – nước theo chương trình gradient:
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Bản mỏng silica gel 60 RP-18 F254
-Phát hiện vết: dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol, sấy ở 105 0 C trong 5 phút
2.3.2 Định tính, định lượng đánh giá độ tinh khiết và xác định sơ bộ cấu trúc của chất chiết được
- Sắc ký lớp mỏng: Định tính sự có mặt của Re trong cắn chiết được
- HPLC: so sánh thời gian lưu, định lượng hàm lượng G-Re và xác định tạp liên quan của chất G-Re đã tinh chế
- So sánh phổ IR của chất chuẩn G-Re và G-Re tinh chế được để định tính và kiểm tra độ tinh khiết của G-Re tinh chế được
- Sử dụng phương pháp phân tích khối phổ để xác định khối lượng phân tử của chất tinh chế được.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng quy trình thực nghiệm phân lập và tinh chế Re từ Saponin toàn phần của tam thất
3.1.1 Định tính, Định lượng hàm lượng ginsenosid Re trong nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất
Kiểm tra sự có mặt của G-Re trong nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất mua trên thị trường được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng theo quy trình DĐVN V, chuyên luận Tam tất, trang 1321 Phương pháp TLC cho phép xác định nhanh sự hiện diện của G-Re trong mẫu và được thực hiện đúng theo quy trình DĐVN V Kết quả phân tích cung cấp bằng chứng về sự có mặt của G-Re, từ đó hỗ trợ đánh giá chất lượng và chuẩn hóa nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất trên thị trường.
* Chuẩn bị mẫu thử vầ mẫu chuẩn
- Dung dịch thử: Cân khoảng 0,1 g mẫu thử, thêm 2 ml methanol, lắc siêu âm cho tan
- Dung dịch Re chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc Re (5,74mg/5ml MeOH, 92,3%)
* Điều kiện sắc ký mô tả trong bảng 2.3, phương pháp pha thuận
Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng TLC với 10 µL cho mỗi dung dịch, sau đó triển khai sắc ký lớp mỏng cho tới khi dung môi di chuyển được khoảng 12 cm Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch sulfuric acid 10% trong ethanol (TT) và sấy ở 105°C cho đến khi xuất hiện rõ các vết, rồi quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường để nhận diện vị trí, màu sắc và độ phân giải của các vết trên nền TLC.
Hình 3.1: Sắc ký đồ bản mỏng phân tích nguyên liệu ban đầu
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có vết Re cùng màu sắc và giá trị Rf với vết
Re trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu
Đã tiến hành xác định hàm lượng G-Re trong nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất mua trên thị trường bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Quy trình phân tích tuân thủ DĐTQ 2015 và tham khảo chuyên luận Notoginseng Total Saponins, nhằm đảm bảo độ chính xác và tính lặp khi đánh giá chất lượng saponin tam thất cho các ứng dụng thực tiễn.
* Chuẩn bị mẫu thử vầ mẫu chuẩn
Dung dịch thử được chuẩn bị bằng cách cân chính xác khoảng 50 mg mẫu thử vào bình định mức 50 mL, sau đó thêm 15 mL methanol 70%, lắc siêu âm cho tan, để nguội, bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch, lắc đều và lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.
Dung dịch chuẩn được pha trong methanol 70% với nồng độ chính xác khoảng 0,05 mg/ml Lấy 1 ml chuẩn gốc Re (5,74 mg/5 ml MeOH, 92,3%) cho vào bình định mức 20 ml, rồi bổ sung MeOH 70% vừa đủ đến vạch 20 ml.
* Điều kiện sắc ký mô tả ở bảng 2.3
Tiêm lần lượt các dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, ghi lại diện tích của pic trên sắc ký đồ của cả dung dịch thử và dung dịch chuẩn Việc ghi nhận diện tích pic cho từng dung dịch cho phép so sánh mức độ hiện diện của chất giữa mẫu và chuẩn, từ đó đánh giá tính lặp lại và độ chính xác của quá trình phân tích bằng sắc ký.
Hàm lượng % Re trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
X % là hàm lượng Re có trong mẫu nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất
St, Sc là diện tích pic của Re trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn
Cc là nồng độ của dung dịch chuẩn Re (mg/ml)
D là độ pha loãng của dung dịch thử m là khối lượng cân mẫu thử đem định lượng (mg)
Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn được ghi trong hình sau:
SKĐ mẫu thử SKĐ mẫu chuẩn
Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử phân tích G-Re trong nguyên liệu
Kết quả định lượng thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1: Kết quả định lượng G-Re trong nguyên liệu
Mẫu Thời gian lưu (phút)
Kết quả định lượng hàm lượng Re trong nguyên liệu là 2,75%
3.1.2 Xây dựng quy trình thực nghiệm phân lập ginsenosid Re
3.1.2.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân lập
Dựa vào các tài liệu tham khảo, chúng tôi chọn phương pháp phân lập Re từ nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất bằng kỹ thuật tách phân đoạn trên sắc ký cột Do mẫu nguyên liệu ban đầu có nhiều thành phần phức tạp, để thu được chất Re với hiệu suất cao đồng thời tiết kiệm dung môi rửa giải và chất nhồi, chúng tôi tiến hành phân lập qua các bước được tối ưu hóa nhằm phân tách và tinh chế Re một cách hiệu quả.
Dựng silica gel cú kớch thước hạt 63-200 àm, rửa giải bằng hỗn hợp dicloromethan (hoặc cloroform) – methanol – nước với tỷ lệ phân cực tăng dần
Đã tiến hành khảo sát hai dung môi dicloromethan và cloroform ở tỷ lệ 8:2:0,1 Kết quả được thể hiện trên hình 3.3 cho thấy sắc ký đồ của hai dung môi tương đồng về số vết tách và giá trị Rf, dẫn tới lựa chọn hệ dung môi rửa giải dicloromethan – methanol – nước Hệ dung môi này có ưu điểm là ít độc hại hơn so với hệ cloroform – methanol – nước.
Hệ CH2Cl2:MeOH:H2O (8:2:0,1) Hệ CHCl3:MeOH:H2O (8:2:0,1)
Hình 3.3: Sắc ký đồ bản mỏng khảo sát hai hệ dung môi CH2Cl2:MeOH:H2O và
Để lựa chọn tỷ lệ phù hợp, chúng tôi khảo sát các tỷ lệ dung môi khác nhau cho sắc ký lớp mỏng (16:2:0,1; 8:2:0,1; 4:2:0,1; 2:2:0,1) bằng phát hiện vết với dung dịch axit sulfuric 10% trong ethanol trên bản silica gel 60 F254 (Merck), hiện vết và sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút Kết quả từ hình 3.4 cho thấy ở tỷ lệ 16:2:0,1 vết Re chưa tách ra được nhưng có thể đã loại bỏ được vết tạp; ở tỷ lệ 8:2:0,1 vết Re đã tách ra khá rõ ràng và ở vị trí tương đối xa so với các vết khác Tuy nhiên để tăng tốc độ di chuyển của Re trên cột, ta có thể sử dụng tỷ lệ 4:2:0,1 và 2:2:0,1.
Hình 3.4: Sắc ký đồ bản mỏng pha thuận ở các tỉ lệ dung môi hệ CH2Cl2: MeOH: H2O
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy có thể tách G-Re trên sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là C18 bằng cách sử dụng hệ dung môi acetonitrile – nước ở chế độ gradient có độ phân cực giảm dần, giúp tách G-Re khỏi các chất còn lại Vì vậy, chúng tôi đã chọn hệ dung môi acetonitrile – nước cho sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh C18 để phân lập tinh G-Re một cách hiệu quả và tối ưu cho các ứng dụng phân tích.
Để chọn tỷ lệ dung môi phù hợp cho sắc ký lớp mỏng (TLC), chúng tôi khảo sát các tỷ lệ 1:3; 1:2; 1:1 và 2:1 bằng sắc ký lớp mỏng với dung dịch mẫu thử trong ethanol tuyệt đối trên bản mỏng pha đảo silica gel 60 RP-18 F254S (YMC) Sau khi chiếu lên bản mỏng, hiện vết bằng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol và sấy ở 105°C trong 5 phút, hình 3.5 cho thấy ở tỷ lệ 1:2 vết G-Re chưa tách ra được; ở tỷ lệ 1:1 có dấu hiệu tách hoặc phân tách rõ rệt hơn.
Trong quá trình sắc ký, hợp chất Re được tách ra khá rõ và nằm ở vị trí tương đối xa so với các vết khác, giúp nhận diện dễ dàng và tăng độ tin cậy của phân tích Để tăng tốc độ di chuyển của G-Re trên cột, ta có thể điều chỉnh hệ dung môi bằng cách tăng tỷ lệ acetonitrile và nước lên 2:1 Việc tối ưu hệ dung môi này không chỉ rút ngắn thời gian phân tích mà còn cải thiện độ phân giải giữa các vết tách, từ đó nâng cao hiệu suất và độ nhạy khi xác định G-Re trong mẫu.
Hình 3.5: Sắc ký đồ bản mỏng pha đảo ở các tỉ lệ dung môi hệ aceton : nước
Trong quá trình nghiên cứu và qua tham khảo tài liệu, chúng tôi nhận thấy hệ dung môi methanol – nước vẫn được sử dụng để tách G-Re trên sắc ký cột pha đảo (RP-HPLC) với pha tĩnh C-18 Việc phối hợp methanol và nước cho phép điều chỉnh độ phân giải và thời gian lưu của G-Re bằng cách thay đổi tỷ lệ dung môi và lưu lượng, từ đó tối ưu hóa hiệu suất phân tích Hệ dung môi này có tính linh hoạt cao, phù hợp với nhiều loại mẫu, kể cả mẫu sinh học và thực phẩm chứa G-Re, và tương thích tốt với các detector phổ biến Vì vậy, methanol – nước là một lựa chọn được ưa chuộng để tách G-Re trên sắc ký cột pha đảo C-18.
Chúng tôi khảo sát các tỷ lệ dung môi chạy TLC khác nhau (2:1; 1:1; 1:2) trên bản TLC pha đảo silica gel 60 RP-18 F254S (Merck) với dịch mẫu thử hòa tan trong ethanol tuyệt đối Bản TLC được hiện vết bằng dung dịch axit sunfuric 10% trong ethanol và sấy ở 105°C trong 5 phút Kết quả (Hình 3.6) cho thấy ở tỷ lệ 1:2 và 1:1 vết G-Re chưa tách ra, trong khi ở tỷ lệ 2:1 vết G-Re đã tách ra khá rõ so với các vết khác.
Hình 3.6: Sắc ký đồ bản mỏng pha đảo ở các tỉ lệ dung môi hệ methanol : nước
3.1.2.2 Quy trình thực nghiệm phân lập ginsenosid Re trên cột silica gel
Bảng 3.2: Tóm tắt quy trình thực nghiệm phân lập ginsenosid Re trên cột silica gel
Cột Chất nhồi silica gel Hệ dung môi
Tên Kích thước Khối lượng (gam)
Kích thước (àm) Phân lập thô
Dựng silica gel cú kớch thước hạt 63-200 àm, rửa giải bằng hỗn hợp dicloromethan - methanol - nước với tỷ lệ phân cực tăng dần
Chuẩn bị cột sắc ký bằng cột thủy tinh trung tính có kích thước 10 cm x 60 cm, đặt thẳng đứng trên giá và có van để điều chỉnh tốc độ dung môi Khóa van trước khi tiến hành, lót một lớp bông mỏng phía đáy cột, trên lớp bông chèn thêm một lớp giấy lọc có kích thước vừa khít trong lòng cột để ngăn silica gel lẫn vào lớp bông gây tắc cột Đổ vào cột một ít dung môi dicloromethan.
Xác định cấu trúc, đánh giá độ tinh khiết và xác định hàm lượng của chất chiết được
Sản phẩm là dạng bột vô định hình, màu trắng
3.2.2 Phổ khối Để xác định chính xác khối lượng phân tử của chất cắn D tinh chế được, sử dụng thiết bị LC-MS, trong quá trình bắn phá mẫu bằng phương pháp ESI, tác nhân
Trong phân tích phổ khối, Na+ đã được sử dụng Kết quả cho chất tinh chế cho thấy mảnh ion phân tử ở trạng thái [M+Na]+ với m/z = 969,7 dalton Do đó khối lượng phân tử của chất tinh chế (M) được xác định bằng 969,7 − 23 ≈ 946,7 dalton.
Khối lượng phân tử của chất tinh chế đo được là 946,7 dalton Với z = 1, khối lượng phân tử ước tính là 946,7 dalton, xấp xỉ 947,2 dalton, phù hợp với công thức phân tử của ginsenosid Re (C48H82O18) và tương thích với các tài liệu tham khảo [8], [22].
Mẫu thử (cắn D) Mẫu chuẩn G-Re
Hình 3.21: Phổ khối của mẫu thử (cắn D) và mẫu chuẩn ginsenosid Re
Kết quả so sánh phổ hồng ngoại (hình 3.21) của mẫu thử ginsenosid Re (cắn D) với phổ hồng ngoại của chất chuẩn ginsenosid Re có hệ số match là 0,9277
Hình 3.22 mô tả sự so sánh phổ hồng ngoại của chất tinh chế với chuẩn ginsenosid Re, nhằm đánh giá tính tương đồng và độ tinh sạch của mẫu Phần 3.2.4 trình bày phương pháp định lượng và xác định giới hạn tổng các tạp chất liên quan của G-Re tinh chế được bằng HPLC với detector DAD, đảm bảo độ chính xác trong định lượng và kiểm soát các tạp chất ở ngưỡng cho phép.
* Điều kiện sắc ký: theo Dược điển Trung Quốc 2015, chuyên luận
Notoginseng total sapnins, đã được mô tả trong bảng 2.3
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phân tích sắc ký, cân chính xác khoảng 5 mg G-Re chuẩn và hòa tan trong 10 ml methanol 70%, lắc đều cho tới khi hòa tan hoàn toàn và lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm để thu được dung dịch chuẩn tiêm sắc ký Phải pha hai dung dịch chuẩn.
Dung dịch thử 1 (định lượng ginsenosid Re) được chuẩn bị như sau: cân chính xác khoảng 5 mg chất G-Re tinh chế trên cân phân tích có độ chính xác 0,01 mg, hòa tan bằng methanol 70% vừa đủ trong 10 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 μm để thu được dung dịch thử; từ dung dịch này pha 3 dung dịch thử khác nhau cho quá trình định lượng.
Dung dịch thử 2 được dùng để xác định tạp chất liên quan và được chuẩn bị từ chất G-Re tinh chế Quá trình này bắt đầu bằng việc cân một lượng mẫu phù hợp trên cân phân tích, sau đó hòa tan với dung môi phù hợp cho tới khi đạt thể tích cần thiết, khuấy đều cho đến khi hòa tan hoàn toàn và lọc qua màng lọc có kích thước thích hợp để thu được dung dịch thử Tiếp theo, tiến hành chuẩn bị ba dung dịch thử nhằm phục vụ đánh giá tạp chất liên quan.
Để kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích của đỉnh chính Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích đỉnh G-Re từ 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0%.
- Tiêm riêng biệt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả, ghi sắc ký đồ
Định lượng ginsenosid Re (G-Re) trong mẫu thử ở trạng thái nguyên trạng được thực hiện dựa trên diện tích peak chính trên chromatogram của mẫu thử và của dung dịch chuẩn Hàm lượng phần trăm G-Re được xác định bằng tỷ lệ diện tích peak giữa mẫu và chuẩn, cho phép tính toán hàm lượng G-Re chuẩn và hàm lượng G-Re có trong mẫu thử.
Xác định tạp chất liên quan bằng phương pháp % diện tích pic để tính kết quả Phương pháp này so sánh diện tích tín hiệu của tạp chất với tổng diện tích tín hiệu trên sắc ký đồ, cho ra tỷ lệ phần trăm diện tích của tạp chất so với tổng diện tích pic Việc tính % diện tích pic tạp so với tổng diện tích pic giúp định lượng và đánh giá mức độ tạp chất một cách nhanh chóng và chính xác trong phân tích sắc ký.
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Quy trình tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn G-Re 1 (nồng độ 0,404 mg/ml) và 1 lần dung dịch chuẩn G-Re 2 (nồng độ 0,405 mg/ml) trong methanol 70% được thực hiện, với yêu cầu hệ số kiểm tra phải nằm trong khoảng 0,98–1,02 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký định lượng G-Re
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAu.S)
Kết quả cho thấy hệ thống HPLC được sử dụng cho phân tích có độ lặp cao, với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích peak đều nhỏ hơn 1%, và giá trị hệ số kiểm tra giữa hai chuẩn là 1,00 (yêu cầu: 0,98–1,02).
Kết quả định lượng chất G-Re tinh chế được
Trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử G-Re tinh chế, pic chính có thời gian lưu trùng khớp với thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn G-Re (Hình 3.19) Sự trùng khớp này cho thấy mẫu thử và chuẩn G-Re có cùng đặc tính lưu giữ trên cột, khẳng định tính nhất quán của phân tích và xác định đúng chất G-Re.
- Hàm lượng G-Re định lượng được là 94,1% (Bảng 3.8)
Kết quả xác định tạp chất liên quan
Bảng 3.10: Kết quả định lượng tạp chất liên quan của G-Re tinh chế được
Pic Thời gian lưu (phút)
Kết quả phân tích (Hình 3.23) cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu trắng tại thời gian lưu của G-Re khoảng 28 phút không có pic nào xuất hiện Với mẫu thử, có một pic với thời gian lưu tR = 28,610 phút, gần bằng thời gian lưu của pic G-Re ở mẫu chuẩn (tR = 28,749 phút), và một pic tạp có thời gian lưu tR = 28,210 phút Tại thời gian lưu của các pic tạp trên sắc ký đồ mẫu thử, sắc ký đồ dung môi không chứa pic nào Tổng diện tích các pic tạp là 1,98%.
Hình 3.23: Sắc ký đồ định lượng tạp trong mẫu thử (cắn D)