Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt HRGC-MS High resolution gas chromatography – Mass spectrometry Sắc ký khí độ phân giải cao ghép khối phổ IS Ionspray Voltage Thế ion hóa LC-MS/MS Liquid c
TỔNG QUAN
Tổng quan về Propylen glycol
Propylene glycol (PG) là chất lỏng tổng hợp có khả năng hút ẩm và hấp thụ nước, tồn tại dưới dạng propan-1,2-diol, không màu và trong suốt PG được dùng để sản xuất các hợp chất polyester, làm chất chống đông trong hóa học, thực phẩm và dược phẩm; nó cũng được dùng để hấp thụ nước thừa và duy trì độ ẩm trong một số thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm Ngoài ra, PG là dung môi để tạo màu và mùi cho thực phẩm, đồng thời được ứng dụng trong công nghiệp sơn và nhựa; nó còn được dùng để tạo khói hoặc sương mù nhân tạo cho các buổi diễn tập cứu hỏa và ở các rạp hát Trong nhóm glycol, PG có độc tính thấp nhất và được FDA phân loại vào nhóm phụ gia được xem là “an toàn”, trừ việc sử dụng trong thức ăn cho mèo do tác dụng bất lợi nghiêm trọng đối với loài này.
1.1.2 Định danh và tính chất lý hóa
Thông tin về định danh hóa học của PG [28, 32] được thể hiện trong bảng 1-1
Bảng 1-1 Định danh hóa học của PG Đặc điểm Thông tin
Tên hóa học Propylen glycol
Tên khác và tên thương mại
1,2-Dihydroxypropan; 1,2-propandiol; 1,2-Propylen glycol; 2,3-propandiol; hydroxy-propanol; alpha- Propylen glycol; methyl glycol; methylethyl glycol; monoPropylen glycol; trimethyl glycol
Cấu trúc hóa học CH 3 – CH(OH) – CH 2 (OH)
Một số tính chất lý học, hóa học của PG [32] được trình bày trong bảng 1-2
Bảng 1-2 Tính chất lý hóa của PG Đặc tính Thông tin
Trạng thái vật lý Lỏng
Mùi, Vị Không mùi, Gần như không có vị Độ tan
- Trong dung môi hữu cơ
- Tan trong alcol, ete, benzen, aceton, cloroform
Hệ số log Kow (n- octanol/ nước)
Điểm đánh giá độ ổn định của PG là -0,92 Ở nhiệt độ thấp, PG có độ ổn định tương đối cao; tuy nhiên ở nhiệt độ cao, PG có xu hướng oxy hóa thành các sản phẩm như propionaldehyde, axit lactic, axit pyruvic và axit axetic.
1.1.3 Độc tính Độc tính của PG với mèo được nghiên cứu trên nhiều cơ quan, bộ phận và được thể hiện qua 2 thông số no-observed-adverse-efect level (NOAEL) và lowest- observed-adverse-effect level (LOAEL) LOAEL là mức liều hoặc nồng độ thấp nhất của một chất, xác định qua thực nghiệm hoặc quan sát, gây ra một sự thay đổi bất lợi về mặt hình thái, chức năng cơ quan, sự sinh trưởng, phát triển hoặc tuổi thọ của đối tượng đích so với nhóm đối chứng trên cùng một loài và cùng trong các điều kiện phơi nhiễm; NOAEL là mức liều hoặc nồng độ cao nhất của một chất, xác định qua thực nghiệm hoặc quan sát, gây ra những thay đổi bất lợi không xác định được về mặt hình thái, chức năng cơ quan, sự sinh trưởng, phát triển hoặc tuổi thọ của đối tượng địch dưới những điều kiện phơi nhiễm nhất định[38] Một số độc tính của PG trên mèo được thể hiện trong bảng 1-3
Bảng 1-3 Một số tác động của PG qua đường miệng trên mèo
TLTK Ít nghiêm trọng Nghiêm trọng
3600 (Tăng hồng cầu lưới, tăng cơ thể Heinz, tăng sự bất ổn chuyển hóa nghiêm trọng)
14 ngày Hệ miễn dịch 3600 (giảm nồng độ
13 tuần Huyết học 1260 (tăng cơ thể Heinz, giảm đời sống hồng cầu) [8]
2750 (tăng cơ thể Heinz, tăng hồng cầu lưới có hạt, giảm đời sống hồng cầu
5 tuần Huyết học 1600 (xuất hiện cơ thể
Thận 8000 (đa niệu, khát nhiều)
Thận 1600 8000 (đa niệu, khát nhiều)
Chuyển hóa 1600 (tăng khoảng anion, tăng D-lactat)
17 tuần Huyêt học 2400 (xuất hiện cơ thể
8000 (mất điều hòa, ức chế CNS, không hoạt động)
Qua các kết quả nghiên cứu, độc tính của PG với mèo được nhận diện rõ ràng Các công bố [8, 14, 36] cho rằng nguyên nhân là sự hình thành Heinz bodies—dấu hiệu của tổn thương oxy hóa hồng cầu—xảy ra khi PG hoặc các chất chuyển hóa của nó tương tác với các nhóm sulfhydryl trên phân tử hemoglobin, làm hemoglobin biến tính và ngăn không cho nó trở lại bình thường, đồng thời dính vào màng tế bào Mèo đặc biệt nhạy cảm, có thể do hemoglobin của chúng chứa tám nhóm sulfhydryl và vì chúng có ít khả năng liên kết và thải các chất độc ra khỏi cơ thể hơn so với các loài khác.
5 hợp PG với glucuronid hơn các loài khác
- Từ các đặc điểm trên, FDA 21CFR589.1001 – “Propylen glycol in or on cat food” xếp PG vào nhóm chất chấm sử dụng trong thức ăn cho mèo.
Tổng quan phương pháp xác định PG
1.2.1 Một số phương pháp xác định PG trên thế giới
Một số phương pháp xác định PG trong các nền mẫu khác nhau được thể hiện trong bảng 1-4
Bảng 1-4 Một số phương pháp đã dùng trong xác định PG
Nền mẫu Xử lý mẫu, đối tượng Phương pháp
LOD LOQ Độ thu hồi (%)
Thức ăn Thêm nước nóng vào mẫu, loại tạp bằng hexan, kết tủa đường bằng Ca(OH)2 , cô, tạo dẫn chất với
Chiết bằng nước khử khoáng, thêm đệm natri carbonat (pH 9,5), NAD+
(pH 9,5), sau đó thêm dung dịch enzym Propylenglycol dehydrogenase với mẫu thử và đệm kali phosphat với mẫu chứng, ủ 10 phút ở
37 o C, tiến hành đo mật độ quang tại 340 nm
Mỹ phẩm Chưng cất với heptan sau đó đem phản ứng với muối periodat
Quá trình hấp thụ khói thuốc được thực hiện lên tấm lọc Cambridge 44 mm; sau đó tấm lọc được xử lý với mẫu thuốc lá điện tử dạng lỏng, sử dụng 100–150 mg mẫu Mẫu được chiết bằng methanol (MeOH), và dịch chiết thu được được pha loãng 10 lần để phân tích tiếp.
GC-MS/MS LOD = 0,0109 mg
Nền mẫu Xử lý mẫu, đối tượng Phương pháp
LOD LOQ Độ thu hồi (%)
Trộn thuốc thử màu vào dung dịch PG tạo viên nén
Chiết thuốc thử màu từ viên nén bằng dung môi thích hợp rồi định lượng bằng GC
GC – FID gián tiếp qua thuốc nhuộm
Hydrogels Chiết bằng acid sulfuric HPLC-RI LOD = 87ng
Nhựa Chiết bằng hỗn hợp dung môi ethylacetat – nước –
Thêm chất chuẩn nội; ly tâm; Tạo dẫn chất với
Tạo dẫn chất với benzoyl clorid trong môi trường kiềm, sau đó chiết bằng pentan, thổi khô bằng khí nitrogen và hòa cắn bằng
LC-MS/MS LOD = 0,99 ppm
Thêm chất chuẩn nội EG, tạo dẫn xuất với benzoyl clorid trong NaOH, chiết bằng pentan, thổi khô
Tạo dẫn chất với benzoyl clorid trong môi trường kiềm, chiết bằng pentan, thổi khô dịch bằng khí nitrogen, hòa tan cắn với hỗn hợp
LC-ESI-MS LOD = 10-25 ppb LOQ = 20-50 ppb
Hấp phụ chất trong không khí vào ống than hoạt được hoạt hóa và màng lọc sợi thủy tinh; Chiết bằng hỗn hợp dicloromethan/MeOH
7 Ưu-nhược điểm của một số phương pháp định lượng PG được trình bày trong bảng 1-5
Bảng 1-5 Ưu nhược điểm của một số phương pháp đã được sử dụng để định lượng PG:
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm TLTK
Xử lý mẫu dễ dàng
Phân tích được đồng phân vị trí tốt hơn LC
Thời gian phân tích lâu
Sự hấp thụ của PG vào các bộ phận thủy tinh
FID độ nhạy kém hơn
Pic kéo đuôi và nhiễm chéo
Thời gian phân tích ngắn hơn GC và các phương pháp khác
LOD, LOQ thấp (ppb, ppm)
Phân tích được đồng thời nhiều chất trong cùng một mẫu
Giảm nhiễu pic và bỏ xót pic
Sử dụng dung môi độc hại
Nguy cơ ô nhiễm môi trường
HPLC – UV Thời gian phân tích ngắn hơn GC
LOD, LOQ cao hơn so với dùng MS Độ đặc hiệu kém hơn GC
Chuẩn độ bằng oxy hóa
Nhanh, đơn giản, tiết kiệm Độ chính xác thấp
Hiệu quả tương đương GC và tránh được hiện tượng mất mẫu do hấp thụ vào thủy tinh ở GC
Chuẩn bị enzym phức tạp
Bị nhiễu bởi 1,2 và 2,3- butandiol
Một số tác nhân dẫn xuất PG
Nhiều nghiên cứu phải dẫn xuất PG Một số tác nhân và kỹ thuật phân tích đã sử dụng được trình bày trong bảng 1-6
Bảng 1-6 Một số tác nhân dẫn xuất PG
Tác nhân phản ứng Phương pháp áp dụng TKTK
Benzoyl clorid/NaOH HPLC-UV
LC-MS, LC-MS/MS, GC-FID
Bis(trimethylsilyl)trifloro-acetamid HRGC-FID
[13] p-toluensulfonyl isocyanat HPLC-UV [40] heptaflorobutyric anhydrid GC-MS [39]
Trong phân tích propylene glycol (PG) bằng LC-MS, benzoyl chloride được sử dụng phổ biến và hầu hết các nghiên cứu cho thấy nó mang lại ưu điểm nổi bật ở việc cải thiện độ nhạy Quá trình benzoylation glycols với benzoyl chloride tạo ra các benzoyl esters có đặc tính tương thích với hệ LC-MS, từ đó tăng cường tín hiệu và độ đặc hiệu cho quá trình định lượng PG Phản ứng này đóng vai trò là bước tiền xử lý quan trọng, giúp nhận diện và đo lường glycols trong mẫu một cách nhạy bén và nhất quán, đồng thời tối ưu hoá quy trình phân tích PG bằng LC-MS.
Hình 1-1 Phương trình phản ứng của Glycols với benzoyl clorid [35]
Phương trình phản ứng cho thấy các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng: lượng NaOH, lượng benzoyl clorid, thời gian phản ứng
Một số chất chuẩn nội được dùng trong các phương pháp phân tích PG trình bày trong bảng 1-7
Bảng 1-7 Một số chất chuẩn nội được dùng trong các phương pháp định lượng PG
Chất chuẩn nội được dùng TLTK
Nghiên cứu này sử dụng EG là chất chuẩn nội
1.2.2 Tổng quan về etylen glycol
Thông tin về định danh hóa học của etylen glycol (EG) [31] được thể hiện trong bảng 1-8
Bảng 1-8 Bảng định danh hóa học của EG Đặc điểm Thông tin
Tên hóa học Etylen glycol
Tên khác và tên thương mại Etan-1,2-diol; 1,2-etandiol
Cấu trúc hóa học (HO)CH 2 – CH 2 (OH)
Một số tính chất vật lý và hóa học của EG [31] được thể hiện trong bảng 1-9
Bảng 1-9 Tính chất lý hóa của EG Đặc tính Thông tin
Trạng thái vật lý Lỏng
Tỷ trọng ở 20 o C (g/cm 3 ) 1,1135 pKa 15,1 Độ tan
- Trong dung môi hữu cơ
- trộn lẫn được với nước
- Tan trong alcol, eter, benzen, aceton,
Hệ số log Kow (n- Octanol/ nước)
Phản ứng với benzoyl clorid Xem hình 1-1 (R=H)
Ethylene glycol (EG) khi xâm nhập vào cơ thể được phân giải thành các hợp chất độc hại như glycoaldehyde, axit glycolic, glycolate và axit oxalic; Những sản phẩm độc hại này trước tiên ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (CNS), sau đó gây tổn thương cho tim và cuối cùng là thận, thậm chí có thể gây tử vong, ngay cả khi tiêu thụ với liều lượng nhỏ.
10 mèo với LD50 của EG qua đường miệng cho mèo là 1650 mg/kg [3]
Theo thông tin tra cứu từ Trung tâm kiểm soát độc động vật của Mỹ (APCC) và FDA, không có tài liệu nào cho thấy EG được dùng với vai trò phụ gia trực tiếp cho vào thực phẩm.
1.2.3 Phương pháp LC-MS/MS
Sắc ký lỏng khối phổ được ứng dụng để phân tích rộng rãi do có nhiều ưu điểm [1]:
Độ nhạy cao của hệ thống phân tích, đặc biệt là sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS), là lợi thế lớn cho phân tích các mẫu có hàm lượng ở mức thấp Khả năng phát hiện và định lượng ở ngưỡng rất thấp của LC-MS/MS cho phép xác định chính xác các hợp chất dù nồng độ nhỏ, giúp tăng độ tin cậy và hiệu quả trong các ứng dụng phân tích mẫu có hàm lượng thấp.
- Có khả năng tách các chất dựa theo m/z, do đó cùng với khả năng tách các chất nhờ HPLC thì phương pháp này có khả năng phân tích đồng thời nhiều chất
- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lượng và cấu tạo của chất nên rất đặc trưng cho từng chất
- Có khả năng phân tích được những chất không thể phân tích bằng sắc ký khí như các chất kém bay hơi, các chất không bền với nhiệt
Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phát hiện là detector khối phổ [1, 7]
1.2.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong sắc ký lỏng (HPLC), quá trình tách diễn ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Khi chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh, phụ thuộc vào cấu trúc phân tử và tính chất hoá lý của từng chất, do đó khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Vì vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Pha tĩnh trong HPLC đóng vai trò quan trọng trong quyết định hiệu suất phân tích.
Trong HPLC, pha tĩnh là bề mặt chất nhồi cột đảm nhiệm chức năng tách các chất phân tích khỏi hỗn hợp Bản chất của pha tĩnh trong phương pháp sắc ký lỏng ảnh hưởng đến quá trình tương tác với chất phân tích và hiệu quả tách Trong sắc ký lỏng pha liên kết, hệ thống được chia thành hai loại chính: sắc ký pha thuận (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC), mỗi loại có cơ chế tương tác riêng biệt giúp tối ưu hóa quá trình phân tích.
Sắc ký pha thuận là hệ thống tách dựa trên sự tương tác phân cực giữa mẫu và pha tĩnh Pha tĩnh có bề mặt phân cực, thường là silica trần hoặc silica được gắn nhóm alkyl ngắn mang các nhóm phân cực; nhờ đó, các phân tử có độ phân cực cao tương tác mạnh và bị giữ lại nhiều hơn trên cột so với các phân tử ít phân cực Trong khi đó, pha động là dung môi ít phân cực hoặc không phân cực (ví dụ hexane hoặc các hỗn hợp không mạnh phân cực), khiến các chất ít phân cực di chuyển nhanh hơn và elute sớm, còn các hợp chất có nhóm chức phân cực sẽ được giữ lại lâu hơn Sắc ký pha thuận được ứng dụng rộng rãi để tách các hợp chất hữu cơ có độ phân cực khác nhau, như axit hữu cơ, ancol, đường và các hợp chất chứa nhóm chức phân cực.
- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được alkyl hóa, không phân cực, loại thông dụng nhất là -C18H 37 [1, 5]
Pha động trong HPLC đóng vai trò thiết yếu trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký, ảnh hưởng trực tiếp đến độ phân giải và thời gian phân tích Pha động có thể được phân loại thành hai loại cơ bản: pha động đơn (isocratic) và pha động gradient, mỗi loại mang lại những ưu điểm riêng tùy thuộc vào tính chất của mẫu Với pha động đơn, thành phần dung môi được giữ cố định suốt quá trình phân tích, phù hợp cho các phân tích có đặc tính tương tự và thời gian chạy ngắn Pha động gradient cho phép thay đổi tỉ lệ dung môi theo thời gian, giúp tối ưu hóa sự phân tách giữa các chất phân tích và có thể rút ngắn thời gian phân tích cho các mẫu phức tạp Việc lựa chọn giữa hai loại pha động phụ thuộc vào đặc tính của chất phân tích và mục tiêu phân tích nhằm đạt được độ nhạy và độ lặp lại cao.
Pha động phân cực có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần bổ sung các dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp như methanol hoặc acetonitril để làm giảm độ phân cực của pha; pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết pha đảo, hay còn gọi là sắc ký pha ngược, nhằm tối ưu hóa quá trình tách các hợp chất hữu cơ nhờ sự phối hợp giữa nước và dung môi hữu cơ.
- Pha động không phân cực: bao gồm các dung môi ít phân cực như cyclopentan, n-pentan, n-hexan, n-heptan, 2-cloropropan, cacbondisuldua
Đôi khi pha động một thành phần không đạt được khả năng rửa giải mong muốn, vì vậy người ta kết hợp hai hoặc ba dung môi để tạo ra hệ dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao, phù hợp với phép phân tích Sự biến đổi của thành phần pha động theo thời gian được gọi là rửa giải gradient nồng độ.
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên nguyên lý xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng cách phân tách các ion theo tỷ lệ khối lượng–điện tích (m/z) Các ion này được hình thành bằng cách mất hoặc nhận điện tích, ví dụ bằng việc loại bỏ electron hoặc proton hoá, dẫn tới các ion với các giá trị m/z khác nhau Những ion được tách theo m/z rồi được phát hiện, từ đó cung cấp thông tin về khối lượng và cấu trúc phân tử của hợp chất Nhờ đó khối phổ đóng vai trò thiết yếu trong phân tích hóa học, giúp nhận diện thành phần và cấu trúc của các hợp chất một cách chính xác.
Trong hình 1-2, một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS được trình bày để minh họa cấu trúc và luồng dữ liệu trong thiết bị Thiết bị khối phổ gồm ba phần chính: nguồn ion hóa, bộ phân tích khối và bộ phận phát hiện Nguồn ion hóa có nhiệm vụ biến mẫu thành các ion mang điện tích, bước đầu tiên quyết định hiệu suất đo lường trong hệ thống LC-MS Sau đó, bộ phân tích khối có chức năng phân tích khối lượng của các ion này, còn bộ phận phát hiện ghi nhận tín hiệu và chuyển đổi thành dữ liệu phân tích để xác định thành phần của mẫu.
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa thành các ion nguyên tử Trong sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), các kỹ thuật ion hóa phổ biến là ion hóa phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật ion hóa ESI.
Detector/ lưu giữ số liệu
Hình 1-2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu pate đóng hộp cho mèo thu thập trên địa bàn Hà Nội (thu thập từ Quận Hai Bà Trưng, Hoàn Kiếm, Hoàng Mai và Bắc
Từ Liêm) Tổng số mẫu là 40 mẫu (mỗi mẫu lấy tối thiểu 1 kg)
Mẫu trắng là mẫu đã được phân tích theo quy trình xử lý mẫu và không phát hiện chất phân tích
2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị
2.1.2.1 Chất chuẩn a) Chất chuẩn ngoại PG
Chuẩn gốc PG có độ tinh khiết 99,88% được mua từ hãng LGC, số lô: G1007429, bảo quản ở nhiệt độ 20 o C ± 4 o C, hạn dùng 18/03/2025
Dung dịch chuẩn đơn stock PG 10000 ppm được chuẩn bị bằng cách cân chính xác khoảng 250 mg chất chuẩn gốc PG bằng cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg, cho vào bình định mức 25,00 mL, hòa tan và định mức bằng nước cất hai lần, sau đó chuyển dung dịch vào lọ nhựa chuẩn và bảo quản ở nhiệt độ 20 o C ± 4 o C, dùng trong 1 tháng.
Dung dịch chuẩn làm việc PG 100 ppm được chuẩn bị như sau: dùng micropipet chính xác lấy 250 µL dung dịch chuẩn PG 10000 ppm cho vào bình định mức 25,00 mL, bổ sung nước cất để đưa mực xuống vạch 25,00 mL và khuấy đều cho hòa tan; dung dịch được để ở nhiệt độ phòng và dùng trong ngày b) Chất chuẩn nội EG.
Chuẩn gốc EG có độ tinh khiết 99,8% được mua từ hãng Sigma Aldrich, số lô: BCBW2668, bảo quản ở nhiệt độ 20 o C ± 4 o C, hạn dùng 2025
Dung dịch chuẩn đơn stock EG 10000 ppm, dung dịch chuẩn làm việc EG 100 ppm chuẩn bị và bảo quản tương tự như chuẩn bị PG
2.1.2.2 Hóa chất và thuốc thử
Các hóa chất và thuốc thử sử dụng trong đề tài được trình bày trong bảng 2-1
Bảng 2-1 Danh mục hóa chất và thuốc thử
STT Nguyên vật liệu Độ tinh khiết Nguồn gốc
7 Nước cất 2 lần Hệ thống cất nước Mili-
2.1.2.3 Thiết bị và dụng cụ a) Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ 6500 của AB Sciex
- Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1 mm x 3,5) và tiền cột tương ứng
- Máy votex IKA vortex Genius 3
- Máy đồng nhất mẫu HR1843 Philips
- Máy li tâm lạnh HERMLE – Z 326 K
- Máy lắc ngang IKA KS501
- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo
- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 Organomation 8125 N-EVAP 112
- Máy lọc hút chân không
- Thiết bị siêu âm Elma S 180 H b) Dụng cụ
- Micropipet có thể điều chỉnh được 10-100, 20-200, 100-1000, 1000-5000, 1000-10000 àL
- Bình định mức 10 mL, 20 mL, 50 mL, 100 mL
- Ống ly tâm nhựa 50 mL
- Bình thủy phân nhựa 250 mL
- Chai thủy tinh các loại
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Lựa chọn chất chuẩn nội
2.2.2 Khảo sát các điều kiện xác định PG bằng LC – MS/MS
2.2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng
2.2.2.2 Khảo sát điều kiện khối phổ
- Ion hóa bằng nguồn ESI
Xác định và lựa chọn đúng ion phân tử và ion sản phẩm phù hợp là bước then chốt trong phân tích MS/MS Để tạo ion mẹ, sử dụng chế độ ion dương (ví dụ [M+H]+) và áp dụng phương pháp theo dõi đa phản ứng (MRM) để xác định tín hiệu một cách nhạy và đặc hiệu.
- Tối ưu hóa các điều kiện MS/MS
2.2.3 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
2.2.3.1 Khảo sát quá trình chiết mẫu
Khảo sát các yếu tố:
- Nhiệt độ chiết rắn – lỏng
- Thời gian chiết rắn – lỏng
- Số lần chiết rắn – lỏng
2.2.3.2 Khảo sát quá trình dẫn xuất
Khảo sát các yếu tố:
- Thời gian tạo dẫn xuất
- Thời gian chiết dẫn xuất (lỏng – lỏng)
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
- Tính tương thích của hệ thống
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Đường chuẩn/Khoảng tuyến tính
- Độ chụm (độ lặp lại, độ tái lập nội bộ)
- Độ đúng (Độ thu hồi)
2.2.6 Ứng dụng phương pháp Áp dụng phương pháp để đánh giá hàm lượng PG trong các mẫu pate đóng hộp cho mèo thu thập trên địa bàn Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến
2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu sơ bộ
Các mẫu sau khi chuyển về phòng thí nghiệm được gắn mã nhận diện để bảo vệ truy xuất và quản lý dữ liệu, được chuẩn hóa với khối lượng tối thiểu 200 g và bảo quản ở điều kiện 2–8 °C Chúng được phân tích trong vòng 7 ngày hoặc lưu trữ lâu dài ở điều kiện -25 °C để duy trì chất lượng mẫu.
2.3.1.2 Quy trình xử lý mẫu dự kiến
Quy trình xử lý mẫu dự kiến được xây dựng sau khi tham khảo một số quy trình của các nghiên cứu trước đây [23, 25, 34] được trình bày trong hình 2-1
Các yếu tố cần khảo sát thêm trong quy trình xử lý mẫu gồm: Nhiệt độ chiết rắn
Trong quá trình chiết rắn – lỏng, các yếu tố then chốt được tối ưu hóa như Thời gian chiết rắn – lỏng và Số lần chiết rắn – lỏng nhằm tăng hiệu suất tách và thu hồi chất Thể tích NaOH 40% được tính toán để đảm bảo độ kiềm phù hợp cho quá trình tạo dẫn xuất, trong khi Thể tích benzoyl clorid được kiểm soát nhằm đảm bảo sản phẩm mong muốn Thời gian tạo dẫn xuất và Thời gian chiết dẫn xuất (lỏng – lỏng) là các tham số quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và độ tinh sạch của sản phẩm cuối cùng Tất cả các yếu tố này được cân nhắc khi thiết kế và tối ưu hóa quy trình, bao gồm lỏng và các pha liên quan, nhằm đạt được hiệu suất cao và tính ổn định của toàn hệ thống.
2 - 10 g mẫu đã đồng nhất trong ống ly tâm 50 mL
Vortex 1 phút, lắc ngang 10 phút, ly tâm ở 6000 rpm trong 2 phút
Thờm chớnh xỏc 100 àL EG 100ppm
Hút bỏ lớp n-hexan phía trên
Vortex 1 phút, lắc ngang 10 phút, ly tâm ở 6000 rpm trong 5 phút
Hút toàn bộ phần dịch chiết nước sang ống ly tâm
Vortex 1 phút, lắc ngang 10 phút, ly tâm ở 6000 rpm trong 5 phút ở 25 o C
Vortex 1 phút, lắc ngang 10 phút
Hút lấy lớp n-hexan chuyển sang ống ly tâm 50 mL
Vortex 1 phút, hút vào vial, phân tích trên thiết bị LC-MS/MS
Thêm chính xác 1,00 mL ACN
Hình 2-1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến
2.3.2 Phương pháp thẩm định quy trình phân tích [2, 6]
2.3.2.1 Tính chọn lọc Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp, thực hiện phân tích và so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mâu thêm chuẩn, mẫu thêm chất chuẩn nội có tín hiệu chất chuẩn nội tại thời gian gần thời gian lưu chất phân tích
Quá trình chọn lọc được khẳng định thông qua số điểm nhận dạng và tỷ lệ ion tuân theo tiêu chuẩn EC 808/2021/EC của Châu Âu [16] Số điểm nhận dạng được tính toán dựa trên bảng 2-2 và bảng 2-3.
Bảng 2-2 Quan hệ giữa các kỹ thuật phân tích và số điểm IP đạt được
Kỹ thuật phân tích Số điểm IP đạt được
Kỹ thuật tách (GC, LC, SFC, CE) 1,0
Bảng 2-3 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần
Kỹ thuật Kỹ thuật tách Số ion Số điểm IP
GC -MS-MS hoặc LC-
MS/MS GC hoặc LC 1 ion mẹ, 2 ion con 1+1+2x1,5=5
GC -MS-MS hoặc LC-
MS/MS GC hoặc LC 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 1+2+2x1,5=6
Tỷ lệ ion của ion xác nhận và ion định lượng trên mẫu phân tích phải không vượt quá tỉ lệ tương ứng của mẫu chuẩn theo các giới hạn được ghi trong bảng 2-4 Việc tuân thủ giới hạn này đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả phân tích, đồng thời cho phép so sánh các mẫu với chuẩn một cách nhất quán.
Bảng 2-4 Tỷ lệ ion đối với các kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ
(so với ion chính) LC-MS, LC-MS n
2.3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ tối thiếu của một chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể tính lượng được
Giới hạn định lượng LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Xác định LOD và LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của đường nền là cách tiếp cận chủ đạo để ước lượng ngưỡng phát hiện và ngưỡng định lượng trong phân tích Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp cho thấy vẫn có thể phát hiện tín hiệu của chất phân tích, qua đó có căn cứ xác định LOD và LOQ dựa trên ngưỡng S/N phù hợp Xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N = signal to noise ratio) là yếu tố cốt lõi giúp đánh giá độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp, đồng thời hỗ trợ tối ưu hóa quy trình và báo cáo kết quả một cách chính xác cho người dùng.
LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3
LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10
Trong đó : S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích
2.3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là phạm vi nồng độ ở đó đại lượng đo được có mối quan hệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích Đường chuẩn là biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Để xác định khoảng tuyến tính, người ta tiến hành đo các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, đã được bổ sung chất chuẩn nội với nồng độ phù hợp và nhất quán Sau đó, người ta vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích của các pic (peak area) và nồng độ chất phân tích, hoặc giữa diện tích của chuẩn ngoại và nồng độ tương ứng, nhằm xác định vùng nồng độ mà đáp ứng của phương pháp là tuyến tính.
20 chia cho chất chuẩn nội vào nồng độ chất chuẩn ngoại, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính
Sau khi xác định khoảng tuyến tính của các chất, tiến hành xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực nhằm loại bỏ ảnh hưởng của nền đến kết quả phân tích Xây dựng đồ thị và phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích peak của chất phân tích chia cho diện tích peak của chất chuẩn nội Từ đường chuẩn, tính hệ số tương quan r và độ lệch ∆i để đánh giá độ tin cậy và độ chính xác của phương pháp phân tích.
Trong đó: a là độ dốc, b là hệ số chặn
Yêu cầu hệ số tương quan r: 0,995 < r ≤ 1 hay hệ số xác định r 2 :
Trong đó: : độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn : Nồng độ của các điểm chuẩn
Yêu cầu độ chệch không vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%
2.3.2.4 Độ chụm và độ đúng Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quá thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình, được đánh giá qua độ lặp lại và độ tái lập nội bộ, ngoài ra còn độ tái lập với thử nghiệm liên phòng Độ đúng là mức độ gần nhau của các giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ đúng là khái niện định tính và có thể được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau của PG, làm lặp 6 lần và tính toán kết quả theo các công thức:
- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tương đối RSD:
X i : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i” ̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm N: Số lần thử nghiệm
R: Độ thu hồi (%) C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL)
C c : Nồng độ chất thêm (lý thuyết) (ng/mL)
Xác định độ tái lập nội bộ bằng cách thực hiện 6 lần lặp lại ở cùng mức nồng độ, đánh giá độ lặp lại trên nền mẫu trắng tại các thời điểm khác nhau Toàn bộ dữ liệu được gom lại và tính toán theo tiêu chuẩn TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), nhằm đảm bảo đánh giá đầy đủ độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp phân tích.
- p: số các điều kiện tái lập;
- Số lần thử nghiệm , trung bình , độ lệch chuẩn của từng thử nghiệm viên (trong đề tài là của các thời điểm) “i”
- Trung bình của toàn bộ các kết quả: ̅
- Phương sai giữa các thử nghiệm viên
- Độ lệch chuẩn tương đối: ̅
Yêu cầu về độ chụm: giá trị độ lệch chuẩn tương đối tính được không được vượt mức tối đa theo quy định tính theo công thức:
Trong đó: PRSD R : Độ lệch chuẩn tương đối tái lập ước tính (%)
PRSD r : Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại ước tính (%) C: tỷ lệ chất (không có thứ nguyên)
Yêu cầu về độ thu hồi: Các kết quả độ thu hồi nằm trong giới hạn cho phép quy định trong bảng 2-5:
Bảng 2-5 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau
STT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)
2.3.2.5 Tính tương thích của hệ thống Đối với kỹ thuật sắc ký, phép thử tích tương thích của hệ thống được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của hệ thống sắc ký Các giới hạn chấp nhận về tính tương thích của hệ thống phải đạt được trước khi tiến hành phân tích mẫu Tiêm 6 lần dung dịch chất chuẩn làm việc, RSD% không được vượt quá 2,0%
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả phân tích được xử lý bằng phần mềm Analyst ® 1.6.2 (AB SCIEX, Mỹ) và tính toán bằng Excel
Nồng độ PG trong mẫu được tính theo công thức:
C: nồng độ của PG có trong mẫu (mg/kg)
Cx: nồng độ của PG có trong mẫu tính theo đường chuẩn (mg/kg) m 0 : Khối lượng mẫu thử cân theo đường chuẩn m t : Khối lượng mẫu thử cân thực tế
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Lựa chọn chất chuẩn nội
Việc lựa chọn chất chuẩn nội phù hợp giúp giảm thiểu ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu và tiêm mẫu, từ đó tăng độ chính xác của phương pháp phân tích Chất chuẩn nội được lựa chọn dựa trên TLTK và điều kiện thực tế, đảm bảo tính ổn định, tương thích với mẫu và phương pháp đo, đồng thời tối ưu hoá hiệu suất phân tích và khả năng tái lặp.
Dựa trên các tài liệu tham khảo [20, 24], EG có tính chất tương đồng và thời gian lưu gần giống với PG, đồng thời có khả năng tách riêng được pic so với PG Qua khảo sát thực nghiệm, không thấy sự có mặt của EG trong mẫu thực (hình 3-1) Vì vậy, EG được lựa chọn làm chất chuẩn nội.
Hình 3-1 Sắc ký đồ mẫu thêm và không thêm EG
Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ LC – MS/MS
3.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ Để khảo sát điều kiện MS/MS, chúng tôi sử dụng kỹ thuật FIA (the flow injection analysis), nghĩa là dung dịch chuẩn 5 àg/mL sau khi dẫn xuất được bơm trực tiếp vào máy MS/MS cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký Thực hiện các khảo sát bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) với chế độ bắn ion dương
3.2.1.1 Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm
Mẫu thêm EG Mẫu không thêm EG Pic EG
Trong phân tích ion, ion mẹ được chọn ở dạng (M-H)+; từ đó phân mảnh ion mẹ để thu được các ion con Ion con có cường độ cao nhất được dùng làm ion định lượng, trong khi các ion con có cường độ thấp hơn được dùng để định tính Năng lượng va chạm (CE) được tối ưu tự động cho từng ion con dựa trên phần mềm của thiết bị.
Các kết quả được trình bày trong bảng 3-1 và hình 3-2 và phụ lục 1 và 2
Hình 3-2 Phổ khối của PG và EG Bảng 3-1 Các điều kiện phân tích PG, EG bằng ESI (+) - MS/MS
Ion mẹ Ion con CE (eV) CXP (V) Ghi chú
3.2.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện MS/MS
Qua khảo sát thu được giá trị tối ưu của từng thông số cho chất phân tích Giá trị được liệt kê trong bảng 3-2 và phụ lục 1
Bảng 3-2 Các thông số tối ưu của thiết bị MS/MS
Thông số Ký hiệu Giá trị tối ưu (ESI (+)) Áp suất khí màng Curtain gas (CUR) 35 psi Áp suất khí va chạm Collision gas (CAD) 8 psi
Thế ion hóa Ionspray Voltage (IS) 4500 V
Nhiệt độ nguồn ion Temperature (TEM) 450 o C Áp suất khí nguồn 1 Ion source gas 1 (GS 1) 50 psi Áp suất khí nguồn 2 Ion source gas 2 (GS 2) 50 psi
Thế cổng vào Entrance Potential (EP) 9 V
3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Pha tĩnh đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất trong hệ thống sắc ký, vì ái lực của pha tĩnh với các chất phân tích quyết định hiệu quả phân tách Chất phân tích PG là một chất phân cực; sau khi tạo dẫn xuất với benzoyl chloride, nó hình thành hợp chất kém phân cực Dựa trên tham khảo tài liệu và điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn sử dụng cột pha đảo Agilent C18 (150 mm × 2,1 mm; 3,5 μm).
3.2.2.2 Khảo sát thành phần pha động
Pha động trong LC–MS/MS không chỉ ảnh hưởng đến hiệu quả tách mà còn tác động tới quá trình ion hóa và tín hiệu của các chất phân tích Với kỹ thuật ion hóa ESI, quá trình ion hóa được tăng lên khi có bổ sung các chất nền như acid acetic, acid formic và ammonium acetate Nghiên cứu khảo sát các hệ pha động phân cực bằng acid formic 0,1%/H2O và ACN; acid formic 0,1%/H2O và MeOH.
Kết quả khảo sát hệ pha động cho hai lựa chọn: (1) acid formic 0,1%/H2O và ACN; (2) acid formic 0,1%/H2O và MeOH, được trình bày ở hình 3-3 và hình 3-4 Hệ pha được chạy theo chương trình gradient như được mô tả trong bảng 2-2 Do sau khi thử nghiệm một chương trình gradient cho thấy kết quả tách tốt, nên không tiến hành khảo sát thêm các chương trình gradient pha động và đã lựa chọn chương trình gradient này cho các phân tích tiếp theo.
Hình 3-3 Sắc ký đồ hệ pha động (1)
Hình 3-4 Sắc ký đồ hệ pha động (2)
Đánh giá sắc ký đồ ở hai hệ dung môi cho thấy hệ dung môi thứ hai (hệ 2) có hiện tượng chẻ pic nhiều và các pic không cân xứng so với các chuẩn PG và EG Ngược lại, hệ dung môi thứ nhất (hệ 1) cho kết quả pic đều và cân xứng, tách hoàn toàn với các pic khác Vì vậy, dung môi pha động được chọn là hỗn hợp acid formic 0,1% trong nước (formic acid 0,1% / H2O) và ACN để tối ưu độ phân giải và hình dạng pic trong sắc ký đồ.
Bảng 3-3 Chương trình gradient pha động
Thời gian (phút) Thành phần pha động
8,0 70 30 Điều kiện sắc ký được lựa chọn như :
- Pha tĩnh: Cột sắc ký C18 (150 mm x 2,1 mm; 3,5 àm)
- Pha động chạy theo chương trình gradient với 2 kênh là acid formic
0,1%/H 2 O và kênh ACN theo bảng 2-2
- Tốc độ dòng pha động 0,4 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 5 àL
- Các thông số của thiết bị MS/MS theo bảng 3-2
- Ion hóa bằng nguồn ESI
- Sử dụng chế độ ion dương tạo ion mẹ [M-H] +
- Sử dụng chế độ theo dõi đa phản ứng (MRM) để xác định tín hiệu.
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Mẫu phân tích là các mẫu thực phẩm chứa rất nhiều tạp chất, ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích nên cần được xử lý và chiết tách để làm giàu mẫu, loại bỏ tạp chất, tránh làm bẩn detector và tăng khả năng phát hiện Chất phân tích PG tan rất tốt trong nước nên sẽ được chiết tách từ các mẫu rắn sang môi trường nước Để chiết tối đa lượng PG và giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu, cần khảo sát nhiệt độ chiết rắn–lỏng, thời gian chiết rắn–lỏng và số lần chiết rắn–lỏng.
3.3.1 Khảo sát quy trình chiết mẫu
3.3.1.1 Khảo sát nhiệt độ chiết rắn – lỏng
Trong nghiên cứu này, dung môi chiết được sử dụng là nước và mẫu đã được xác định dương tính với PG Nhiệt độ chiết được khảo sát ở bốn điều kiện: 25°C/25°C, 75°C/75°C, 100°C/100°C và 100°C/25°C, nhằm đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả chiết khi chiết bằng nước Việc so sánh các nhóm nhiệt độ cho phép xác định sự phụ thuộc của quá trình chiết vào nhiệt độ và xác lập điều kiện tối ưu cho thực tiễn ứng dụng.
Trong thí nghiệm, các bước còn lại được cố định theo quy trình dự kiến trong hình 2-1, với điều kiện nhiệt ở hai mức 100 °C và 25 °C Mỗi điều kiện được tiến hành hai lần để bảo đảm tính lặp lại và độ tin cậy của kết quả Kết quả thí nghiệm được trình bày chi tiết trong hình 3-5 và phụ lục 3.
Hình 3-5 Biểu đồ khảo sát nhiệt độ chiết rắn – lỏng
Kết quả cho thấy chiết nước ở nhiệt độ cao làm giảm đáng kể nồng độ PG, có thể do PG dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao [32] Kết quả tối ưu được ghi nhận khi dùng nước cất hai lần ở 25 °C và chiết ở 25 °C Vì vậy, điều kiện chiết rắn – lỏng ở 25 °C sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.
3.3.1.2 Khảo sát thời gian chiết rắn – lỏng
Quy trình chiết bằng nước ở nhiệt độ 25 o C được thực hiện trên mẫu đã khẳng định dương tính với PG Thời gian khảo sát được thực hiện ở năm mức: 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút và 30 phút, mỗi mức được lặp lại hai lần Các bước còn lại được giữ nguyên như hình 2-1 Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong hình 3-6 và phụ lục 4.
Hình 3-6 Biểu đồ khảo sát thời gian chiết rắn - lỏng
Dựa trên kết quả tín hiệu thu được, thời gian chiết được lựa chọn là 15 phút
3.3.1.3 Khảo sát số lần chiết rắn – lỏng
Trong phương pháp chiết được khảo sát, hai điều kiện đã được thử nghiệm: chiết ở nhiệt độ 25 °C trong 15 phút và tiếp tục thực hiện trên mẫu khẳng định dương tính với PG Quá trình khảo sát các lần chiết được tiến hành theo hai vòng: chiết lần 1 và chiết lần 2, nhằm đánh giá tính lặp lại và hiệu suất của từng vòng chiết trên mẫu PG.
2 và chiết lần 3 Các thao tác còn lại giữ nguyên như hình 2-1 Mỗi điều kiện được tiến hành lặp lại 3 lần
Kết quả được biểu diễn trong hình 3-7 và phụ lục 5
Hình 3-7 Biểu đồ khảo sát số lần chiết rắn - lỏng
Kết quả cho thấy chiết lần thứ hai đạt khoảng 20% tín hiệu so với lần chiết đầu tiên, trong khi lần chiết thứ ba cho lượng thu được không đáng kể Vì vậy, chiết hai lần được xem là hiệu quả và tối ưu nhất cho quy trình chiết xuất.
Quy trình chiết rắn – lỏng được lựa chọn, một số chú ý:
Ở bước ly tâm để loại bỏ phần rắn, tủa rắn thường rã nhanh và phân tán lại trong nước khi ly tâm ở nhiệt độ phòng, gây khó khăn cho việc hút dịch chiết Để khắc phục hiện tượng này, nhiệt độ ly tâm được hạ xuống còn 0 o C, giúp tủa rắn duy trì trạng thái kết tụ và tăng hiệu quả hút dịch chiết.
Trong quá trình xử lý, tổng thể tích dịch chiết đạt khoảng 40 mL; do không thể dùng ống ly tâm 50 mL nên dịch chiết được chuyển vào bình thủy phân nhựa 250 mL để tiếp tục các thao tác tiếp theo.
Do dùng bình thủy phân nhựa 250 mL, trong quá trình dẫn xuất thể tích n-hexan được đẩy lên 30 mL Sau khi lắc với n-hexan, lượng dịch được chia sang hai ống ly tâm 50 mL để ly tâm.
Trong bước chiết xuất, hiện tượng huyền phù thường xuất hiện làm phức tạp việc tách lớp n-hexan và đòi hỏi phải kéo dài thời gian ly tâm để phân tầng hoàn toàn Để chiết dễ dàng hơn, sau khi cho n-hexan, thêm 10 g bột NaCl và tiến hành chiết tiếp; natri clorua tăng cường độ phân tầng giữa pha nước và pha hữu cơ, từ đó giúp tách lớp n-hexan nhanh chóng và hiệu quả hơn.
Thờm chớnh xỏc 100 àL EG 100 ppm
2 - 10 g mẫu đã đồng nhất trong ống ly tâm
Vortex 1 phút, lắc ngang 10 phút, ly tâm ở
Hút bỏ lớp n-hexan phía trên
Vortex 1 phút, lắc ngang 15 phút ở 25 o C , ly tâm ở 6000 rpm trong 5 phút ở 0 o C
Hút toàn bộ phần dịch chiết nước (2 lần) sang bình thủy phân nhựa 250 mL
Cặn trong ống ly tâm 50
Hút lớp n-hexan gộp vào ống ly tâm 50 mL
Vortex 1 phút, lắc ngang 10 phút Vortex 1 phút, lắc ngang 10 phút
Vortex 1 phút, hút vào vial, phân tích trên thiết bị LC-MS/MS
Thêm chính xác 1,00 mL ACN
San dịch sang 2 ống ly tâm 50 mL, ly tâm
Hình 3-8 Sơ đồ quy trình sau khi khảo sát quá trình xử lý mẫu
3.3.2 Khảo sát quy trình dẫn xuất
Khối lượng phân tử của PG rất thấp (76,10 Dalton) khiến PG không phù hợp cho phân tích khối phổ; do đó cần dẫn xuất để tạo ion có phân tử khối lớn hơn, điển hình là propylen glycol dibenzoat với khối lượng 284,31 Dalton Việc này đồng thời giảm nhiễu nền và cho phép đạt được LOD và LOQ thấp hơn [23].
Trong số các tác nhân dẫn xuất được lựa chọn dựa trên tính sẵn có và phổ biến, benzoyl chloride được xem là lựa chọn thích hợp nhờ hiệu quả cao để phản ứng với PG (propylene glycol) và EG (ethylene glycol) Khi các nhóm glycol phản ứng với benzoyl chloride, sẽ sinh ra HCl và tạo môi trường axit (hình 1-1); đây là một phản ứng cân bằng không triệt để Để tăng hiệu suất của phản ứng, quá trình này nên diễn ra trong môi trường kiềm mạnh.
Phản ứng dẫn xuất là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của phương pháp được áp dụng Để tối ưu hóa kết quả, quá trình này được khảo sát và điều chỉnh qua các tham số như thể tích NaOH 40%, thể tích benzoyl chloride, thời gian tạo dẫn xuất và thời thời gian chiết dẫn xuất (lỏng – lỏng).
Khảo sát quy trình dẫn xuất được tiến hành trên mẫu trắng; cân 10,00 g mẫu trắng, thêm 1000 μL PG 100 ppm và 100 μL EG 100 ppm, tiến hành theo quy trình chiết mẫu đã khảo sát; các bước còn lại được khảo sát lần lượt: (1) thể tích NaOH 40%; (2) thể tích benzoyl chloride; (3) thời gian dẫn xuất; (4) thời gian chiết dẫn xuất (chiết lỏng – lỏng) Kết quả khảo sát được tính dựa trên tỉ số diện tích pic PG so với diện tích pic EG (S_PG / S_EG).
3.3.2.1 Khảo sát thể tích NaOH 40%
Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
Mẫu phân tích là các mẫu đóng hộp có thành phần phức tạp, có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả phân tích LC-MS/MS Để đảm bảo độ tin cậy của dữ liệu, cần khảo sát mức độ ảnh hưởng của từng thành phần lên hiệu suất đo và biến đổi tín hiệu Việc đánh giá ảnh hưởng này giúp quyết định cách xây dựng đường chuẩn (calibration curve) phù hợp và xác định các kết quả phân tích khác liên quan Do đó, nghiên cứu ảnh hưởng của mẫu đối với LC-MS/MS là bước nền tảng để tối ưu hóa quy trình phân tích và nâng cao độ chính xác của kết quả.
Tiến hành dựng đường chuẩn trên 2 nền: (1) nền dung môi; (2) nền mẫu thực Kết quả được biểu thị trong hình 3-14 và phụ lục 10
Hình 3-14 Đồ thị đường chuẩn trên nền dung môi và nền mẫu thực
Từ 2 phương trình đường chuẩn, chênh lệch độ dốc của 2 đường chuẩn:
-79% Ảnh hưởng của nền mẫu vượt quá ± 20% theo AOAC do đó cần sử dụng đường chuẩn pha trên nền mẫu thực để tính kết quả phân tích.
Thẩm định phương pháp
3.5.1 Tính tương thích của hệ thống
Trong quy trình xử lý theo chuẩn, dung dịch chuẩn làm việc ở liều 2 mg/kg sẽ được tiêm lại sau khi thực hiện các bước xử lý như quy trình chung và được tiêm lặp lại tổng cộng 6 lần Kết quả thu được được trình bày chi tiết trong Bảng 3-4 và Phụ lục 11.
Bảng 3-4 Kết quả tính tương thích của hệ thống
STT t R PG (phút) Diện tích pic PG
Diện tích pic EG (counts)
STT t R PG (phút) Diện tích pic PG
Diện tích pic EG (counts)
RSD% < 2,0% cho thấy phương pháp ổn định
3.5.2 Độ chọn lọc của phương pháp Để đánh giá tính chọn lọc, tiến hành phân tích trên các mẫu trắng, mẫu chuẩn trong dung dịch nước cất và mẫu trắng thêm chuẩn Hình 3-15 biểu diễn sắc ký đồ của
PG và EG trên các mẫu trắng, chuẩn (mẫu chuẩn trong dung dich nước cất) và thêm chuẩn
Hình 3-15 Sắc ký đồ của PG ở mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn
Thông qua sắc ký đồ, tín hiệu của hai hợp chất PG và EG trên nền mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn xuất hiện ở thời gian trùng khớp, với mức chênh lệch không quá 5% so với thời gian lưu của các hợp chất tương ứng trong chuẩn Kết quả cho thấy phương pháp sắc ký được hiệu chuẩn chính xác và có độ lặp lại cao, đảm bảo phân tích đáng tin cậy của PG và EG trong mẫu.
PG là 3,86 phút và EG là 3,66 phút, không xuất hiện pic trên mẫu trắng ở khoảng thời gian của 2 pic nói trên, đáp ứng yêu cầu theo tiêu chuẩn của Hội đồng Châu Âu
Ngoài ra, để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp LC – MS/MS, chúng ta còn dùng kỹ thuật tính số điểm IP và tỷ lệ ion xác nhận chia cho ion định lượng làm thước đo Kỹ thuật này giúp phân biệt các ion đặc hiệu khỏi các ion nhiễu và tăng độ tin cậy của kết quả phân tích Việc tính số điểm IP cho thấy mức đáp ứng tín hiệu ở các mức đặc hiệu, trong khi tỷ lệ ion xác nhận trên ion định lượng được sử dụng như một chỉ tiêu để đánh giá tính đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp, theo các tiêu chuẩn được nêu trong Chỉ tiêu.
38 thị 808/2021/EC của Hội đồng Châu Âu [16]
Trong kỹ thuật LC-MS/MS, điểm số được tính theo: tách LC được 1 điểm, mỗi ion mẹ (phân tử ion) được 1 điểm và mỗi ion con (ion sản phẩm) được 1,5 điểm Trong nghiên cứu, PG được nhận diện bởi 1 ion mẹ và 2 ion con, nên tổng điểm là 5.
IP là 5 và đáp ứng yêu của Hội đồng Châu Âu
Trong các mẫu chuẩn trung bình, tỷ lệ ion PG2/PG1 đạt 16%, nằm trong mức cho phép ±30% Ở mẫu thực, tỷ lệ PG2/PG1 là 15%, và đáp ứng đầy đủ yêu cầu chất lượng Kết quả được trình bày trong phụ lục 12.
3.5.3 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ Định lượng PG trong các mẫu thức ăn cho mèo, chúng tôi tiến hành khảo sát LOQ ở mức nồng độ 0,5 mg/kg trên mẫu trắng thì được kết quả S/N = 20,3 (yêu cầu theo AOAC S/N ở LOQ bằng 10), đồng thời mức 0,5 mg/kg thấp hơn nhiều so với hầu hết các nghiên cứu trước đó nên LOQ của phương pháp là < 0,5 mg/kg Phân tích lặp lại 6 lần Sau khi xác nhận được giá trị LOQ, LOD sẽ được tính toán dựa trên công thức LOQ =3,3 LOD Kết quả LOQ và LOD được trình bày trong bảng 3-5
Bảng 3-5 Giá trị LOD, LOQ
LOD (mg/kg) LOQ (mg/kg)
Sắc ký đồ tại giá trị LOQ được trình bày trong hình 3-16
Hình 3-16 Sắc ký đồ tại giá trị LOQ
3.5.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Pha dãy chuẩn làm việc ở các nồng độ 0,5; 1; 2; 5; 10 và 20 mg/kg, thực hiện thêm chuẩn vào mẫu trắng và xử lý tương tự như mẫu thử, phân tích trên LC-MS/MS Xây dựng đường chuẩn bằng cách xác định mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích peak PG/EG và nồng độ PG Đường chuẩn được lập theo phần mềm của thiết bị.
Kết quả đường chuẩn được trình bày ở hình 3-17, bảng 3-6 và phụ lục 13
Hình 3-17 Đường chuẩn Bảng 3-6 Đường chuẩn của PG
Nồng độ mong muốn (mg/kg)
Nồng độ tính toán (mg/kg) Phương trình hồi quy tuyến tính Độ lệch (%)
Kết quả cho cho thấy trong khoảng nồng độ 0,5 mg/kg đến 20 mg/kg có tỷ lệ
S PG /S EG tỷ lệ tuyến tính với nồng độ với hệ số xác định r 2 > 0,99 và độ chệch < 15% với tất cả các giá trị
3.5.5 Độ chụm và độ đúng
3.5.5.1 Độ lặp lại và độ đúng Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu đã được xác định không chứa PG, tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng Các mẫu được thêm chuẩn ở các mức nồng độ 2; 10 và 20 mg/kg Kết quả trình bày trong bảng 3-7 và phụ lục 14
Bảng 3-7 Kết quả độ lặp và độ thu hồi của PG trên nền pate đóng hộp
Diện tích pic PG (counts)
Diện tích pic EG (counts)
Diện tích pic PG (counts)
Diện tích pic EG (counts)
Kết quả độ thu hồi từ 90,0% -109%; RSD từ 2,1% - 4,8% do đó phương pháp đạt tiêu chí độ đúng và độ lặp lại (so với bảng 2.6)
3.5.5.2 Độ tái lập nội bộ Độ tái lập nội bộ được tiến hành vào ngày sau đó ở mức nồng độ 2 mg/kg, kết quả biểu diễn trong bảng 3-8 và phụ lục 15
Bảng 3-8 Độ tái lặp nội bộ của PG trên nền pate đóng hộp
Diện tích pic PG (counts)
Diện tích pic EG (counts)
Kết quả phân tích cho thấy độ thu hồi có RSD% nằm trong khoảng 80–110%, độ lặp lại (RSD%) từ 2,8–4,8%, và độ tái lặp nội bộ (RSD) đạt 13,7% Tất cả các thông số này đều nằm trong giới hạn cho phép, cho thấy phương pháp phân tích có độ đúng và độ chụm đáp ứng yêu cầu của AOAC.
Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng PG trong thức ăn cho mèo
Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng, chúng tối tiến hành xác định hàm lượng
Nghiên cứu xác định hàm lượng PG trên các mẫu pate đóng hộp lấy từ thị trường Hà Nội, với kết quả hàm lượng PG được tổng hợp trong bảng 3-9 và sắc ký đồ của mẫu thử được trình bày trong hình 3-18 và phụ lục 16.
Bảng 3-9 Bảng kết quả phân tích mẫu pate đóng hộp
Mẫu Nguồn gốc Khối lượng cân (g) Nồng độ (mg/kg) 5011dv1
Mẫu Nguồn gốc Khối lượng cân (g) Nồng độ (mg/kg)
Với LOD < 0,15 mg/kg; LOQ < 0,5 mg/kg
Kết quả phân tích mẫu thực tế về các mẫu pate đóng hộp được thu thập trên địa bàn Hà Nội cho thấy 23/40 mẫu chứa PG ở mức nồng độ từ 0,5 mg/kg Trong số này, một số mẫu có hàm lượng gần 200 mg/kg, chủ yếu tập trung ở Quận Hoàng Mai và Quận Bắc Từ Liêm.
Hình 3-18 Sắc ký đồ của một số mẫu pate đóng hộp cho mèo
Mẫu 5074dv12 Mẫu 5073dv9 Mẫu 5015dv2
Bàn luận
3.7.1 Bàn luận về phương pháp phân tích
Phần lớn các nghiên cứu trước đây về PG tập trung vào mẫu lỏng và được phân tích bằng GC-FID, GC-MS hoặc LC-MS Nghiên cứu này đóng góp bằng việc định lượng PG trong mẫu rắn, đặc biệt là mẫu thực phẩm Việc đo PG ở trạng thái rắn cung cấp dữ liệu về mức độ hiện diện và phân bố của PG trong các sản phẩm thực phẩm, từ đó hỗ trợ đánh giá chất lượng và an toàn thực phẩm Phương pháp phân tích được tối ưu cho mẫu rắn cho kết quả định lượng đáng tin cậy và có khả năng áp dụng trực tiếp vào quy trình kiểm tra chất lượng trong công nghiệp chế biến thực phẩm Những kết quả này mở ra cơ hội mở rộng nghiên cứu PG ở nhiều loại thực phẩm và cải thiện chuẩn mực phân tích trong chuỗi cung ứng thực phẩm.
3.7.1.1 Bàn luận về quy trình xử lý mẫu
Dựa trên các TLTK [23, 25, 34], quy trình xử lý mẫu dự kiến đã được đưa ra Tuy nhiên trong quá trình khảo sát thực tế có một số thay đổi
Khác với phương pháp chiết nóng được thực hiện ở nghiên cứu [13], nghiên cứu này tiến hành chiết ở nhiệt độ 25°C, cho thấy chiết ở nhiệt độ phòng phù hợp với đặc tính của PG (propylene glycol), một chất không ổn định ở nhiệt độ cao Việc chiết ở nhiệt độ thấp giúp bảo toàn chất lượng PG và làm nổi bật sự khác biệt so với các phương pháp chiết ở nhiệt độ cao trước đó.
Trong nghiên cứu [34], EG được lựa chọn làm chuẩn nội EG có nhiều điểm tương đồng về cấu trúc với PG và có khả năng phản ứng với benzoyl chloride tương tự PG Trong công trình này, các mẫu thử đều không chứa EG nên việc sử dụng EG làm chất chuẩn nội được xem là phù hợp để đảm bảo độ chính xác và độ lặp của phân tích.
Trong nghiên cứu này, derivat hóa bằng benzoyl chloride được thực hiện như các công trình trước [23, 25, 34], nhưng khác biệt ở việc dùng 8 mL NaOH 40% và 0,2 mL benzoyl chloride với thời gian phản ứng 10 phút để phù hợp với mẫu lipids thực phẩm Thời gian phản ứng ngắn hơn so với các nghiên cứu trước Vì mẫu là lipid thực phẩm nên cần loại bỏ béo trước khi chiết để tránh nhiễu tín hiệu do hiện tượng nhũ tương, phù hợp với các nghiên cứu thức ăn trước đây [13] Điểm khác biệt là chúng tôi loại bỏ béo trước bước chiết nhằm tránh nhũ hóa và thuận lợi cho quá trình ly tâm.
Nền mẫu ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, thể hiện qua ME% = -79%, cho thấy hiện tượng ion suppression làm giảm cường độ ion do nền mẫu Giải pháp khắc phục là bổ sung spike chuẩn vào nền mẫu thử không chứa PG, nhằm hiệu chỉnh tín hiệu và giảm sai lệch do nền.
Phương pháp định lượng PG xây dựng trong đề tài cho thấy ưu điểm rút ngắn thời gian phân tích còn 8 phút so với 11 phút trong [25] và 19 phút trong [29], đồng thời hạ thấp được LOD và LOQ xuống (