BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA LÁ HẸ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022... B
TỔNG QUAN
Tên khoa học và vị trí phân loại
Hẹ có tên khoa học là Allium tuberosum Rottler ex Spreng [3], [22] và nhiều tên đồng nghĩa như Allium odorum L [6], [7], Allium uliginosum G Don [1], nén tàu, cửu thái, phỉ tử, kìu sỏi (Dao), phiếc cát ngào (Thái) [1]
Hẹ thuộc chi Hành (Allium L.) Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín APG IV (2016), vị trí phân loại của chi Allium L như sau [10], [21], [22]:
Họ: Thủy Tiên (Amaryllidaceae) Phân họ: Hành (Allioideae) Chi: Hành (Allium L.) Loài: Allium tuberosum R.
Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố
Hẹ là cây cỏ nhỏ, cao 20 – 45cm, toàn cây có mùi đặc biệt Thân hành, nhỏ gầy, thường hợp thành túm, hình nón – trụ, có áo mỏng màu nâu vàng, bị xé thành sợi [4] Thân rễ mọc ngang, chếch [4] Lá hẹp, dài, dày, thường là 4 – 5 lá, dài 10 – 27 cm rộng 1,5 – 9 mm, bẹ lá dài và mỏng, đầu nhọn, mọc ốp vào nhau thành hai dãy [1], [7] Cây có cụm củ hình trụ ở thân rễ nằm ngang, màu vàng nâu [30] Cụm hoa tụ thành hình xim nhưng co ngắn lại thành tán giả, mọc trên một cán dài hơn lá, dài 15 – 30 cm, hình trụ hoặc 3 cạnh, có vạch dọc Hoa nhiều có cuống dài, bao hoa màu trắng gồm 6 phiến thuôn, mũi mác, xếp thành 2 vòng, nhị có gốc đính vào các mảnh của bao hoa, cuống hoa dài chừng 10 – 15 mm, đường kính 4 mm [1], [7] Lá bắc tổng bao dạng mo, mỏng, xẻ 1 bên hoặc xẻ 2 – 3 mảnh, ngắn hơn cụm hoa Nhị 6, gốc chỉ nhị hợp và dính với bao hoa, dài bằng ẵ bao hoa; bao phấn đớnh lưng, 2 ụ mở bằng khe dọc Bầu thượng, hỡnh chựy ngược, phía ngoài có những nốt nhỏ, 3 cạnh tròn, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn, vòi nhụy rất ngắn, đầu nhụy không rõ [4] Quả nang, hình trái xoan ngược hoặc hình cầu hơi dẹt, chia 3 mảnh Hạt nhỏ, màu đen [1], [4], [3] Cây mọc bằng hạt hoặc bằng cách phân thành từng khóm [22] Cây phát triển tốt trong điều kiện đất ẩm, râm mát,
3 đất hữu cơ sẽ cho năng suất tốt hơn [1], [30] Vào mùa đông, lá tiêu biến dần, chỉ còn lại rễ và thân rễ nhưng sẽ mọc lại và phát triển bình thường vào mùa xuân [30] Mùa hoa thường vào tháng 6 – 8 Mùa quả thường vào tháng 8 – 10 [7]
Chi Allium L thuộc họ Amaryllidaceae với hơn 850 loài khác nhau [21] và được tìm thấy trên khắp Bắc Mỹ, Bắc Phi, Châu Âu, Châu Á [33]
Hẹ có nguồn gốc hoang dại ở vùng Trung và Bắc Á Cây được người Trung Quốc đưa vào trồng khoảng 200 năm trước Công nguyên Sau đó là các nước Triều Tiên, Nhật Bản, Nepal, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Indonesia, Hoa Kỳ Hiện nay, Trung Quốc là nước trồng hẹ nhiều nhất thế giới Ở Việt Nam, Hẹ cũng được trồng từ rất lâu và được trồng khắp nơi để làm thực phẩm, gia vị hoặc để làm thuốc [1].
Thành phần hóa học
Trong lá Hẹ có chứa flavonoid, saponin, tanin, đường khử, các hợp chất sulfid, alkaloid [29] Trong 100g Hẹ có chứa 93g nước, 2,2g protein, 0,1g chất béo, 2,8g carbohydrat, 0,9g chất xơ, 4mg caroten và 25mg vitamin C Hẹ có 4 loại đường là fructose, glucose, galactose và saccharose [1] Trong thành phần của Hẹ còn chứa odorin có tác dụng kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus và Bacillus coli [7]
Các thành phần được tìm thấy trong tinh dầu lá Hẹ chia thành các nhóm: monosulfid, disulfid, trisulfid, tetrasulfid, pentasulfid, hợp chất chứa oxy và terpen Các hợp chất chứa lưu huỳnh chiếm đến 88%, các hợp chất chứa oxy chỉ chiếm 1,5% tổng hàm lượng tinh dầu lá Hẹ Thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất trong tinh dầu Hẹ là allyl methyl disulfid (39,3%), tiếp theo là dimethyl disulfid (12,6%) [33] Theo Mnayer và cộng sự, thành phần chính trong tinh dầu lá Hẹ chủ yếu là dimethyl disulfid (19,58%), allyl methyl disulfid (14,37%), dimthyl trisulfid (14,34%), allyl methyl trisulfid (7,24%), methyl-1-propenyl disulfid (6,07%), diallyl disulfid (5,14%) [27] Năm 2015, các nhà khoa học Trung Quốc đã báo cáo thành phần chính của tinh dầu Hẹ bao gồm allyl methyl trisulfid (36,24%), diallyl disulfid (27,26%), diallyl trisulfid (18,68%), dimethyl trisulfid (9,23%) [36]
Có thể thấy, tuy thành phần và hàm lượng cấu tử ở các nghiên cứu là khác nhau nhưng tất cả đều chỉ ra rằng thành phần chính của Hẹ là các hợp chất sulfid, đặc biệt là các disulfid và trisulfid
Hẹ chứa khoảng 31,10 (mgQE/g) flavonoid trong cắn chiết ethanol và 16,74 (mgQE/g) flavonoid trong cắn chiết nước Trong đó, hàm lượng flavonoid được tính theo microgam quercetin trong 1 mg cắn chiết (àgQE/mg) Đó cú nhiều hợp chất flavonoid được phân lập từ lá Hẹ (Bảng 1.1) [29]
Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid được tìm thấy từ Hẹ
STT Tên hợp chất TLTK
1-yl]-β-D-glucopyranosyl]-β-D-glucopyranosyl]-oxy]-7-(β-D- glucopyranosyloxy)-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1- benzopyran-4-on
[[2-O-[6-O-[(2E)-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxo 2- propen-1-yl]-β-D-glucopyranosyl]-β-D-glucopyranosyl]-oxy]-
3 3,7-bis-(β-D-glucopyranosyl-oxy)-5-hydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on [13]
7-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]-3-[(2-O-β-D- glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)-oxy]-5-hydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on
5 3-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)-oxy]-5,7- dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on [13]
D-glucopyranosyloxy)-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1- benzopyran-4-on
7 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D- glucopyranosyl)-oxy]-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on [13]
8 Quercetin-3-O-(6-trans-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-(12)- β-D-glucopyranoside-7-O- β-D-glucopyranosid [13]
Trong đó, hợp chất (12) và (13) được phân lập sớm nhất bởi Yoshida và cộng sự vào năm 1987 [40] Năm 2001, hợp chất (14) được phân lập bởi Lee và cộng sự [26] Năm
2010, các nhà khoa học Đức phân lập ra hợp chất (11) [39] Năm 2016, Gao và cộng sự đã phân lập được 10 hợp chất flavonoid mới từ lá Hẹ Trong đó, 3 hợp chất (8), (9), (10) lần đầu tiên xác định được cấu trúc và 7 hợp chất (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) có cấu trúc đã biết Hai hợp chất mới (8) và (9) được nghiên cứu cho thấy, chúng dễ dàng bị acid dịch vị thủy phân tạo thành kaempferol, quercetin, acid ferulic và glucose Trong đó kaempferol, quercetin, acid ferulic là những chất được công nhận có hoạt tính sinh học
Hạt của Hẹ là một nguồn giàu saponin steroid Từ năm 1999 đến 2002, 13 hợp chất saponin đã được xác định từ hạt của loài cây này, chúng được đặt tên lần lượt là tuberosid
A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M [22] Năm 2003, 8 saponin mới đã được báo cáo với tên và công thức phân tử lần lượt là tuberosid N (C45H74O18), tuberosid O (C33H54O10), tuberosid P (C39H64O14), tuberosid Q (C39H64O15), tuberosid R (C39H64O15 - đồng phân hình học của tuberosid Q), tuberosid S (C51H84O22), tuberosid T (C51H84O21), tuberosid U (C51H86O22) [22], [34]
Năm 2015, Fang và cộng sự đã phân lập được 3 saponin mới từ rễ Hẹ (Bảng 1.2)
Bảng 1.2 Các saponin mới được tìm thấy từ rễ Hẹ
Tên thường Danh pháp IUPAC CTPT
Tuberosin C (25S)-5b-spirostan-2b,3b-diol-3-O-α-L- rhamnopyranoyl-(14)-O-β-D-glucopyranosid C39H64O13
Công thức cấu tạo của 3 saponin mới nhất được tìm thấy từ rễ Hẹ:
Tuberosin C OH α-L-Rha α-L-Rha α-L-Rha α-L-Rha
Năm 1988, Choi và cộng sự đã phân lập được alkaloid đầu tiên từ Hẹ có tên (-)-3S- 1,2,3,4-tetrahydro-β-carbolin-3-carboxylic acid với cấu trúc [11]:
(-)-3S-1,2,3,4-tetrahydro-β-carbolin-3-carboxylic acid Đến nay, vẫn chưa tìm thấy thêm thông tin nào liên quan đến các alkaloid mới được tìm thấy từ Hẹ
Năm 1992, các nhà khoa học tại Hàn Quốc đã phân lập được một số acid amin từ
Hẹ Trong đó, các acid amin chính được xác định là alanin (9,9%), valin (7,44%), acid glutamic (8,67%), acid aspartic (6,31%) [31]
Năm 2018, Gu và cộng sự đã xác định được sự có mặt của các nucleotid từ cắn chiết EtOH 70% của Hẹ gồm: uracil (4-pyrimidinediol; C4H4N2O2); thymin (2,4-hydroxy-5- methylpyrimidin; C5H6N2O2), thymidine (1-(2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-5-methyluracil;
C10H14N2O5) và adenosin (9-(β-D-ribofuranosyl) adenin; C10H13N5O4) Trong đó, hàm
8 lượng của từng nucleotid lần lượt là: uracil 0,756 mg/g; thymin 0,543 mg/g; thymidin 0,435 mg/g; adenosin 0,480 mg/g [15].
Tác dụng dược lý
Odorin trong lá Hẹ có tác dụng kháng khuẩn với Staphylococcus aureus và Bacillus coli Nước ép tươi của lá Hẹ cũng có tác dụng kháng khuẩn với các chủng Salmonella typhi, Shigela flexneri, Bacillus subtilis, Coli pathogene và Coli bethesda Tính chất kháng sinh này khá vững bền, cụ thể: nước ép của Hẹ, ly tâm để bỏ cặn, lấy nước trong, hấp Tyndall để lâu vẫn giữ được tính chất sinh kháng sinh Tính chất kháng sinh của Hẹ chỉ mất một ít khi chịu tác dụng của pepsin, nhưng nếu đun nóng (sắc) thì mất hết tác dụng kháng sinh [7] Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nước ép lá Hẹ trên các chủng vi khuẩn:
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 19659, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium ATCC 13311, Escherichia coli ATCC
25922, Enterococcus faecalis ATCC 49452 bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, kết quả cho thấy nước ép lá Hẹ có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên S aureus và B subtilis, yếu hơn trên E coli, S typhimurium, E faecalis và không có tác dụng kháng khuẩn trên P aeruginosa Khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn của Hẹ và Allium sativum L trên các vi khuẩn trên, Hẹ thể hiện tác dụng kháng khuẩn tốt hơn [25]
Một số vi khuẩn Gram (+) như Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 8739, Campylobacter jejuni ATCC 33291, Staphylococcus aureus ATCC
25923 đều nhạy cảm với tinh dầu lá Hẹ Tuy nhiên, Listeria monocytogenes ATCC
19115 đề kháng với tinh dầu này [27] Thành phần diallyl sulfid được xem là chất có vai trò chính trong tác dụng kháng khuẩn của Hẹ Ngoài ra, có thể kể đến vai trò của allyl methyl disulfid, dimethyl trisulfid, allyl methyl trisulfid, các dẫn xuất propyl [27] hoặc các hợp chất thiosulfinat như S-methylmethanthiosulfinat và S-methyl-2-propen-1- thiosulfinat [35]
1.4.2 Tác dụng bảo vệ gan
Nghiên cứu của Sutejo năm 2017 cho thấy, cắn chiết ethanol 70% của lá Hẹ có tác dụng bảo vệ gan Nghiên cứu này được thực hiện trên chuột Wistar đã bị tổn thương gan do sử dụng doxorubicin Để đánh giá mức độ tổn thương gan do doxorubicin gây ra, Sutejo và cộng sự đã căn cứ vào nồng độ của glutamat oxaloacetat transaminase (SGOT hoặc AST), glutamat pyruvat transaminase (SGPT hoặc GPT) và malondialdehyd (MDA) Đây được xem như là những chỉ số thể hiện tổn thương gan, khi các chỉ số này tăng cao là
9 dấu hiệu gan đang bị tổn thương Sau khi sử dụng cắn chiết lá Hẹ với liều 1000 mg/kg thì nồng độ SGOT, SGPT và MDA huyết thanh chuột giảm đi đáng kể [37]
Năm 2017, Xingli và cộng sự thực hiện nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ đường huyết của lá Hẹ trên chuột Wistar bị tiểu đường do dùng alloxan monohydrat (liều 150 mg/kg) Đánh giá kết quả dựa trên nồng độ glucose trong máu lúc đói (FBG) Lá Hẹ sau khi chiết với MeOH 80% được chiết phân đoạn lỏng – lỏng lần lượt qua n-hexan, ethyl acetat và n-BuOH Phần cắn chiết sau phân đoạn cuối cùng được sử dụng trên chuột ở các nồng độ khác nhau Sau khi sử dụng cắn chiết lá Hẹ ở các nồng độ 100, 200, 400mg/kg trong 3 tuần, kết quả cho thấy FBG của chuột đã giảm đi đáng kể [37]
Năm 2007, Part và cộng sự đã phân lập được 2 thiosulfunat là S- methylmethanthiosulfinat và S-methyl-2-propen-1-thiosulfinat từ cắn chiết dichlomethan của cây Hẹ Các hợp chất này được chứng minh là có tác dụng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 [32] Ngoài ra, Hẹ còn là nguồn nguyên liệu thiên nhiên vô cùng hữu ích trong điều trị bệnh ung thư ruột kết Cụ thể, các hợp chất thiosulfinat phân lập từ cắn chiết dichlomethan của Hẹ có tác dụng ức chế đáng kể sự phát triển của các tế bào ung thư ruột kết HT-29 Cơ chế được giải thích do thiosulfat hoạt hóa các enzym caspase-8, caspase-9 và caspase-3 từ đó kích hoạt quá trình chết theo chương trình của tế bào Ngoài ra, bản thân thisulfat cũng có thể trực tiếp kích hoạt quá trình này mà không cần thông qua các enzym caspase [22] Năm 2007, Kim và cộng sự đã chứng minh rằng các thiosulfinat phân lập từ cắn chiết dichlomethan của cây Hẹ có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt Rc-58T/h/#4 ở người với cơ chế tương tự như trên [23]
1.4.5 Chống côn trùng, ký sinh trùng
Hẹ có đặc tính diệt ký sinh trùng, chống lại các loại trùng đốt rễ, đặc biệt là
Meloidogyne incognita J2 - một loại ký sinh trùng tấn công các mô mạch của rễ cây Thử nghiệm in vivo với cắn chiết nước của Hẹ cho thấy nó tác dụng tiêu diệt đáng kể ký sinh trùng này [20] Năm 2018, Gao và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng đuổi côn trùng của tinh dầu Hẹ với ấu trùng Plutella xylostella và thu được kết quả rất khả quan
Cơ chế được giải thích là do cắn chiết của Hẹ đã ức chế glutathion S-transferase và carboxylesterase trong ấu trùng [14]
Thiosulfinat của Hẹ cho thấy hoạt tính kháng nấm đối với Aspergillus niger, Aspergillus flavus và Aspergillus fumigatus [9] Theo Koceyski và cộng sự, thành phần
10 allytrisulfat được phân lập từ Hẹ có tác dụng ức chế các chủng nấm Aspergillus flavus và
Aspergillus oryzae ở nồng độ tối thiểu 250 ppm [24] Năm 2018, Trương Thị Mỹ Hạnh và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng kháng nấm của nước ép lá Hẹ trên chủng
Saprolegnia sp., kết quả cho thấy nước ép lá Hẹ có tác dụng kháng Saprolegnia sp Khi dùng ở nồng độ 15.000 ppm trong 6h và 13.000 ppm trong 24h [5]
Một số hợp chất từ cắn chiết ethanol của lá Hẹ khi tan trong nước tạo các acid amino-styren và glycosid đều cho tác dụng chống đông máu mạnh [22] Bên cạnh đó, việc chứa hàm lượng lớn các hợp chất lưu huỳnh cũng là một nguyên nhân có thể giải thích cho tác dụng trên của Hẹ Các hợp chất lưu huỳnh có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu do một số cơ chế giả định: hợp chất lưu huỳnh có thể gián tiếp ức chế sự liên kết của tiểu cầu với các sợi fibrinogen thông qua việc ức chế thụ thể GP-IIb và IIIa, từ đó hạn chế việc hình thành huyết khối Trong đó, GP-IIb và IIIa là thụ thể của fibrinogen trên bề mặt tiểu cầu [38].
Công dụng
Hẹ là một vị thuốc kinh nghiệm của nhân dân Toàn cây Hẹ có vị cay, tính ôn trung, kiện vị, hành khí, tán ứ, chỉ hãn Hạt Hẹ có vị cay, tính ôn, tốt cho gan thận, tráng dương, cố tinh Theo kinh nghiệm dân gian, lá và thân hành Hẹ chữa ho cho trẻ em, hen suyễn, tiêu hóa kém, giun kim, lỵ amip, mồ hôi trộm với liều dùng hằng ngày 20 – 30g Hạt Hẹ chữa bệnh di tinh, mộng tinh, đái són, đái dầm, đau lưng, mỏi gối, khí hư với liều 4 – 12g mỗi ngày[1], [7], viêm tuyến tiền liệt và ỉa chảy [3] Người âm hư hỏa vượng không nên dùng [1], [7]
Hẹ được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc với nhiều công dụng như tăng cường miễn dịch, thúc đẩy tiêu hóa, rễ của Hẹ có thể dùng để ngăn ngừa loét dạ dày và điều trị chứng khó tiêu Ở Ấn Độ, nước sắc lá Hẹ được dùng để chữa rối loạn chức năng gan, rối loạn tiêu hóa, giảm lượng đường huyết và cholesterol trong huyết thanh, điều trị bệnh di tinh và làm thuốc kích thích mọc tóc, đắp lên các vết thương giúp cầm máu, tránh nhiễm trùng Ở Philippin, Hẹ được sử dụng để điều trị hen suyễn hoặc sử dụng toàn cây làm thuốc đắp giúp hạ sốt [22].
Một số bài thuốc dân gian từ Hẹ
- Bài thuốc chữa ho cho trẻ em: Lá Hẹ 15g, hoa đu đủ 15g, hạt chanh 20 hạt Tất cả dùng tươi, cho vào bát sạch, giã nát, thêm đường và 10ml nước Đem hấp để nguội, cho trẻ em uống làm 3 lần trong ngày, dùng 3 – 4 ngày liên tục Hoặc lấy lá Hẹ 15g phối hợp với lá đậu non 10g Cách làm và dùng như trên [1]
- Chữa hen suyễn nguy cấp: Lá Hẹ 50g, sắc với 200ml nước còn 50ml Uống trong ngày [1]
- Chữa chứng ợ chua: Nước ép lá Hẹ 60ml, sữa bò 250ml, uống nóng với 15ml nước gừng tươi [1]
- Chữa giun kim ở trẻ em, ra mồ hôi trộm: Lá Hẹ 30g, ép lấy nước uống hoặc làm rau ăn trong ngày [1]
- Chữa nam giới thận hư, di mộng tinh, phụ nữ bạch đới: Lá Hẹ đem ngâm giấm, rang khô, tán bột, trộn với mật làm thành viên bằng hạt đậu Mỗi lần uống 3,5 – 5g vào lúc đói với rượu nóng [1]
- Rượu bổ thận tăng cường hoạt động sinh dục của nam giới: Lá Hẹ 200g, con ngài tằm đực khô 1000g, Dâm dương hoắc 600g, Câu kỷ tử 200g, Kim anh 500g, Ngưu tất 300g, Ba kích 500g, Thục địa 400g, Sơn thù 300g, đường kính 4kg Tất cả ngâm trong cồn 40 o (20 L) Uống mỗi lần 10 – 15 ml, ngày 2 lần [1]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là toàn cây Hẹ, được thu hái vào tháng 4 năm 2022 tại Nam Từ Liêm, Hà Nội Sau khi thu hái, một phần dược liệu tươi được cắt nhỏ, sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 o C, bảo quản ở túi nilon sạch kín, để nơi khô mát để sử dụng làm nghiên cứu Một phần được bảo quản trong tủ lạnh để nghiên cứu đặc điểm hình thái, giám định và lưu mẫu Một phần được cắt nhỏ để chiết lấy tinh dầu
Hóa chất và dung môi dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích DĐVN V gồm có:
- Các dung môi hữu cơ: ethanol 96%, ethyl acetat, toluen, acid fomic, n-hexan, toluen
- Các thuốc thử dùng cho phản ứng định tính: chì acetat 10%, thuốc thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử diazo, tinh thể Na2CO3, bột magie kim loại, anhydrid acetic, dung dịch gelatin 1%, chloroform, acid picric 1%, thuốc thử Baljet, acid clohydric đặc, acid sulfuric đặc, dung dịch FeCl3, dung dịch NaOH 10%,
- Thuốc thử dùng hiện màu trong SKLM: dung dịch vanilin-acid sulfuric được pha mới bằng cách phối hợp đồng thể tích vanilin 1% trong ethanol và dung dịch H2SO4 5% trong ethanol
- Dùng trong đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ: DMSO, kháng sinh streptomycin, cycloheximid, môi trường LB, các chủng vi sinh vật thử nghiệm: 4 chủng vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 299212, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC
14579, 2 chủng vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica
ATCC 13076 và chủng nấm men Candida albicans ATCC 10231
2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu, cốc có mỏ, bộ dụng cụ cất tinh dầu nặng hơn nước theo dược điển Mỹ, đĩa petri,
- Cân phân tích AND GR-200
- Bể siêu âm Daihan Scientific
- Kính hiển vi Leica DM 100
- Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao (CAMAG) bao gồm hệ thống chấm Limonat 5, bình triển khai sắc ký đôi, hệ thống chụp ảnh sắc ký TLC Visualizer
- Bản mỏng silicagel 60 F254 của Merck (Đức) tráng sẵn
- Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS
2.2.1 Thu mẫu và xác định hàm lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu
- Thu hái mẫu Hẹ, mô tả đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
- Xác định hàm lượng tinh dầu Hẹ bằng phương pháp cất kéo hơi nước
2.2.2 Định tính thành phần hóa học của lá Hẹ
- Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong lá Hẹ bằng các phản ứng hóa học
- Định tính dịch chiết toàn phần lá Hẹ bằng SKLM
2.2.3 Phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ
- Định tính tinh dầu lá Hẹ bằng SKLM
- Phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)
2.2.4 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ trên 4 chủng vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 299212, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 14579, 2 chủng vi khuẩn
Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica ATCC 13076 và chủng nấm men Candida albicans ATCC 10231
2.3.1 Thu mẫu nghiên cứu và giám định tên khoa học
Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu Đối chiếu đặc điểm của cây với các tài liệu và tham khảo ý kiến của chuyên gia về thực vật để giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
2.3.2 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá Hẹ
2.3.2.1 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá Hẹ bằng các phản ứng hóa học
Phương pháp định tính các nhóm chất trong dịch chiết toàn phần lá Hẹ bằng phản ứng hóa học được trình bày ở Phụ lục 3
2.3.2.2 Định tính dịch chiết toàn phần lá Hẹ bằng SKLM
Cân 3 g dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml EtOH 96%, đun cách thủy trong
5 phút, lọc nóng vào cốc có mỏ thu được dịch chiết toàn phần sau đó cô cách thủy đến cắn thu được cắn toàn phần của dịch chiết lá Hẹ Điều kiện sắc ký:
- Dịch chấm sắc ký: mẫu cắn toàn phần được hòa tan trong methanol
- Pha tĩnh: bản mỏng Silicagel 60 F254 được hoạt hóa ở 110 o C trong 1h
- Pha động: khảo sát các hệ dung môi khác nhau, chọn hệ cho khả năng phân tách tốt nhất
Hệ I: ethyl acetat – acid formic – acid acetic băng – nước (100:11:11:27)
Hệ II: ethyl acetat – acid formic – nước (6:1:3)
Hệ III: toluen – ethyl acetat – acid formic (6:4:1)
Hệ IV: toluen – ethyl acetat – acid formic (5:4:1)
- Cách tiến hành: Đưa mẫu lên bản mỏng bằng thiết bị phun mẫu Limonat 5 Vị trí tiờm mẫu cỏch mộp dưới 10 mm Độ dài băng chấm 10 mm Thể tớch tiờm mẫu là 10 àl
- Triển khai sắc ký: Đưa bản mỏng đã chấm vào bình triển khai sắc ký Sau khi triển khai, lấy bản mỏng ra và để khô ở điều kiện thường
- Phát hiện vết: Quan sát dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và 366 nm Hình ảnh sắc ký được chụp bằng hệ thống TLC Visualiser CAMAG Phun thuốc thử hiện màu là vanilin/H2SO4, sấy khô ở nhiệt độ 110 o C Quan sát dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm, hình ảnh được chụp bằng hệ thống TLC Visualiser CAMAG
2.3.3 Xác định hàm lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu
- Chuẩn bị mẫu dược liệu: Dược liệu tươi sau khi thu hái được rửa sạch, bảo quản trong túi ni-lông kín
- Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước, sử dụng bộ dụng cụ tinh dầu nặng hơn nước
- Thời gian tiến hành: 3 tiếng
- Bộ phận chưng cất: Phần trên mặt đất của cây Hẹ
+ Cân chính xác khoảng 5kg dược liệu đã được chuẩn bị, dùng máy xay làm nhỏ dược liệu
+ Cho dược liệu đã làm nhỏ vào nồi áp suất, thêm nước ngập bề mặt dược liệu, đậy nắp nồi
+ Lắp bộ dụng cụ chiết tinh dầu và sinh hàn
+ Đun dược liệu đến sôi, sau đó giảm nhiệt độ của bếp xuống 100 o C, đun liên tục trong khoảng 3 tiếng
+ Theo dõi quá trình tạo tinh dầu, đến khi thể tích tinh dầu không tăng thêm nữa thì tắt bếp, để nguội rồi đọc thể tích tinh dầu cất được
- Tính hàm lượng tinh dầu (% thể tích/khối lượng) so với dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:
H: Hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g)
V: Thể tích tinh dầu thu được (ml) m: Khối lượng dược liệu đem cất (g)
X: Hàm ẩm của dược liệu (%)
2.3.4 Xác định hàm ẩm của mẫu nghiên cứu
Xác định hàm ẩm trong dược liệu bằng phương pháp sấy: Lấy 1 lượng dược liệu đã được chia nhỏ thích hợp để xác định hàm ẩm Bật máy đo hàm ẩm Ohaus, điều chỉnh nhiệt độ 130 o C Đổ dược liệu lên đĩa cân và trải đều, đậy nắp cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình
2.3.5 Định tính tinh dầu lá Hẹ bằng sắc ký lớp mỏng Điều kiện sắc ký:
- Dịch chấm sắc ký: mẫu tinh dầu đã cất được loại nước bằng Na2SO4 khan, sau đó pha loãng đến nồng độ 1/30 bằng toluen
- Pha tĩnh: Bản mỏng silicagel 60 F254 được hoạt hóa ở 110 o C trong 1h
- Pha động: khảo sát các hệ dung môi khác nhau, chọn hệ cho khả năng phân tách tốt nhất
- Cách tiến hành: đưa mẫu lên bản mỏng bằng thiết bị phun mẫu Limonat 5 Vị trí tiêm tiêm mẫu cách mép dưới 10 mm Độ dài băng chấm 10 mm Thể tích tiêm mẫu là 10àl
- Triển khai sắc ký: Đưa bản mỏng đã chấm vào bình triển khai sắc ký Sau khi triển khai, lấy bản mỏng ra và để khô ở điều kiện thường
- Phát hiện vết: Quan sát dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm và 366nm Hình ảnh sắc ký được chụp bằng hệ thống TLC Visualiser CAMAG Phun thuốc thử hiện màu là Vanilin/H2SO4, sấy khô ở nhiệt độ 110 o C Quan sát dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm, hình ảnh được chụp bằng hệ thống TLC Visualiser CAMAG
2.3.6 Phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)
Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS) gồm có thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu sau khi tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký sẽ được detector khối phổ nhận biết Hiện nay phương pháp này được áp dụng phổ biến để định tính dựa vào thời gian lưu hay định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích pic tinh dầu
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu
Các đặc điểm hình thái và các bộ phận của cây được mô tả ở hình 3.1 và 3.2 với các đặc điểm như sau: Cây cỏ nhỏ, thân hành nhỏ gầy cao 18 – 45 cm, mọc thành khóm, có mùi hăng đặc trưng Lá dài, nhỏ, hẹp, mỏng, đầu nhọn, dài khoảng 6 – 25 cm, rộng khoảng 2 – 8 mm, mọc ốp vào nhau thành hai dãy Lá đơn, nguyên, mọc so le thành hai dãy, hướng lên trên Bẹ lá dài, mỏng, màu trắng, ốp vào nhau tạo thành thân giả Thân giả màu trắng, cao 5 – 7 cm, đường kính 0,3 – 0,7 cm Thân rễ màu vàng nhạt, dài 4 – 7 cm, đường kính khoảng 1 mm, có nhiều rễ con Cụm hoa là tán giả, mọc trên cán thẳng đứng dài 25 – 35 cm Hoa màu trắng, lưỡng tính, gồm 6 phiến nhỏ, thuôn mũi mác, đường kính
5 mm Nhị 6, chỉ nhị dài 2 - 2,5 mm; bao phấn dài khoảng 1 mm, màu vàng, 2 ô, nứt dọc ở chớnh giữa Hạt phấn màu vàng, đa số hỡnh bầu dục, kớch thước 30 – 40 àm Nhụy màu vàng nhạt, hình chùy ngược có 3 thùy, 3 ô mỗi ô 2 noãn, đính noãn trung trụ, vòi nhụy màu trắng, dài 3 – 4 mm Quả nang, hình cầu hơi dẹt, chia ra 3 mảnh, khi chín nứt dọc các mảnh, lộ hạt bên trong Hạt nhỏ, sần sùi, màu đen, đường kính 3mm
Hình 3.1 Ảnh chụp cây Hẹ Chú thích: A Toàn cây; B Nụ hoa và cọng hoa
Hình 3.2 Ảnh chụp một số bộ phận của cây Hẹ Chú thích: 1 Quả; 2, 6 Hoa; 3 Bao phấn; 4 Hạt; 5, 7 Quả già; 8 Hạt phấn
3.1.2 Kết quả giám định mẫu nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu khi so sánh với đặc điểm của loài Allium tuberosum R trong các tài liệu về thực vật: [1], [7], [4], [3], [30], đều cho thấy các đặc điểm hình thái gần như tương đồng, trùng khớp với các đặc điểm trong tài liệu đã mô tả Cùng với sự giúp đỡ của TS Hoàng Quỳnh Hoa – Chủ nhiệm Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Allium tuberosum Rottler ex Spreng (Phụ lục 2)
Chúng tôi đã tiến hành ép tiêu bản và lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật của bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 3) Tiêu bản mang số hiệu HNIP/18678/22 (Phụ lục 1)
3.2 Xác định hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu
Sau khi tiến hành xác định hàm ẩm mẫu nghiên cứu theo mục 2.3.2.3, hàm ẩm trung bình của mẫu nghiên cứu là 73,31% Kết quả hàm ẩm (%) của mẫu nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Hàm ẩm (%) phần trên mặt đất của cây Hẹ
Tiến hành định lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu theo mục 2.3.2.2, hàm lượng tinh dầu trung bình có trong mẫu nghiên cứu là 0,046% Hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu khô tuyệt đối và là kết quả trung bình của 2 lần định lượng Kết quả xác định hàm lượng tinh dầu trong phần trên mặt đất của cây Hẹ được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Hàm lượng tinh dầu (%) phần trên mặt đất của cây Hẹ
Hàm lượng TD trung bình (%) 0,046% Đặc điểm tinh dầu: Tinh dầu có màu vàng đậm, mùi hăng, trong, sánh, nặng hơn nước
Nhận xét: Trong quá trình cất tinh dầu, sau khi đun sôi khoảng 30 phút thì tinh dầu bắt đầu xuất hiện và lượng tăng dần theo thời gian trong quá trình cất
3.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học
3.3.1 Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong lá Hẹ bằng các phản ứng hóa học
Các nhóm chất trong lá Hẹ được định tính sơ bộ bằng các phản ứng hóa học theo phụ lục 4 Kết quả được trình bày như bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong dịch chiết mẫu nghiên cứu STT Hợp chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
Phản ứng với dd NaOH 10% ++
Phản ứng với dd FeCl3 5% +++
2 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt + Dương tính
Phản ứng với dd chì acetat 10% +++
Phản ứng với dd gelatin 1% - Phản ứng với dd FeCl3 5% +++
Phản ứng huỳnh quang + Âm tính
Phản ứng Liebermann-Burchard - Âm tính
Phản ứng với TT Mayer - Âm tính Phản ứng với TT Bouchardat -
Phản ứng với TT Dragendorff -
Phản ứng với TT Fehling A và
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Dương tính
9 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% +++ Dương tính
Chú thích: (-): Phản ứng âm tính
(++): Phản ứng dương tính rõ
(+++): Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học, có thể sơ bộ đánh giá trong lá Hẹ có chứa flavonoid, tanin, saponin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin
3.3.2 Định tính dịch chiết toàn phần lá Hẹ bằng SKLM
Sau khi khai triển sắc ký trên các hệ dung môi, nhận thấy hệ IV: toluen – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) cho kết quả tốt nhất Kết quả định tính cắn toàn phần lá Hẹ bằng SKLM được thể hiện trong hình 3.3 và bảng 3.4:
Hình 3.3 Sắc ký đồ cắn toàn phần lá Hẹ bằng SKLM Chú thích:
A SKĐ cắn toàn phần lá Hẹ ở bước sóng 366 nm trước hiện màu
B SKĐ cắn toàn phần lá Hẹ ở ánh sáng thường sau hiện màu
Bảng 3.4 Kết quả định tính bằng SKLM cắn toàn phần lá Hẹ STT R f ×100
Màu sắc Trước hiện màu bước sóng
Sau hiện màu ở ánh sáng thường
8 50,6 Đỏ tươi Xanh lá cây nhạt
10 84,7 Đỏ cam Xanh lá cây
Nhận xét: Sắc ký đồ cắn toàn phần lá Hẹ ở ánh sáng thường sau khi phun TT hiện màu là dung dịch vanilin/H2SO4 thu được ít nhất là 10 vết, hầu hết các vết có màu sắc gần giống nhau Tuy nhiên các vết vẫn chưa tách nhau hoàn toàn
3.3 Kết quả định tính tinh dầu lá Hẹ bằng sắc ký lớp mỏng
Sau khi triển khai triển sắc ký trên các hệ dung môi, nhận thấy hệ n-hexan – ethyl acetat (9:1) cho thấy kết quả tốt nhất Sắc ký đồ dịch chấm tinh dầu lá Hẹ của mẫu nghiên cứu được trình bày như hình 3.4, 3.5 và kết quả định tính các thành phần trong tinh dầu lá
Hẹ được trình bày ở bảng 3.5
Hình 3.4 Sắc ký đồ tinh dầu của mẫu nghiên cứu bằng SKLM
A: SKĐ tinh dầu ở ánh sáng thường sau khi TT vanilin/ethanol/H2SO4 đặc
Hình 3.5 Sắc ký đồ tinh dầu lá Hẹ ở ánh sáng thường sau khi hiện màu bằng TT vanilin/H 2 SO 4
Bảng 3.5 Kết quả định tính các thành phần tinh dầu mẫu nghiên cứu bằng SKLM
Nhận xét: Sắc ký đồ tinh dầu lá Hẹ ở ánh sáng thường, sau khi phun TT hiện màu là dung dịch vanilin/ H2SO4 đặc =1:1 cho các vết tương đối rõ ràng, có ít nhất là 5 vết, đa số các vết có màu khá giống nhau Trong đó, vết màu vàng cam (Rf = 0,35, chiếm 29,25%) là vết có màusắc đậm nhất, với diện tích pic lớn nhất ở cả ánh sáng thường và ánh sáng ở bước sóng 366 nm
3.4 Phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)
Kết quả phân tích các thành phần cấu tử của tinh dầu lá Hẹ bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.6
Bảng 3.6 Thành phần cấu tử trong tinh dầu của mẫu nghiên cứu
STT Thành phần Công thức cấu tạo RT
Chú thích: (-): không có dữ liệu
Các tín hiệu thu được trên sắc ký đồ nằm trong khoảng thời gian lưu từ 3 – 27 phút
Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu lá Hẹ bằng GC/MS Nhận xét: Tinh dầu mẫu nghiên cứu có 24 cấu tử, chiếm khoảng 83,76% tổng hàm lượng tinh dầu Thời gian lưu của các hợp chất chứa lưu huỳnh kéo dài từ 6 – 17 phút
Trong đó, các hợp chất lưu huỳnh có hàm lượng cao có thời gian lưu kéo dài từ 6 – 13 phút Tinh dầu lá Hẹ có một số cấu tử có hàm lượng cao như dimethyl trisulfid (29,56%),
1,4-dithian (16,64%), methyl-2-propenyl trisulfid (7,17%), 2-(methoxymethyl)-3- propylthiiran (5,78%), (E)-2-hexenal (5,74%), C6H10S2 (4,79%) Trong đó, hợp chất
C6H10S2 vẫn chưa xác định chính xác được tên và công thức cấu tạo Các hợp chất sulfid chiếm đến 68,75% tổng hàm lượng tinh dầu Trong số các cấu tử của tinh dầu, hợp chất trisulfid chiếm hàm lượng lớn nhất (36,73%) gồm dimethyl trisulfid (29,56%), methyl-2- propenyl trisulfid (7,17%); hợp chất disulfid chiếm hàm lượng lớn thứ 2 với 24,33% tổng hàm lượng tinh dầu bao gồm 1,4-dithian (16,64%), methyl (Z)-1-propenyl disulfid
3.5 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu lá Hẹ
Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ được trình bày ở bảng 3.7:
Bảng 3.7 Giỏ trị MIC (àg/ml) của tinh dầu lỏ Hẹ trờn cỏc chủng vi sinh vật kiểm định
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, àg/mL) Tinh dầu lá
Chú thích: (-) không thực hiện thí nghiệm
Nhận xét: Mẫu tinh dầu lá Hẹ biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật với tất cả các chủng thử nghiệm với giá trị MIC gần như tương đương với MIC của kháng sinh đối chứng Đặc biệt, trên vi khuẩn S aureus ATCC 25922, tinh dầu lá Hẹ cho tác dụng kháng khuẩn tốt hơn streptomycin, cụ thể MICTD hẹ (128 àg/mL) = ẵ MICStreptomycin (256 àg/mL) Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn E coli ATCC 25922 của tinh dầu Hẹ yếu hơn khỏng sinh đối chứng streptomycin, cụ thể MICTD hẹ (256 àg/mL) = 8 MICStreptomycin
BÀN LUẬN
4.1 Về định tính sơ bộ thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu
Qua đánh giá sơ bộ bằng các phản ứng hóa học, nhận thấy dịch chiết của mẫu nghiên cứu chứa nhiều thành phần như flavonoid, tanin, đường khử, saponin, acid hữu cơ, acid amin Các nhóm chất: flavonoid, tanin, đường khử, acid amin cho phản ứng dương tính thấy rõ, do đó có thể kết luận những nhóm chất này có trong cây với độ tin cậy khá cao Một số nhóm chất còn lại có phản ứng dương tính, tuy nhiên chỉ được tiến hành bởi một phản ứng hoặc phản ứng dương tính chưa rõ ràng, nên độ tin cậy thấp hơn Kết quả này rất có khác biệt so với nghiên cứu trước đây của PT Nhut và cộng sự năm 2020 [29] Theo PT Nhut và cộng sự năm 2020, phản ứng định tính của alkaloid của lá Hẹ (Mayer, Bouchardat, Dragendorff) dương tính trong cả dịch chiết nước và dịch chiết EtOH 96%
Sự sai khác có thể do nguyên liệu được thu hái ở địa điểm và thời điểm khác nhau, cách chiết, thao tác tiến hành thí nghiệm, Ngoài ra, phản ứng định tính coumarin của PT Nhut và cộng sự chỉ được thực hiện trên 1 loại phản ứng (phản ứng huỳnh quang), do đó chưa thể kết luận sự có mặt của coumarin trong dịch chiết, cần phải tiến hành thêm các phản ứng khác để định tính (phản ứng diazo hóa, phản ứng mở/đóng vòng lacton)
Thử nghiệm định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cắn toàn phần lá Hẹ bằng SKLM cho thấy mặc dù đã khảo sát nhiều hệ dung môi và chọn ra hệ dung môi tốt nhất là toluen – ethyl acetat – acid fomic (5:4:1) nhưng các vết vẫn chưa được tách rõ ràng, màu sắc sau khi phun TT vanilin/H2SO4 vẫn khá mờ nhạt Do đó, cần khảo sát thêm các hệ dung môi khác hoặc thay đổi tỉ lệ các chất trong hệ dung môi trên đồng thời hiện màu bằng các TT đặc hiệu hơn
4.2 Về định tính thành phần tinh dầu bằng sắc ký lớp mỏng
SKLM là phương pháp định tính các thành phần hóa học với ưu điểm nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, cho phép nhận biết sơ bộ thành phần tinh dầu Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm không thể phân biệt rõ ràng và chính xác từng thành phần trong tinh dầu Dù đã khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau và chọn ra hệ dung môi tốt nhất là n-hexan – ethyl acetat (9:1) nhưng vẫn chưa thể tách rõ ràng các vết trên sắc ký đồ Do đó cần tiến hành khảo sát thêm các hệ dung môi khác hoặc thay đổi tỉ lệ các chất trong hệ dung môi trên để định tính chính xác hơn
Kết quả thử nghiệm cho thấy, sắc ký đồ của tinh dầu lá Hẹ cho ít nhất 5 vết khi quan sát ở ánh sáng thường sau khi đã hiện màu với TT vanilin/H2SO4 Trong đó, vết chính là vết màu vàng cam (Rf = 0,35, chiếm 29,25%) có diện tích pic sắc ký lớn nhất và màu sắc đậm nhất Đây có thể là thành phần có hàm lượng cao nhất, tương ứng với cấu tử có hàm
31 lượng cao nhất trong tinh dầu lá Hẹ khi phân tích bằng GC/MS là dimethyl trisulfid (chiếm 29,56% tổng hàm lượng tinh dầu) hoặc có thể là hỗn hợp của các hợp chất có hàm lượng cao như hỗn hợp trisulfid ( chiếm 36,73% tổng hàm lượng tinh dầu)
4.3 Về phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp phối khổ (GC/MS)
Kết quả phân tích thành phần cấu tử trong tinh dầu bằng GC/MS cho thấy trong tinh dầu lá Hẹ có khoảng 24 cấu tử, chiếm khoảng 83,76 % tổng hàm lượng tinh dầu, bao gồm thành phần chính là các trisulfid (36,73%) và disulfid (24,33%) Ngoài ra còn có các hợp chất aldehyd (6,39%), monosulfid (5,78%), alcol (3,04%), ceton (2,25%), tetrasulfid (1,42%), amin (1%), acid hữu cơ (0,54%) và các hydrocacbon khác (2,28%) Trong đó, cấu tử C6H10S2 (4,79%; RI = 1098) vẫn chưa xác định được chính xác tên và công thức cấu tạo Qua quá trình tra cứu tại thư viện NIST, chúng tôi nhận thấy hợp chất (E)-1-allyl- 2-(pro-1-en-1-yl)disulfan (RI = 1103) có mức độ tương tự về công thức cấu tạo so với cấu tử C6H10S2 (RI = 1098) lên đến 90,1 % Tuy nhiên chưa thể khẳng định chắc chắn cấu tử
C6H10S2 (RI = 1098) là hợp chất (E)-1-allyl-2-(pro-1-en-1-yl)disulfan (RI = 1103) mà cần phân tích thêm để xác định chính hơn
So sánh kết quả phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ với các tài liệu trên thế giới Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự khác biệt so với kết quả nghiên cứu của Shi và cộng sự năm 2015 [36], Mnayer và cộng sự năm 2014 [27] đồng thời cũng khác với kết quả nghiên cứu của Pino và cộng sự năm 2001 [33] Sự giống và khác nhau về kết quả phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ của 4 nghiên cứu được trình bày cụ thể ở bảng 4.1
Bảng 4.1 So sánh kết quả phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ với các tài liệu trên thế giới Nghiên cứu của
Nghiên cứu của Pino và cộng sự
Nghiên cứu của Shi và cộng sự
Nghiên cứu của chúng tôi
Thành phần chính của tinh dầu lá
Như vậy, thành phần chính của tinh dầu lá Hẹ trong các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu là các disulfid và trisulfid, có thể gồm các tetrasulfid hoặc monosulfid Tuy nhiên, thành phần cũng như hàm lượng % (so với tổng lượng tinh dầu) của các cấu tử trong các nghiên cứu đều có sự khác biệt Nguyên nhân có thể dẫn đến sự sai khác về kết quả phân tích thành phần tinh dầu được trình bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2 So sánh một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ Nghiên cứu của
Nghiên cứu của Pino và cộng sự
Nghiên cứu của Shi và cộng sự
Nghiên cứu của chúng tôi
Thời gian, địa điểm thu mẫu
Avignon, Pháp Mùa hè, năm
2014, tại Bắc Kinh, Trung Quốc
Phương pháp chưng cất tinh dầu
Cất kéo hơi nước bằng thiết bị Clevenger, dung môi chiết là nước, được tối ưu hóa bằng cách thêm ete dầu hỏa
Cất kéo hơi nước bằng thiết bị Likens- Nickerson, dung môi chiết là diethyl ete
Cất kéo hơi nước bằng thiết bị Clevenger, dung môi chiết là n- hexan
Cất kéo hơi nước sử dụng nồi áp suất, dung môi chiết là nước
Loại thiết bị sắc ký khí
Máy sắc ký khí 7890A (Agilent)
Máy sắc ký khí JEOL IMS DX
Máy sắc ký khí 6890N (Agilent)
Máy sắc ký khí 7890A (Agilent)
Kích thước cột sắc ký khí
Kích thước cột sắc ký HP–5MS:
Kích thước cột sắc ký DB – 1:
Kích thước cột sắc ký HP-5MS:
Kích thước cột sắc ký HP–5MS: 30m×0,25mm×0,
Loại khí mang Helium Hydrogen Helium Helium
Loại máy dò khối phổ
Cách xác Chỉ số RI được Chỉ số RI được Chỉ số RI được Chỉ số RI được
33 định chỉ số RI xác định qua dãy đồng đẳng alkan xác định qua các chỉ số của n- parafin xác định qua dãy đồng đẳng alkan C8 – C24 xác định qua dãy đồng đẳng alkan C9 – C20
So sánh kết quả phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ với các tài liệu tại Việt Nam
So sánh kết quả thử nghiệm với các tài liệu tổng hợp được tại Việt Nam cho thấy kết quả khá tương đồng Thành phần chính trong tinh dầu lá Hẹ là disulfid và trisulfid giống với kết quả nghiên cứu của Lê Thị Hóa [6] và Huỳnh Thị Ngọc Ni [8], nhưng hàm lượng
% của chúng trong tổng lượng tinh dầu lại thấp hơn (bảng 4.3)
Bảng 4.3 So sánh kết quả phân tích tinh dầu với các tài liệu tại Việt Nam
Nghiên cứu của Huỳnh Thị Ngọc Ni [8]
Nghiên cứu của Lê Thị Hóa [6]
Nghiên cứu của chúng tôi
Như vậy, so với các tài liệu tại Việt Nam, disulfid và trisulfid vẫn là 2 thành phần chính của tinh dầu lá Hẹ Hàm lượng disulfid và trisulfid trong tổng lượng tinh dầu có thể khác nhau phụ thuộc vào thời điểm, địa điểm thu hái nguyên liệu, phương pháp chưng cất và loại thiết bị phân tích tinh dầu
4.4 Về đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ
Các loài thuộc chi Allium L nói chung và cây Hẹ nói riêng là những loài có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh Hoạt tính kháng khuẩn của các loài thuộc chi Allium L chủ yếu là do tác dụng các hợp chất sulfid, ngoài ra có sự đóng góp nhỏ của các flavonoid, phenol, [36] Qua các tài liệu tổng hợp được và kết quả thực nghiệm, nhận thấy trong tinh dầu lá Hẹ chứa hàm lượng lớn hợp chất sulfid (chiếm 68,75% tổng hàm lượng tinh dầu), do đó, chúng tôi đã lựa chọn tinh dầu để tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật của Hẹ
Kết quả thu được mẫu tinh dầu lá Hẹ biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn gần như tương đương với kháng sinh đối chứng trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm, bao gồm Gram (-):
E coli ATCC 25922, S enterica ATCC 13076; Gram (+): S epidermidis ATCC 12228,
E faecalis ATCC 299212, S aureus ATCC 25923, B cereus ATCC 14579 và nấm men
C albicans ATCC 10231 ở giỏ trị MIC từ 128 – 256 àg/mL Riờng đối với S aureus
ATCC 25923, tinh dầu lá Hẹ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn kháng sinh đối chứng là streptomycin Đối với nấm men C albicans ATCC 10231 và vi khuẩn E coli
ATCC 25922, tinh dầu lá Hẹ cho hoạt tính yếu hơn cyclohexamid và streptomycin Với các chủng còn lại, hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Hẹ bằng kháng sinh đối chứng streptomycin
So sánh kết quả thực nghiệm với các nghiên cứu trước đây của Mnayer năm 2014
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Sau quá trình thực hiện, khóa luận đã thu được một số kết quả như sau:
- Đã tiến hành thu mẫu, giám định tên khoa học và định lượng hàm lượng tinh dầu của mẫu lá Hẹ thu hái tại Nam Từ Liêm, Hà Nội (hàm lượng tinh dầu là 0,046% so với dược liệu khô tuyệt đối)
- Trong thân rễ mẫu nghiên cứu có chứa một số nhóm chất hữu cơ như flavonoid, tanin, đường khử, saponin, acid hữu cơ, acid amin
- Đã phân tích được thành phần tinh dầu mẫu nghiên cứu, xác định được các cấu tử và hàm lượng của từng cấu tử trong tinh dầu mẫu nghiên cứu Trong đó, các hợp chất sulfid chiếm tỉ lệ cao với 68,75% tổng hàm lượng tinh dầu, chủ yếu là các disulfid và trisulfid
- Tinh dầu mẫu nghiên cứu biểu hiện hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica ATCC 13076; Gram (+):
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 299212,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 14579 và nấm men
Candida albicans ATCC 10231 ở giỏ trị MIC từ 128 – 256 àg/mL Trong đú, tinh dầu lá Hẹ thể hiện tác dụng kháng tốt nhất trên Staphylococcus aureus (MIC = 128 àg/mL), yếu nhất trờn vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 (MIC = 256 àg/mL) và nấm men Candida albicans (MIC = 256 àg/mL)
- Nghiên cứu thêm về hàm lượng tinh dầu và thành phần cấu tử của Hẹ thu hái tại các thời điểm và địa điểm cụ thể khác nhau
- Khảo sát thêm các hệ dung môi khác với SKLM cắn toàn phần và SKLM tinh dầu lá
- Đánh giá thêm về mối liên quan giữa các thành phần hóa học trong dịch chiết toàn phần: flavonoid, polyphenol với hoạt tính kháng khuẩn của lá Hẹ
- Nghiên cứu đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu lá Hẹ và kháng sinh trên vi khuẩn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mân, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, Tập 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 911-913
2 Bộ môn Dược liệu (2019), Thực tập Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr
3 Võ Văn Chi (2011), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr
4 Nguyễn Thị Đỏ (2000), Thực vật chí Việt Nam, Quyển 8, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 22-24
5 Trương Thị Mỹ Hạnh (2018), "Nghiên cứu khả năng diệt một số loài vi khuẩn và nấm của lá hẹ (Allium tuberosum)", Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
6 Lê Thị Hóa (2014), Xác định thành phần hóa học và tìm hiểu tác dụng dược lý của cây hẹ (tên khoa học Allium odorum L.), Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học sư phạm Huế, tr 10-30
7 Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr 724-726
8 Huỳnh Thị Ngọc Ni (2019), Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu lá Hẹ (Allium odorum L.) ở Phú Yên, Khóa luận tốt nghiệp,
Trường Đại học Phú Yên, tr 27-28
9 Benkeblia Noureddine, Lanzotti Virginia (2007), "Allium thiosulfinates: chemistry, biological properties and their potential utilization in food preservation", Food, 1(2), pp 193-201
10 Cheng Rui-Yu, Xie Deng-Feng, et al (2022), "Comparative Plastome Analysis of Three Amaryllidaceae Subfamilies: Insights into Variation of Genome Characteristics, Phylogeny and Adaptive Evolution", BioMed research international
11 Choi Jae Sue, Kim Jae Yeun, et al (1988), "Isolation of a β-carboline alkaloid from the leaves of Allium tuberosum", Archives of Pharmacal Research,11(4), pp 270-
12 Fang Yun-Shan, Cai Le, et al (2015), "Spirostanol steroids from the roots of Allium tuberosum", Steroid, 100, pp 1-4
13 Gao Quan, Li Xia-Bing, et al (2018), "Isolation and identification of new chemical constituents from Chinese chive (Allium tuberosum) and toxicological evaluation of raw and cooked Chinese chive", Food and Chemical Toxicology, 112, pp 400-411
14 Gao Quan, Song Li, et al (2019), "Repellent action and contact toxicity mechanisms of the essential oil extracted from Chinese chive against Plutella xylostella larvae",
Archives of insect biochemistry and physiology, 100(1)
15 Gu Shuang, Wang Xiangyang, et al (2019), "Isolation and identification of nucleosides/nucleotides raising testosterone and NO levels of mice serum from Chinese chive (Allium tuberosum) leaves", Andrologia, 51(2)
16 Hadacek Franz, Greger Harald, et al (2000), "Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice", Phytochemical Analysis:
An International Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques, 11(3), pp
17 Họkkinen S, Heinonen M, et al (1999), "Screening of selected flavonoids and phenolic acids in 19 berries", Food Research International, 32(5), pp 345-353
18 Han Sang Hyun, Suh Won Se, et al (2015), "Two new phenylpropane glycosides from Allium tuberosum Rottler", Archives of Pharmacal Research, 38(7), pp 1312-
19 Hong Jeong-Hwa, Lee Mi-Hyung, et al (2000), "Separation and identification of antimicrobial compounds from Korean leek (Allium tuberosum)", Journal of Food Hygiene and Safety, 15(3), pp 235-240
20 Huang Yong-hong, Mao Zhen-chuan, et al (2016), "Chinese leek (Allium tuberosum Rottler ex Sprengel) reduced disease symptom caused by root-knot nematode", Journal of Integrative Agriculture,15(2), pp 364-372
21 Huo YuMeng, Gao LiMin, et al (2019), "Complete chloroplast genome sequences of four Allium species: comparative and phylogenetic analyses", Scientific reports,
22 Jannat Khoshnur, Rahman Taufiq, et al (2019), "Traditional uses, phytochemicals and pharmacological properties of Allium tuberosum Rottler ex spreng", J Med Plants Stud, 7, pp 214-220
23 Khalid Nauman, Ahmed Iftikhar, et al (2014), "Comparison of antimicrobial activity, phytochemical profile and minerals composition of garlic Allium sativum and Allium tuberosum", Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 57(3), pp 311-317
24 Kim So-Yeon, Park Kyoung-Wuk, et al (2008), "Induction of apoptosis by thiosulfinates in primary human prostate cancer cells", International journal of oncology,32(4), pp 869-875
25 Kocevski Dragana, Du Muying, et al (2013), "Antifungal effect of Allium tuberosum, Cinnamomum cassia, and Pogostemon cablin essential oils and their components against population of Aspergillus species", Journal of Food Science,
26 Lee Kyung-Tae, Choi Jung-Hye, et al (2001), "Constituents and the antitumor principle of Allium victorialis var platyphyllum", Archives of pharmacal research,
27 Mnayer Dima, Fabiano-Tixier Anne-Sylvie, et al (2014), "Chemical composition, antibacterial and antioxidant activities of six essentials oils from the Alliaceae family", Molecules, 19(12), pp 20034-20053
28 Nguyen-Vo Thanh-Hoang, Le Tri, et al (2018), "Vietherb: a database for Vietnamese herbal species", Journal of chemical information and modeling, 59(1), pp 1-9
29 Nhut PT, An TNT, et al (2020), “Phytochemical screening of Allium Tuberosum Rottler ex Spreng as food spice”, IOP Conference Series: Materials Science and Engineering, IOP Publishing, pp 12-21
30 Pandey Anjula, Pradheep K, et al (2014), "Chinese chives (Allium tuberosum Rottler ex Sprengel): a home garden species or a commercial crop in India", Genetic
Resources and Crop Evolution, 61(7), pp 1433-1440
31 Park Jae-Sue, Kim Jae-Yeun, et al (1992), "Isolation of adenosine and free amino acid composition from the leaves of Allium tuberosum", Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 21(3), pp 286-290
32 Park Kyoung-Wuk, Kim So-Yeon, et al (2007), "Cytotoxic and antitumor activities of thiosulfinates from Allium tuberosum L", J Agric Food Chem,55(19), pp 7957-
33 Pino Jorge A, Fuentes Victor, et al (2001), "Volatile constituents of Chinese chive (Allium tuberosum Rottl ex Sprengel) and rakkyo (Allium chinense G Don)",
Journal of Agricultural and Food Chemistry,49(3), pp 1328-1330
34 Sang Shengmin, Mao Shilong, et al (2003), "New steroid saponins from the seeds of Allium tuberosum L", Food chemistry, 83(4), pp 499-506
35 Sharifi-Rad J, Mnayer D, et al (2016), "Plants of the genus Allium as antibacterial agents: From tradition to pharmacy", Cellular and Molecular Biology, 62(9), pp 57-
36 Shi Jizhe, Liu Xinchao, et al (2015), "Laboratory evaluation of acute toxicity of the essential oil of Allium tuberosum leaves and its selected major constituents against Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae)", Journal of Insect Science, 15(1), pp 117
37 Sutejo Ika R, Efendi Erfan (2017), "Antioxidant and hepatoprotective activity of garlic chives (Allium tuberosum) ethanolic extract on doxorubicin-induced liver injured rats", International Journal of Pharma Medicine and Biological Sciences,
38 Tapiero Haim, Townsend Danyelle M, et al (2004), "Organosulfur compounds from alliaceae in the prevention of human pathologies", Biomedicine & Pharmacotherapy, 58(3), pp 183-193
39 Wolfram Karina, Schmidt Jürgen, et al (2010), "Profiling of phenylpropanoids in transgenic low-sinapine oilseed rape (Brassica napus)", Phytochemistry, 71(10), pp 1076-1084
40 Yoshida takatoshi, Saito takashi, et al (1987), "New acylated flavonol glucosides in Allium tuberosum Rottler", Chemical and pharmaceutical bulletin, 35(1), pp 97-
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Giấy chứng nhận mã số tiêu bản
Phụ lục 2: Phiếu giám định tên khoa học
Phụ lục 3: Ảnh chụp mẫu tiêu bản
Phụ lục 4: Định tính sơ bộ thành phần hóa học bằng phản ứng thường quy
Phụ lục 5: Sắc ký đồ cắn toàn phần lá Hẹ ở bước sóng 366 nm trước khi phun TT hiện màu
Phụ lục 6: Sắc ký đồ cắn toàn phần lá Hẹ ở ánh sáng thường sau khi phun TT hiện màu Phụ lục 7: Sắc ký đồ cắn toàn phần lá Hẹ ở bước sóng 366 nm sau khi phun TT hiện màu Phụ lục 8: Hình ảnh định tính thành phần hóa học
Phụ lục 1: Giấy chứng nhận mã số tiêu bản
Phụ lục 2: Phiếu giám định tên khoa học
Phụ lục 3: Ảnh chụp mẫu tiêu bản
Phụ lục 4: Định tính sơ bộ thành phần hóa học bằng phản ứng thường quy [2] 2.1 Định tính Flavonoid
Chuẩn bị dịch chiết : Cho 5g dược liệu vào bình nón 100ml, thêm 30ml nước cất, đun sôi trực tiếp trong 5 phút Lọc lấy dịch lọc làm các phản ứng định tính
- Phản ứng cyanidin: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid clohydric (TT) đậm đặc Đun nóng cách thủy sau vài phút Phản ứng dương tính nếu thấy dung dịch chuyển từ vàng sang màu đỏ
- Phản ứng với FeCl3 5%: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu xanh lục, xanh hoặc nâu