Trong đó, hạt hạnh nhân đã được nhiều nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng tới sức khỏe người dùng như tăng mức polyphenol và giảm đáng kể tác hại của quá trình oxy hóa tới cơ thể [40
TỔNG QUAN
Giới thiệu về amygdalin
Amigdalin là một trong những hợp chất phổ biến nhất thuộc nhóm cyanogenic glycosides, tức glycosid của α-hydronitrile Trong tự nhiên, nhóm chất này được coi như một chất độc tự nhiên có khả năng sinh ra axit hydrocyan (HCN), giúp bảo vệ thực vật chống lại côn trùng và động vật ăn cỏ Amygdalin phân bố rộng rãi trong thực vật, với hàm lượng đáng kể ở hạt của các loài thuộc họ Rosaceae, đặc biệt là chi Prunus như hạnh nhân, đào, mơ, anh đào, lê và mận; nó cũng xuất hiện trong các bộ phận ăn được của cây sắn và ở quả chanh dây thuộc chi Passiflora.
Amygdalin có công thức phân tử là C20H27NO11, công thức cấu tạo như hình 1.1, khối lượng mol là 457,431 g/mol Amygdalin tan tốt trong nước nóng và cồn nóng, hòa tan nhẹ trong cồn, không tan trong ether và cloroform, nhiệt độ nóng chảy là 223 –
226 o C Amygdalin gồm một đơn vị acid hydrocyanic (HCN), một đơn vị benzaldehyd và hai đơn vị glucose
Amygdalin, hay D-mandelonitril-β-D-gentiobiosid, được phân lập lần đầu vào năm 1830 bởi các nhà hóa sinh Pháp Robiquet và Boutron-Chalard và được nghiên cứu chi tiết bởi nhà hóa học người Đức Emil Fischer Vào năm 1920, tiến sĩ Ernst T Krebs, Sr cho rằng amygdalin có thể là một loại thuốc hiệu quả chống lại bệnh ung thư, nhưng quá độc đối với con người Bất chấp tuyên bố này, vào năm 1952, con trai ông đã tổng hợp một dẫn xuất amygdalin ít có hại hơn với một tiểu đơn vị của glucose và đặt tên là laetril; Krebs mô tả hỗn hợp của amygdalin và dạng biến đổi của nó là “vitamin B17” mặc dù thực chất cả amygdalin và laetril đều không phải là vitamin Năm 1977, FDA (Hoa Kỳ) đã ban hành một tuyên bố cho rằng không có bằng chứng về tính an toàn và hiệu quả của laetril.
Qua các thí nghiệm trên tế bào in vitro, amygdalin được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học nổi bật, gồm ức chế xơ hóa thận, ức chế hình thành mạch, điều hòa nội tiết và miễn dịch, đồng thời có tác dụng bảo vệ dạ dày, chống xơ vữa động mạch và bảo vệ thần kinh [5], [12], [25], [20], [21], [29], [30].
Trên thế giới đã ghi nhận các trường hợp ngộ độc cyanid do sử dụng các sản phẩm chứa amygdalin Rubino và Davidoff báo cáo năm 1979 về một phụ nữ 49 tuổi ngộ độc sau khi ăn 20–40 hạt mơ, được xem là trường hợp đầu tiên trong y văn; bệnh nhân xuất hiện nhức đầu, suy nhược, buồn nôn, nôn và mất phương hướng trong vòng nửa giờ sau ăn và đã được điều trị thành công bằng amyl nitrite, natri nitrit và natri thiosulfat Báo cáo kết thúc với cảnh báo về tiêu thụ và tiếp thị các loại thực phẩm chứa cyanogenic glycoside để ngăn ngừa ngộ độc, nhưng hạt mơ vẫn được bán trên thị trường vì những lợi ích được cho là có sức khỏe Khoảng hai mươi năm sau, năm 1998, Suchard và đồng nghiệp công bố báo cáo về trường hợp thứ hai: một phụ nữ 41 tuổi có các triệu chứng tương tự sau khi ăn 30 hạt mơ Những năm gần đây cũng đã có thêm nhiều báo cáo về ngộ độc cyanid do sử dụng các sản phẩm chứa amygdalin (Bảng 1.1).
Bảng 1.1 Một số báo cáo về ngộ độc cyanide do sử dụng sản phẩm chứa amygdalin
Bệnh nhân Sản phẩm chứa
1500 mg – 3 viên nén amygdalin (vitamin B17 500 mg )
Thay đổi trạng thái tâm thần, toát mồ hôi, nhịp tim nhanh, nôn, chóng mặt, đau bụng quặn thắt,
300 mL dịch chiết bao gồm hạt mơ xay
Khó thở, chóng mặt và nôn mửa [15]
10 – 15 hạt mơ Nôn mửa, đau đầu và giảm mức độ ý thức
15 – 20 hạt mơ Nôn mửa, bất tỉnh, thang điểm hôn mê Glasgow nhi khoa là 8
500 mg Tiêu chảy, hơi thở gấp gáp, nồng độ cyanid huyết tương là 515μg/L
Amygdalin biosynthesis begins with the conversion of L-phenylalanine to mandelonitrile, a reaction catalyzed by cytochrome P450 enzymes, including CYP71AN24 Mandelonitrile is then converted to prunasin by UDP-glucosyltransferases, and prunasin is subsequently transformed into amygdalin through the activity of glucosyltransferases in a sequential biosynthetic pathway.
Amigdalin không độc khi còn nguyên vẹn, nhưng có thể bị phân giải trong ruột non và gây ngộ độc cho người sử dụng β-glucosidase, được lưu trữ trong các khoang tế bào thực vật, cũng có mặt ở ruột non người và phân giải amigdalin thành prunasin, mandelonitril, glucose, benzaldehyd và axit hydrocyanic (HCN) HCN, benzaldehyde, prunasin và mandelonitril có thể được hấp thu vào hệ bạch huyết và vòng tuần hoàn cửa Ở người, cyanide hình thành do vi khuẩn đường ruột có khả năng sản xuất β-glucosidase ở viền bàn chải của ruột non Khi được hấp thu, cyanide nhanh chóng phân bố khắp cơ thể Cyanide được giải độc chủ yếu qua chuyển hóa trans-sulfuration để tạo thành thiocyanat, nhưng cũng có thể được giải độc bằng phản ứng với hydroxycobalamin (Vitamin B12) để tạo thành cyanocobalamin Thận thải axit hydrocyanic với thời gian khoảng 2,7 ngày ở người có chức năng thận bình thường Uống 500 mg amigdalin có thể thủy phân ra tới 30 mg cyanide Amigdalin đường uống được đánh giá có tác dụng mạnh hơn 40 lần so với dạng tiêm tĩnh mạch do sự chuyển hóa thành hydrogen cyanide bởi enzyme trong đường tiêu hóa.
Độc tính của cyanide rất cao vì nó ngăn cản ty thể sử dụng oxy, khiến tế bào chết do thiếu oxy Cyanide liên kết với ion sắt trên cytochrom oxidase và làm tắc đột ngột chu trình vận chuyển điện tử cùng quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, từ đó gây ra thiếu oxy tế bào và tăng axit lactic.
Hình 1.2 Sự hình thành HCN từ Amygdalin [24]
Liều gây độc của axit hydrocyanic được định nghĩa là vượt quá 20 mg axit hydrocyanic cho mỗi 100 g trọng lượng cơ thể, do axit này được giải phóng từ sự phân hủy cyanogenic glycosid nhờ enzyme trong tế bào thực vật; việc ăn quá nhiều hạt chứa cyanogenic glycosid có thể gây hại cho cơ thể Trong ngộ độc cyanid ở mức độ nhẹ đến trung bình, triệu chứng có thể gồm nhịp tim nhanh, lú lẫn, buồn nôn và suy nhược, còn ở mức độ nặng có thể xuất hiện tím tái, hôn mê, co giật, rối loạn nhịp tim, ngừng tim và có thể dẫn đến tử vong; liều gây tử vong ở người của amygdalin khi tiêm tĩnh mạch là 5 g Người ta cho rằng ăn 50 hạt hạnh nhân đắng trong thời gian ngắn có thể gây chết ở người lớn, và 5–10 hạt hạnh nhân đắng có thể gây tử vong ở trẻ em; liều gây tử vong ở người lớn được ước tính khoảng 0,5–3,5 mg/kg cân nặng.
Ngộ độc cyanide mãn tính phát sinh khi tiêu thụ kéo dài các loại thực vật chứa cyanogenic glycosides, dẫn đến tổn thương thần kinh và tủy sống Konzo là một bệnh lý tủy nhiệt đới đặc trưng được quan sát thấy ở các cộng đồng có mức tiêu thụ sắn cao Sắn chứa linamarin, một cyanogenic glycoside, được chuyển hóa thành prunasin và sau đó giải phóng HCN (hydrogen cyanide, axit xyanhidric), chất độc gây tác động lên hệ thần kinh Quá trình này là cơ chế sinh bệnh được nhắc tới trong các nguồn tham khảo như HSDB.
2017, COT 2006 ) Bệnh bướu cổ cũng có liên quan đến việc ăn các thực vật chứa cyanogenic glycosid dài ngày, vì thiocyanate cản trở sự hấp thu iod ở tuyến giáp (Speijers 1993 ) Tuy nhiên, những quần thể ăn nhiều thực vật chứa cyanogenic glycosid này cũng có tỷ lệ suy dinh dưỡng ca Sự thiếu hụt dinh dưỡng, đặc biệt là methionin và riboflavin, iod, kết hợp với phơi nhiễm cyanid mãn tính, có liên quan đến nguyên nhân của bệnh thần kinh, bệnh lý tủy và bệnh bướu cổ (Speijers 1993) [45].Việc sử dụng những sản phẩm chứa cynogenic glycosid, cụ thể ở đây là amygdalin với liệu lượng không phù hợp hoàn toàn có thể đem lại hậu quả đáng tiếc
Các tổ chức quản lý thực phẩm trên thế giới đã thực hiện các biện pháp phòng ngừa để quản lý nguy cơ tiềm ẩn liên quan đến việc tiêu thụ hạt mơ
Canada thiết lập mức tối đa (maximum level – ML) 20 phần triệu (ppm) cho tổng số cyanide có thể chiết xuất được từ hạt mơ bán ở Canada ở dạng thực phẩm Bộ Y tế Canada và Cơ quan Thanh tra Thực phẩm (CFIA) thông báo cho ngành công nghiệp rằng hạt mơ không đáp ứng mức tối đa và không được bán tại các cửa hàng hoặc được sử dụng trong các loại thực phẩm khác sau khi mức tối đa có hiệu lực.
Vào năm 2017, Ủy ban Châu Âu (EC) đã thiết lập mức tối đa 20 ppm axit hydrocyanic trong hạt mơ chưa chế biến, hạt nguyên, xay, nghiền, nứt hoặc cắt nhỏ được đưa ra thị trường cho người tiêu dùng cuối cùng, theo Quy định của Ủy ban EU 2017/1237 Mức giới hạn này áp dụng cho cả hạt mơ ngọt và hạt mơ đắng. -**Support Pollinations.AI:** -🌸 **Ad** 🌸Powered by Pollinations.AI free text APIs [Support our mission](https://pollinations.ai/redirect/kofi) to keep AI accessible for everyone.
An toàn Thực phẩm Vương quốc Anh cũng áp dụng EC ML
Vào năm 2015, FSANZ (Food Standards Australia New Zealand) đã ban hành quy định cấm bán lẻ hạt mơ sống như một loại thực phẩm riêng lẻ Tuy nhiên, hạt mơ có thể được sử dụng như một thành phần trong các sản phẩm thực phẩm khác nếu hạt mơ đã hoặc sẽ được xử lý để bảo đảm an toàn cho người tiêu dùng Quy định này nhấn mạnh rằng việc xử lý nhằm bảo đảm an toàn thực phẩm là điều kiện bắt buộc để đưa hạt mơ vào chuỗi cung ứng bán ra thị trường.
Phương pháp phân tích
1.2.1 Các nghiên cứu đã được thực hiện xác định amygdalin
Một số nghiên cứu xác định amygdalin trong mẫu thực phẩm và huyết tương chuột được trình bày trong bảng 1.2
Bảng 1.2 Các nghiên cứu đã được thực hiện để xác định Amygdalin
Xử lý mẫu Phương pháp
Lấy mẫu 0,5 g cho vào bình cầu chứa 20 mL ethanol và tiến hành chiết xuất trong 2 giờ, sau đó đưa mẫu vào bể siêu âm trong 30 phút để tăng hiệu quả chiết Chuyển dịch ethanol sang bình cầu khác và bổ sung thêm 20 mL ethanol, lặp lại quá trình này 3 lần Gộp toàn bộ dịch chiết ethanol lại và cô quay ở 35°C.
Hòa cắn bằng 2 mL pha động và lọc qua màng lọc 0,2 μm rồi chuyển vào vial
Cân 2.0 g bột nhân hạt mận vào bình cầu 250 mL, thêm ethanol tuyệt đối với tỉ lệ 1:15(m/V) Đun hồi lưu trong 90 phút Sau đó dịch chiết được lọc qua giấy lọc và hút chân không đến cắn
Sau đó được đặt trong bình hút ẩm đến khối lượng không đổi
Sau đó cân chính xác 125 mg cắn vào bình cầu có 10 mL pha động và siêu âm trong 5 phút
Hút 1ml dịch này chuyển vào bình định mức 10ml và định mức bằng pha động Sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm
Cân 2 g mẫu vào bình cầu 100 mL, thêm ethanol đậy kín Sau khí chiết xong, dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch lọc được cô quay đến cắn và để trong bình hút ẩm đến khối lượng không đổi Thêm diethyl ether để loại béo và amygdalin sẽ kết tủa Gạn bỏ lớp diethyl ether và để bay hơi toàn bộ dung môi
100 o C để khử hoạt tính enzyme
Mẫu được chiết bằng 20 mL nước bằng siêu âm trong 3 phút
Phần nổi được gạn ra sau khi ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút Bước chiết xuất được lặp lại, phần dịch phía trên được gộp lại và điều chỉnh đến tổng thể tích 50 mL bằng nước Dịch này được pha loãng tiếp 20 lần và lọc qua màng lọc 0,2 μm.
5 Hạt, nhân hạt và thực phẩm
Cân 2 g mẫu cho vào bình cầu, thêm 50 mL ethanol đun hồi lưu trong 100 phút Sau đó dịch chiết được cho vào ông eppendorf , ly tâm 10 phút và được lọc qua màng lọc PTFE 0,45μm
Chuột được cho uống thuốc được sắc từ bài thuốc
Mẫu được bảo quản ở −20 °C và rã đông ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc xoáy 200 μL huyết tương được trộn với 20 μL IS (geniposid) Hỗn hợp sau đó được loại bỏ protein bằng 600 μL methanol, lắc xoáy 5 phút và ly tâm để tách protein.
Một phần 0,2 ml phần nổi phía trên được pha loãng bằng cách thêm 0,2 ml nước Sau khi được lắc xoáy trong 5s rồi được chuyển vào trong vial
Chuột được cho uống thuốc được sắc từ bài thuốc
30 μL Cloramphenicol làm nội chuẩn Thêm 5 mL ethyl acetat để chiết trong 5 phút Ly tâm
5000 vòng/phút x 5 phút, chuyển lớp hữu cơ sang ông ly tâm khác Thêm 1ml ethyl acetat và lớp nước, lắc xoáy và ly tâm
5000 vòng/phút x 5 phút Gộp dịch ethyl acetate, thổi khô bằng
N2 ở 40 o C Hòa căn bằng Methanol, lắc xoáy 5 phút và ly tâm 15000 vòng/phút x 5 phút
Hút phần nổi chuyển vào vial
Đánh giá này cho thấy các nghiên cứu sử dụng siêu âm và đun hồi lưu để chiết AMG khỏi nền mẫu là hạt và thực phẩm; dung môi được dùng phổ biến là ethanol, và khi nước được dùng làm dung môi chiết xuất cần tiến hành một bước bất hoạt enzyme để ngăn thủy phân AMG do sự hiện diện của enzyme trong môi trường nước Dung môi diethyl ether được sử dụng để loại béo và kết tinh chất phân tích do AMG có tính chất không tan trong ether Kỹ thuật HPLC–UV được áp dụng phổ biến và phù hợp để phân tích các mẫu có hàm lượng ở mức μg/ml, trong khi LC–MS/MS được dùng để phát hiện AMG ở hàm lượng rất thấp (ng/ml), như trong nền mẫu huyết tương chuột và ở hạt trái sơn trà.
Phương pháp phân tích được ứng dụng trong nghiên cứu này là LC–MS (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry), hợp nhất khả năng tách phân lập các thành phần trong hỗn hợp bằng hệ thống sắc ký lỏng với khả năng phân tích số khối/m/z của bộ phận khối phổ Phân tích khối phổ có đặc tính chọn lọc cao, độ nhạy và độ đặc hiệu lớn, với giới hạn phát hiện (LOD) có thể lên tới 10^-14 g Hiện nay, khối phổ là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực để xác định các chất vô cơ và hữu cơ, từ xác định công thức cấu tạo và đồng vị cho đến định tính và định lượng các chất có mặt trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên.
1.2.2.1 Bộ phận sắc ký lỏng
Sắc ký là quá trình tách diễn ra trên cột tách, với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được đưa lên cột dưới dạng dung dịch, và khi chạy sắc ký, các chất phân tích liên tục phân bố giữa pha động và pha tĩnh Nhờ khác biệt về cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa, các chất trong hỗn hợp được tách ra thành các thành phần riêng biệt.
Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau
Khối phổ (mass spectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion được hình thành từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu ở pha khí Tỷ số này được biểu diễn bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của carbon-12, C-12) hoặc bằng Dalton (Da, bằng khối lượng của nguyên tử hydro) Các ion có thể được hình thành bằng cách loại bỏ hoặc thêm điện tích, như mất electron hoặc proton hóa Các ion này được tách theo tỷ số m/z và được phát hiện, từ đó cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc của phân tử hợp chất.
Cấu tạo thiết bị khối phổ:
Hình 1.3 Cấu tạo thiết bị khối phổ [44]
1 Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần chuyển sang dạng hơi Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký
2 Bộ nguồn ion hóa: ion hóa các phân tử, nguyển tử của mẫu ở trạng thái khí và hơi
Có ba kiểu hình thành ion thường gặp trong phân tích: ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Chemical Ionization – APCI), và ion hóa bằng photon ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI) Trong ba loại này, ESI được sử dụng phổ biến nhất do khả năng ion hóa hiệu quả các hợp chất phân tử lớn và dung môi, đặc biệt hữu ích cho mẫu sinh học và protein; APCI phù hợp với các hợp chất ít phân cực và có độ bay hơi cao; còn APPI mở rộng khả năng ion hóa cho những hợp chất khó ion hóa bằng ESI hoặc APCI.
3 Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có nhiều bộ phận phân tích khối khác nhau như: bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chập ba, phân tích bẫy ion, phân tích thời gian bay…
Bộ tứ cực (Quadrupole) hoạt động dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ dao động khác nhau khi chịu tác dụng đồng thời của điện áp một chiều và điện áp xoay chiều được áp vào vùng di chuyển của chúng Nhờ sự phân tách dao động dựa trên khối lượng này, bộ tứ cực có thể phân tích và lọc các ion trong mẫu, từ đó xác định thành phần ion và phục vụ cho các ứng dụng phân tích phổ và hóa học Việc điều chỉnh điện áp một chiều và điện áp xoay chiều cho phép kiểm soát tần số và biên độ dao động, tối ưu hóa hiệu suất phân tích của bộ tứ cực.
Hiện nay, bộ tứ cực chập ba được sử dụng với ba bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3
Hình 1.4 Cấu tạo bộ tứ cục chập ba
Q1: bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách các ion Một số ion được chọn lọc (thường gọi là các tiền ion ) từ đây vào Q2
Trong bộ Q2, ở điều kiện áp suất cao, tiền ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như nitơ (N2), argon và helium Bộ Q2 thực hiện phân ly nhờ quá trình CID (collision-induced dissociation) Qua va chạm, năng lượng động học của các ion được chuyển hóa thành nội năng, khiến chúng phân mảnh thành các ion con (daughter ions) Các ion con này sau đó được dẫn tới Q3 để tiếp tục quá trình phân tích.
Q3: bộ tứ cực thứ ba, tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới detector
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của phương pháp này là các mẫu nhân hạt chứa amygdalin và các sản phẩm thực phẩm có sử dụng các loại nhân hạt này làm thành phần Nghiên cứu nhằm phân tích sự hiện diện và hàm lượng amygdalin ở từng mẫu nhân hạt và trong các thực phẩm liên quan, từ đó đánh giá mức độ an toàn và ảnh hưởng tiềm tàng của amygdalin đến sức khỏe người tiêu dùng Phạm vi áp dụng bao gồm các loại nhân hạt phổ biến có chứa amygdalin và các sản phẩm chế biến từ chúng được dùng làm nguyên liệu hoặc thành phần trong nhiều món ăn và đồ uống Kết quả mong đợi cung cấp dữ liệu thực nghiệm hỗ trợ quản lý rủi ro thực phẩm và đề xuất biện pháp kiểm soát hàm lượng amygdalin trong chuỗi cung ứng.
Nguyên vật liệu, thiết bị
Amygdalin với độ tinh khiết 97% từ hãng SIGMA
Cloramphenicol với độ tinh khiết 98% từ hãng Dr Ehrenstorfer
Cân chuẩn amygdalin (AMG) vào trong bình định mức 20 mL
Khối lượng cân chuẩn m = 0,03 g Định mức bằng MeOH
Chuẩn Amygdalin hàm lượng 1500 ppm
Cân chuẩn cloramphenicol (CAP) trong bình định mức 20 mL
Khối lượng cân chuẩn m = 0,01 g Định mức bằng MeOH
Chuẩn cloramphenicol hàm lượng 500 ppm
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích
Dung môi tiêu chuẩn LC-MS : methanol, acetonitril, acid formic (Merck)
Dung môi tiêu chuẩn phân tích: ethanol tuyệt đối, ether dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ:
Hệ thống sắc ký lỏng HPLC 20 AXL của Shimadzu gắn đầu dò khối phổ SciexTriple Quad 5500
Cột sắc ký pha đảo cột Symmetry C18 (3 mm x 150 mm, 3,5 μm)
Pipet thủy tinh 5ml, 10ml Pipet Pasteur
Bình cầu thể tích 100ml, 250ml
Máy lắc vortex (IKA, Đức)
Máy ly tâm (Hermle, Đức)
Máy siêu âm (Elmasonic, Mỹ) Ống ly tâm falcon 15ml
Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Khảo sát điều kiện LC – MS
Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn AMG 150 ppb và CAP 100 ppb
Để phân tích hai chất một cách hiệu quả, tham khảo các tài liệu liên quan và khảo sát để lựa chọn chế độ ion hóa tối ưu, xác định ion mẹ và các ion con cho từng chất, đồng thời thiết lập các thông số tối ưu của thiết bị Việc chọn đúng chế độ ion hóa và các ion đặc trưng sẽ nâng cao độ nhạy cũng như độ đặc hiệu của phương pháp, giúp tối ưu hóa quy trình đo và phân tích kết quả Nhờ đó, phương pháp phân tích đạt được độ tin cậy cao và phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.
Lựa chọn cột sắc ký
Khảo sát và lựa chọn thành phần, chương trình gradient pha động
2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Chuẩn bị mẫu sơ bộ: đồng nhất ít nhất 50 g mẫu bằng máy đồng nhất mẫu
Quy trình xử lí mẫu ban đầu được tổng hợp từ các tài liệu tham khảo [1],[7], [26], [32],
Chuẩn nội cloramphenicol theo tài liệu tham khảo [21]
Thực hiện khảo sát toàn diện các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết trong quy trình nhằm chiết được toàn bộ chất trong mẫu, đồng thời hạn chế tạp chất và tiết kiệm chi phí Việc đánh giá các tham số như điều kiện dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết và độ pH giúp tối ưu hóa hiệu suất chiết, bảo đảm độ thu hồi cao và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng Các phương pháp đánh giá và tối ưu hóa cần được thiết kế có hệ thống để xác định đúng biến số ảnh hưởng và mức tối ưu, từ đó cải thiện quy trình chiết và giảm thiểu lãng phí nguyên liệu Mục tiêu cuối cùng là chiết đầy đủ chất trong mẫu, hạn chế tạp chất và tối ưu hóa chi phí vận hành.
Khảo sát dung môi chiết được thực hiện bằng cách xử lý mẫu theo quy trình dự kiến và đánh giá hiệu quả của từng dung môi, lần lượt là methanol tuyệt đối, ethanol tuyệt đối và ethanol 70%, nhằm tối ưu hóa hiệu suất chiết và đảm bảo độ tin cậy của kết quả phân tích.
Trong khảo sát thời gian chiết, chúng tôi thực hiện xử lý mẫu theo quy trình dự kiến và thay đổi thời gian siêu âm theo chu kỳ 20 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút để đánh giá ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Quá trình này cho phép xác định mối quan hệ giữa thời gian chiết và chất lượng giải chiết, từ đó tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu Dữ liệu thu được từ mỗi thời gian siêu âm sẽ được phân tích để xác định thời gian chiết tối ưu, cân bằng giữa hiệu suất chiết và tiết kiệm nguồn lực Mục tiêu cuối cùng là đề xuất thời gian siêu âm tối ưu cho quy trình chiết dựa trên kết quả thực nghiệm.
Khảo sát lượng dung môi được thực hiện bằng cách xử lý mẫu theo quy trình dự kiến với các thể tích dung môi khác nhau: 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml và 50 ml Mỗi mức thể tích dung môi được áp dụng riêng biệt nhằm đánh giá ảnh hưởng của dung môi lên hiệu suất xử lý và độ lặp lại của kết quả phân tích Dữ liệu thu được giúp so sánh hiệu quả giữa các mức dung môi, xác định lượng dung môi tối ưu cho quy trình và giảm thiểu sai số trong phép đo Từ đó có thể tối ưu chi phí và nâng cao độ tin cậy của kết quả phân tích.
Khảo sát nhiệt độ chiết: thực hiện xử lý mẫu theo quy trình dự kiến, thay đổi nhiệt độ bể siêu âm mỗi lần khác nhau ở các mức 35 o C, 45 o C, 55 o C, 65 o C, 75 o C
Khảo sát dung môi loại béo: sử dụng các dung môi loại béo khác nhau để thực hiện loại béo là n-hexane, diethylether và ether dầu hỏa
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nền
Xây dựng đồng thời đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền mẫu trắng cho chất phân tích
Xác định ảnh hưởng nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích bằng so sánh 2 hệ số góc của 2 đường chuẩn
2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích
Quá trình thẩm định được tiến hành theo hướng dẫn của AOAC 2016, ICH 2005 và tài liệu hướng dẫn chuyên khảo [2], áp dụng trên nền mẫu tự tạo và đánh giá các chỉ tiêu liên quan đến Độ chọn lọc nhằm đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp và khả năng loại bỏ nhiễu từ nền mẫu Việc tham chiếu AOAC 2016 và ICH 2005 cung cấp khung chuẩn cho phương pháp và điều kiện thí nghiệm, trong khi tài liệu chuyên khảo [2] bổ sung các chi tiết thực nghiệm và tiêu chí đánh giá độ chọn lọc, đồng thời liên hệ với hiệu suất đo lường như độ nhạy và độ tuyến tính trên nền mẫu tự tạo Kết quả thẩm định sẽ chỉ ra mức độ tối ưu của độ chọn lọc để đảm bảo phân tích đáng tin cậy và phù hợp với yêu cầu chuẩn mực.
Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện Đường chuẩn Độ đúng Độ lặp lại
Tính thích hợp hệ thống
2.3.4.1 Độ chọn lọc Để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp, chúng tôi tiến hành so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn trên dung môi Phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu khi:
Trong kết quả sắc ký, đồ mẫu trắng không cho tín hiệu của chất phân tích; thời gian lưu chất phân tích ở mẫu thêm chuẩn bằng với thời gian lưu ở mẫu chuẩn dung môi hoặc chênh lệch giữa hai thời gian này không quá 0,1 phút Điều này cho thấy phương pháp sắc ký ổn định và có độ lặp, đảm bảo kết quả phân tích chính xác và phù hợp với chuẩn kiểm tra chất lượng.
Trong phân tích, tỉ số ion của hai ion con thu được ở mẫu thêm chuẩn phải tương đồng với tỉ số ion ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không vượt quá mức giới hạn được quy định theo hướng dẫn của Hội đồng Châu Âu Độ lệch giữa tỉ lệ ion của mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn được tính bằng một công thức cụ thể, giúp đánh giá độ đồng nhất và độ tin cậy của kết quả phân tích, đồng thời đảm bảo quá trình hiệu chuẩn diễn ra chính xác và có thể tin cậy được trong các báo cáo dữ liệu.
Rdiff : độ lệch tương đối
IRspk: tỉ số ion trong mẫu thêm chuẩn
IRstd: tỉ số ion trong mẫu chuẩn dung môi
2.3.4.2 Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện
Để xác định giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp, tính tỉ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) Thực hiện phân tích các mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ thấp dần cho đến khi tỉ lệ S/N đạt giá trị từ 10 đến 20 Tại nồng độ đạt được tỉ lệ S/N như vậy, nồng độ này được coi là LOQ của phương pháp.
Giới hạn phát hiện (LOD) được tính từ giá trị nồng độ LOQ:
Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích
2.3.4.3 Đường chuẩn và khoảng nồng độ xác định
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là phạm vi nồng độ trong đó mối quan hệ giữa giá trị đo được và nồng độ chất phân tích giữ ở mức tuyến tính Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ tuyến tính này giữa giá trị đo được và nồng độ chất phân tích, đóng vai trò là công cụ hiệu chuẩn để ước lượng nồng độ chất phân tích từ tín hiệu đo và phục vụ cho các ứng dụng phân tích định lượng và tối ưu hóa phương pháp.
Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn được thực hiện với mẫu chuẩn được pha trên nền mẫu trắng
2.3.4.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của phép đo lặp lại Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp, chúng tôi thực hiện thêm chuẩn vào mẫu trắng ở 3 mức nồng độ khác nhau của AMG và tính toán kết quả theo công thức: Độ thu hồi (%) = ự 100%
Cthực : là nồng độ chất phân tích có trong mẫu, được tính thông qua đường chuẩn
Cspk là nồng độ chất phân tích được thêm vào mẫu trắng để đánh giá độ nhạy và độ ổn định của phương pháp, và độ lặp lại được biểu thị thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của các phép đo, cho biết mức biến động giữa các lần đo RSD được tính theo công thức: RSD (%) = (s / x̄) × 100, trong đó s là độ lệch chuẩn của tập dữ liệu và x̄ là giá trị trung bình của các phép đo Việc trình bày Cspk và RSD giúp đánh giá tính chính xác và khả năng lặp lại của phương pháp phân tích, đồng thời hỗ trợ so sánh kết quả giữa các mẫu và tối ưu hóa quy trình thử nghiệm.
𝑥: là nồng độ của lần thử nghiệm thứ i
𝑥̅ : là nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm
2.3.4.5 Độ phù hợp hệ thống Đánh giá sự phù hợp hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng Cần đánh giá hàng ngày tùy thuộc vào độ ổn định của hệ thống hoặc số lượng mẫu phân tích
Phép thử đánh giá phù hợp hệ thống của phương pháp sắc ký được quy định theo nhiều tổ chức (USP, USFDA) như sau:
Độ chụm của thời gian lưu và diện tích pic sắc ký được đánh giá bằng cách tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Việc đo đạc RSD cho cả thời gian lưu và diện tích pic cho thấy mức độ lặp lại và ổn định của hệ thống sắc ký trong quá trình phân tích Kết quả RSD ở mức thấp chỉ ra độ tin cậy cao của phương pháp và phù hợp cho phân tích định lượng, đồng thời hỗ trợ tối ưu hóa điều kiện vận hành và hiệu suất của hệ thống sắc ký.
Số lần bơm tối thiểu 5 lần phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm
Độ phân giải giữa 2 chất
Các thông số khác nhau: độ trôi đường nền, nhiễu đường nền (khi giới hạn phát hiện đóng vai trò quan trọng trong phương pháp)
Các mẫu thực được mua ngẫu nhiên trên thị trường
Mẫu khi được chuyển đến phòng thí nghiệm được đồng nhất rồi thực hiện phân tích ngay.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng và thẩm định phương pháp LC – MS/MS
3.1.1 Xây dựng phương pháp LC – MS/MS
3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ
Kết quả ion mẹ, mảnh ion con và các thông số tối ưu được cho từng mảnh được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả và điều kiện tối ưu cho các mảnh của chất phân tích
Chất phân tích Ion mẹ
CE (eV) DP (eV) Ứng dụng
Tối ưu các thông số thiết bị
Các thông số áp suất khí mang (CUR), áp suất khí (CAD), thế ion hóa (IS), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí nguồn 1 (GS1) và áp suất khí nguồn 2 (GS2) được tối ưu tự động sau khi đã chọn ion mẹ và các mảnh ion con, và được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS
Ion source gas 1 (GS1) 45 psi
Ion source gas 2 (GS2) 45 psi
3.1.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng
Việc lựa chọn cột sắc ký dựa trên ái lực giữa chất phân tích và pha tĩnh đóng vai trò then chốt cho hiệu lực tách của sắc ký Dựa vào cấu trúc hóa học của chất phân tích, chúng tôi đã lựa chọn cột sắc ký pha đảo chứa pha tĩnh C18 để tối ưu hóa sự phân tách Trong phòng thí nghiệm có sẵn cột Symmetry C18 (3 mm x 150 mm, 3,5 μm), phù hợp với quy trình phân tích hiện tại.
Khảo sát và lựa chọn chương trình pha động:
Trong cột sắc ký pha đảo, pha tĩnh C18 được lựa chọn làm nền tách Dung môi hữu cơ ACN được sử dụng để hòa tan mẫu một cách hiệu quả, còn dung môi nền là H2O có bổ sung 0,1% HCOOH nhằm tạo môi trường ion hóa cho hệ thống khối phổ và để hình thành ion mẹ [M+HCOO]– cho AMG và [M–H]– cho CAP.
Khảo sát chương trình gradient pha động được trình bày ở bảng 3.3,hình 3.1 và hình 3.2
Bảng 3.3 Các chương trình gradient khảo sát
Hình 3.1 Khảo sát chương trình gradient 1
Hình 3.2 Khảo sát chương trình gradient 2
Sau khi khảo sát hai chương trình gradient pha động, thời gian lưu của AMG và CAP ở chương trình gradient 1 lần lượt là 6,32 phút và 7,31 phút; ở chương trình gradient 2 lần lượt là 5,45 phút và 6,09 phút Chương trình gradient 2 cho thời gian phân tích ngắn hơn nên lựa chọn gradient 2 làm chương trình tối ưu.
Chương trình gradient pha động được tối ưu cho quy trình phân tích như sau:
Bảng 3.4 Chương trình gradient pha động tối ưu
Thời gian (phút) Kênh A: HCOOH 0,1% Kênh B: ACN
10 99% 1% Điều kiện sắc ký tối ưu được trình bày dưới đây:
Cột sắc ký pha đảo cột Symmetry C18 (3 mm x 150 mm, 3,5 μm)
Pha động tối ưu theo chương trình gradient trong bảng 3.4
Tốc độ dòng 0,5 ml/phút
Thời gian phân tích: 10 phút
3.1.2 Tối ưu quy trình xử lí mẫu
Thực hiện khảo sát ở các điều kiện khác nhau, mỗi điều kiện thực hiện lặp lại 2–3 lần
Kết quả của mỗi lần khảo sát sẽ được so sánh qua thông số là 𝐴 = S AMG
S CAP 1 m (1/g) Trong đó: SAMG: diện tích pic của amygdalin
SCAP: diện tích pic của cloramphenicol m: khối lượng cân mẫu (g)
3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết
Thực hiện khảo sát các dung môi: methanol, ethanol và ethanol 70%
Hình 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Kết quả cho thấy hiệu quả chiết AMG bằng ethanol 70% thấp hơn so với methanol và ethanol tuyệt đối AMG có thể tan được trong methanol, ethanol và nước sôi, giải thích tại sao các dung môi này cho hiệu quả khác nhau Tuy nhiên, tín hiệu chiết AMG bằng ethanol 70% giảm do ở nhân hạt có enzyme gây thủy phân AMG; enzyme này hòa tan trong nước nên khi dùng ethanol 70% sẽ tạo điều kiện cho quá trình phân hủy AMG và làm giảm đáp ứng đo được.
Vì thế việc sử dụng dung môi là methanol tuyệt đối và ethanol tuyệt đối giúp hạn chế khả năng chất phân tích bị thủy phân bởi enzyme khi gặp nước Ethanol tuyệt đối được lựa chọn để làm dung môi chiết xuất
MeOH abs EtOH abs EtOH 70
A (1/g) Khảo sát dung môi chiết
3.1.2.2 Khảo sát dung môi loại béo
Thực hiện khảo sát các dung môi diethyl ether, ether dầu hỏa và n-hexane làm dung môi loại béo
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát dung môi loại béo
Diện tích pic AMG Diện tích pic CAP
Nhận xét: Dựa vào kết quả khảo sát, thấy được rằng đáp ứng của chloramphenicol khi sử dụng diethyl ether để loại béo là thấp nhất, điều này có thể giải thích là CAP bị hòa tan vào diethyl ether Sử dụng ether dầu hỏa cho đáp ứng của AMG và CAP là cao nhất chứng tỏ ether dầu hỏa không hòa tan và làm mât mẫu trong quá trình loại béo
Kết luận: lựa chọn ether dầu hỏa làm dung môi loại béo
3.1.2.3 Khảo sát nhiệt độ siêu âm
Thực hiện khảo sát ở các mức nhiệt độ khác nhau: 35 o C, 45 o C, 55 o C, 65 o C, 75 o C
Hình 3.4 Kết quả khảo sát nhiệt độ siêu âm
Theo kết quả khảo sát, đáp ứng của chất phân tích đạt mức cao nhất ở điều kiện 65 °C Nguyên nhân là khi nhiệt độ tăng sẽ làm tăng quá trình khuếch tán của chất tan vào dung môi, từ đó cho phép hòa tan được lượng chất phân tích lớn hơn.
Kết luận: lựa chọn nhiệt độ bể siêu âm tối ưu cho quy trình chiết là 65 o C
Khảo sát nhiệt độ siêu âm
3.1.2.4 Khảo sát thời gian siêu âm
Thực hiện khảo sát ở các khoảng thời gian là 20 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút
Hình 3.5 Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm
Khảo sát thời gian siêu âm cho thấy đáp ứng của chất phân tích tăng lên và đạt mức cao nhất tại hai mốc 90 phút và 120 phút Giữ nguyên các điều kiện khác của quy trình và chọn thời gian chiết siêu âm 90 phút sẽ cho được lượng chất phân tích cao nhất, tối ưu hóa hiệu quả chiết và thu được nhiều chất phân tích nhất.
Kết luận: lựa chọn thời gian siêu âm tối ưu là 90 phút
3.1.2.5 Khảo sát thể tích dung môi
Thực hiện khảo sát ở lượng dung môi là 5ml, 10ml, 20ml, 30ml, 40ml và 50ml ethanol
Hình 3.6 Kết quả khảo sát thể tích dung môi sử dụng
A (1/g) Khảo sát thời gian siêu âm
A (1/g) Khảo sát thể tích dung môi chiết
Khảo sát lượng dung môi cho quá trình chiết cho thấy lượng chất chiết được thay đổi theo thể tích dung môi Đáp ứng đạt cao nhất khi sử dụng 30 ml hoặc 40 ml EtOH Đáp ứng ở 30 ml và 40 ml EtOH không chênh lệch quá nhiều; tuy nhiên, khi dùng nhiều dung môi để chiết, đồng thời cũng hòa tan nhiều tạp chất hơn, ảnh hưởng tới tín hiệu của chất phân tích.
Kết luận: lượng thể tích dung môi tối ưu được lựa chọn là 30 ml
3.1.2.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu
Sau những kết quả của quá trình khảo sát, quy trình tối ưu được rút ra như sau:
Cân chính xác khoảng 0,2g mẫu vào bình cầu 100 ml.
Thêm 30ml ethanol tuyệt đối.
Lọc qua giấy lọc qua bình cầu 250 ml khác
Hòa cắn bằng 10 ml ethanol tuyệt đối
Hút 1ml dịch hòa cắn cho vào ống falcon 15ml
Thêm 0,1 ml cloramphenicol làm nội chuẩn
Thêm khoảng 5 ml ether dầu hỏa để loại béo
Ly tâm Loại bỏ lớp ether dầu hỏa bằng pipet pasteur
Hòa tan cắn còn lại trong ống falcon bằng 1 ml methanol rồi chuyển vào vial.
Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu phân tích tối ưu
3.1.2.7 Đánh giá ảnh hưởng nền Đường chuẩn của chất phân tích amygdalin trên dung môi và các nền mẫu với nồng độ từ 1,5 ppb đến 30 ppb:
Bảng 3.6 Kết quả đường chuẩn AMG không có IS
Hình 3.8 Đường chuẩn AMG trên các nền mẫu Ảnh hưởng của nền mẫu lên chất phân tích ở 2 nền mẫu:
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá ảnh hưởng nền
AMG adung môi anhân hạt abánh
Qua kết quả cho thấy nền âm ảnh hưởng lên chất phân tích trong nền trắng khiến tín hiệu bị giảm trên 20% theo AOAC Vì vậy chloramphenicol được chọn làm chất chuẩn nội để giảm ảnh hưởng của nền mẫu lên kết quả phân tích (xem bảng 3.13 và bảng 3.14).
C AMG nhân hạt bánh dung môi
Linear (nhân hạt) Linear (bánh) Linear (dung môi)
Thẩm định phương pháp phân tích
Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn trên nền dung môi của AMG và CAP trên 2 nền mẫu được trình bày trong hình 3.9, 3.10, 3.11
Sắc ký đồ của dung môi ở hình 3.9
Hình 3.9 Sắc ký đồ của dung môi MeOH Sắc ký đồ của chuẩn pha trong dung môi ở hình 3.10
Hình 3.10 Sắc ký đồ của chuẩn pha trong dung môi
Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn, a) trắng – AMG, b) trắng thêm chuẩn – AMG, c) trắng – CAP, d) trắng thêm chuẩn – CAP
Nhận xét cho thấy thời gian lưu của chất phân tích ở mẫu thêm chuẩn trùng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn trên nền dung môi, xác nhận tính nhất quán của quá trình phân tích và sự lặp lại giữa hai mẫu Ở mẫu trắng, không xuất hiện tín hiệu của chất phân tích, đáp ứng theo tiêu chuẩn và cho thấy sự vắng mặt của chất phân tích trên nền mẫu, từ đó đảm bảo tính đặc hiệu và độ tin cậy của phương pháp.
Tỉ số ion và độ lệch của chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn trong dung môi được trình bày ở bảng 3.8
Bảng 3.8 Bảng so sánh tỉ số ion
Dung môi Nền nhân hạt Nền bánh Yêu cầu
Nhận xét cho thấy độ lệch giữa các mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn trong dung môi đều nằm trong giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn của Hội đồng Châu Âu, khẳng định tính chính xác và sự tuân thủ các chuẩn mực trong phương pháp phân tích.
Tính điểm IP và yêu cầu của Hội đồng Châu Âu [2] đối với phương pháp LC – MS/MS như sau:
Bảng 3.9 Yêu cầu số điểm IP theo Hội đồng Châu Âu
Ion mẹ Ion con Yêu cầu
Chất phân tích đều có một ion mẹ và hai ion con, điểm IP đạt 4 điểm, đáp ứng yêu cầu phân tích theo Hội đồng Châu Âu [2]
3.2.2 Độ phù hợp hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn AMG 10 ppb và CAP 5 ppb trong methanol
Bảng 3.10 Kết quả thời gian lưu
Thời gian lưu L1 L2 L3 L4 L5 L6 Trung bình RSD
Bảng 3.11 Kết quả diện tích pic
Diện tích pic AMG CAP
Nhận xét: RSD của thời gian lưu cho hai chất là 0,2%, trong khi RSD ở các lần lặp AMG và CAP lần lượt là 1,4% và 1,7% Những con số này cho thấy hệ thống phân tích có độ lặp lại ổn định và đáp ứng yêu cầu của AOAC về độ chính xác và tin cậy của thời gian lưu, phù hợp cho đánh giá chất lượng và tuân thủ tiêu chuẩn.
3.2.3 Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện
Để xác định LOQ, tiến hành thêm chuẩn ở các mức 0,3 ppb, 0,5 ppb và 1,0 ppb vào nền mẫu trắng, sau đó thực hiện xử lý mẫu theo quy trình và phân tích.
Giá trị LOQ ở các nền khác nhau được trình bày ở bảng 3.12 và hình 3.12
Bảng 3.12 Kết quả LOQ trền các nền mẫu
AMG S/N LOQ (ppb) LOD (ppb)
Hình 3.12 Sắc ký đồ LOQ của AMG trên nền mẫu, a) nhân hạt, b) bánh
Nhận xét: Mức LOQ của phương pháp trên hai nền mẫu là 50 ppb, tương đương với các nghiên cứu trước đây (ví dụ 48 ppb [39] trên hạt sơn trà) Mức LOD của phương pháp trên hai nền mẫu là 15 ppb.
Thực hiện phân tích các mẫu chuẩn pha trên nền mẫu trắng ở các mức nồng độ trong khoảng từ từ 1,5ppb đến 30ppb, kết quả trong bảng 3.13 và hình 3.13
Bảng 3.13 Đường chuẩn AMG khi thêm IS
Hình 3.13 Đường chuẩn của AMG khi có IS Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu khi thêm CAP làm nội chuẩn trình bày ở bảng 3.14
Bảng 3.14 Ảnh hưởng nền khi có sử dụng IS
AMG adung môi anhân hạt abánh
Nhận xét cho thấy khi CAP được bổ sung làm chất chuẩn nội trong nền mẫu, ảnh hưởng của nền mẫu nhân hạt lên kết quả phân tích giảm xuống còn -16,1% Do đó, có thể sử dụng đường chuẩn pha trong dung môi để thực hiện tính toán kết quả và hiệu chỉnh số liệu, giúp tăng độ chính xác khi phân tích CAP trong nền mẫu.
Kết quả cho thấy đường chuẩn có hệ số xác định R^2 ≥ 0,995 và độ lệch chuẩn không vượt quá 15%, cho thấy phạm vi nồng độ từ 1,5 ppb đến 30 ppb thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích của peak chất phân tích và nội chuẩn với nồng độ chất.
C AMG nhân hạt bánh dung môi
Linear (nhân hạt) Linear (bánh) Linear (dung môi)
3.2.5 Độ đúng và độ lặp lại
Phương pháp phân tích mẫu thêm chuẩn được thực hiện ở ba mức nồng độ 3 ppb, 5 ppb và 10 ppb, mỗi mức nồng độ được phân tích 6 lần độc lập trên hai nền mẫu là nhân hạt và bánh, tính từ bước cân mẫu.
Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại được trình bày ở bảng 3.15 và bảng 3.16
Bảng 3.15 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại trong nền mẫu nhân hạt
Chất phân tích Nội chuẩn Nồng độ
Diện tích pic Diện tích pic
Bảng 3.16 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại trong nền bánh
Chất phân tích Nội chuẩn Nồng độ
Diện tích pic Diện tích pic
Độ thu hồi nằm trong khoảng 88,5 – 113,2% và RSD = 3,9 – 6,0% ở nền mẫu nhân hạt; với nền mẫu bánh, độ thu hồi nằm trong khoảng 98,1 – 114,2% và RSD = 5,6 – 6,7% Theo AOAC 2016, yêu cầu về độ thu hồi là 60 – 115% và RSD ≤ 21% đối với độ lặp lại Chứng minh phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu về độ đúng và độ lặp lại theo tiêu chuẩn AOAC 2016.
Ứng dụng phương pháp phân tích hàm lượng amygdalin
Thực hiện phân tích các mẫu thực được mua ngẫu nhiên trên thị trường Đánh giá kết quả:
So sánh thời gian lưu, mảnh mẹ, mảnh con, tỷ lệ mảnh định tính và định lượng để xác định sự có mắt của chất phân tích
Tính hàm lượng AMG có trong mẫu thực dựa trên đường chuẩn xây dựng trong
Kết quả được trình bày ở bảng 3.17
Bảng 3.17 Kết quả xác định hàm lượng Amygdalin trong mẫu thực phẩm
Mẫu Nền V (mL) Độ pha loãng
H4 Hạt hạnh nhân cắt lát
Kết quả sắc ký đồ một số mẫu dương tính ở hình 3.14
Hình 3.14 Sắc ký đồ phân tích mẫu, a) Hạt hạnh nhân - CAP, b) Hạt hạnh nhân -
AMG, c) Bánh B1 - CAP, d) Bánh B1 - AMG
Về phương pháp phân tích:
Ưu điểm của phương pháp là độ nhạy tốt với LOQ = 50 ppb, gần bằng giá trị 48 ppb được công bố trong tài liệu tham khảo [39], cho phép phát hiện chất phân tích ở nồng độ rất thấp như trong mẫu bánh của đề tài này Việc sử dụng chuẩn nội chloramphenicol có thể giảm sai số khi pha loãng, giảm mất mẫu trong quá trình xử lý và giảm ảnh hưởng của nền mẫu lên kết quả phân tích Do đó, có thể áp dụng đường chuẩn pha trong dung môi, giúp đơn giản hóa quá trình phân tích.
Những nhược điểm chính của quy trình bao gồm: quy trình xử lý mẫu kéo dài nhiều bước do cần làm sạch hệ thống LC–MS/MS; thời gian chiết mẫu lâu vì phải hòa tan toàn bộ chất phân tích có trong mẫu; chuẩn nội không phải là chuẩn nội đồng vị Tuy nhiên chloramphenicol không có trong các mẫu phân tích và kết quả thẩm định đã chứng minh việc sử dụng chloramphenicol làm nội chuẩn là phù hợp.
Về thẩm định phương pháp:
Phương pháp đã được thẩm định và đạt đầy đủ các tiêu chí theo hướng dẫn thẩm định AOAC 2016, gồm độ phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, cũng như độ lặp lại và độ thu hồi.
Về kết quả phân tích:
Trong các sản phẩm từ hạt hạnh nhân, amygdalin luôn xuất hiện và được phân tích như một thành phần có mặt Tuy nhiên ở nền bánh, hàm lượng amygdalin thấp hơn nhiều so với các dạng nguyên liệu hạnh nhân như hạt hạnh nhân nguyên hạt, bột hạnh nhân và hạnh nhân cắt lát.
Với lượng tổng HCN cho phép trong bánh hạnh nhân theo Ủy ban Châu Âu – EC là
Ở mức 50 ppm, 500 mg amygdalin có thể thủy phân thành 30 mg HCN; từ kết quả này suy ra lượng amygdalin tối đa được cho phép trong bánh hạnh nhân là 833 ppm Kết quả phân tích các mẫu bánh cho thấy hàm lượng amygdalin ở mức thấp, phù hợp với yêu cầu của EC.
Bộ Y tế Canada thiết lập mức giới hạn tối đa cho tổng lượng HCN có thể chiết được từ hạt mơ ở 20 ppm, tương đương amygdalin tối đa 333 ppm Tuy nhiên, mẫu hạt mơ được dùng để định lượng amygdalin cho thấy hàm lượng lên tới 34.000 ppm, vượt mức quy định Ở Việt Nam hiện chưa có mức quy định về phơi nhiễm amygdalin trong hạt mơ.
Các mẫu hạt khác như hạt điều, hạt macca và hạt dẻ cười chưa cho thấy sự xuất hiện của chất được phân tích, và cho tới nay chưa có nghiên cứu nào báo cáo về hàm lượng amygdalin ở những hạt này.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Sau quá trình nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, cụ thể:
1 Đã xây dựng thành công phương pháp phân tích xác định amygdalin trong thực phẩm có sử dụng cloramphenicol làm nội chuẩn bằng LC – MS/MS sử dụng cột sắc ký pha đảo Symmetry C18 (3 mm x 150 mm, 3,5 μm), pha động sử dụng kênh A là HCOOH 0,1% và kênh B là acetonitril Điều kiện khối phổ chế độ ion hóa âm, chọn được ion mẹ và hai mảnh ion con tương ứng cho chất phân tích Quy trình xử lý mẫu được tối ưu để có thể chiết được toàn bộ chất phân tích Sử dụng chuẩn nội trong quy trình để giảm ảnh hưởng của nền mẫu lên kết quả phân tích và giảm sai số trong thao tác trong quy trình xử lý mẫu
Phương pháp được thẩm định để đáp ứng các yêu cầu theo chuẩn của AOAC và ICH, cho thấy khả năng định lượng amygdalin ở hàm lượng 50 ppb trên nền bánh và trên nhân hạt Giá trị này gần tương đương với kết quả đã được báo cáo trước đây là 48 ppb [39], cho thấy phương pháp có độ nhạy và độ chính xác phù hợp với nghiên cứu trước đó.
2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để thực hiện phân tích các mẫu có trên thị trường thì các sản phẩm và nguyên liệu từ hạt hạnh nhân đều có chứa amygdalin Các mẫu hạt khác như hạt điều, hạt macca hay hạt dẻ cười không thấy có xuất hiện chất phân tích
Phương pháp có thể được ứng dụng mở rộng trong một số hướng nghiên cứu khác nhau:
Nghiên cứu xác định amygdalin trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau được sản xuất từ các hạt chứa amygdalin làm nguyên liệu Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá mức tồn tại của amygdalin trong chuỗi cung ứng thực phẩm và các nền mẫu liên quan đến nguyên liệu từ hạt chứa amygdalin Đồng thời, nghiên cứu phân tích mức tiêu thụ của người dùng để đánh giá nguy cơ phơi nhiễm và mức độ an toàn của thực phẩm liên quan đến amygdalin.
- Nghiên cứu để xác định ngưỡng hàm lượng amygdalin trong các nguồn thực vật khác để nhằm đánh giá nguy cơ gây ngộ độc cyanid của thực vật đấy
- Nghiên cứu mức tiêu thụ và phơi nhiễm với amygdalin từ những sản phẩm chứa lượng amygdalin cao như hạt mơ
1 Hội đồng Dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học,
2 Trần Cao Sơn, Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội, 1 – 84
3 Trần Tử An (2012), Hóa Phân Tích 2: Phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 107 – 205
4 AOAC Official Methods of Analysis (2012), Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements
5 Baroni, A., Paoletti, I., Greco, R., Satriano, R., Ruocco, E., Tufano, M., & Perez, J
(2005), “Immunomodulatory effects of a set of amygdalin analogues on human keratinocyte cells”, Experimental Dermatology, 14(11),854–859
6 Beilstein, F K., Praeger, B., Jacobson, P., Richter, F., & Deutsche Chemische Gesellschaft (1918), Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, Berlin: J Springer., Germany
7 Bolarinwa, I F., Orfila, C., & Morgan, M R (2014), “Amygdalin content of seeds, kernels and food products commercially-available in the UK”, Food Chemistry, 152,133–139
8 Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R L., Torre, L A., & Jemal, A
(2018), “Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries”, CA: A Cancer Journal for Clinicians, 68(6), 394–424
9 Calabrese E J (1979), “Possible adverse side effects from treatment with laetrile”, Medical hypotheses, 5(9), 1045–1049
10 Chang, J., & Zhang, Y (2012), “Catalytic degradation of amygdalin by extracellular enzymes from Aspergillus niger”, Process Biochemistry, 47(2), 195–200
“Identification and Quantification of Passion Fruit Cyanogenic Glycosides”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(12), 3817–3820
12 Cheng, Y., Yang, C., Zhao, J., Tse, H F., & Rong, J (2015), “Proteomic identification of calcium-binding chaperone calreticulin as a potential mediator for the neuroprotective and neuritogenic activities of fruit-derived glycoside amygdalin”, The Journal of Nutritional Biochemistry, 26(2), 146–154
13 Dang, T., Nguyen, C., & Tran, P N (2017), “Physician Beware: Severe Cyanide Toxicity from Amygdalin Tablets Ingestion”, Case Reports in Emergency Medicine,
14 Dhillon, J., Tan, S Y., & Mattes, R D (2016), “Almond Consumption during Energy Restriction Lowers Truncal Fat and Blood Pressure in Compliant Overweight or Obese Adults”, The Journal of Nutrition, 146(12), 2513–2519
15 Drankowska, J., Kos, M., Ko´sciuk, A., Tchórz, M (2018), “Cyanide poisoning from an alternative medicine treatment with apricot kernels in a 80- year-old female”, Journal of Education, Health and Sport, 8, 19–26
16 Ekinci, F., Yildizdas, D., Ates, A., & Gửkay, N (2019), “Cyanide intoxication by apricot kernels: A case report and literature review”, Emergency Care Journal, 15(2)
17 Flies, E J., Mavoa, S., Zosky, G R., Mantzioris, E., Williams, C., Eri, R., Brook,
B W., & Buettel, J C (2019), “Urban-associated diseases: Candidate diseases, environmental risk factors, and a path forward”, Environment international, 133(Pt A), 105187
18 Ganjewala, D., Kumar, S., Asha, D., Ambika, K (2010), “Advances in cyanogenic glycosides biosynthesis and analyses in plant: a review”, Acta Biologica Szegediensis, 54, 1−14
19 GAO, M., WANG, Y., WEI, H., OUYANG, H., HE, M., ZENG, L., SHEN, F., GUO, Q., & RAO, Y (2014), “Qualitative and quantitative analysis of amygdalin and its metabolite prunasin in plasma by ultra-high performance liquid chromatography-tandem quadrupole time of flight mass spectrometry and ultra-high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry”, Chinese Journal of Chromatography, 32(6), 591
20 Guo, J., Wu, W., Sheng, M., Yang, S., & Tan, J (2013), “Amygdalin inhibits renal fibrosis in chronic kidney disease”, Molecular medicine reports, 7(5), 1453–1457
21 Halenar, M., Chrastinova, L., Ondruska, L., Jurcik, R., Zbynovska, K., Tusimova, E., & Kolesarova, A (2017), “The evaluation of endocrine regulators after intramuscular and oral application of cyanogenic glycoside amygdalin in rabbits”, Biologia, 72(4), 468-474
22 International Conference on Harmonisation (2005), ''Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology'', ICH harmonised tripartite guideline, 1- 13
23 Jamshed, H., Sultan, F A T., Iqbal, R., & Gilani, A H (2015), “Dietary Almonds Increase Serum HDL Cholesterol in Coronary Artery Disease Patients in a Randomized Controlled Trial”, The Journal of Nutrition, 145(10), 2287–2292
24 Jaszczak-Wilke, E., Polkowska, A., Koprowski, M., Owsianik, K., Mitchell, A E.,
& Bałczewski, P (2021), “Amygdalin: Toxicity, Anticancer Activity and Analytical Procedures for Its Determination in Plant Seeds”, Molecules, 26(8), 2253
25 Jiagang, D., Wang, H., Liu, Y., Li, C., Hao, E., Du, Z., Bao, C., Lv, J., & Wang, Y
(2012), “Anti-Atherosclerotic Effects Mediated by the Combination of Probucol and Amygdalin in Apolipoprotein E-Knockout Mice Fed with a High Fat Diet”, Journal of Animal and Veterinary Advances, 11(1), 20–25
26 Karsavuran, N., Charehsaz, M., Celik, H., Asma, B M., Yakıncı, C., & Aydın, A
(2014), “Amygdalin in bitter and sweet seeds of apricots”, Toxicological & Environmental Chemistry, 96(10), 1564–1570
27 Li, X., Shi, F., Gu, P., Liu, L., He, H., & Ding, L (2014), “A sensitive LC–MS/MS method for simultaneous determination of amygdalin and paeoniflorin in human plasma and its application”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
28 Meredith T., Jacobsen D., Haines J., Berger J-C., and A Van Heijst (1993), Antidotes for Poisoning by Cyanide, World Health Organization
29 Mirmiranpour, H., Khaghani, S., Zandieh, A., Khalilzadeh, O O., Gerayesh-Nejad, S., Morteza, A., & Esteghamati, A (2012), “Amygdalin inhibits angiogenesis in the cultured endothelial cells of diabetic rats”, Indian journal of pathology & microbiology, 55(2), 211–214
30 Nabavizadeh, F., Alizadeh, AM., adroleslami, ZS., Adeli, S (2011),
“Gastroprotective effects of amygdalin on experimental gastric ulcer: Role of NO and TNF-alpha”, Journal of Medicinal Plants Research, 5, 3122-3127
31 Newton, G W., Schmidt, E S., Lewis, J P., Lawrence, R., & Conn, E (1981),
“Amygdalin toxicity studies in rats predict chronic cyanide poisoning in humans” Western Journal of Medicine, 134(2), 97
32 Nikolic, L (2012), “Development and validation of HPLC method for the determination of amygdalin in the plant extract of plum kernel”, Research Journal of Chemistry and Environment
33 Qadir, M., & Fatima, K (2017), “Review on Pharmacological Activity of Amygdalin”, Archives in Cancer Research, 05(04)
34 Rubino, M J., & Davidoff, F (1979), “Cyanide poisoning from apricot seeds”, JAMA, 241(4), 359
35 Sauer, H., Wollny, C., Oster, I., Tutdibi, E., Gortner, L., Gottschling, S., & Meyer,
S (2015), “Severe cyanide poisoning from an alternative medicine treatment with amygdalin and apricot kernels in a 4-year-old child”, Wiener Medizinische Wochenschrift, 165(9–10), 185–188
36 Savic, I M., Nikolic, V D., Savic-Gajic, I M., Nikolic, L B., Ibric, S R., & Gajic,
D G (2015), “Optimization of technological procedure for amygdalin isolation from plum seeds (Pruni domesticae semen)”, Frontiers in Plant Science, 6
37 Shim, S M., & Kwon, H (2010), “Metabolites of amygdalin under simulated human digestive fluids”, International journal of food sciences and nutrition, 61(8), 770–779
38 Suchard, J R., Wallace, K L., & Gerkin, R D (1998), “Acute cyanide toxicity caused by apricot kernel ingestion”, Annals of emergency medicine, 32(6), 742–
39 Tanaka, T., Kimura, K., Kan, K., Katori, Y., Michishita, K., Nakano, H., & Sasamoto, T (2020), “Quantification of amygdalin, prunasin, total cyanide and free cyanide in powdered loquat seeds”, Food Additives & Contaminants: Part A, 37(9), 1503–1509
40 Torabian, S., Haddad, E., Rajaram, S., Banta, J., & Sabaté, J (2009), “ Acute effect of nut consumption on plasma total polyphenols, antioxidant capacity and lipid peroxidation”, Journal of human nutrition and dietetics : the official journal of the British Dietetic Association, 22(1), 64–71
41 Unproven methods of cancer management Laetrile (1991), CA: A Cancer Journal for Clinicians, 41(3), 187–192
42 White, W L., Arias-Garzon, D I., McMahon, J M., & Sayre, R T (1998),
“Cyanogenesis in Cassava1” Plant Physiology, 116(4), 1219–1225
43 Wien, M A., Sabaté, J M., Iklé, D N., Cole, S E., & Kandeel, F R (2003),
“Almonds vs complex carbohydrates in a weight reduction program”, International journal of obesity and related metabolic disorders : journal of the International Association for the Study of Obesity, 27(11), 1365–1372
44 , xem 12/5/2022
45 , xem 12/5/2022