Nghiên cứu khả năng sinh độc tố một số chủng nấm mốc sinh độc tố trong không khí môi trường lao động

là nhóm có nhiều chúng loại nấm sinh ra độc tố và bào tử phát tán được trong không khí.. Xuất phát từ những vấn đề trên, đồng thời tham gia nghiên cứu đề tài cấp bộ “Nghiên cứu phân lập

DANH MỤC CHỮ VIÉT TẤT

NCBI National Center for Biotechnology Information

ADM Aspergillus Differentiation Medium Base

A fumigatus Aspergillus fumigatus

A.flavus Aspergillus flavus

A niger Aspergillus niger

A nidulans Aspergillus nidulans

A versicoler Aspergillus versicolor

A terreus Aspergillus terreus

A keratitis Aspergillus keratitis

ACGIH American conference of Governmental industrial

hygienists

So sánh mẫu VA-11 trên 4 môi trường

sau 10 ngày nuôicấýl học Mở Hà N

40

51

7 Bảng 7 Ngày quan sát 7/2/2017 của mẫu VA-16 41

8 Bảng 8 Ngày quan sát 9/2/2017 cúa mẫu VA-16 42

9 Băng 9 Ngày quan sát 10/2/2017 của mẫu

So sánh mẫu VA-16 trên 4 môi trường

12 Bàng 12 Ket quá quan sát vi thế mầu VA-11 47

13 Bàng 13 Kết quá quan sát vi thề mầu VA-16 49

3 Hình Các kiểu cuồng bào tử đính cúa Aspergillus 10

5 Hình 5 Cơ quan sinh sàn của mầu VA-1 1 47

So sánh độ tươTig đồng cua đoạn gen mầu

VA-1 1 với Genbank

51

10 Hình 10 Ket quà giái trình tự gen VA-16 53

II Hình 11

So sánh độ tương đồng của đoạn gen mầu

VA-16 với Genbank

54

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

DANH MỤC CÁC BÁNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỚ đầu’ 1

1.1 Tông quan về nấm mốc 5

1.1.1 Đặc điềm hình thái cấu tạo 5

1.1.2 Đặc điêm sinh trường và sinh sàn 8

1.1.3 Phân loại nấm mốc 11

1.1.4 VỊ trí, vai trò của nấm mốc 13

1.2 Tống quan về nấm mốc có khả năng sinh độc tố trên thế giới 14

1.2.1 Tinh hình nghiên cứu nấm mốc sinh độc tố 14

1.2.2 Phương pháp xác định nấm mốc sinh độc tố 16

1.3 Tinh hình nghiên cứu ờ Việt Nam về nấm mốc sinh độc tố có trong không khí môi trường lao động 21

1.3.1 Tinh hình nghiên cứu những nấm mốc sinh độc tố có trong không khí môi trường lao động 21

1.3.2 Phương pháp xác định nấm mốc sinh độc tố 23

2.1 Đối tượng, phương pháp lấy mẫu nấm mốc trong không khí 25

2.2 Xác định đặc điếm sinh hộc ịCÙa nấntị^pốơsinh đỘỊCtọ^.Ị 29

2.2.1 Phương pháp qúan sát hình thai ( đại thể, vi thể) 29

3.1 Ket quá lấy mẫu nấm mốc có khá năng sinh độc tố có mặt trong không khí môi trường lao động 32

3.1.1 Mật độ nấm mốc sinh độc tố có trong không khí MTLĐ xác định bằng phương pháp chù động 32

3.1.2 Mật độ nấm mốc sinh độc tố có trong không khí MTLĐ xác định bằng phương pháp thụ động 34

3.2 Kết quả đặc điếm sinh học các chùng nấm mốc sinh độc tố có trong không khí MTLĐ trên môi trường khác nhau 35

3.2.1 Kết quà quan sát đại thề 36

3.2.2 Kết quả quan sát vi thể 46

3.3 Mức độ nguy hại của nấm mốc sinh độc tố đã phân lập được 56

PHẦN 4: KỂT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ ’ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THẤM KHẢO 60

MÓ ĐÀU Tính cấp thiết

Nấm Aspergillus spp là một trong những chúng nấm lớn nhất, tồn tại ở khắp nơi nhưng hay gặp ở vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới Nó có khoảng 100 loài nhưng có khoáng 20-30 loài gây bệnh cho người, thường gặp

là chủng A fumigatus, A.flavus, A niger như: A aureus, A.flavus gây viêm da; A niger gây viêm tai, phôi, dị ứng, hen; A nidulans, A versicolerr, A

terreuss gây viêm da ở chân, tay, viêm quanh móng; A keratitis gây viêm giác mạc; đặc biệt A fuinigatus và A.flavus hay gây viêm phổi.110]

Nấm Aspergillus spp tồn tại trong đất, không khí, các thực phẩm như ngô, lúa hay thức ăn ôi thiu Ớ nước ta, thời tiết nóng ẩm, môi trường sinh hoạt và điều kiện vệ sinh chưa cao nên các bệnh nấm dễ phát triên Nam phát triền trong môi trường không cần ánh sáng mặt trời, môi trường nghèo chất dinh dưỡng, chỉ cần có nhiệt độ và độ ấm thích hợp Nấm tồn tại trong tự nhiên, ờ khắp mọi nơi trên thế giới và hầu hết mọi người đều tiếp xúc với nấm nhưng tình trạng nhiễm nấm trờ nên gây bệnh phụ thuộc vào mức độ chất truyền nhiễm và sức đè kháng cùa cơ thế.[ 17]

Nhóm Aspergillus spp. là nhóm có nhiều chúng loại nấm sinh ra độc tố

và bào tử phát tán được trong không khí khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sinh trướng phát triền trên các loại cơ chất, sán phẩm khác nhau, trong chế biến lương thực nguy cơ bị nhiễm độc lố là rất cao khi bị bào tử nam mốc xâm nhiễm Phạm vi ký chủ rất rộng, khả năng phát tán rất lớn nên việc phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn Đặc biệt trong không khí rất khó kiếm soát, hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về việc tiếp xúc với nấm mốc

và độc tố trong không khí, đưa ra giải pháp kiểm soát chúng

Loại nấm này có chùng lây truyền cho con người qua đường hô hấp, lơ lửng trong không khí và phát tán theo gió Nếu bị nấm Aspergillus spp nhiễm vào phồi sẽ rất khó nhận biết bởi không có triệu chứng rõ rệt Chỉ khi nào tế bào nấm xâm lấn vào phế quàn thì bệnh nhân mới có phản xạ ho Phương thức gây bệnh của Aspergillus spp là đầu tiên có thề gây bệnh ờ da sau đó tiến triển gây bệnh hệ thống hoặc ngược lại [ 181

Ngoài ra nam còn gây bệnh ớ hệ thần kinh: Khi nhiễm nấm nếu bệnh nhân không được điều trị ngay, thông qua các hốc ở mặt hay hốc sọ, nấm có thế xâm nhập vào bên trong gây viêm não, viêm tiều não

Có khoảng 1 (X) loại vi nấm gây bệnh cho người, trong đó: 20 loại gây bệnh nội tạng làm chết người 35 loại gây bệnh nội tạng nhẹ, bệnh ớ da và mô dưới da, mạch bạch huyết, 45 loại gây bệnh ở da và màng nhày Các vi nấm gây bệnh bàng nhiều yeu tố: men (vi nấm ngoài da), cơ học (chốc đau), độc to (aflatoxin do A flavus tiết ra), viêm (Cryptococcus neoformans) và miễn dịch

Một số bệnh do vi nấm gây ra thường gặp nhất hiện nay được chia làm 3 nhóm chính: Nhóm bệnh do vi nấm ngoại biên gây ra, nhóm bệnh do vi nấm ngoài da, nhóm bệnh do vi nấm nội tạng Các loại độc tố sinh ra từ các loại nấm mốc điển hình như:

-Aflatoxin: Aflatoxin được tìm thấy nhiều trong khô dầu phộng, khô dầu dừa, bắp, cám, tấm do A flavus và A parasiticus sinh ra, độc tố này gây tổn thương ớ gan, thận, mật, nó cũng làm giám khả năng tiết sữa, đẻ trứng và sức đề kháng ờ gia súc, gia cầm Theo Tố chức về bệnh ung thư Quốc tế aflatoxin được xếp vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người Aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm A flavus và A parasiticus tạo ra Ngoài ra

Aspergillus spp chúng còn là nguyên nhân gây bệnh cho động vật và thực vật trong đó có cá con người và vật nuôi

-Ochatoxin A: do A ochraceus sinh ra, các nguyên liệu dễ nhiễm độc tố

này như cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê Độc tố này gây hại đến gan và thận động vật Tương tự như aflatoxin, độc tố này cũng gây nên sự giám sức đề kháng và là tác nhân gây ung thư ở người

-Citrinin: Độc tố này do sinh ra bởi p citricum có nhiều trên tấm gạo đế mốc, độc tố này gây hại cho thận, gây hoại tử nhiễm trùng vì thế làm tồn hại den chất lượng quầy thịt

-Tricothecenes (T2-toxin): do F tricinotum sinh ra thường nhiễm nhiều trong bắp, tấm gạo bị mốc Ánh hưởng chính của các độc tố này là làm giảm tính thèm ăn ở gia súc, kèm theo triệu chứng nôn mửa và làm giảm năng suất cùa động vật nuôi Heo là loài gia súc nhạy cảm với tricothecenes

-F2 -Toxin (zearlenon): do F roseum sinh ra, theo quan sát thấy nhiều

trên bắp, lúa mạch, lúa mì Heo là loài động vật rất dễ quan sát, khi bị nhiễm độc thì âm hộ bị sưng đỏ, đôi khi núm vú cũng sưng đỏ, có thế dẫn tới sa trực tràng và âm đạo, tử cung nở rộng và có hiện tượng thoái hóa buồng trứng.Trong số các độc chất ở trên thì aflatoxin do A flavus và A parasiticus sinh ra có mức nguy hiếm lớn nhất Aflatoxin bao gồm 6 loại khác nhau (Bl, B2, Gl, G2, MI và M3), trong đó độc tính cao nhất là aflatoxin Bl Sự nguy hiểm ờ chồ nó có khá nàng gây hại chi với liều lượng rất nhỏ, 1 kg thức ăn chi cần nhiễm 2 mg cũng đã đù làm hỏng gan Độc chất này lại bền vững với nhiệt, nếu đem đun sôi 100 °C ở nồi bình thường hoặc nhiệt độ cao hơn ớ nồi

áp suất, hay nhiệt độ từ máy ép đùn viên thức ăn gia súc thì aflatoxin vẫn không bị phân hũy Ngoài khà năng tạo ra một số loại độc chất thì có một số bệnh nguy hiếm đã được tìm thấy nguyên nhân là do các loại nấm gây ra Các aflatoxin được cấu tạo gồm bon hợp chất thuộc nhóm furanocouramin, là sàn phẩm trao đối chất tạo ra bởi A flavus và A parasiticus Hiện nay đã có trên

16 loại độc tố afalatoxin đã được tìm thấy và cơ chế sinh độc tố được phát hiện ký hiệu B|, B2, G|, G2, M|, Mị, P| Qi Các aflatoxin B| và G| là được biết đến nhiều nhất, aflatoxin B| có chứa vòng lacton và aflatoxin GI có chứa

2 vòng lacton Qua các nghiên cứu trên hiện nay đã phát hiện nhiều nhất là

Aspergillus có gần 7CX) loài nhưng chỉ có 19 loài có thế gây bệnh cho người

Những loài được phân lập phỗ biến nhất bao gồm: A fumigatus, A flavus, A

niger, và A terreus Trong đó, trên 90 % trường hợp nhiễm Aspergillus là do

A Fumigatus.

Xuất phát từ những vấn đề trên, đồng thời tham gia nghiên cứu đề tài cấp

bộ “Nghiên cứu phân lập và định danh bằng phương pháp sinh học phân tử một số nấm mốc gây hại trong không khí môi trường lao động” cùa Trạm quan trắc và phân tích môi trường lao động - Viện Nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Bào Hộ lao động, được sự đồng ý và hướng dẫn cùa ThS Vũ Duy Thanh, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh độc tố

một số chủng nấm mốc phân lập trong không khí môi trường lao dộng".

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định khã năng sinh độc tố cùa một số nam mốc phân lập được trong không khí môi trường lao động

Nội dung nghiên cứu

- Mật độ nấm mốc có khá năng sinh độc tố có trong không khí môi trường lao động tại cơ sở chế biến nông sàn

- Xác định độc tố do nấm mốc phân lập được trong không khí sinh ra

PHẦN 1: TÓNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm mốc

1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái và kích thước

Nấm mốc một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường

là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính cùa sợi nấm thường từ 3-5 pm, có khi đến 10 pm, thậm chí đến 1 mm Chiều dài của sợi nam có thể tới vài chục cm Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trường ờ ngọn Các sợi nấm có thế phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (Hình 1) Trên môi trường đặc trưng và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thố phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.(Hình 2)

Nam mốc có 2 dạng: khuân ty (hay sợi nam) và bào tử [13]

* Khuẩn ty (Hypha) hay sợi nấm:

- Khuấn ty có cấu tạo dạng sợi phân nhánh, những sợi này sinh trưởng ở đinh Khuẩn ty được sinh ra từ bào tử, tùy từng loại mà khuẩn ty có thế có hình lò xo, xoan ốc, cái vợt, sừng hươu, cái lược

- Sợi nam có 2 loại:

+ Sợi nấm có vách ngăn: loại này có ở phần lớn các loại nấm mốc Sợi nấm do những chuỗi tế bào tạo nên Sợi nấm lớn lên do tế bào không ngừng phân cắt, nên cơ thề chúng có cấu tạo đa bào đơn nhân

Ví dụ: Aspergillus, Penicillinum

+ Sợi nấm không có vách ngăn: loại này có ở một số loài nấm mốc bậc thấp Toàn bộ hệ sợi nấm được coi như một tế bào phân nhánh được gọi là cơ thể đa nhân Trong quá trình phát triển của sợi nấm chi có nhân phân chia Te bào chất tăng lên nhưng không có màng ngăn nên cơ thể chúng được gọi là cơ thề đơn bào đa nhân.

Ví dụ,- Murco, Rhizupus

- Khi nuôi cấy trong môi trường đặc, căn cứ vào vị trí chức năng khuẩn

ty có thế chia làm 3 loại khuần ty:

+ Khuẩn ty cơ chất: khuẩn ty phát triền sâu vào môi trường lấy thức ăn.+ Khuấn ty khí sinh: khuẩn ty phát triển trên bề mặt môi trường.+ Khuẩn ty sinh sàn: khuấn ty phát triến từ một khuẩn ty khí sinh, đầu của khuẩn ty phát triển đặc biệt trong chứa bào tứ

*Bào tử:

Bào tử là cơ quan sinh sàn chú yểu của nấm mốc Khi nấm mốc trướng thành các khuân ty sinh sản sẽ sinh ra các bào tử Bào tử được hình thành bang hình thức sinh sán vô tính hay hữu tính

Hình 1: Sọi nấm và cấu tạo vách tế bào sọi nấm (theo Samson và ctv,

Hình 2: Một số dạng khuẩn lạc nấm (theo Samson và ctv, 1995)

1.1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Bên ngoài có thành tế bào hau như không được bao bọc bởi cellulose như ở thực vật mà ngược lại là chất kitin Rồi đến màng tế bào chất dày khoáng 7 pm, bên trong là tế bào chất với nhân phân hóa Màng nhân có cấu tạo 2 lớp và trên màng có nhiều lỗ nhỏ Trong nhân có hạch nhân Bên trong

tế bào nấm còn có thổ màng biên, đó là một kết cấu màng đặc biệt nằm ớ giữa thành tế bào và màng tế bào chất, bao bọc bới một lớp màng đon và có hình dạng biến hóa rất nhiều (hình ong, hình túi hình trứng )

Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein dầy 0,02 ụm, bên trong màng nhân chứa ARN và ADN

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản

Ẵ Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội

1.1.2.1 Đặc điểm sinh trưỏng

Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng.Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử.[13J

Nhiệt độ tối thiếu cần cho sự phát triển là từ 2°C-Ỉ-5”C, tối ưu từ 22°C-r28°C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35°c -T 40"C, cá biệt có một so ít loài có thề sống sót ờ 0"C và ở 60"C Nói chung, nấm mốc có thế phát triến tốt cả ở môi trường axit (pH=6) nhưng pH tối ưu là

5 4- 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9.Oxy cũng cần cho sự phát triển cùa nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngừng khi không có oxy và dĩ nhiên nước là yếu

tố cần thiết cho sự phát triển

Theo Alexopoulos và Minns (1979) cho biết nấm mốc có thể phát triển liên tục trong 400 năm hay hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát triến cùa chúng Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng can được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triền nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thề động vật hay thực vật) hay hoại sinh trên xác bã chất hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dường chat cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau:

c, o, H, N p, K, Mg, s, B Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối amoni

sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp đế cắt các đại phân từ này thành những phân tử nhó để dễ hấp thu vào trong tế bào

„ _ Thự viên Viện Đại học Mớ Hà Nội

1.1.2.2 Đặc diêm sinh sản

Có 2 hình thức sinh sàn: sinh sán vô tính và sinh sán hữa tính [13]

*Sinh sản vô tính: có nhiều hình thức

+ Trực phân: giống vi khuẩn

+ Náy chồi: giống nấm men

+ Khúc khuẩn ty: trên cơ thề nấm mốc, khuẩn ty đứt ra thành từng đoạn, mỗi đoạn phát triển thành cơ thể nấm mới

- Các bào từ vô tính gồm:

+ Bào từ noãn: đau các khuẩn ty sinh sàn có sự ngắt đốt Mỗi dốt được coi như một bào tử, khi rơi ra ngoài môi trường sẽ phát triển thành một khuẩn ty mới

+ Bào từ màng dày (hậu bào tử): có ở nấm mốc đa bào Đến thời kì sinh sàn một số tế bào ở cơ thế nấm tích lũy chất dinh dưỡng màng dày lên hình thành

bào tử Bào từ tách rời khòi cơ thể gặp điều kiện thuận lợi nảy mầm cho cơ thề mới.

+ Bào tử nang (bào tứ nội sinh): đây là hình thức sinh sàn chủ yếu của đa số nấm mốc bậc thấp Ớ đầu khuẩn ty sinh sàn phình to ra hình thành nang bào

từ (hình tròn, hình chai, phân nhánh) Trong đó nhân phân chia nhiều lần liên tiếp tạo một loạt nhân con Nhân con được tế bào chất và màng bao bọc hình thành bào tử nang Nang bào tử chứa các bào tử, khi bào tử được giải phóng gặp điều kiện thuận lợi thì hình thành cơ thế nấm mới

+ Bào tử đính (bào từ trần); đây là hình thức sinh sàn của nấm mốc bậc cao và một số nam bậc thấp Từ cơ chất mọc lên những khuẩn ty đặc biệt gọi là cuống sinh bào tứ Đầu cuống sinh bào tử phình to hoặc phân nhánh tạo ra chồi ngắn như hình cái chai Từ đó các chồi này các bào tử được sinh ra tuần

tự liên tiếp, các bào tứ đính mới sinh ra sẽ đẩy dần các bào tứ cũ ra ngoài Bào

tử đính của từng loại nam mốc sẽ có hình dạng, màu sắc khác nhau Ví dụ

Penicillinum có bào tứ màu xanh, hình cầu

từ đinh*

phialides ’

— 7 “ stipe bọng cuống

mctuiac.

Hình 3: các kiếu cuống bào tử đính của Aspergillus: a-1 lóp;

b-2 lóp; c-phiến; d-tia; e-tể

*Sinh săn hữu tính

Nấm mốc sinh sàn hữu tính hình thành các loại bào tử sau:

- Bào tử noãn: Ớ đỉnh các sợi nấm sinh săn sinh ra các noãn khí ( cơ quan giao tử cái) trong đó chứa nhiều noãn cầu Hùng khí (cơ quan giao tứ đực) ớ gần noãn khí Noãn khí và hùng khí tiếp xúc, hùng khí sẽ thụ tinh cho các noãn cầu bằng nhân và một phần tế bào chất của mình để tạo thành một bào tử noãn Bào từ noãn được bao bọc bới một màng dày, sau một thời gian phân chia giảm nhiễm sẽ tạo ra bào tử đơn bội và phát triển thành một khuẩn

ty mới

- Bào tử tiếp hợp (zygospore): Khi hai khuấn ty sinh sản khác giới tiếp giáp nhau, sẽ mọc ra 2 mấu lồi gọi là nguyên phối nang Các mấu lồi tiến dần lại gặp nhau Mỗi mấu lồi sẽ xuất hiện một cách ngăn tạo ra một tế bào đa nhân Hai tế bào cùa 2 mấu lồi sẽ tiếp hợp với nhau tạo thành một hợp tứ đa nhân có màng dày bao bọc gọi là bào tứ tiếp họp Sau một thời gian sống tiềm tàng bào tử tiếp hợp sẽ phát triến thành một nang chứa nhiều bào từ

- Bào tứ túi (Ascospore): Trên một khuấn ty sinh ra hai cơ quan sinh sân: túi giao tử đực-hùng khí; túi giao tử cái-thế sinh túi Hùng khí và túi giao tứ cái tiếp hợp hình thành túi trong chứa bào tử

Ngoài ra còn có bào tứ đám hay gọi là bào tứ ngoại sinh Bào tứ đảm sinh ra trên những cơ quan đắc biệt gọi là quá đám

1.1.3 Phân loại nấm mốc

Cho đến nay chưa có hệ thống phân loại nấm nào được các nhà nấm học thống nhất công nhận Tuy nhiên hệ thống phân loại của G.c Ainsworth (1973) là được sử dụng rộng rãi hơn cả Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ớ nhiều dạng môi trường sống khác nhau, kể cà ờ sa mạc Đa phần nấm sổng ở trên cạn nhưng một số loài lại chì thấy ờ môi trường nước Nấm

và vi khuẩn là những sinh vật phân húy chúng có vai trò quan trọng đối với các hệ sinh thái trên cạn trên toàn thế giới.[2]

Dayal (1975) liệt kê 7 đặc tính để phân loại nấm mốc như sau:

+ Đặc điếm hình thái

+ Chu kì đặc thù

+ Đặc điểm sinh lý

+ Đặc điếm tế bào học và di truyền học

+ Đặc điếm kháng huyết thanh

+ Đặc tính sinh hóa chung

Gần đây, Kurashi (1985) nhấn mạnh đến tầm quan trọng cùa hệ thống Ubiquinon trong phân loại nấm mốc cũng như ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử đề kháo sát đa dạng di truyền và qua mối liên hệ di truyền phân loại cho chính xác hơn.

1.1.4 VỊ trí, vai trò của nấm mốc

Nấm đã được con người sử dụng đế chế biến và bảo quàn thức ăn một cách rộng rãi và lâu dài:

+ Sứ dụng cho quá trình lên men đế tạo ra rượu, bia và bánh mì

+ Một số loài nấm khác được sừ dụng đế sàn xuất dầu , tương, nước chấm Nhiều loại nấm được sứ dụng đế sàn xuất chất kháng sinh, gồm các kháng sinh P-lactam như penicillin và cephalosporin

Nấm rất tích cực trong cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian với những sinh vật khác

Ví dụ: nấm có thế ngăn chặn sự tăng trưởng hay loại trừ kè thù nguy hiếm cùa thực vật và con người, như kiến đục gồ, mối, châu chấu, muồi, ve bét, cỏ dại, giun tròn hay nấm khác mà có thế gây hại cho mùa màng và nhà cửa

Khã năng điều khiển sinh học các loài gây hại cho nông nghiệp của nấm

đã được quan tâm và ứng dụng thực tế:

+ Loài nam kí sinh côn trùng đã được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học vì khả năng kí sinh và tiêu diệt côn trùng của chúng

+ Có ít nhất 14 loại nấm có khá năng chống rệp

+ Loài nấm thuộc chi Trichoderma cũng có khá năng ngăn chặn những loài nam gây bệnh cho cây

+ Các nấm hiến vi Irong đất còn có the phân giãi các chất hữu cơ thành chất

Tương đối ít dữ liệu tồn tại liên quan đến nồng độ aflatoxin và các sinh vật gây bệnh trên bụi trong môi trường lao động

Tại Philippines, các nhà nghiên cứu đã kiếm tra Aspergillus spp và mức aflatoxin trong 54 mẫu hạt bụi được tạo ra bời các cơ sở chế biến nông nghiệp như các chỉ số có thổ tiếp xúc với aflatoxin Tỷ lệ trung bình cùa

Aspergillus spp. thế hiện như là một tý lệ phần trăm cùa tồng số nấm mốc trong bụi lúa, bụi ngô bụi thức ăn và bụi dừa là 8%, 4%, 31% và 10%, tương ứng Nam Aspergillus spp có khã năng sinh độc tố chiếm ưu thế bị cô lập là

Aspergillusflavus và A parasiticus với tỳ lệ 31: 1, 40: 5, 16: 4 và I: 1 trong bụi lúa, bụi ngô, bụi thức ăn và bụi dừa tương ứng Aflatoxin được sàn xuất bởi các chùng được phân lập ờ trong ống nghiệm nền từ hạt lúa dao động từ

100 mg/kg’1 đen 100.5 mg/kg’ Khả năng gây hại bởi độc tố của các chủng dựa trên nồng độ aflatoxin trung bình được sán xuất bới các chùng theo thứ tự

là bụi dừa > bụi ngô > bụi lúa > bụi thức ăn Nồng độ trung bình tự nhiên cùa các độc to aflatoxin trong bụi lúa bụi ngô, bụi thức ăn, và bụi dừa là 25, 6, 15

và 10 mg/kg’1 tương ứng Ước tính số lượng aflatoxin hít vào bới người lao động trong một ca làm việc 8h dao động 0,06-114 mg, trung bình, cao hơn so với số lượng aflatoxin vào ruột của người Philippines do việc tiêu thụ gạo đánh bóng.l 151

Tại Georgia, nghi ngờ rằng các nhân viên làm việc tại cơ sở chế biến ngô

có khả năng phơi nhiễm với Aspergillus spp và độc to Aflatoxin trong không khí, năm 1984 và 1985 James Clayton và Silas thuộc đại học Georgia đã thực hiện một nghiên cứu Đó là là lấy mẫu không khí tại 2 cơ sở chế biến ngô lớn nhất bang phương pháp lấy mẫu chù động và thu được kết quả là: phát hiện được một lượng lớn Aspergillus Flavus và Aspergillus Parasiticus trong không khí, tuy nhiên chi 32 % trong tống số nấm thu được có khả năng sinh độc to aflatoxin [ 14]

Tại Ba Lan, sự phơi nhiễm với vi sinh vật trong không khí ở cơ sở chế biến và sàn xuất ngũ cốc được nghiên cứu thực hiện trên 10 cơ sờ chế biến và sản suất ngũ cốc dược tháo mộc Kết quả cho thấy tồng nồng độ vi sinh vật trong không khí là 0,18-861,4 X 103 CFU/m3 Nấm chiếm 2,5 - 76,9 % tổng

số vi sinh vật Trong sổ đó, Penicillium spp., Mucor spp., Alternaria spp.,

Aspergillus lúger và Aspergillus spp đã được tìm thay Nồng độ bụi dao động

0,18-86,9 mg / m\ Sự tập trung cùa nội độc tố là lớn và dao động 0,0041- 1562,6 ụg / m3.

1.2.2 Phuong pháp xác định nấm mốc sinh độc tố

Việc phát hiện aflatoxin trong nhiều loại nông sán cả trên đồng ruộng lẫn trong bảo quản đã thúc đẩy các nồ lực trên toàn thế giới nhằm phát triển các phương pháp phát hiện hợp chất này

1.2.2.1 Phuong pháp truyền thống

Đế phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc to Aflatoxin dựa vào đặc điếm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang đế lại trên môi trường đã được công bố từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước Phương pháp này có nhược điếm là tốn nhiều thời gian, công sức và độ nhạy không cao, thậm chí nhiều khi sự nham lẫn có the rất nguy hiếm Arseculeratne và cộng sự (1969) sử dụng môi trường CAM (Coconut agar media) - là môi trường rất tốt cho việc sàn xuất Aflatoxin cùa nấm A flavus Chủng nấm A flavus sau khi được cấy lên môi trường CAM, để ở nhiệt độ 28°c, khoảng 30 - 40 ngày, kết hợp cá xem xét màu sắc chúng nấm lên môi trường và dưới đèn uv đế phát hiện chùng nấm sinh độc tố Tuy nhiên, phương pháp này rất mất thời gian.Ị 10]

1.2.2.2 Phuong pháp vật lý hóa học

Hiện nay, các phòng thí nghiệm đang sử dụng các phương pháp sắc ký

đề phát hiện nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin như: sắc ký lớp mòng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC)

Ưu điếm của phương pháp này là có thế định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này lại

có nhược điếm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền.

* Phương pháp sắc ký lớp mòng (Thin layer chromatography-TLC)Phương pháp sắc ký lớp mông được sứ dụng rộng rãi để xác định, định lượng Aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960 (Coomes et al, 1964, 1965) Thủ tục phân tích sử dụng các bàn được tráng bởi Silica gel Dung môi

sử dụng cho dung dịch chạy ban mỏng là Chloroform: methanol và Chloroform: axeton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan Aflatoxin Hệ dung môi gồm: nước: axeton: chloroform (1,5: 12: 88) được đánh giá là có khã năng hòa tan Aflatoxin tốt nhất Các bản mòng đã được chày qua các dung môi chạy, được đưa vào chiếu bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm Các vết mẫu phân tích có màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây và có độ dài Rt được so sánh với các vết của Aflatoxin tiêu chuấn.Nhược điếm của phương pháp này là phụ thuộc vào người phân tích Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thế có sự sai lệch kết quà tới 20-30% [10]

* Phương pháp đo mật độ huỳnh quang trên máy fluorodensitometer.Fluorodensitometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường (Dons, 1968) Tuy nhiên, ờ nhiều phòng thí nghiệm hiện đại vần

sử dụng phương pháp nhìn đế so sánh trực tiếp các vết trên bán mỏng vì dễ hơn nhiều khi phải qua máy densitometer Khăng định sự có mặt cùa Aflatoxin của phương pháp này: một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dề nhầm lần với Aflatoxin, dẫn đến sự khắng định sai lệch Phương pháp khắng định sự có mặt của Aflatoxin trực tiếp thực hiện trên các bản sắc ký Dựa vào

sự biến đồi cúa Aflatoxin thành các đồng phân có mầu huỳnh quang khác so

với huỳnh quang ban đầu, cà Aílatoxin chuẩn và Aflatoxin có trong mầu phân tích đều chuyển sang có cùng một đồng phân.

Thử nghiệm khăng định sự có mặt của Aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và được hội phân tích hóa học Hoa Kỳ (A.O.A.C) công nhận Aflatoxin Bl được axit hóa

để trở thành đồng phân Aflatoxin B2 Đồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài cùa Rf của Aflatoxin Bl Theo phương pháp của Przybylski, Aflatoxin Bl được chuyển thành Aflatoxin B2a nhờ axit trifloaxetic (TFA) phun trực tiếp lên các bàn mỏng Axit sulfuric 50% cũng được sứ dụng đề phun trực tiếp lên các bàn mỏng trước khi chạy trong các dung môi chạy Axit sulfuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của Aflatoxin B1 thành màu vàng Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của Aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyên thành màu vàng [10]

*sắc ký lớp mỏng hiệu suât cao (High performance thin layer chromatography - HPTLC)

Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần

ở các khâu như chiết tách mầu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ờ 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bàn mòng một cách tự động; cải thiện sự đồng nhất cả lớp hấp thụ; chạy bản mỏng trong dung môi có kiếm soát Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục cùa phương pháp TLC như một phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu quá nhất

*Phương pháp sac ký lòng cao áp (High performance liquid chromatography - HPLC)

Hệ thống phân tích Aflatoxin tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng xác định định lượng Aflatoxin Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: pha bình thường và pha phàn Hệ thống này dựa trên sự hấp thu tia tím (UV) và xác định cường độ huỳnh quang Trong pha bình thường, pha tĩnh là rắn, phân cực hơn pha động Trong pha phán, pha bình thường là pha phán pha pha tĩnh là lỏng và ít phân cực hơn pha động Trong HPLC, pha phản được sứ dụng để tách Aflatoxin nhiều hơn pha bình thường.[10]

1.2.2.3 Phương pháp hóa sinh học (Immunochemical methods)

Phương pháp hoá sinh miễn dịch mang tính đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thế đặc hiệu Hai phương pháp hiện dùng là: Aflatoxin đánh dấu phóng xạ và Aflatoxin gắn men (Pestka, 1980, 1981) Do sự tiến bộ của kỹ thuật miễn dịch trong những năm qua, đã phát triền nhiều hệ thống EL1SA khác nhau để xác định Aflatoxin và kháng thể đơn và đa dòng

* Phương pháp ELISA (enzyme - linked immunoabsorbant assay)Phương pháp ELISA gồm ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp, ELISA trực tiếp sứ dụng Aflatoxin có gắn men, ELISA gián tiếp - Aflatoxin có gắn prôtêin và một kháng the thứ hai Cả hai phương pháp này đều sừ dụng men pcroxidaza và men photphataza kiềm đề gắn

- Phương pháp ELISA trực tiếp: dựa trên nguyên lý kháng thê đặc hiệu được phù trên các đĩa chuẩn độ (microtites) Dung dịch tách từ mẫu hay Aflatoxin mẫu được ủ cùng nhau hay tách thành hai bước, sau đó được rừa bằng dung dịch thích hợp Lượng men gắn vào đĩa được xác định bằng dung dịch đặc biệt Phăn ứng màu được đo bang quang phố hoặc so sánh trực tiếp bằng mắt thường với các đĩa chuẩn Phương pháp này chiếm nhiều thời gian

và sai sổ lớn trong cùng mầu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai

có trong mẫu tách

- Phương pháp ELISA gián tiếp: Aflatoxin gắn vào protein được phủ các đĩa chuẩn độ (microliter) Mầu tách hay Aflatoxin chuẩn được đưa vào đĩa tiếp theo là kháng thế thứ cap (anti Aflatoxin antibody) Lượng kháng the gắn vào đĩa được xác định do thêm kháng the IgG (anti rabit IgG) gắn với photphataza kiềm (ALP) và phàn ứng màu xảy ra với P-nitrophenyl photphat Lượng độc tố được xác định bang cách so sánh với đường độc chuẩn Standard Curve Phương pháp này trải qua nhiều bước và cần một kháng thề thứ cấp nên sai số cao và chiếm nhiều thời gian I 101

1.2.2.4 Phuong pháp PCR dùng chẩn đoán nấm sinh độc tố Aflatoxin.

Đề tiện lợi hoá việc phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin, gần đây phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR đang được nghiên cứu

áp dụng rộng rãi Ngoài tính tiện lợi và dễ sử dụng, phương pháp này còn có

ưu điếm là phát hiện nhanh, nhạy, chính xác nấm Aspergillus spp sinh độc tố

Aflatoxin Phương pháp chấn đoán sừ dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quà nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus ssp sinh độc to Aflatoxin và con đường sinh tổng hợp Aflatoxin Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia vào con đường sinh tống hợp Aflatoxin, trong đó có 4 gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1 và apa-2 đã được công bố trình tự nucleotide và chức năng gen Trình tự nucleotide cùa các gcn này là cơ sờ đế sinh tồng họp các cặp mồi đặc hiệu cho phán ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tống số tách chiết tír sợi nấm hoặc các mẫu xét nghiệm Chat đầu tiên tham gia vào con đường sinh tống hợp Aflatoxin có nguồn gốc từ một polyketide, ngưng tụ các chất acetate để tạo thành axit norsoloric, tiếp đó là sự biến đồi norsolorinic axit (NOR)—> averantin (AVN)—> averufanin —» averufin (AVF)

—» hydroxyversicolorone —> versiconal hemiacetal acetate —* versicolorin B

—» versicolorin A (VA)—» sterigmatocystin (ST) —> o - methylsterigmatocystin (OMST) —> Aflatoxin Bl Trong mat xích cuối của con đường sinh tống hợp enzym o - methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyến hoá (ST) —»(OMST) có liên quan tới sự sàn sinh Aflatoxin Gần đây, chì mới một vài enzym trong con đường sinh tống hợp này được phân lập Cụ thể, ba gen cấu trúc trong con đường sinh tổng hợp Aflatoxin cùa nấm A paraciticus có liên quan đến sự biến đổi của NOR và VA (nor-l và ver-1), enzym o - methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyến hoá (ST) —» (OMST) (omt -1) ; và một gen điều hoà của nam A flavus (afl-2) đã được nhân dòng Các gen này được chọn làm gen đích cho phàn ứng PCR Gen afl -

2 được biết đến như một như một enzym bảo tồn hoạt động của các enzym khác trong con đường sinh tống hợp Aflatoxin Trong một số nghiên cứu cũng đưa ra, gcn apa-2 của chúng nấm A parasiticus trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin, có mức độ tưmig đồng về ADN rất lớn với gen afl-2 của nấm A //ưvn.y.l 10|

1.3 Tinh hình nghiên cứu ỏ’ Việt Nam về nấm mốc sinh độc tố có trong không khí môi trường lao động

1.3.1 Tinh hình nghiên cứu những nấm mốc sinh độc tố có trong không khí môi trưòng lao động

Việt Nam hiện nay chưa có nhiều người quan tâm đến sự ánh hưởng của

vi sinh không khí, chưa nhìn thấy ảnh hường như thế nào đến môi trường cộng đồng

Năm 2003, kỹ thuật đặt đĩa thạch lấy mầu không khí đánh giá chất lượng không khí về mặt sinh học trong phòng thí nghiệm vi sinh đã được Từ

Hài Bằng ứng dụng Kết quả so sánh hai mùa đông và mùa hè, chi tiêu đánh giá trung bình mật độ trong không khí là 2,6.10’ CFU/m’ không khí cao hơn mùa hè rất nhiều là 5.13.1O2 CFU/m3 không khí, tổng số nấm cũng tương tự như vậy lần lượt là 5,2.102CFU/m' vào mùa nóng và mùa lạnh là 4,62.102 CFU/m3.[9]

Năm 2009, Nguyễn Quốc Tuấn đã nghiên cứu đánh giá chất lượng các phòng mô cùa 13 bệnh viện quanh thành phố Hồ Chí Minh, kết quà cho thấy

tỷ lệ phòng mổ, phòng hồi sức đạt mức c theo tiêu chuẩn EU GMP 1997 và WHO 2002 là 6,1%; đạt mức D là 21,2%, tý lệ đạt theo tiêu chuẩn K16 phòng phẫu thuật của Merck 2009 (10 4- 200 CFƯ/m3) là 21,2% số lượng vi sinh trong không khí cùa 13 bệnh viện tại Thành phố Hồ Chí Minh phần lớn tập trung trong khoáng từ 2.102 4- 5.102 CFU/m3 chiếm 70% (23/33 phòng).[9] [11]

Năm 2010, Trịnh Quỳnh Mai đã nghiên cứu so sánh hai phương pháp lấy mẫu bằng thiết bị và lấy mẫu đạt đĩa thạch kết quã dùng thiết bị lấy mẫu

có độ đồng đều hơn so với phương pháp đặt đĩa thạch Nãm 2011 có nhiều nghiên cứu khảo sát mức độ nhiễm nấm môi trường không khí phòng không máy lạnh, các dược liệu đang bán tại thành phố Hồ Chí Minh, mức ô nhiễm đều vượt qua mức giới hạn cho phép tiêu chuẩn WHO.[9]

Kháo sát mức độ nhiễm nấm mốc các phòng làm việc cho thấy mức độ nhiễm nấm cùa 10 phòng không máy lạnh là 1397 - 1777 CFU/m3 không khí

Cả 10 phòng kháo sát đều nhiễm vi nấm thuộc chi Penicillium, Aspergillus,

Cladosporium và nấm sợi màu với tỉ lệ cao hơn các nấm khác và với mức độ nhiễm từng loại nấm lớn hơn 50 CFU/m’ không khí Đa số nấm mốc được phát hiện đều là nam có thề gây bệnh cho người.[13]

1.3.2 Phuong pháp xác định nấm mốc sinh độc tố

Các nhà nghiên cứu của Công ty Innotech, thuộc Vườn ươm doanh nghiệp công nghệ cao, Khu Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh đã chế tạo thành công bộ kít phát hiện độc tố nấm mốc, dư lượng thuốc trừ sâu và chất kích thích tăng trưởng trong thực phâm, nông sản Sản phâm mới này cho phép người sử dụng có được két quà chính xác cao, nhanh, rè tiền và dỗ sử dụng.Việt Nam là nước có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, các loại thực phấm, nông sàn rất dễ bị các loài vi sinh vật và nấm mốc xâm nhập Chúng được hình thành và phát triền từ bào tử nấm các nông sàn, ngũ cốc khi gặp điều kiện thuận lợi Khoáng 30%-40% số loài nấm mốc này có thề sản sinh ra độc

tố, gọi chung là độc to nam (mycotoxin) Độc tố nấm mycotoxin được xem là mối nguy hại tiềm ẩn cho người và vật nuôi Tác hại chú yếu là gây tốn thương tế bào gan, thận, bào mòn niêm mạc của ống tiêu hóa, ức chế hoạt động của các men tiêu hóa , thậm chí ờ mức độ nặng có thể gây tử vong.Hiện nay ớ Việt Nam đế phát hiện độc tố nấm, chú yếu chì sử dụng các phương pháp truyền thống là soi màu bằng tia uv, định tính bàng mắt hoặc phóng đoán Việc tiến hành xét nghiệm vi sinh vật, nấm mốc trong nông sản, thực phấm hầu hết cũng chỉ dựa trên phương pháp truyền thống: nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn dịch Các quy trình này rất phức tạp, cần có kỹ thuật viên kinh nghiệm về vi sinh vật và đặc biệt thời gian chờ kết quả phân tích lâu, từ 7-10 ngày, chi phí cao đến vài trăm nghìn đồng Chính vì vậy các nhà nghiên cứu của Công ty Innotech, thuộc Vườn ươm doanh nghiệp công nghệ cao, Khu Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh đã chế tạo thành công

bộ kít phát hiện độc tố nấm mốc, dư lượng thuốc trừ sâu và chất kích thích tàng trưởng trong thực phẩm, nông sán Đây là sản phâm đầu tiên của Việt Nam về lĩnh vực này, sàn phấm mới này cho phép người sử dụng có được kết

quả chính xác cao, nhanh, rè liền, dễ sừ dụng và khắc phục được những hạn chế của phương pháp truyền thống.

Sản phấm sử dụng phương pháp phân tích ELISA dựa trên phán ứng trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể cấu tạo của bộ kít khá đơn giản, gồm một bản nhựa có 96 lồ (giếng nhựa ELISA) đã có chất nhận biết và các lọ dung dịch đi kèm Khi sử dụng, chi việc bó mẫu thứ đã nghiền nhó vào các giếng nhựa, thực hiện các thao tác như hướng dẫn Sau từ 1,5 đến 2 giờ phàn ứng hoàn tất sẽ xuất hiện mầu sắc trên các giếng thừ đã cho mẫu Dựa vào sự biến đổi mầu của dung dịch trong giếng sẽ biết được hàm lượng nhiễm Nếu mầu xanh càng nhạt, chứng tò độc tố càng nhiều, mầu xanh càng đậm, độc tố càng ít Đe xác định được hàm lượng cùa từng loại độc tố qua mẫu nhiễm, phải đưa tiếp vào máy đọc ELISA, chừng một phút sau sẽ có được kết quá cụ thề Dựa vào mầu sắc này ta có thể nhận biết được lượng độc tố nhiều hay ít.Sản phấm có ưu điểm: phân tích nhanh, có độ nhạy và độ chọn lọc cao,

dễ thực hiện, đặc biệt giá thành rất rẻ Đối tượng mà Innotech hướng đến là các chi cục, trung tâm thú y tinh thành; phòng thí nghiệm, phân tích; các chợ đầu mối; ban quàn lý các chợ; các công ly sàn xuất thức ăn gia súc, che biến thực phàm [6]

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cưu

2.1 Đối tượng, phưong pháp lấy mẫu nấm mốc trong không khí 2.1.1 Đối tưọng nghiên cứu

Nấm mốc trong không khí môi trường lao động tại chi nhánh công ty cổ phần Việt Pháp sàn xuất thức ăn gia súc Proconco Hãi Phòng (Khu công nghiệp Đình Vũ, thuộc Khu kinh tế Đình Vũ, Phường Đông Hải 2, Quận Hải An, Hâi Phòng)

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

d Môi trường ADM

Thành phần:

Peptone

Yeast extract

10,00 g/120,00 g/1Ferric ammonium citrate 0,50 g/1

Máy lấy mẫu không khí Spin Air

Tủ cay mẫu an toàn sinh học

Tủ nuôi cấy

Nồi khử trùng bẩn

Nồi khử trùng sạch

2.1.3 Phuong pháp lấy mẫu

2.1.3.1 Phuong pháp lấy mẫu chủ động

Phương pháp chù động sử dụng thiết bị hút chân không đặt đĩa thạch lấy mẫu trực tiếp lên bề mặt đĩa thạch Kết quả được định lượng trên một mét khối không khí Tác động lực hút cùa bơm chân không sẽ thu được cà các hạt bụi, các hạt sinh học lơ lừng trong không khí.[9; 11 ]

a) Thiết bị lấy mẫu

Thiết bị lấy mầu vi sinh trong không khí: Spin-Air (EUL) có thông số kỹ thuật: Thể tích khí 10 - 9900 lít không khí, tốc độ dòng 100 lít/phút được điều khiển bới bộ vi xử lý ổn định vận tốc lấy mẫu, tốc độ quay 0, 1,2, 3, 4 RPM Mã hiệu chuẩn số: V05 CN: 2603.16 do Viện đo lường Việt Nam cấp ngày 27/9/2016

b) Lấy mẫu tại hiện trưòng

Sử dụng thiết bị lấy mẫu chủ động, lay mẫu tại 3 vị trí khác nhau, mồi vị trí lấy 4 thể tích khí khác nhau là 50 lít, lOOlít, 150 lít và 200 lít với tốc độ hút không khí là 100 lít/phút, tại mồi địa điểm, mồi thế tích mẫu được lấy lặp lại 2 lần để kết quả chính xác nhất

c) Bảo quản và vận chuyến

Mầu được đặt trong hộp sạch với nhiệt độ thấp rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm đề không làm sai số do bão quàn và vận chuyến mẫu

d) Công thức xác định.- tống vi sinh vật trong 1 m3 không khí của phương

pháp chù động [9]

Asciooo

x=v&

Trong đó:

X: Tổng số vi sinh vật trong lm' không khí (CFU/m3)

A: Tổng so vi sinh vật đếm được trong đĩa thạch

1000: 1 m3 không khí được quy đổi tương đương với 1.000 lít không khí.V: thê tích lấy mầu

2.1.3.2 Phương pháp thụ động

Phương pháp này được đề xuất bởi Fisher trong những nãm 1970 , các đĩa petri có chứa môi trường nuôi cấy được đặt ờ ngoài không khí trong một thời gian nhất định Các vi sinh vật được mang vào môi trường nuôi cấy nhờ các phần tử trơ rơi vào bề mặt của đĩa Sau khi ủ ở 28+rc thì chúng mọc thành khuẩn lạc tỳ lệ với sự nhiễm bẩn vi sinh vật trong không khí

Phương pháp này sẽ không phát hiện các hạt nhỏ hơn hoặc các hạt nhẹ

và lư lừng trong không khí, vì vậy kết quả không mang tính định lượng Các thao tác thực hiện cũng dễ bị ảnh hưởng và bị ô nhiễm từ các nguồn trong không khí, môi trường nuôi cấy trong đĩa cũng có the bị biến tính nếu chúng

bị để quá lâu