Nhằm xây dựng căn cứ khoa học trong việc sử dụng sản phẩm này trên lâm sàng, giúp bác sĩ và bệnh nhân có thêm lựa chọn trong điều trị gút, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Nghiên cứu tá
TỔNG QUAN
Tổng quan về bệnh gút
Gút là bệnh rối loạn chuyển hóa purin và dẫn đến sự lắng đọng các tinh thể urat do tăng acid uric kéo dài [2] Các rối loạn xảy ra riêng lẻ hay kết hợp bao gồm: Tăng acid uric máu; Cơn viêm khớp, đau khớp điển hình, cấp tính; Lắng đọng đơn tinh thể natri urat trong các tổ chức: bên trong hoặc xung quanh các khớp, sụn xương, gân, tổ chức dưới da, khoảng kẽ hoặc nhu mô thận; Sỏi tiết niệu [6] Đặc trưng của bệnh là những đợt viêm cấp, tái phát gây đau dữ dội, lâu dài bệnh trở thành mạn tính [3]
1.1.2 Cơ chế bệnh sinh bệnh gút
1.1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp acid uric
Acid uric là sản phẩm của quá trình thoái giáng các nucleo-protein có chứa nhân purin (adenin, guanin) trong cơ thể với sự tham gia của các enzym: phosphoribosyl, pyrophosphatase (PRPP), nucleosid phosphorylase, xanthin oxidase (XO) [38]
Quá trình sinh tổng hợp acid uric trong cơ thể được trình bày tóm tắt ở sơ đồ hình 1.1 [50]
Hình 1.1 Quá trình tổng hợp acid uric trong cơ thể
1.1.2.2 Cơ chế bệnh sinh bệnh gút
Khi hàm lượng purin trong cơ thể tăng, dẫn đến quá trình chuyển hóa purin thành acid uric tăng Khi cơ thể tạo ra quá nhiều acid uric hoặc giảm thải trừ acid uric, nồng độ acid uric máu lại tăng lên Khi nồng độ acid uric máu tăng cao vượt quá nồng độ bão hoà dẫn (khoảng 6,8mg/dL) đến tích luỹ vô triệu chứng tinh thể urat trong các mô không có mạch máu, tạo thành các microtophus (vi hạt tophi) [6] Sự lắng đọng các hạt này ở các vị trí khác nhau gây nên các tổn thương khác nhau Khi microtophus ở sụn khớp bị vỡ ra, tinh thể urat tiếp xúc với mạch máu màng hoạt dịch làm khởi động quá trình viêm gây cơn gút cấp Sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt dịch, mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gout [50] Tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận dẫn đến viêm thận kẽ; acid uric niệu tăng và sự toan hoá nước tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu [6]
Có nhiều nguyên nhân gây bệnh gút nhưng chủ yếu là do tăng acid uric máu Nồng độ acid uric mỏu của người Việt Nam khoảng 4,5 - 1,0 mg/L (208 - 327 àmol/L)
[6] Khi nồng độ trờn 7,0 mg/L (420 àmol/L) thỡ được coi là tăng acid uric mỏu [50] Tăng acid uric máu chưa hẳn đã bị gút vì bệnh gút chỉ chiếm dưới 25% tổng số bệnh nhân có tăng acid uric máu nhưng trên thực tế nếu mắc bênh gút chắc chắn có tăng acid uric máu [6], [60]
Tăng acid uric máu có thể do nhiều nguyên nhân: tăng tổng hợp, giảm tiết hoặc đồng thời cả hai
1.1.3.1 Tăng tổng hợp acid uric máu
Tăng tổng hợp acid uric có thể đến từ 3 yếu tố chính: ngoại sinh, nội sinh và tăng thoái hóa các nucleo – protein tế bào
- Nguyên nhân ngoại sinh đến từ việc ăn nhiều thức ăn chứa purin như nội tạng, hải sản, thịt bò [1], [2]
- Nguyên nhân nội sinh có thể do rối loạn các enzym tổng hợp acid uric như sự thiếu hụt HGPR transferase, enzym có vai trò bắt giữ các base purin, làm chậm sự tạo vòng mới nên làm chậm quá trình chuyển các gianin và hypoxanthin thành acid uric Vì vậy, thiếu hụt enzym này gây hội chứng Lesch – Nyhan Hay sự tăng hoạt động của PRPP synthetase là enzym đầu tiên trong con đường tạo vòng mới Vì vậy, khi tăng hoạt động của enzym này gây tăng sản xuất quá mức purin dẫn đến tăng acid uric máu và bị sỏi urat [11]
- Tăng thoái hóa nucleo – protein tế bào: trong trường hợp tế bào thay nhanh, tăng sinh, hoặc chết như bệnh bạch cầu, tan huyết, liệu pháp độc tế bào điều trị bệnh ác tính, hoặc do thoái hóa quá mức ATP của cơ vận động [6]
1.1.3.2 Giảm bài tiết acid uric
Sự giảm bài tiết acid uric có thể đến từ các bệnh đang gặp phải như các bệnh thận nội sinh: suy thận, viêm cầu thận…Bên cạnh đó, việc sử dụng các thuốc lợi tiểu (thiazid, probrnecid,…), tăng acid lacti máu (nhiễm toan acid lactic), tăng ceton máu (nhiễm toan ceton do đái tháo đường), đái tháo nhạt cũng sẽ làm suy giảm chức năng vận chuyển ở ống thận từ đó cũng làm giảm tốc độ lọc của cầu thận và giảm bài tiết urat ở ống lượn gần, tăng tái hấp thu ở ống lượn xa Ngoài ra, giảm phân hủy acid uric do vi khuẩn trong phân cũng là một trong nhưng nguyên nhân hiếm gặp [21], [26]
Sự thiếu hiếu hụt glucose–6-phosphatase, fructose-1-phosphat aldolase là một trong những lý do gây tặng acid uric từ lúc còn nhỏ và gây khởi phát gút sớm Bên cạnh đó, tăng acid uric máu còn có thể do gen di truyền và các nguyên nhân phối hợp như: vận động quá mức, sốc, uống nhiều rượu có độ cồn cao [21]
Nguyên nhân của gút nguyên phát còn chưa rõ Loại này thường có tính chất gia đình, khởi phát do ăn thức ăn có chứa nhiều nhân purin và uống quá nhiều rượu (30% tăng tạo acid uric, 70% giảm bài tiết acid uric) Đa số các trường hợp là gút nguyên phát, do đó, thông thường khi nói đến gút, tức là nói đến gút nguyên phát [1], [6]
Nguyên nhân chính của gút thứ phát có thể do suy thận mạn hay các thuốc đang sử dụng Tính đến năm 2020, các con số thống kê đã chỉ ra có khoảng 20 thuốc có thể gây gút thứ phát và 70 thuốc khác cũng bị nghi gây nên gút [6] Các thuốc gây gút thứ phát thường gặp như: corticoid (Prednisolon, dexamethason, K-cort), thuốc lợi tiểu, thuốc chống lao, thuốc điều trị ung thư Ngoài ra, một số bệnh như lơ xe mi thể tủy mạn tính, thiếu máu huyết tán, bệnh vẩy nến diện rộng, đều có thể dẫn đến tiêu tế bào quá mức gây tăng acid uric [2], [6]
1.1.4.3 Gút do bất thường về enzym Đây là loại bệnh rất hiếm gặp Bệnh xảy ra do di truyền do thiếu hụt hoàn toàn hoặc một phần enzym HGRT (ở gan), hoặc tăng hoạt tính của enzym PRPP [6]
1.1.5 Triệu chứng lâm sàng của bệnh gút
Triệu chứng lâm sàng thường gặp các khớp ở chi dưới như ngón chân cái, gối bàn ngón và các khớp khác Các khớp thường đều có đặc điểm như dưới đây:
- Hoàn cảnh xuất hiện: Cơn xuất hiện tự phát hoặc sau một bữa ăn nhiều chất đạm hặc uống rượu quá mức; một chấn thương; một can thiệp phẫu thuật, một đợt dùng thuốc: aspirin, lợi tiểu (thiazid, furosemmid, thuốc gây hủy tế bào, penicilline…) [1], [3]
- Thời điểm khởi phát: Cơn khởi phát đột ngột vào nửa đêm [2]
- Tính chất: Khớp đau ghê gớm, bỏng rát, thường xuyên đau đến cực độ, đau làm mất ngủ, mất ngủ càng tăng thêm do tăng cảm giác đau của da Đau chủ yếu về đêm, ban ngày có giảm đau Thường kèm theo cảm giác mệt mỏi, đôi khi sốt 38- 38,5 độ C, có thể kèm rét run Đau tăng về đêm trong 5-6 ngày đêm tiếp đó Ban ngày đau giảm dần, có thể hết đau hoàn toàn vào ban ngày [6]
Loại này khá thường gặp, do vị trí tổn thương và đặc điểm của thể này mà vấn đề chẩn đoán phân biệt được đặt ra [6], [26]
- Biểu hiện tại chỗ chiếm ưu thế: dễ nhầm với viêm khớp nhiễm khuẩn
- Biểu hiện tràn dịch chiếm ưu thế: thường ở khớp gối, diễn biến bán cấp, dễ nhầm với lao khớp
- Biểu hiện toàn thân là chính: cơ thể suy nhược, trong khi hiện tượng viêm tại chỗ không đáng kể
- Biểu hiện bằng viêm nhiều khớp cấp tính: biểu hiện cạnh khớp có thể đơn độc hoặc kèm theo cơn gút cấp có triệu chứng khớp điển hình Biểu hiện chính là viêm gân do gút, nhất là viêm gân Achille, viêm túi thanh mạc khuỷu tay, hoặc hiếm hơn, có thể gặp viêm tĩnh mạch
Tổng quan về chế phẩm nghiên cứu
Nguồn tài nguyên cây thuốc ở nước ta vô cùng đa dạng và phong phú, chính bởi thế nên cũng tạo ra không ít các bài thuốc có khả năng điều trị bệnh Y học cổ truyền ít khi sử dụng đơn độc một vị thuốc mà thường phối hợp các vị thuốc với nhau Căn cứ để xây dựng các bài thuốc này thường dựa trên kinh nghiệm dân gian cũng như các nghiên cứu, công bố hiện đại liên quan đến tác dụng điều trị bệnh
Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tác dụng chữa bệnh gút của viên nang chứa thổ phục linh, hy thiêm và một số dược liệu khác dựa trên các bài thuốc kinh nghiệm theo y học cổ truyền như độc hoạt tang ký sinh, khu phong thanh nhiệt trừ thấp nhang và một số nghiên cứu hiện đại của Vĩ Quang Nghiệp (2010), Jiang và cộng sự (năm 1997) … liên quan đến tác dụng điều trị gút/ thống phong Các dược liệu chính trong thành phần của viên nang chứa Thổ Phục Linh, Hy Thiêm và một số dược liêu khác được tóm tắt thông tin dưới đây
➢ Tên khoa học: Smilax glabra Roxb (Smilax hookeri Kunth), họ Hành (Liliaceae)
➢ Bộ phận dùng: thân rễ đã phơi hay sấy khô [8], [23]
➢ Các tác dụng theo y học cổ truyền
Thổ phục linh thuộc nhóm khử phong thấp, cường gân cốt có vị ngọt, nhạt, tính bình, quy kinh can và vị, có tác dụng khử phong thấp, lợi gân cốt [45] Trong dân gian, loài cây này được dùng để tẩy độc cơ thể, bổ dạ dày, giảm đau xương khớp và làm cho ra mồ hôi [15], [31] Thổ phục linh cũng được phối hợp trong nhiều bài thuốc trị phong thấp như:
• Độc hoạt tang ký sinh gia giảm [1],[17] Độc hoạt 8g Tần giao 12g Quế tâm 4g
Phòng phong 8g Phục linh 12g Đảng sâm 8g
Ngưu tất 8g Đương quy 12g Sinh địa 8g
Bạch thược 12g Tang ký sinh 20g Cam thảo 6g Đỗ trọng 12g Tế tân 4g Xuyên khung 8g
- Công dụng: Trừ phong thấp, chữa đau khớp, bổ can thận, bổ khí huyết
- Cách dùng: Sắc 1 thang, uống 3 lần trong ngày
• Phòng kỷ hoàng kỳ thang gia vị [17]
Hoàng kỳ 24g Ý dĩ 24g Thổ phục linh 24g
Phòng kỷ 12g Cam thảo 6g Tàm sa 12g
Bạch truật 12g Tỳ giải 24g Xích thược 12g
- Công dụng: chữa phong thấp, các khớp nặng nề đau nhức, cử động không linh hoạt tay chân tê bì, nổi u cục
- Cách dùng: Sắc với nước uống hằng ngày
➢ Các tác dụng theo y học hiện đại
• Một số thành phần trong Thổ phục linh đã được chứng minh tác dụng trên thực nghiệm:
Theo y học hiện đại, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Có khoảng 200 hợp chất hóa học đã được phân lập từ S glabra Roxb Các thành phần chính đã được xác định là flavonoid, flavonoid glycosid, axit phenolic và steroid Các chất này đã được chứng minh là có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột bằng cách ức chế các hoạt động của enzym xanthin oxidase đồng thời làm giảm phản ứng viêm thông qua ức chế các chất trung gian gây viêm [40], [41]
• Một số bài thuốc chứa Thổ phục linh cũng đã được chứng minh tác dụng trên thực nghiệm:
Năm 1997, Jiang và cộng sự nghiên cứu tác dụng của dịch chiết nước thổ phục linh, kết quả cho thấy sự ức chế đáng kể phù nề trên chân viêm thứ cấp của chuột trong mô hình gây phù bằng carrageenan [45] Cùng với đó, Lu và cộng sự (2015) cũng đã chứng minh tác dụng chống viêm của dịch chiết phenolic của thổ phục linh, trong đó chỉ ra vai trò lớn của các hoạt chất flavonoid [49]
Chế phẩm cao nước Thấp khớp II là một bài thuốc nghiệm phương do lương y Tống Trần Luân xây dựng Thành phần bài thuốc gồm các vị thổ phục linh, hy thiêm và một số dược liệu khác như: cây xấu hổ, kê huyết đằng, dây gắm, thiên niên kiện, tục đoạn Năm 1981, Tống Trần Luân và cộng sự đã tiến hành đánh giá bước đầu tác dụng của bài thuốc trên 64 bệnh nhân viêm khớp tại Bệnh viện Y học Cổ truyền Trung ương Kết quả cho thấy bài thuốc có hiệu quả chống viêm [24]
Hoàng Bảo Châu và cộng sự (năm 1987) nghiên cứu tác dụng của bài Độc hoạt
II (thành phần gồm có gia hy thiêm, thổ phục linh, ngoài ra còn có phòng phong, tế tân, tần giao, tang ký sinh, bạch linh, hà thủ ô, kê huyết đằng, cốt toái, can khương và kim ngân) Kết quả nghiên cứu cho thấy, bài thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau trên bệnh nhân viêm khớp với tỷ lệ khá tốt là 75% Bài thuốc có tác dụng tốt trên thể phong hàn thấp tý [7]
Nguyễn Văn Tâm, Trần Ngọc Ân (năm 2002) đánh giá tác dụng điều trị viêm khớp dạng thấp của viên nang “Phong tê thấp” (có thành phần gồm thổ phục linh, hy thiêm, thiên niên kiện, huyết giác, ké đầu ngựa, hà thủ ô và phòng kỷ) trên người do xí nghiệp dược phẩm trung ương III sản xuất Kết quả cho thấy, viên nang “phong tê thấp” có tác dụng giảm đau, chống viêm, tỷ lệ đạt loại tốt và khá là 73,3% [29]
Bên cạnh các nghiên cứu chứng minh về tác dụng, Thổ phụ linh đã được thử nghiệm tính an toàn tiền lâm sàng [5] Nghiên cứu này cho thấy LD50 đường tiêm màng bụng của cao khô EtOH là 2,5g/kg chuột nhắt Thử nghiệm độc tính bán trường diễn cho thấy, cao khô liều 1,25g/kg và 2,5g/kg thỏ trong 30 ngày không thể hiện các biểu hiện của độc tính
➢ Tên khoa học: Siegesbeckia orientalis L (S glutinosa Wall.,
Minyranthes heterophylla Turez.), họ Cúc (Asteraceae) [8], [23]
➢ Bộ phận dùng: toàn cây [8], [23]
➢ Các tác dụng theo y học cổ truyền
Theo y học cổ truyền, Hy thiêm thuộc nhóm khử phong thấp, thanh nhiệt có vị đắng, tính hàn, hơi có độc, quy kinh can và thận Tác dụng nổi bật của nó là khử phong thấp, lợi gân cốt, giảm đau, giảm độc [30] Chính vì vậy, hy thiêm được phối hợp trong nhiều các bài thuốc trị phong thấp như:
• Khu phong tán hàn trừ thấp thang [30]
Hy thiêm 12g Rễ cỏ xước (sao) 12g Bạch giải 12g
Rễ lá lốt 12g Bồ công anh 16g Đơn tướng quân 12g
Kim ngân 16g Ích mẫu 12g Gừng tươi 10g
Ké đầu ngựa 12g Cốt khí muồng 12g
- Công dụng: trị thấp khớp mạn
- Cách dùng: 1 thang sắc với 800 ml nước, được 200 ml nước thuốc uống 2 lần trong ngày
• Khu phong thanh nhiệt trừ thấp thang [30]
Hy thiêm 12g Bồ công anh 16g Bạch giải 12g
Kim ngân 16g Cây dây 20g Đơn tướng quân 12g
Rễ cỏ xước (sao) 12g Ích mẫu 12g Cà gai leo 20g
Ké đầu ngựa 12g Cốt khí muồng 12g
- Công dụng: Điều trị đợt cấp của viêm đa khớp, khớp xương sưng, nóng, đỏ, đau đột ngột
- Cách dùng: Một thang sắc với 800 ml nước, được 200 ml nước uống 2 lần trong ngày
➢ Các tác dụng theo y học hiện đại
• Một số vị thuốc và bài thuốc chứa Hy Thiêm cũng đã được chứng minh tác dụng trên thực nghiệm:
Theo y học hiện đại, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hy thiêm có những đặc tính phù hợp để điều trị gút Tiêu biểu phải kể đến nghiên cứu của Nguyễn Thùy Dương và cộng sự đã chứng minh hy thiêm với liều 600 mg/kg, uống liên tục trong 5 ngày có tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình hạ acid uric cấp và ức chế hoạt độ enzym xanthin oxidase ở gan chuột cống trắng có ý nghĩa thống kê [10], [12] Ngoài ra, có bằng chứng đã chỉ ra rằng, chiết xuất ethanol của hy thiêm có thể làm giảm viêm bằng cách ức chế các chất trung gian gây viêm thông qua việc ức chế các con đường phụ thuộc KAPKs và NF – B [37]
Vĩ Quang Nghiệp (2010) ở Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu tác dụng của bài thuốc Ô đầu thang gia giảm có chứa thành phần hy thiêm trên 70 bệnh nhân được chẩn đoán viêm khớp Sau 1 tháng điều trị có 7 BN đạt kết quả tốt, 15 khá, 20 trung bình, 8 kém, điều trị có hiệu quả chiếm 84% [25] Đỗ Thị Phương và Phó Đức Thuần (năm 1986) đánh giá tác dụng của viên Hy đan (có thành phần gồm hy thiêm, ngũ gia bì và mã tiền chế) do Xí nghiệp Dược phẩm Thanh Hóa sản xuất Nghiên cứu được thực hiện trên 60 bệnh nhân viêm khớp Tỷ lệ đạt kết quả tốt là 80% và thuốc tác dụng tốt trên bệnh nhân viêm khớp giai đoạn I và II, thể phong thấp nhiệt tý [28]
1.2.3 Một số dược liệu khác
Tên khoa học: Lactuca indica L, họ Cúc (Asteraceae) [8], [23]
Bộ phận dùng: toàn cây [8], [23]
Tác dụng theo y học cổ truyền : Theo y học cổ truyền, bồ công anh có vị ngọt, hơi đắng, tính hàn, quy vào hai kinh can, vị Loài này được chứng minh là có tác dụng giải độc, tiêu viêm, thanh nhiệt, tán kết, lợi tiểu tiện, từ lâu được sử dụng trong dân gian để phối hợp với các vị thuốc khác tạo nên bài thuốc chữa ăn uống kém tiêu, đau dạ dày, mụn nhọt áp xe, tiêu chỗ sưng đau, khỏe mạnh gân cốt mà không phát hiện độc tính [8],
Tác dụng theo y học hiện đại: Theo y học hiện đại, các nghiên cứu cũng đã chỉ ra thành phần flavon, luteolin chiết xuất từ lá bồ công anh có tác dụng chống oxi hóa đồng thời ức chế biểu hiện COX-2 trong viêm nên làm giảm phản ứng viêm [39], [44]
Vỏ của hạt đậu xanh (còn gọi là lục đậu bì, lục đậu y, lục đậu xác) thu được bằng cách xay đậu, gạn lấy vỏ phơi hoặc sấy khô
Thành phần: Định tính nhóm chất hữu cơ trong vỏ đậu xanh cho thấy, vỏ đậu xanh chứa flavonoid, tannin, acid hữu cơ, đường khử, tinh bột, trong đó thành phần chính là flavonoid [20] Nhóm nghiên cứu của Trần Lưu Vân Hiền chỉ ra flavonoid trong vỏ đậu xanh có chứa đến 90,5% là vitexin và 9,5% là isovitexin [19]
Tác dụng theo y học cổ truyền : Vỏ đậu xanh có vị ngọt, tính mát, không độc, có tác dụng thanh nhiệt giải độc tốt [18]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1.1 Thông tin về chế phẩm
Chế phẩm viên nang chứa thổ phục linh, hy thiêm và một số dược liệu khác do Công ty cổ phần Khoa học kỹ thuật bách khoa sản xuất với số công bố 7/2017/0106400103-CBPH (Phụ lục 1)
Chế phẩm nghiên cứu được dùng với tên mã hóa là NC
Thành phần: Mỗi viên NC có chứa 500mg cao khô tương ứng với các cao dược liệu sau:
• Ngoài ra còn có một số dược liệu khác gồm: Bồ công anh, nhọ nồi, vỏ đậu xanh (với hàm lượng trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm tại Phụ lục 2)
Dạng bào chế: viên nang cứng, khối lượng trung bình viên 500 mg/viên
Quy cách đóng gói: hộp 60 viên
2.1.1.2 Mức liều thử chế phẩm
Liều mẫu thử NC được xây dựng dựa trên liều của các dược liệu thổ phục linh, hy thiêm đã được công bố có tác dụng trên thực nghiệm và liều của viên nang cứng chứa thổ phục linh, hy thiêm đã được nhóm nghiên cứu thực hiện trước đó [13]
Các mức liều thử trong nghiên cứu này cụ thể như sau:
• Liều trên chuột nhắt trắng:
- Liều thử 1: chuột nhắt trắng được uống chế phẩm NC với liều 600 mg/kg
- Liều thử 2: chuột nhắt trắng được uống chế phẩm NC với liều 1200 mg/kg
• Liều trên chuột cống trắng:
- Liều thử 1: chuột cống trắng được uống chế phẩm NC với liều 330 mg/kg (tương đương liều 600 mg/kg trên chuột nhắt, sử dụng phương pháp ngoại suy liều giữa các loài động vật thí nghiệm)
- Liều thử 2: chuột cống trắng được uống chế phẩm NC với liều 660 mg/kg (tương đương liều 1200 mg/kg trên chuột nhắt, sử dụng phương pháp ngoại suy liều giữa các loài động vật thí nghiệm)
Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống (đực và cái), cân nặng 150 - 200 g, khỏe mạnh, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu tại phòng nuôi động vật thí nghiệm của bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội và sử dụng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do
• Allopurinol (Zyloric, Aspen Pharma), LOT: A880942, HSD: 06/2023
• Bộ hóa chất định lượng acid uric (BioSystem) gồm hóa chất phản ứng, LOT: 223XA, HSD: 31/3/2022 và acid uric chuẩn, LOT: 081XB, HSD: 31/3/2022
• Diclofenac (Voltaren, Novartis), LOT: KDY28, HSD: 31/10/2023
• Hóa chất pha đệm Na2HPO4.2H2O, KH2PO4, HCl, NaOH (Sigma Aldrich)
• Các hóa chất và thuốc thử khác đạt chuẩn nghiên cứu
- Cân phân tích (AND-GR200, Nhật)
- Cân kỹ thuật (Precisa-BJ610C, TE 412, Sartorius)
- Đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning, Mỹ)
- Hệ thống máy ELISA bao gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kỳ) và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kỳ)
- Máy ly tâm EBA 20 (Hettich Zentrifugen, Đức)
- Máy ly tâm lạnh (Centrifuge 5702R, Mỹ)
- Máy nghiền dịch đồng thể (Wisestir HS-30E, Mỹ)
- Máy sinh hóa TC - 3300 Plus (Teco Diagnostics USA)
- Thiết bị đo độ phù chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instruments)
- Tủ ấm điều nhiệt (Memmert)
- Máy móc và các dụng cụ khác thuộc phòng thí nghiệm bộ môn Dược lực Trường Đại học Dược Hà Nội
2.1.5 Nội dung nghiên cứu Để giải quyết 3 mục tiêu đã đề ra, nghiên cứu gồm 3 nội dung:
Nội dung 1: Đánh giá tác dụng hạ acid uric của NC trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxonat
- Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nghiên cứu đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxonat
- Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nghiên cứu đến hoạt độ của enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của NC trên mô hình thực nghiệm:
- Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của NC trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan
- Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của NC trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat
Nội dung 3: Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của NC
Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu
NC Đánh giá tác dụng hạ acid uric
Mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat
Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan Đánh giá tác dụng chống viêm cấp Đánh giá độc tính tiền lâm sàng Độc tính cấp Độc tính bán trường diễn
Mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxalat
Mô hình đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme XO
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric của chế phẩm NC
2.2.1.1 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nghiên cứu đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxonat Áp dụng mô hình gây tăng acid uric cấp bằng cách tiêm màng bụng kalioxonat
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 9 con
- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%
- Lô 2 (lô chứng dương): uống allopurinol liều 10 mg/kg cân nặng chuột
- Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 600 mg/kg cân nặng chuột
- Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 1200 mg/kg cân nặng chuột
Các lô chuột được uống các chế phẩm tương ứng với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định, hàng ngày trong 4 ngày Vào ngày thứ năm, thực hiện các bước như sau:
- Gây tăng acid uric: tiêm màng bụng hỗn dịch kalioxonate pha trong NaCMC 0,5%, liều 500 mg/kg cân nặng vào tất cả các chuột
- Lấy mẫu và xử lý mẫu: Sau khi tiêm kalioxonate 150 phút, lấy máu từ xoang hốc mắt chuột Máu được để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, sau đó đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó lấy huyết thanh để định lượng acid uric Trong thời gian chờ để định lượng acid uric, huyết thanh được bảo quản ở -20 0 C Nồng độ acid uric được xác định thông qua việc đo mật độ quang của sản phẩm phản ứng giữa acid uric và hóa chất thử ở bước sóng 520nm
➢ Thông số đánh giá: Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm
Tác dụng hạ acid uric được đánh giá bằng tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng và tính theo công thức:
CC, CT: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử
I (%): tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng
Toàn bộ quy trình thí nghiệm được tóm tắt như hình 2.2
Hình 2.2 Quy trình đánh giá tác dụng của chế phẩm NC trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxonat
2.2.1.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nghiên cứu đến hoạt độ của enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 9 con
- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%
- Lô 2 (lô chứng dương): uống allopurinol liều 10 mg/kg cân nặng chuột
- Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 600 mg/kg cân nặng chuột
- Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 1200 mg/kg cân nặng chuột
Các lô chuột được uống các chế phẩm tương ứng với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định, hàng ngày trong 4 ngày Vào ngày thứ năm, thực hiện tiêm màng bụng hỗn dịch kalioxonate pha trong NaCMC 0,5%, liều 500 mg/kg cân nặng vào tất cả các chuột Sau 150 phút, lấy 0,4 g gan chuột đựng trong ống microtube, bảo quản ngay trong tủ lạnh -80 o C, mẫu gan này dùng để xác định hoạt độ enzym XO
➢ Kỹ thuật chiết enzym XO trong gan và làm phản ứng enzym [10]
Pha dung dịch đệm phosphat pH 7,5 lạnh, dung dịch đệm cơ chất (xanthin, EDTA, kalioxonat)
Chuẩn bị mẫu thử, mẫu trắng:
- Mẫu thử: 2,9 ml đệm phosphat và 2,5 ml đệm cơ chất
- Mẫu trắng: 5,4 ml đệm phosphat
Chiết enzym: Thêm 0,5 ml đệm lạnh vào ống chứa 0,4 g gan chuột, nghiền đồng thể, thêm dần đệm đến tỉ lệ gan : đệm = 1 : 5 Ly tâm lạnh ở 0 ºC với tốc độ 3000 vòng/10 phút và 10000 vòng/60 phút Phần dịch trong thu được sau khi ly tâm là dịch enzym dùng để xác định hoạt độ Toàn bộ các bước của thí nghiệm được thực hiện trong điều
Lấy máu hốc mắt, định lượng acid uric
(phút) kiện lạnh (môi trường nước đá đang tan)
Làm phản ứng enzym: Ủ mẫu thử ở 37 ºC trong 15 phút Thêm 0,1 ml enzym vừa thu được, tiếp tục ủ trong 30 phỳt Hỳt 200 àL dịch sau phản ứng ra đĩa UV 96 giếng Costar, đo quang ở 290 nm Song song tiến hành với mẫu trắng của từng mẫu thử
➢ Thông số đánh giá: Mật độ quang ΔOD của acid uric
Acid uric được tạo thành theo phản ứng:
Hoạt độ xanthin oxidase được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành đo ở bước sóng 290 nm
Tác dụng ức chế enzym XO được đánh giá bằng tỷ lệ giảm mật độ quang acid uric của lô thử so với lô chứng và được tính theo công thức:
I (%): tỷ lệ giảm mật độ quang acid uric của lô thử so với lô chứng ΔODchứng = ODchứng – ODtrắng chứng ΔODthử = ODthử - ODtrắng thử
2.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm NC
2.2.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm nghiên cứu trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan Áp dụng mô hình gây phù bàn chân chuột thực nghiệm bằng carrageenan của Winter [68]
Chuột được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con
- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%
- Lô 2 (lô chứng dương): uống diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng
- Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 330 mg/kg cân nặng
- Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 660 mg/kg cân nặng
Chuột được uống dung môi pha thuốc, diclofenac hoặc chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi gây viêm Vào ngày thứ năm của thực nghiệm, tiến hành các bước như sau:
- Cho 4 lô dùng dung môi pha thuốc, thuốc chứng dương, chế phẩm thử tương ứng
- Gây viêm: sau khi uống các chế phẩm 1 giờ, tiêm carrageenan 1%, 0,1 ml/chuột vào dưới da gan bàn chân sau phải của chuột
- Đo thể tích chân sau phải của chuột tại thời điểm: trước khi gây viêm (V0), sau khi gây viêm 1 giờ (V1), 3 giờ (V3), 5 giờ (V5), 7 giờ (V7)
Kỹ thuật đo được thực hiện như sau: dùng bút đánh dấu cố định mặt bên khớp gối chân sau phải của chuột, nhúng bàn chân đó vào dung dịch đo đến đúng vị trị được đánh dấu, đọc kết quả hiển thị trên thiết bị đo Kỹ thuật đo được thực hiện bởi cùng một kỹ thuật viên theo nguyên tắc làm mù
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như hình 2.3
Hình 2.3 Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm cấp bằng mô hình gây phù bàn chân chuột
- Mức độ phù bàn chân sau phải của chuột tại các thời điểm: 1, 3, 5, 7 giờ sau khi gây viêm và tính theo công thức: ΔV(%) = 𝑉𝑡−𝑉0
Trong đó: ΔV(%): mức độ phù bàn chân chuột tại thời điểm t sau khi gây viêm
V0: thể tích bàn chân chuột trước khi gây viêm
Vt: thể tích bàn chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm
Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù so với lô chứng bệnh và được tính theo công thức:
- Thông số AUC mức độ phù của từng lô Tính toán thông số này theo quy tắc hình thang dựa trên mức độ phù bàn chân chuột trong toàn bộ thời gian nghiên cứu [22],
2.2.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm nghiên cứu trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat Áp dụng mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat của McCarty và Faires [64]
Chuột cống trắng khỏe mạnh, được chia ngẫu nhiên vào 4 lô, mỗi lô 9 con
- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống NaCMC 0,5%
- Lô 2 (lô chứng dương): uống diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng
- Lô 3 (lô thử NC1): uống chế phẩm NC liều 330 mg/kg cân nặng
- Lô 4 (lô thử NC2): uống chế phẩm NC liều 660 mg/kg cân nặng
Chuột được uống dung môi pha thuốc, diclofenac hoặc chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 0,1 ml/10g cân nặng vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi gây viêm Vào ngày thứ 3 bắt đầu chuẩn bị tạo tinh thể natri urat bằng cách hòa tan 0,4 g (0,01 mol) natri hydroxid trong 400 ml nước cất Tiếp tục thêm 1,68 g (0,01 mol) acid uric, khuấy đều, siêu âm để acid uric hòa tan hoàn toàn và để qua đêm ở nhiệt độ phòng Sau đó, lọc hút chân không thu được tinh thể natri urat, rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý lạnh và sấy khô bằng tủ sấy ở 60 °C Vào ngày thứ 5, thực nghiệm được tiến hành theo các bước sau:
- Cho 4 lô dùng dung môi pha thuốc, chứng dương, chế phẩm thử tương ứng
- Tạo hỗn dịch tinh thể natri urat: cân tinh thể natri urat khô, nghiền mịn và tạo hỗn dịch bằng nước muối sinh lý Hỗn dịch natri urat thu được có nồng độ 48 mg/ml
- Gây viêm: 1 giờ sau khi uống các chế phẩm, tiêm 0,05 ml hỗn dịch natri urat trên vào khớp gối chân sau trái của chuột
Phương pháp xử lý số liệu
Biểu đồ được vẽ trên phần mềm Microsoft Excel 365
Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 20 Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
Với các số liệu thuộc phân phối chuẩn, kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình từng lô, SE: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one - way ANOVA và dùng hậu kiểm LSD đối với phương sai đồng nhất, Dunnett’s T3 với phương sai không đồng nhất Đối với các số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả được trình bày dưới dạng trung vị, tứ phân vị hoặc khoảng giá trị cực tiểu - giá trị cực đại Dùng kiểm định Kruskal Wallis để so sánh giữa các lô, Man - Whitney U Test để so sánh kết quả giữa lô thử và lô chứng.