Kết quả phân tích sự thay đổi của một số chỉ số huyết học trong quá trình theo dõi ở các thời điểm trước và sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhược cơ……….... Kết quả khảo
TỔNG QUAN
Bệnh nhược cơ
1.1.1 Định nghĩa bệnh nhược cơ
- Nhược cơ (MG): là một bệnh về rối loạn thần kinh cơ, được đặc trưng bởi tình trạng yếu và mỏi cơ Bản chất của bệnh là tình trạng giảm số lượng các thụ thể acetylcholin (acetylcholin receptor – AchR) tại bản vận động cơ do sự tấn công của các kháng thể tự miễn vào các thụ thể này [30]
- Tình trạng yếu cơ thay đổi và xảy ra với một số cơ chủ động, nhất là các cơ chi phối bởi các tế bào thần kinh vận động ví dụ như các cơ vận nhân, cơ nhai, cơ mặt cơ nuốt và cơ nói
- Yếu cơ xảy ra khi cơ hoạt động liên tục và phục hồi khi nghỉ ngơi Sử dụng các thuốc kháng cholinesterase giúp phục hồi cơ lực nhanh
Hà Lan (2004) tỷ lệ mắc bệnh là 22/218054242 người Na Uy (2001) là
453/64714284 người Anh (1998) tỷ lệ là 3171/176166666 người Ở Hy Lạp
(2006) là 33/107286179 người Và ở Nagano Nhật Bản (2000) tỷ lệ là 178/41400000 [93]
Tỷ lệ mắc bệnh ở Việt Nam từ khoảng 0,5-5/100.000 người Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi và cả 2 giới, nữ mắc bệnh nhiều hơn nam[11]
Bệnh thường gặp ở những người trong độ tuổi lao động nên việc chẩn đoán sớm và điều trị tích cực có ý nghĩa xã hội rất to lớn
Nhược cơ là một bệnh tự miễn, bệnh thuộc thần kinh ngoại vi với tổn thương cơ bản là tổn thương ở màng sau xi náp các khớp thần kinh cơ Các thụ cảm thể Achetylcholin (Acetylcholin Receptor- AchR) ở màng sau xi náp giảm cả về số lượng và chất lượng Acetylcholin (Ach) giải phóng ở màng trước xi náp không được tiếp nhận để tạo ra được điện thế hoạt động ở màng sau kích hoạt sự co cơ Các AchR ở màng sau xi náp bị tổn thương do tác động của các tự kháng thể kháng AchR theo cơ chế tự miễn dịch [30]
Hình 1.1 Kháng thể kháng thụ cảm thể Acetylcholin [30]
Các cơ sở sau để kết luận:
+ Có sự xuất hiện của kháng thể kháng lại AchR trong huyết thanh BN nhược cơ Có tới 80% – 90% bệnh nhân nhược cơ có kháng thể này
+ Có sự lắng đọng IgG ở xi náp thần kinh- cơ cạnh các AchR Bằng các kỹ thuật miễn dịch, các nghiên cứu đã chứng minh các tự kháng thể có kháng nguyên đích chính là các AchR ở màng sau xi náp các khớp thần kinh cơ
+ Truyền huyết thanh BN nhược cơ cho động vật thí nghiệm gây ra các biểu hiện nhược cơ trên lâm sàng cũng như trên điện cơ đồ
+ Khi tiêm kháng nguyên AchR cho động vật thí nghiệm, đáp ứng miễn dịch sẽ gây ra tình trạng nhược cơ
+ Khi dùng các thuốc ức chế miễn dịch hoặc lọc huyết thanh BN để loại bỏ các tự kháng thể kháng lại AchR, tình trạng bệnh giảm rõ rệt
Mặc dù tự kháng thể tham gia trực tiếp vào cơ chế bệnh sinh của bệnh nhược
5 cơ, song quá trình hình thành tự kháng thể trong bệnh nhược cơ là một quá trình phụ thuộc tế bào lympho T [32],[34]
Sự phá vỡ trạng thái tự dung nạp của tế bào lympho TCD4 với protein tự thân là rối loạn đầu tiên trong bệnh sinh nhược cơ Các tế bào TCD4 đặc hiệu với AchR đóng vai trò quyết định trong hoạt hóa tế bào lympho B sản xuất và chế tiết kháng thể kháng AchR ái lực cao
Tuyến ức là cơ quan lympho trung ương, nơi biệt hóa của tế bào lympho T Tuyến ức đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tự dung nạp của các tế bào lympho
T với các protein bản thân (tự kháng nguyên), cũng như trong đáp ứng của tế bào lympho với kháng nguyên lạ Mô tuyến ức ở bệnh nhân nhược cơ có nhiều các tế bào T trưởng thành hơn so với mô tuyến ức bình thường [31]
Hầu hết mô tuyến ức ở BN nhược cơ có mặt các tế bào lympho B có khả năng chế tiết kháng thể kháng AchR Cả hai loại tế bào lympho B và lympho T của tuyến ức đều đáp ứng với AchR hơn là các tế bào lympho của máu ngoại vi Các nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng tự kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhược cơ có u hoặc tăng sản tuyến ức cao hơn hẳn những BN tuyến ức bình thường hoặc thoái triển [33]
Tăng sản tuyến ức ở BN nhược cơ thường gặp là tăng sản thể nang Khoảng 90% BN nhược cơ có các tổn thương ở tuyến ức bao gồm tăng sản (70%) và u (20%) Thể tăng sản này có đặc trưng là sự xuất hiện các trung tâm mầm chứa nhiều tế bào lympho B Các tế bào lympho B tại đây, được các tế bào dạng cơ biểu lộ AchR bao quanh, trải qua nhiều quá trình siêu đột biến gợi ý sự tham gia của các trung tâm mầm này trong bệnh sinh của bệnh Nhiều yếu tố khác nhau cũng dẫn đến hiện tượng tự mẫn cảm với AchR tại tuyến ức ở các bệnh nhân nhược cơ Các trường hợp tuyến ức tăng sản ở BN nhược cơ được đặc trưng bởi sự tăng biểu lộ các cytokine viêm, IFN, gen liên quan đến IFN, gen mã hóa MHC lớp II, các chemokine hấp dẫn tế bào lympho
Trong u tuyến ức, tế bào tuyến ức giảm biểu lộ yếu tố điều hòa đáp ứng tự miễn (autoimmune regulator – AIRE) Thiếu vắng các tế bào dạng cơ và không hoạt hóa thành công tế bào Treg (regulatory T cell) là những yếu tố gây phá vỡ trạng thái tự dung nạp Kết quả là các tế bào lympho T tự miễn đặc hiệu với AchR có cơ hội hoạt hóa, kích hoạt đáp ứng tạo kháng thể kháng AchR trong bệnh tự miễn [11],[59],[12]
1.1.4 Chẩn đoán bệnh nhược cơ
Chẩn đoán bệnh nhược cơ cần sự phối hợp giữa lâm sàng và cận lâm sàng phù hợp, trong đó các phương tiện cận lâm sàng đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán chính xác bệnh
Dựa vào các yếu tố sau, trong đó yếu tố 1 và 2 bắt buộc phải có
1 Biểu hiện nhược các nhóm cơ vân khác nhau: mức độ nhược cơ thay đổi trong ngày, tăng lên khi vận động và giảm đi khi nghỉ ngơi
2 Test prostigmin hoặc Tensilon dương tính
- Ghi điện cơ: điện thế hoạt động cơ đáp ứng giảm dần khi kích thích dây thần kinh lặp đi lặp lại
- Xét nghiệm tìm thấy các tự kháng thể kháng acetylcholin trong máu [12]
- Một đặc điểm nổi bật về triệu chứng lâm sàng của bệnh nhược cơ là: triệu chứng nhược cơ thay đổi trong ngày (chiều nặng hơn sáng, đỡ khi nghỉ ngơi và nặng lên khi vận động nhiều)
- Sụp mi: do bị nhược các cơ nâng mi, là triệu chứng khởi đầu ở khoảng 65% bệnh nhân, đôi khi có thể là triệu chứng duy nhất của bệnh Thường sụp mi ở cả hai mắt nhưng không đều nhau Các nếp nhăn ở trán xuất hiện sớm vì bệnh nhân thường cố mở mắt và nhìn lên bằng các cơ trán Sụp mi thường kèm theo triệu chứng nhìn đôi, lác do các cơ vận nhãn cũng bị tổn thương Dấu hiệu sụp mi và nhìn đôi càng về chiều càng nặng
- Yếu cơ chân và tay: làm việc chóng mỏi, có thể không tự nhấc tay, chân lên được Càng vận động nhiều thì càng nhược cơ nặng, đỡ khi nghỉ ngơi
- Nhược các cơ vùng hầu - thanh quản: khó phát âm do bị nhược các cơ vận động phát âm Nếu nói liên tục thì bệnh nhân bị nói ngọng, líu lưỡi lại và không nói được nữa Bệnh nhân nhai chóng mỏi, nặng có thể không nhai được và hàm dưới trễ xuống do bị nhược nặng các cơ nhai Khó nuốt và nuốt thường bị sặc, do đó bệnh nhân không ăn uống được
- Các cơn khó thở: do nhược các cơ hô hấp, có thể diễn biến rất nhanh làm bệnh nhân bị suy hô hấp và dẫn đến tử vong
Các loại tế bào gốc của tủy xương và ứng dụng trong điều trị bệnh nhược cơ
1.2.1 Đại cương tế bào gốc
TGB là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hoá trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hoá với các chức phận sinh lí Trong điều kiện in vivo hay in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới với các tính năng riêng biệt mới Chẳng hạn, các tế bào gốc tuỷ xương hoàn toàn chưa được chuyên hoá, chúng có thể biệt hoá thành các tế bào máu chuyên hoá (chẳng hạn tế bào bạch cầu, tế bào hồng cầu), và những kiểu tế bào mới này có các chức năng chuyên biệt, như khả năng sản xuất kháng thể, vận chuyển các chất khí mà trước đó tế bào gốc không hề có Do đó, một kiểu tế bào xuất thân có nguồn gốc từ một tế bào khác, thì tế bào khác đó cũng có thể được gọi là “tế bào gốc”
Tế bào gốc có hai đặc tính đáng chú ý nhất là:
- Tính tự làm mới (self - renewal): tế bào đó có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kì phân bào nguyên nhiễm, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hoá
Hình 1.2 Khả năng tự làm mới của tế bào gốc [23]
- Tính tiềm năng không giới hạn (unlimited potency): tế bào đó có khả năng biệt hoá thành bất kì kiểu tế bào trưởng thành nào.Trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với các tế bào gốc toàn năng, hoặc vạn năng, tuy nhiên một tế bào gốc đa năng (hay tế bào tiền thân) cũng nhiều khi được gọi là tế bào gốc
Chu kỳ sống của TBG hoặc tế bào tiền thân là một quá trình được điều hoà bởi
5 hoạt động cơ bản: hoạt hoá, sinh sản, di chuyển, biệt hoá và tồn tại (hoặc chết theo chương trình) (Hình 1.2) [23]
Hình 1.3: Quá trình hoạt động của tế bào gốc [23]
Vào năm 2008, sau khi kết quả các công trình của Shinya Yamanaka (Đại học Kyoto của Nhật) và James Thompson (Đại học Wisconsin của Mĩ) được công bố chính thức, cũng như thuyết tế bào gốc ung thư được nhiều nghiên cứu thẩm định, tế bào gốc được chia thành năm nhóm chính:
- Tế bào gốc phôi (thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ – Blastocyst)
- Tế bào gốc nhũ nhi (thu nhận từ thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối, màng lót dây rốn
- Tế bào gốc trưởng thành (thu nhận từ cơ thể trưởng thành)
- Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem cell iPS), có thể tạm hiểu là tế bào gốc phôi nhân tạo hay tế bào gốc nhân tạo, chúng có tiềm năng như là các tế bào gốc phôi (loại tế bào gốc đã được tạo ra do có sự thao tác in vitro trên chính bộ gene đã biệt hoá chức năng của chúng)
- Tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cell_CSC), được coi là nguồn gốc của khối u và chúng chỉ có trong các khối u [4]
1.2.2 Các loại TBG của tủy xương:
Tủy xương là nơi cư trú của một hỗn hợp các TBG có khả năng tái tạo và biệt hóa khác nhau Các tế bào gốc của tủy xương chủ yếu thuộc loại tế bào gốc trưởng thành dòng soma [4],[25]
- TBG tạo máu (Haemopoietic Stem Cell - HSC)
- Tế bào tiền thân nội mạc (Endothelial stem/progenitor cells - EPC)
TBG tạo máu và TBG trung mô đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi Ngoài ra còn một số loại TBG khác hiếm gặp hơn và sự tồn tại của chúng vẫn còn đang
12 gây tranh cãi như: quần thể tế bào phụ (Side population – SP)
Khả năng biệt hóa, tính mềm dẻo của chúng là cơ sở cho những liệu pháp điều trị bằng TBG của tủy xương, chúng có thể được sử dụng để tái tạo nhiều cơ quan, tổ chức khác nhau: cơ, xương, sụn, cơ tim, thay thế tế bào tụy tạng
Các TBG của tủy xương trước hết đều mang đặc tính chung của TBG đồng thời có những đặc tính riêng, chuyên biệt cho từng loại TBG [4]
Hình 1.4: Một số tế bào gốc [4]
HSC là những TBG sinh ra các dòng tế bào máu và các tế bào miễn dịch, thay thế các tế bào máu già chết đi sau khi đã thực hiện hết chức năng, đảm bảo
13 duy trì sự hằng định của hệ thống huyết học miễn dịch của cơ thể HSC của người có nhiều trong tủy xương, máu cuống rốn và máu ngoại vi Trong tuỷ xương khoảng 10.000 - 15.000 tế bào có nhân mới có 1 HSC thực thụ còn ở máu ngoại vi khoảng 100.000 bạch cầu mới có 1 HSC [16]
Hình 1.5: Khả năng biệt hóa của tế bào gốc tạo máu và tế bào đệm tủy xương [80]
Hệ thống tạo máu từ lâu đã được coi là một hệ thống có tổ chức, có trật tự với những TBG tự tạo mới, đa năng ở giai đoạn đầu sau đó chuyển thành những tế bào tiền thân (progenitor) ở giai đoạn trung gian và những tế bào đầu dòng (precursor) ở giai đoạn cuối Những tế bào đầu dòng này có thể phát triển và biệt hóa đến tận cùng tạo nên những tế bào máu trưởng thành với những chức năng chuyên biệt
HSC giống bạch cầu lympho cả về hình dáng và một số tính chất khi được nuôi cấy vì thế rất khó phân biệt và nhận ra chúng bằng hình thái học Một số protein bề mặt đặc trưng cho HSC của chuột và người gần tương tự nhau và đã lần lượt được phát hiện vào những năm 1980 - 1990
Những marker chủ yếu của HSC ở người gồm: CD34 + , CD59 + , CD 90, CD38 + (), C-kit + () Những marker của HSC có bản chất là các protein bề mặt có thể gắn với những kháng thể monoclonal đặc hiệu Hiện nay phân tử CD34 là
1 marker chủ yếu để xác định HSC [16]
TBG tạo máu có những đặc tính chủ yếu như sau:
- Có khả năng tự tái tạo: Trong tủy xương người bình thường, HSC phân chia và tạo ra những tế bào thay thế chúng, những tế bào mới sinh ra vẫn giữ nguyên đặc tính của nó Do đặc tính này nên chỉ một HSC cũng có khả năng thiết lập và duy trì tạo máu trong một thời gian dài Những kỹ thuật nuôi cấy làm tăng số lượng và duy trì HSC không biệt hoá luôn luôn là mục tiêu quan trọng cho những nghiên cứu để có thể thu được một lượng HSC vô hạn cần thiết cho những ứng dụng của nó
- Có khả năng biệt hoá: HSC có thể biệt hóa thành các dòng tế bào máu khác nhau dưới tác dụng của những yếu tố phát triển (growth factor) và các cytokin Những yếu tố này tương tác với nhau hết sức phức tạp tạo nên một hệ thống kiểm soát về di truyền và điều phối tạo máu hoàn hảo, tinh tế Một HSC có thể sản xuất ra tất cả các dòng tế bào trong vòng 7 tuần và khoảng 30 HSC có thể đủ để cứu con chuột đã bị chiếu tia liều chết, tái lập toàn bộ các quần thể tế bào của tuỷ xương Về khả năng biệt hóa của HSC, tính “mềm dẻo” (plasticity) là một khái niệm mới và HSC đang được nghiên cứu chứng minh HSC tủy xương có thể biệt hóa không những thành các tế bào máu mà trong những hoàn cảnh, điều kiện thích hợp nó còn có thể biệt hóa thành những loại TB khác Khả năng biệt hóa của HSC tủy xương bao gồm: Các tế bào cơ (gồm cả tế bào cơ xương và tế bào cơ tim), tế bào não, tế bào gan, tế bào da, tế bào phổi, tế bào thận, tế bào ruột và tế bào tụy HSC có thể thay đổi số phận để đáp ứng với những tín hiệu tái tạo từ tổ chức nếu cần thiết hiện tượng đó được cho là chuyển biệt hóa (transdifferentiation)
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Bệnh án lưu trữ và BN nhược cơ mới chẩn đoán, được điều trị và theo dõi tại khoa Huyết học lâm sàng – Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ tháng 06/2021 đến tháng 05/2022
BN được chẩn đoán nhược cơ và thỏa mãn các tiêu chí sau:
- Đã phẫu thuật cắt tuyến ức
- Đã điều trị bằng các thuốc kháng men, corticoid và tách huyết tương theo phác đồ không hiệu quả (điều trị đúng phác đồ tối thiểu 3 tháng nhưng không kiểm soát được triệu chứng nhược cơ)
- Thời gian điều trị sau phẫu thuật > 12 tháng
- Có đủ khám lâm sàng và xét nghiệm theo protocol nghiên cứu
- Có hồ sơ bệnh án lưu trữ với đầy đủ thông tin trong điều trị và theo dõi sau điều trị theo protocol nghiên cứu
- BN thuộc nhóm chống chỉ định ghép TBG tạo máu tự thân đối với nhược cơ
✓ Suy tạng: trước ghép TBG tạo máu tự thân cần đánh giá chức năng tim, phổi, thận và đường tiêu hóa
+ Chống chỉ định với bệnh tim tiến triển (chức năng tâm thu thất trái < 40%; loạn nhịp thất không kiểm soát, dịch màng tim > 1cm)
+ Với bệnh thận: độ thanh thải creatinin < 30 mL/phút/m 2
+ Với hô hấp: khả năng khuếch tán CO < 40% so với dự đoán, áp lực động mạch phổi trung bình > 50 mmHg hoặc lâm sàng, cận lâm sàng biểu hiện suy hô hấp
+ Chảy máu tiêu hóa đang hoạt động
✓ Nhiễm khuẩn khó kiểm soát: Nhiễm khuẩn cấp hoặc mạn tính: HIV, nhiễm virus giảm lympho T type 1, 2; viêm gan virus B với kháng nguyên bề mặt dương tính hoặc viêm gan virus C PCR dương tính
- BN không đến khám theo lịch hẹn (quá 15 ngày)
- BN không có khả năng giao tiếp hoặc đối thoại trực tiếp
- BN từ chối phỏng vấn
2.1.3 Địa điểm và nơi tiến hành nghiên cứu
- Đề tài được thực hiện tại Khoa Huyết học lâm sàng -Bệnh viện TƯQĐ 108
-Thời gian thực hiện từ tháng 06/2021 đến tháng 05/2022.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu tiến cứu kết hợp với hồi cứu, mô tả cắt ngang, phân tích mối tương quan giữa trước và sau điều trị
Chọn mẫu thuận tiện, không xác suất, thu thập toàn bộ các bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ tại Khoa huyết học lâm sàng- Bệnh viện TƯQĐ 108 được điều trị ngoại trú, thời gian từ 06/2021 đến tháng 05/2022 thõa mãn tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ Sau đó lấy vào nghiên cứu các bệnh án đủ tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ ở trên
2.2.2 Thiết kế nghiên cứu Điền các thông tin cần thiết của mỗi BN vào mẫu bệnh án nghiên cứu bao gồm tuổi, giới, triệu chứng lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng cần thiết để chẩn đoán xác định bệnh nhược cơ (MG) Nhập các số liệu về tuổi, giới, các chỉ số huyết học của BN trong các lần khám T0, T1, T4, T12, T24 và đánh giá sau điều trị vào phần mềm thống kê SPSS 22.0 để xử lý các số liệu và đưa ra các kết quả nghiên cứu
- Lần khám thứ nhất gọi là T0 (lúc bắt đầu nghiên cứu)
- Lần khám thứ hai gọi là T1 (sau 1 tuần)
- Lần khám thứ ba gọi là T4 (sau 4 tuần)
- Lần khám thứ tư gọi là T12 (sau 12 tuần)
- Lần khám thứ năm gọi là T24 (sau 24 tuần.)
2.2.3 Phương pháp đếm tế bào gốc tạo máu CD34+ bằng máy phân tích tế bào dòng chảy flow cytometer
Tế bào gốc tạo máu có kháng nguyên CD34 trên bề mặt Nếu ủ kháng thể anti CD34 với mẫu bệnh phẩm có tế bào gốc tạo máu, kháng thể này sẽ gắn đặc hiệu lên bề mặt các tế bào gốc tạo máu mang CD34 Dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phân tích trên máy phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometer) có thể đếm chính xác số lượng và tỷ lệ % tế bào gốc tạo máu CD34 trong mẫu bệnh phẩm
Máy phân tích tế bào dòng chảy (có thể phân tích các kênh màu huỳnh quang 7ADD, FITC và PE)
Máy ly tâm ống máu
Pipet và đầu pipet loại 25àl và 1000àl
Bộ kít đếm CD34 gồm có các hóa chất sau: 7AAD, CD45 - FITC/CD34 - PE, CD45 - FITC/Isotyp Control - PE, hạt tham chiếu (có nồng độ xác định), dung dịch ly giải hồng cầu
Các dung dịch chạy máy và dung dịch rửa máy để vận hành máy phân tích tế bào dòng chảy;
Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorit
Bệnh phẩm có thể là mẫu máu ngoại vi, mẫu máu cuống rốn, mẫu lấy từ khối tế bào gốc máu ngoại vi tươi hoặc khối tế bào gốc máu ngoại vi đông lạnh sau rã đông, hoặc mẫu dịch hút tủy xương
Lấy tối thiểu 0,5 ml mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm được chống đông bằng EDTA (Ethylen-diamin-tetra-acetic acid) Mẫu bệnh phẩm đảm bảo chất lượng là mẫu bệnh phẩm không đông vón và không lâu quá 1 giờ sau khi lấy khỏi tĩnh mạch hoặc sau khi rã đông
Tiến hành kỹ thuật Đếm số lượng bạch cầu có trong mẫu thử, pha loãng mẫu thử về nồng độ 10×10 9 tế bào/L, ghi lại hệ số pha loãng (số lần pha loãng)
Lấy 100 ul mẫu thử đã pha loãng cho vào các ống 1, 2 và 3
Thờm 20 àl 7AAD vào cả 3 ống 1, 2, 3
Thờm 20 àl CD45 - FITC/CD34 - PE vào ống 1 và ống 2
Thờm 20 àl Control (CD45 - FITC/Isotype PE) vào ống số 3
Votex đều các ống và ủ nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng
Thờm 2000 àl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phũng 10 phỳt
Ngay lập tức thêm 100 ul huyền dịch hạt tham chiếu vào các ống 1, 2, 3
Trộn lắc đều các ống
Phân tích flow cytometer bằng chương trình đếm CD34 có sẵn trên máy flow cytometer
-Nhận định kết quả Đọc kết quả
Kết quả do chương trình máy tính tự động xuất ra dưới dạng chỉ số CD34%, số đếm CD34 tuyệt đối (tế bào/ àl)
Nếu kết quả thu được giữa ống 1 và ống 2 khác nhau dưới hoặc bằng 10% thì kết quả chấp nhận tốt Nếu khác biệt trên 10% cần phải làm lại xét nghiệm, phải chú ý thực hiện thật tốt kỹ thuật hút mẫu và hút hóa chất bằng pipet [94]
2.2.4 Phương pháp định lượng Acetylcholin receptor Ab
Bộ kháng thể thụ thể Acetylcholin ở người (AChR) Bộ ELISA MBS729942
Thụ thể acetylcholin của cơ có 5 tiểu đơn vị thuộc 4 loại khác nhau: 2 alpha và 1 trong mỗi tiểu đơn vị beta, gamma và delta Sau khi liên kết với acetylcholin, thụ thể trải qua một sự thay đổi cấu trúc rộng rãi ảnh hưởng đến tất cả các tiểu đơn vị và dẫn đến việc mở kênh dẫn ion qua màng sinh chất Các khiếm khuyết trong gen này là nguyên nhân của hội chứng mộng thịt loại gây chết người, hội chứng nhược cơ bẩm sinh loại kênh chậm và hội chứng nhược cơ bẩm sinh loại kênh nhanh Một số biến thể phiên mã, một số mã hóa protein và một số không mã hóa, đã được tìm thấy cho gen này
Xét nghiệm có độ nhạy cao và độ đặc hiệu tuyệt vời để phát hiện AchRAb Không quan sát thấy phản ứng chéo hoặc nhiễu đáng kể giữa AchRAb và các chất tương tự Tính đặc hiệu của phát hiện phản ứng chéo giữa AchRAb và tất cả các chất tương tự vẫn chưa được xử lý triệt để, do đó, phản ứng chéo vẫn có thể vẫn tồn tại trong một số trường hợp
Huyết thanh, huyết tương, chất nổi nuôi cấy tế bào (CCS), dịch cơ thể và mô đồng nhất
- Loại thử nghiệm Định lượng cạnh tranh
- Chuẩn bị và Bảo quản
Bảo quản tất cả thuốc thử ở 2-8 độ C
Với các mẫu chuẩn (không pha loãng), độ pha loãng 1:2 hoặc 1:4 Tránh pha loãng mẫu quá 1:10 vì nó sẽ vượt quá giới hạn pha loãng đã đặt cho bộ dụng cụ
MBS729942 là Bộ công cụ ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym) sẵn sàng sử dụng để phân tích sự hiện diện của bộ phân tích ELISA Kit kháng thể thụ thể Acetylcholin (AChR) trong các mẫu sinh học Các gradient nồng độ của các tiêu chuẩn kit hoặc các đối chứng dương tính hiển thị một phạm vi phát hiện kit lý thuyết trong các mẫu nghiên cứu sinh học có chứa AChR Kỹ thuật sinh hóa phân tích ELISA của bộ MBS729942 dựa trên tương tác kháng thể AChR- kháng nguyên AChR (khả năng hấp thụ miễn dịch) và hệ thống phát hiện so màu HRP để phát hiện mục tiêu kháng nguyên AChR trong mẫu Bộ ELISA được thiết kế để phát hiện AChR nguyên bản, không tái tổ hợp Các loại mẫu thích hợp có thể bao gồm dịch cơ thể chưa pha loãng và/hoặc chất đồng nhất của mô, dịch tiết Các xét nghiệm kiểm soát chất lượng đánh giá độ tái lập đã xác định CV (%) trong xét nghiệm và CV (%) giữa các xét nghiệm
Mục đích sử dụng: Bộ AchRAb ELISA là một ELISA pha rắn 1,5 giờ được thiết kế để xác định định lượng AchRAb ở người Bộ ELISA chỉ sử dụng cho nghiên cứu, không dùng cho các ứng dụng điều trị hoặc thử nghiệm
Nguyên tắc của thử nghiệm: Bộ kit ELISA AchRAb áp dụng kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch enzym cạnh tranh sử dụng kháng nguyên thụ thể Acetylcholin và liên hợp AchRAb-HRP Mẫu xét nghiệm và đệm được ủ cùng với liên hợp AchRAb-HRP trong đĩa tráng trước trong một giờ Sau thời gian ủ, giếng được gạn và rửa năm lần Các giếng sau đó được ủ với cơ chất cho enzyme HRP Sản phẩm của phản ứng enzym-cơ chất tạo thành phức chất có màu xanh lam Cuối cùng, một dung dịch được thêm vào để dừng phản ứng, sau đó dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng Cường độ màu được đo bằng quang phổ ở bước sóng 450nm trong đầu đọc microplat Cường độ của màu tỷ lệ nghịch với nồng độ AchRAb vì AchRAb từ mẫu và liên hợp AchRAb-HRP cạnh tranh vị trí liên kết với kháng nguyên Acetylcholin Receptor Vì số lượng vị trí bị hạn chế, do có nhiều vị trí bị chiếm
30 bởi AchRAb từ mẫu, nên sẽ có ít vị trí hơn để gắn kết liên hợp AchRAb-HRP Một đường cong chuẩn được vẽ biểu đồ liên quan đến cường độ của màu (OD) với nồng độ của các chất chuẩn Nồng độ AchRAb trong mỗi mẫu được nội suy từ đường chuẩn này [104]
2.2.5 Thang điểm Quality of Life (QoL) của WHO