Cơ chế hoạt động của enzym Cơ chế tác dụng của enzym là enzym làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng để các cơ chất dễ dàng đạt được mức năng lượng, đưa phản ứng vào trạng thái chuyể
TỔNG QUAN
Tổng quan về enzym
Enzyme là các chất xúc tác sinh học đặc biệt, có bản chất là protein và có tác dụng xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa sinh diễn ra trong cơ thể sống Nhờ tính đặc hiệu và hoạt động tối ưu ở các điều kiện nhất định, enzyme tăng tốc đáng kể các quá trình trao đổi chất và các phản ứng sinh học, giúp duy trì sự sống và cân bằng sinh học của cơ thể.
Hiệp hội enzym quốc tế, hay Enzyme Commission (EC), phân loại enzym dựa trên phản ứng hóa học mà chúng xúc tác Hệ thống này chia enzym thành sáu lớp (class), được đánh số từ 1 đến 6: 1 Oxidoreductases, 2 Transferases, 3 Hydrolases, 4 Lyases, 5 Isomerases và 6 Ligases Mỗi enzym được gán mã EC để mô tả chức năng và phản ứng xúc tác của nó một cách chuẩn xác, hỗ trợ nhận diện vai trò sinh học và ứng dụng thực tiễn trong nghiên cứu và công nghiệp.
Trong hệ thống phân loại enzyme (EC), mỗi loại được chia thành các dưới lớp (subclass), rồi từng dưới lớp lại được chia thành các nhóm (sub-subclass), và mỗi nhóm chứa một số enzyme Do đó, mỗi enzyme được ký hiệu bằng một mã số EC gồm 4 số, cách nhau bằng dấu chấm: số thứ nhất cho loại enzyme, số thứ hai cho dưới lớp, số thứ ba cho nhóm, và số thứ tư cho tên riêng của enzyme trong nhóm.
1.1.1 Trung tâm hoạt động của enzym
Enzym là một loại protein đặc biệt có vùng cấu trúc liên quan trực tiếp đến hoạt tính của nó, được gọi là trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động là phần chịu trách nhiệm nhận diện và tương tác với các chất tham gia phản ứng, thể hiện tính đặc hiệu cho phản ứng mà enzym xúc tác và giúp tăng tốc quá trình sinh hóa.
Trung tâm hoạt động (active site) của enzyme là một vùng đặc biệt trong cấu trúc enzyme có tác dụng gắn cơ chất để xúc tác phản ứng biến đổi cơ chất thành sản phẩm Mỗi enzyme có thể có một, hai hoặc nhiều trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động gồm các nhóm hóa học và các liên kết tiếp xúc trực tiếp với cơ chất hoặc không tiếp xúc trực tiếp với cơ chất nhưng có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác.
Về thành phần cấu tạo, trung tâm hoạt động thường bao gồm các acid amin có các nhóm hóa học có hoạt tính cao như serin (có nhóm –OH), cystein (có nhóm –SH), glutamic (có nhóm ɣ-COO), lysin (có nhóm ɛ-NH3 +), histidin (có nhóm imidazol + ), tryptophan (có nhóm indol + )… Đây là những nhóm phân cực hoặc ion hóa, có khả năng tạo liên kết hydro hoặc ion với cơ chất
Người ta đưa ra hai giả thuyết về mối quan hệ giữa trung tâm hoạt động và cơ chất, được mô tả trong hình 1.1 và hình 1.2
Thuyết “ổ khóa và chìa khóa”: tương tác giữa enzym E và cơ chất S (tức là sự gắn giữa enzym và cơ chất) để tạo thành phức hợp enzym – cơ chất ES cũng giống như quan hệ giữa “ổ khóa” và “chìa khóa”, nghĩa là enzym nào thì chỉ xúc tác cho đúng cơ chất đó
Thuyết này giải thích được tính đặc hiệu tuyệt đối của enzym nhưng không giải thích được tính đặc hiệu tương đối của enzym
Hình 1.1 Mô hình “ổ khóa” và “chìa khóa”
Thuyết “mô hình cảm ứng không gian” cho rằng trung tâm hoạt động của enzym có tính mềm dẻo và linh hoạt, có thể biến đổi cấu hình không gian trong quá trình tương tác với cơ chất S để phù hợp với hình dạng của cơ chất và từ đó hình thành phức hợp enzyme–cơ chất ES Sự biến đổi này giải thích tính đặc hiệu tương đối của enzym: mỗi enzyme có thể điều chỉnh cấu hình để nhận diện và gắn với cơ chất phù hợp, từ đó tối ưu hóa quá trình xúc tác.
Hình 1.2 Mô hình “cảm ứng không gian”
1.1.2 Cơ chế hoạt động của enzym
Enzyme là chất xúc tác sinh học giúp giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng, cho phép các cơ chất đạt tới mức năng lượng cần thiết và vượt qua hàng rào năng lượng để đến trạng thái chuyển tiếp, từ đó phản ứng diễn ra nhanh hơn Tốc độ của phản ứng phụ thuộc vào số lượng phân tử cơ chất có thể vượt qua hàng rào năng lượng và tiến tới trạng thái chuyển tiếp.
Hình 1.3 Sự biến đổi năng lượng tự do
Enzyme giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng bằng cách liên kết với cơ chất để hình thành phức hợp enzyme–cơ chất; nhờ tác động của phức hợp này, cơ chất bị biến đổi mạnh và cuối cùng tạo ra sản phẩm Phức hợp enzyme–cơ chất thường hình thành rất nhanh và về bản chất là không bền vững, tồn tại ở trạng thái trung gian nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro, liên kết ion, lực Van der Waals và các tương tác điện tích.
Hình 1.4 Cơ chế làm giảm năng lượng hoạt hóa của enzym
ES là phức hợp enzym – cơ chất
EP là phức hợp enzym – sản phẩm
P là sản phẩm của phản ứng
Quá trình biến đổi các mức năng lượng trong phản ứng xúc tác enzym cho thấy chu trình diễn ra theo trình tự: trước hết cơ chất được hoạt hóa và chuyển sang trạng thái chuyển tiếp tạm thời, giúp nó tương tác với enzyme để hình thành phức hợp enzym–cơ chất (ES) Phức hợp ES được kích hoạt tiếp để chuyển thành trạng thái chuyển tiếp tạm thời khác, hình thành phức hợp EP Phức hợp EP sau đó trải qua một trạng thái chuyển tiếp cuối cùng để tạo ra sản phẩm P và giải phóng enzyme tự do.
1.1.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzym
Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzym
Phương pháp này tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hoặc lượng sản phẩm được hình thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzym xác định Phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác, cho phép ước lượng hoạt tính enzym một cách nhanh chóng và có thể so sánh giữa các mẫu khác nhau trong các điều kiện phản ứng.
Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hoặc lượng sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzym nhất định Quá trình này cho phép ước lượng tốc độ phản ứng và khám phá mối quan hệ giữa nồng độ enzym với sự biến thiên của cơ chất và sản phẩm theo thời gian Kết quả thu được có thể dùng để xây dựng mô hình động học enzym và tối ưu hóa điều kiện phản ứng cho các ứng dụng sinh học và công nghiệp dựa trên biến thiên của cơ chất và sản phẩm ở mức nồng độ enzym đã cho.
- Tiến hành chọn nồng độ enzym cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm
1.1.4 Đơn vị hoạt tính enzym
Vào năm 1961, Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzym đã đưa ra khái niệm đơn vị enzym quốc tế (hoặc đơn vị enzym tiêu chuẩn) Đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển một attomol chất nền sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 UI = 1 àmol cơ chất (10 -6 mol) / 1 phỳt
Vào năm 1972, khái niệm Katal (Kat) được giới thiệu như một đơn vị đo lường hoạt động của enzyme Đơn vị Katal là lượng enzym có khả năng xúc tác chuyển hóa được một mol cơ chất mỗi giây ở điều kiện tiêu chuẩn Nói cách khác, Kat cho biết tốc độ xúc tác của enzyme tại các điều kiện chuẩn và cho phép so sánh hoạt tính giữa các enzyme khác nhau Việc dùng Kat hỗ trợ đánh giá hiệu suất xúc tác trong nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp, đồng thời tạo cơ sở cho tối ưu hoá các quá trình enzymatic.
1 Kat = 1 mol cơ chất / 1 giây
Tổng quan về enzym bromelain
Bromelain lần đầu được phân lập vào năm 1891 bởi một nhà hóa học người Venezuela, thông qua quá trình lên men quả dứa Năm 1892, Russell Henry Chittenden, với sự hỗ trợ của Elliott P Joslin và Frank Sherman Meara, đã đi sâu nghiên cứu và gọi dịch chiết đó là bromelain Kể từ đó, thuật ngữ bromelain được dùng để chỉ các enzym protease có nguồn gốc từ thân và quả của họ dứa thuộc họ Bromeliaceae Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được sử dụng làm nguyên liệu chính để sản xuất bromelain, nhờ nguồn nguyên liệu dồi dào, đặc biệt sau mùa thu hoạch.
Bromelain có thể được chia thành bromelain thân (EC 3.4.22.32) và bromelain quả (EC 3.4.22.33) tùy thuộc vào vị trí chiết xuất, đây là một enzym thuộc nhóm protease thiol nhưng khác với các protease thực vật khác như papain hay ficin ở chỗ nó là một glycoprotein gồm phần protein và phần phi protein Phần phi protein của bromelain là một chuỗi oligosaccharide bao gồm 3 mannose, 1 fructose, 1 xylose và 2 N-acetylglucosamine (GlcNAc) Dưới đây là cấu trúc carbohydrate của bromelain được chiết từ thân.
Hình 1.5 Cấu trúc sợi hydratcacbon của bromelain được chiết xuất từ thân
Glucosamin là phần nối trực tiếp với mạch polypeptid của phần protein Tùy theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích, thành phần của amino acid trong bromelain thay đổi khác nhau khi được chiết xuất từ thân và từ quả Bromelain có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 321-144 amino acid và bromelain quả là 283-.
Bromelain gồm 161 axit amin Ngoài ra, bromelain ở các bộ phận khác nhau của cây dứa có thành phần hóa học khác nhau; cụ thể, polipeptit của bromelain chiết từ thân có đầu -NH2 là valin và đầu carboxyl là glylin, trong khi bromelain chiết từ quả lại có đầu -NH2 là alanin [3].
1.2.2 Cấu trúc không gian của bromelain
Cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau [3, 20, 25]:
Hình 1.6 Cấu trúc bậc 1 của bromelain
Bromelain là một protease với trung tâm hoạt động chứa cysteine và hai chuỗi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide -S-S- Do sắp xếp phức tạp của các chuỗi này, phân tử bromelain có dạng hình cầu, thuộc loại protein globular [3].
Bromelain có nhóm sulfhydryl đóng vai trò xúc tác chính, và mỗi phân tử có năm cầu nối -S-S- (disulfide) Ngoài ra, phân tử bromelain còn chứa các ion Zn2+ có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzym.
• Các tính chất vật lý của bromelain thân dứa được Murachi và cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau [3]:
- Trọng lượng phân tử: 33200-33500 Dalton
Độ ổn định nhiệt của các enzym cho thấy hầu hết có độ bền với nhiệt giảm khi nhiệt độ tăng; khi nhiệt độ vượt quá 65℃, hoạt động của enzym bị ức chế nghiêm trọng Tuy nhiên, bromelain vẫn tương đối ổn định và duy trì được cấu trúc ở nhiệt độ 60℃ [19].
Hoạt tính của bromelain phụ thuộc vào từng cơ chất và thể hiện khác biệt giữa các loại cơ chất khác nhau; so với protease thực vật thuộc nhóm thiol protease như papain, bromelain phân giải hemoglobin mạnh gấp khoảng 4 lần papain, còn với cơ chất là casein hoạt tính của hai enzyme này tương đương, và đối với cơ chất tổng hợp bromelain lại có hoạt tính thấp hơn; bromelain có khả năng thủy phân protein, peptide và các liên kết amid.
Đối với bromelain chiết từ các vị trí khác nhau trên cây dứa, hoạt tính phân giải casein phụ thuộc nguồn enzyme Khi dùng casein làm substrate, bromelain chiết từ thân cho hoạt tính cao nhất với 7,4 UI/mg; bromelain chiết từ quả xanh cho 4,0 UI/mg và từ quả chín cho 3,0 UI/mg Kết quả này cho thấy hoạt tính phân giải casein của bromelain biến thiên theo nguồn chiết, thân > quả xanh > quả chín.
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain
Cũng giống như các enzym khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, ion kim loại
• Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, trong đó thời gian tác dụng càng dài có thể khiến nhiệt độ biến động và làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Bên cạnh đó, nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất cùng với dạng tồn tại của enzyme cũng quyết định sự ổn định và hiệu quả của quá trình xúc tác Tất cả các yếu tố này cùng nhau xác định nhiệt độ tối ưu và hiệu suất hoạt động của hệ enzym, được ghi nhận trong tài liệu tham khảo [3].
Ở nhiệt độ quá cao, cấu trúc của enzym bị thay đổi, các liên kết trong phân tử enzym bị phá vỡ và cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cystein bị biến dạng, khiến enzym không thể kết hợp với cơ chất Ngược lại, ở nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao, quá trình biến tính protein xảy ra và làm giảm hoạt tính của enzym, làm giảm hiệu suất xúc tác.
Theo Rungtip Jutamongkon và Sanguansri Charoenrein, dịch chiết bromelain vẫn giữ nguyên hoạt tính ở 40°C trong 60 phút; khi nhiệt độ tăng lên 50°C hoạt tính còn lại khoảng 83%; tuy nhiên ở mức 80°C bromelain mất toàn bộ hoạt tính chỉ sau 8 phút [8].
Các tác giả De Lencastre Novaes L C và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt động phân giải protein của bromelain ở các nhiệt độ khác nhau Kết quả cho thấy hoạt động phân giải protein của bromelain giảm đáng kể khi ủ ở 60°C, giảm một nửa sau 30 phút Ở 70°C, hoạt động này giảm từ 9% đến 22% so với trạng thái ban đầu sau 15 phút ủ Khi dung dịch bromelain được đun nóng ở 100°C trong 10 phút, hoạt tính bị mất hoàn toàn.
Giá trị pH ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính xúc tác của enzyme và là yếu tố quan trọng trong quá trình phản ứng sinh hóa Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH trong môi trường xung quanh, vì vậy mỗi loại enzyme thường hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định được gọi là pH tối thích Việc duy trì pH ở mức phù hợp giúp tối ưu hóa tốc độ phản ứng và hiệu suất xúc tác của enzyme, hỗ trợ các ứng dụng trong sinh học, công nghiệp và xử lý môi trường.
pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của enzym vì pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzym, cơ chất và phức hợp enzym–cơ chất; khi pH quá cao hoặc quá thấp, điện tích và khả năng tích điện của cả enzym và cơ chất bị biến đổi, từ đó làm giảm hoặc mất khả năng hình thành liên kết enzym–cơ chất và dẫn tới giảm hoặc mất hoạt tính Bromelain có phạm vi hoạt động rộng trong khoảng pH = 3–10, nhưng pH tối ưu của nó nằm ở khoảng 5–8 Chaurasiya và Hebbar đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự thay đổi độ pH (5,7; 6,5; 7,0 và 8,0) lên độ ổn định của bromelain trong dung dịch đệm natri photphat (0,01 M, 25 ± 3 ℃) Kết quả cho thấy hoạt tính của bromelain ở pH 7,0 là cao nhất và thấp nhất tại pH 5,7.
Các phương pháp định lượng bromelain
Trong các công bố trước đây, hai phương pháp chính được sử dụng để định lượng bromelain là định lượng trực tiếp nồng độ bromelain bằng HPLC và định lượng bromelain bằng phương pháp xác định hoạt tính enzym; phương pháp HPLC cho phép đo chính xác nồng độ bromelain và đặc trưng hóa hàm lượng enzyme, trong khi đánh giá hoạt tính enzym cho thấy khả năng sinh học và hiệu quả của bromelain trong các ứng dụng y sinh; tùy mục đích phân tích mà người nghiên cứu có thể chọn một trong hai phương pháp hoặc kết hợp cả hai để có thông tin toàn diện về nồng độ và hoạt tính của bromelain.
Định lượng bromelain bằng HPLC chủ yếu dùng sắc ký pha đảo với cột ODS C18, sử dụng dung môi pha mẫu là methanol, thể tích tiêm 20 µL và tốc độ dòng 1 mL/phút Tuy nhiên, có sự khác biệt về thành phần pha động giữa các nghiên cứu Tác giả Novo Yantih và các cộng sự đã dùng pha động là methanol và nước ở tỷ lệ 70:30, khi đó thời gian lưu của bromelain khoảng 2 phút.
Trong nghiên cứu của Swapna Goday và cộng sự, họ đã sử dụng pha động gồm acid ortho phosphoric (OPA) và acetonitril ở tỷ lệ 50:50, cho thời gian lưu của bromelain khoảng 2,4 phút [16].
Thông thường, kỹ thuật HPLC có thể xác định chính xác nồng độ của các chất trong mẫu phân tích Tuy nhiên, bromelain là một hỗn hợp các enzym được chiết từ dịch chiết nước dứa, có cấu trúc không ổn định và khối lượng phân tử khác nhau giữa các thành phần, khiến việc định lượng bromelain bằng HPLC gặp nhiều thách thức.
Vì vậy, việc định lượng bromelain bằng HPLC chưa chắc đã phản ánh chính xác hoạt lực của enzym
• Định lượng bromelain bằng phương pháp xác định hoạt tính enzym
Vì bromelain có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều chất nền như casein và gelatin để tạo thành các axit amin, hoạt tính của bromelain có thể được xác định gián tiếp thông qua các sản phẩm thủy phân được hình thành Trên nguyên lý này, một số phương pháp đo hoạt tính bromelain đã được các tác giả đề xuất và được trình bày trong Bảng 1.1 để đánh giá hoạt tính enzyme này.
Bảng 1.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzym
Hoạt tính bromelain được xác định dựa trên nguyên lý thủy phân cơ chất gelatin thành amino acid Quá trình thủy phân này sinh ra các amino acid và cho phép đánh giá mức độ phân giải của enzyme Việc định lượng amino acid được thực hiện bằng phương pháp chuẩn độ với dung dịch NaOH, từ đó xác định hoạt tính bromelain một cách chính xác.
Hoạt tính của bromelain được xác định dựa trên nguyên tắc thủy phân casein làm cơ chất và tạo ra các axit amin làm sản phẩm cuối cùng Việc định lượng các axit amin tạo thành bằng phương pháp quang phổ cho phép đánh giá chính xác hoạt tính của bromelain, phục vụ cho các ứng dụng nghiên cứu và công nghiệp.
[7] Tên phương pháp: Xác định hoạt tính bromelain bằng phương pháp
Hoạt tính của bromelain được xác định dựa trên nguyên lý thủy phân protein casein thành các axit amin Sản phẩm thủy phân được định lượng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin và đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu thu được.
Bromelain là một hỗn hợp các enzym có cấu trúc không cố định, nên định lượng trực tiếp nồng độ bromelain bằng các phương pháp hóa lý như HPLC có thể không còn chính xác Do đó, khóa luận chọn định lượng bromelain gián tiếp bằng cách xác định hoạt tính enzym Mặc dù độ ổn định của phương pháp này thấp hơn so với HPLC, nó có ưu điểm là phản ánh chính xác hoạt tính của enzym, từ đó cho kết quả định lượng phù hợp với bản chất thực tế của bromelain.
Qua tổng hợp từ các tài liệu tham khảo, phần lớn các tác giả sử dụng phản ứng thủy phân casein để xác định hoạt tính của bromelain Với điều kiện của phòng thí nghiệm, nguyên lý này cũng được áp dụng để định lượng bromelain trong viên nén dựa trên các tài liệu tham khảo [5, 6, 18] Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát lại các điều kiện thí nghiệm nhằm tối ưu hóa độ chính xác và độ tin cậy của phép đo hoạt tính bromelain.
- Khảo sát bước sóng đo
- Thời gian tối ưu xảy ra phản ứng
- Khoảng tuyến tính của phương pháp
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất
- Chuẩn nguyên liệu bromelain: số lô 20022, hàm lượng 5,02 đơn vị FIP/mg, nhà sản xuất Biozym – Đức
Viên nén bromelain bao tan trong ruột do Viện công nghệ dược phẩm cung cấp và viên nén bao tan trong ruột Bromanase đang được Mediplantex tiến hành nghiên cứu.
- Casein: nhà sản xuất Shanghai Zhanyun Chemical Co., Ltd
- Acid tricloacetic: nhà sản xuất Xilong Scientific Co., Ltd
- Natri acetat.3H2O: nhà sản xuất Xilong Scientific Co., Ltd
- Acid acetic: nhà sản xuất Xilong Scientific Co., Ltd
- Kali dihydro phosphat: nhà sản xuất Xilong Scientific Co., Ltd
- Natri hydroxyd: nhà sản xuất Xilong Scientific Co., Ltd
- L-cystein: nhà sản xuất Kyowa Hakko Bio Co, Ltd
- Natri edetat: nhà sản xuất Shanghai Zhanyun Chemical Co., Ltd
+ Bể điều nhiệt Memmert: 35℃ ± 0,5℃, Đức
+ Máy khuấy từ gia nhiệt 1 vị trí Daihan Scientific MSH-20A, Hàn Quốc
+ Máy đo pH Eutech, Singapore
+ Máy siêu âm RK 106 Bandelin, Đức
+ Tủ lạnh bảo quản mẫu Haier HYC-390, Trung Quốc
+ Tủ sấy Memmert ULM 500, Đức
+ Cân phân tích AY 220 Shimadzu, Nhật Bản
+ Cân kỹ thuật điện tử 0,01 Sartorius, TE412, Đức
+ Máy lắc xoáy IKA HS-260 Basic, Đức
+ Máy quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến U-5100 Hitachi kết nối với máy tính, Nhật Bản
+ Máy ly tâm để bàn EBA20 Hettich, Đức
+ Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh
- Dụng cụ: Bình định mức, pipet chính xác, pipet 5ml, ống nghiệm có nắp, ống nghiệm thường, giấy lọc và một số dụng cụ thủy tinh khác.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích
Khảo sát và xây dựng phương pháp định lượng bromelain trong viên nén bằng máy đo quang phổ UV-Vis nhằm xác định các điều kiện đo tối ưu như bước sóng quang phổ phù hợp, thời gian tối ưu cho phản ứng và phạm vi tuyến tính của phương pháp để đảm bảo độ nhạy và độ chính xác cho kết quả định lượng.
2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Đánh giá phương pháp phân tích được thực hiện theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc – Phụ lục 8, các phương pháp thẩm định – Phần: Thẩm định quy trình định lượng một số chế phẩm thuốc enzym, và theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học của FDA, căn cứ vào các tiêu chí được liệt kê nhằm bảo đảm tính hợp lệ, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp, đồng thời đáp ứng các yêu cầu về tuyến tính, phạm vi làm việc, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ lặp lại và độ tái lập, cũng như khả năng khử nhiễu nền để có được phương pháp phân tích đáng tin cậy cho các enzym trong thuốc.
- Độ tuyến tính – Khoảng xác định
- Độ chính xác bao gồm:
+ Độ chính xác trung gian gồm độ chính xác khác ngày và khác kiểm nghiệm viên
2.2.3 Ứng dụng Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để xác định hàm lượng bromelain trong viên nén bao phim tan trong ruột do Viện công nghệ dược phẩm cung cấp và xác định hàm lượng bromelain trong viên nén bao tan trong ruột Bromanase đang trong quá trình nghiên cứu của công ty Mediplantex.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nguyên tắc và định nghĩa đơn vị FIP
Bromelain thủy phân casein làm chất nền thành các axit amin Phản ứng được dừng bằng cách thêm dung dịch kết tủa protein và lọc bỏ phần casein dư Lượng axit amin trong dung dịch được xác định bằng đo độ hấp thụ ở bước sóng 275 nm.
Hoạt tính của bromelain được xác định bằng cách so sánh hiệu suất thủy phân của chế phẩm với hiệu suất thủy phân của chất chuẩn bromelain FIP dưới cùng điều kiện
• Định nghĩa đơn vị FIP
Một đơn vị FIP của bromelain là một lượng enzym thủy phân casein ở điều kiện tiờu chuẩn thành cỏc peptid mà khụng bị kết tủa bởi acid sao cho giải phúng 1 àg tyrosin trong 1 phút
2.3.2 Pha hóa chất, thuốc thử
- Dung dịch kết lắng: hoà tan 9 g acid tricloactetic; 24,8 g natri acetat trihydrat và 19,5 ml acid acetic trong nước cất vừa đủ 500 ml
Dung dịch đệm phosphat pH 7,15 ở 25℃ (tương ứng với pH 7,0 ở 35℃) được chuẩn bị bằng cách hòa tan 13,61 g kali dihydro phosphat và 2,69 g natri hydroxyd trong 600 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 7,15 bằng NaOH 0,1 M và bổ sung nước cất vừa đủ để tổng thể tích đạt 1000 ml.
Dung dịch hoạt hoá enzym được chuẩn bị bằng cách hòa tan 60,5 mg L-cystein và 34 mg natri edetat trong dung dịch đệm phosphat có pH 7,15; điều chỉnh tới pH 7,15 nếu cần, sau đó thêm đệm phosphat pH 7,15 vừa đủ để đạt thể tích 100 ml Dung dịch dùng trong ngày.
Dung dịch hoạt hóa cơ chất được chuẩn bị bằng cách hòa tan 242 mg L-cystein và 87 mg natri edetat trong dung dịch đệm phosphat có pH 7,15; điều chỉnh đến pH 7,15 nếu cần Sau đó thêm đúng 25 ml đệm phosphat có pH 7,15 để đạt thể tích mong muốn Dung dịch này được sử dụng trong ngày.
Dung dịch cơ chất được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,25 g casein vào 10 ml nước cất, khuấy đều và thêm 50 ml đệm phosphat pH 7,15 Khuấy kỹ bằng máy khuấy từ trong 30 phút ở 35–40°C cho đến khi casein tan hoàn toàn Cuối cùng, thêm 10 ml dung dịch hoạt hoá cơ chất và khuấy đều.
Trong 60 phút, điều chỉnh pH đến 7,15 ở 25℃ (nếu cần) Thêm dung dịch đệm phosphat vừa đủ 100 ml Dung dịch dùng trong ngày và được ổn định ở nhiệt độ 35℃ trước khi tiến hành phản ứng.
2.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử
• Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Để tạo dung dịch chuẩn làm việc cho phân tích, cân một lượng bromelain và hòa tan vào bình định mức với dung dịch đệm phosphate, sau đó dùng siêu âm để tăng độ hòa tan và đồng nhất Tiếp tục bổ sung dung dịch đệm cho đầy mức quy định, khuấy đều cho dung dịch hoàn toàn hòa tan Lọc dung dịch qua giấy lọc và bỏ phần lọc đầu trước khi chuyển dung dịch vào bình định mức để hoàn tất công đoạn chuẩn bị Quá trình này giúp tạo dung dịch chuẩn có độ chuẩn xác và ổn định, phục vụ cho các phân tích định lượng bromelain với độ nhạy và tin cậy cao.
100 ml, thêm dung dịch hoạt hoá enzym vừa đủ, lắc đều
Quy trình chuẩn hóa dung dịch bắt đầu bằng việc pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với dung dịch hoạt hóa enzym để tạo ra các dung dịch chuẩn ở nồng độ cần thiết Dung dịch được trộn đều và ổn định ở nhiệt độ 35℃ để đảm bảo độ ổn định và độ nhạy của kết quả phân tích.
• Chuẩn bị dung dịch thử:
Quy trình chuẩn bị dung dịch bromelain được mô tả ở mức độ tổng quan: xử lý và nghiền nhỏ viên thành bột mịn, cân đo để đạt nồng độ enzyme mong muốn và hòa tan vào dung dịch đệm phosphat trong bình định mức; tiếp theo là quá trình tăng cường hòa tan và điều chỉnh thể tích bằng dung dịch đệm, sau đó lọc để loại bỏ tạp chất và bỏ phần dịch lọc đầu, thu được dung dịch bromelain tinh khiết, sẵn sàng cho các ứng dụng phân tích hoặc nghiên cứu.
- Hút chính xác 1ml dịch lọc vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch hoạt hóa enzym vừa đủ Lắc đều, rồi để ổn định nhiệt ở 35℃
2.3.4 Tiến hành Ổn định tất cả các dung dịch ở nhiệt độ 35℃ trong 15 phút ở bể điều nhiệt
Chuyển vào các ống nghiệm lần lượt theo thứ tự:
Bảng 2.1 Cách tiến hành phản ứng Ống định lượng (chuẩn, thử) Ống đối chứng
Dung dịch cơ chất - 5,0 ml
Dung dịch kết lắng - 10,0 ml
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây, để yên 10 phút (xác định bằng đồng hồ bấm giây) ở 35℃
(dung dịch chuẩn hoặc dung dịch thử)
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây
Dung dịch cơ chất 5,0 ml
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây, để yên 10 phút (xác định bằng đồng hồ bấm giây) ở 35℃
Dung dịch kết lắng 10,0 ml
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây
Tiếp tục để hỗn hợp phản ứng ở 35℃ trong 30 phút, sau đó gạn lấy dịch và ly tâm với 6000 vòng/phút trong 20 phút Lấy dịch đã ly tâm đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 275 nm bằng cốc đo có đường đi ánh sáng 1 cm, mẫu trắng là nước cất.
Chúng tôi dự định sử dụng đệm phốt phát để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Dựa trên các tham khảo tài liệu, chúng tôi xác định được pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân cơ chất ở 35°C và pH 7,0 [14] Do đó, trong khuôn khổ khảo sát, các điều kiện này sẽ được áp dụng nhằm tối ưu hiệu suất thủy phân.
17 sát chúng tôi khảo sát bước sóng đo, thời gian tối ưu xảy ra phản ứng, khoảng tuyến tính của phương pháp như sau:
- Bước sóng đo: Quét phổ và xác định phổ của các dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Thời gian tối ưu cho phản ứng được xác định khi tiến hành với dung dịch chuẩn có nồng độ cần thiết và đối chứng chuẩn Thay vì đổ dung dịch kết lắng ở phút thứ 10 như phương pháp thông thường, quá trình kết thúc phản ứng được thực hiện bằng cách bổ sung lần lượt dung dịch kết lắng ở các thời điểm 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 và 14 phút để đảm bảo phản ứng được hoàn tất.
Khoảng tuyến tính của phương pháp được xác định bằng cách chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,65 ppm, 1,30 ppm, 2,08 ppm, 3,12 ppm, 3,38 ppm, 3,90 ppm, 4,55 ppm và 5,20 ppm Tiến hành đo lường các dung dịch này và xác định được khoảng tuyến tính của bromelain trong phương pháp phân tích.
2.3.6 Thẩm định phương pháp phân tích
Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm được xử lí bằng thống kê trên phần mềm Microsoft Office
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát
Phổ vi sai của dung dịch chuẩn và dung dịch thử được xác định bằng phương pháp trừ phổ định lượng cho phổ đối chứng tương ứng, và kết quả được thể hiện ở hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1 Phổ vi sai của dung dịch chuẩn
Hình 3.2 Phổ vi sai của dung dịch thử
Trên kết quả, cho thấy cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều cho pic trong khoảng 275 nm ± 1 nm Như vậy, lựa chọn λ = 275 nm làm bước sóng đo
3.1.2 Khảo sát thời gian tối ưu xảy ra phản ứng
Quy trình được tiến hành trên dung dịch chuẩn ở nồng độ cần thiết và có đối chứng chuẩn Kết quả thu được cho thấy thời gian phản ứng dao động từ 7 phút đến 14 phút, được trình bày chi tiết trong bảng 3.1 và hình 3.3.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát động học
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hiệu mật độ quang và thời gian đo
Hiệu số mật độ quang ΔA giữa dung dịch định lượng và đối chứng tăng dần cho tới 10 phút (từ 7 đến 10 phút) Từ 10 đến 11 phút ΔA giữa hai dung dịch trở nên tương đương, và sau 11 phút hiệu ΔA giảm nhẹ rồi ổn định đến hết thời gian khảo sát Để giảm sai số của phép thử, thời gian phản ứng tối ưu được xác định là 10 phút, tức là đổ kết lắng sau 10 phút để kết thúc phản ứng.
3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính
Đã tiến hành phân tích dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,65 ppm đến 5,2 ppm theo mục 2.3.4 Kết quả khảo sát mối quan hệ giữa nồng độ bromelain và hiệu đáp ứng ∆A được thể hiện trong bảng 3.2 và thể hiện trên hình 3.4, cho phép đánh giá phạm vi và độ nhạy của phương pháp.
Nhìn vào đồ thị trên, khi nồng độ bromelain lớn hơn 4 ppm thì đã xảy ra hiện tượng bão hòa cơ chất, tức là casein đã bị thủy phân hết thành các amino acid nên dù có tăng nồng độ bromelain xúc tác lên nữa thì lượng amino acid tạo ra vẫn không đổi Ngược lại, khi nồng độ bromelain dưới 4 ppm, mối tương quan giữa hiệu đáp ứng ∆A và nồng độ bromelain được coi là tuyến tính.
Do đó, trong khóa luận lựa chọn nồng độ bromelain đem đi phân tích là 2,6 ppm.
Phương pháp định lượng bromelain trong viên nén
Sau quá trình khảo sát, chúng tôi đã xây dựng được phương pháp định lượng bromelain trong viên nén với quy trình như sau:
• Chuẩn bị hóa chất, thuốc thử
- Dung dịch kết lắng: hoà tan 9 g acid tricloactetic; 24,8 g natri acetat trihydrat và 19,5 ml acid acetic trong nước cất vừa đủ 500 ml
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,15 (tương ứng với pH 7,0 ở 35℃): nồng độ KH2PO4
- Dung dịch hoạt hoá enzym: 0,005 M L-cystein và 0,001 M NaEDTA trong đệm phosphat Dung dịch dùng trong ngày
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Điểm
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hiệu mật độ quang và nồng độ của bromelain
- Dung dịch hoạt hoá cơ chất: 0,08 M L-cystein và 0,01 M NaEDTA trong đệm phosphat Dung dịch dùng trong ngày
Dung dịch cơ chất được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,25 g casein với 10 ml nước và 10 ml hoạt hóa cơ chất, sau đó thêm đệm để đạt tổng thể tích 100 ml; dung dịch được dùng trong ngày và ổn định ở nhiệt độ 35°C trước khi tiến hành phản ứng.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn (khoảng 2,6 ppm) bằng cách cân chính xác khoảng 13 mg bromelain chuẩn vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 80 ml dung dịch đệm phosphat, lắc siêu âm 10 phút, sau đó thêm dung dịch đệm phosphat vừa đủ và lắc đều; lọc qua giấy lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu, rồi hút chính xác 1 ml dịch lọc vào bình định mức.
50 ml, thêm dung dịch hoạt hoá enzym vừa đủ Lắc đều, rồi để ổn định nhiệt ở 35℃
Chuẩn bị dung dịch thử bằng cách bóc vỏ 10 viên, tính khối lượng trung bình từng viên và nghiền thành bột mịn; cân chính xác lượng bột tương ứng với khoảng 13 mg bromelain cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 80 ml dung dịch đệm phosphat, lắc siêu âm 10 phút rồi thêm dung dịch đệm phosphat vừa đủ và lắc đều; lọc qua giấy lọc và bỏ 20 ml dịch lọc đầu, sau đó hút chính xác 1 ml dịch lọc vào bình định mức để hoàn tất pha dung dịch thử.
50 ml, thêm dung dịch hoạt hóa enzym vừa đủ Lắc đều, rồi để ổn định nhiệt ở 35℃
Tiến hành ổn định tất cả các dung dịch ở nhiệt độ 35°C trong 15 phút tại bể điều nhiệt Sau đó, chuyển các dung dịch lần lượt vào các ống nghiệm theo thứ tự: ống định lượng (chuẩn, thử) và ống đối chứng.
Dung dịch cơ chất - 5,0 ml
Dung dịch kết lắng - 10,0 ml
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây, để yên 10 phút (xác định bằng đồng hồ bấm giây) ở 35℃
(dung dịch chuẩn hoặc dung dịch thử)
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây
Dung dịch cơ chất 5,0 ml -
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây, để yên 10 phút (xác định bằng đồng hồ bấm giây) ở 35℃
Dung dịch kết lắng 10,0 ml
Lắc đều bằng vortex trong 5 giây
Tiếp tục để yên hỗn hợp phản ứng ở 35°C trong 30 phút, sau đó gạn lấy dịch và ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 20 phút Dịch gạn được đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 275 nm bằng cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là nước cất.
Hàm lượng bromelain trong chế phẩm so với ghi trên nhãn được tính theo công thức sau:
% Hàm lượng = m tb m chuẩn ΔA t HL c f t
Trong đó: m tb : khối lượng trung bình của viên nén (g) mchuẩn: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg)
HLc: hoạt lực của chuẩn bromelain (FIP/mg)
∆At: Hiệu mật độ quang của ống thử và ống đối chứng thử
∆Ac: Hiệu mật độ quang của mẫu chuẩn và ống đối chứng chuẩn f c , f t : hệ số pha loãng của chuẩn và thử
Thẩm định phương pháp định lượng bromelain trong viên nén
Để bảo đảm tính nhất quán và tin cậy của dữ liệu, chúng tôi tiến hành phân tích đồng thời các mẫu placebo và đối chứng placebo, mẫu tự tạo và đối chứng của mẫu tự tạo, cũng như mẫu thử và đối chứng thử theo quy trình đã xác định Kết quả đo quang của các mẫu được tổng hợp và trình bày chi tiết tại bảng 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả độ đặc hiệu
Mẫu Hiệu đáp ứng Trung bình
Nhận xét từ bảng kết quả cho thấy mẫu placebo có đáp ứng ∆A là 0,0017 Để làm sáng tỏ xem sự khác biệt giữa ống placebo và ống đối chứng placebo do thành phần hấp thụ tại bước sóng 275 nm hay do sai số trong quá trình tiến hành, đề tài đã tiến hành làm thêm 3 mẫu nước cất và đối chứng của chúng Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.4. -**Support Pollinations.AI:** -🌸 **Ad** 🌸Powered by Pollinations.AI free text APIs [Support our mission](https://pollinations.ai/redirect/kofi) to keep AI accessible for everyone.
Bảng 3.4 Kết quả mẫu nước
Mẫu Hiệu đáp ứng TB
Theo bảng 3.4, mẫu nước cho thấy hiệu đáp ứng ∆A tương tự mẫu placebo Hiệu đáp ứng của cả mẫu placebo và mẫu nước đều nhỏ hơn 2% so với mẫu thử và mẫu placebo + chuẩn, cho thấy sự khác biệt giữa các nhóm là không đáng kể.
Hơn nữa, phổ vi sai của các dung dịch placebo và dung dịch placebo cộng chuẩn được xác định bằng phương pháp trừ phổ định lượng so với phổ đối chứng tương ứng, và kết quả được trình bày ở các hình 3.5, 3.6 và 3.7.
Hình 3.5 Phổ vi sai của dung dịch placebo
Hình 3.6 Phổ vi sai của dung dịch placebo + chuẩn
Hình 3.7 Phổ vi sai của dung dịch thử
Kết quả trên cho thấy cả placebo + chuẩn và mẫu thử đều cho pic trong khoảng
275 nm ± 1 nm, còn mẫu placebo không cho pic trong khoảng 275 ± 1nm
Nhận xét: Từ những kết quả trên chứng tỏ thành phần tá dược trong viên nén không ảnh hưởng đến kết quả đo.
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đặc hiệu theo yêu cầu của sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc
Kết quả đo các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1,30 ppm đến 3,90 ppm được đưa ra trong bảng 3.5 và hình 3.8
Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ tuyến tính Điểm Nồng độ bromelain (ppm)
Lần 1 Lần 2 Trung bình hiệu đáp ứng Hiệu đáp ứng Hiệu đáp ứng
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính hiệu đáp ứng và nồng độ của bromelain
Nhận xét cho thấy trong khoảng nồng độ được khảo sát, nồng độ bromelain trong dung dịch có mối quan hệ tuyến tính với hiệu số mật độ quang so với đối chứng tương ứng Hệ số tương quan R đạt trên 0,98 cho thấy mối liên hệ rất mạnh giữa hai tham số này Kết quả này cho phép xem mật độ quang là một chỉ báo định lượng nồng độ bromelain đáng tin cậy trong dung dịch ở phạm vi nồng độ đã khảo sát.
Kết luận: Độ tuyến tính của bromelain đạt theo yêu cầu của sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc trong khoảng nồng độ khảo sát
Chuẩn bị các mẫu placebo thêm chuẩn như mục 2.3.6.3 Mỗi mẫu tiến hành làm
3 lần Kết quả độ đúng hay tỷ lệ thu hồi của bromelain được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Tỷ lệ thu hồi của bromelain
Mẫu STT Hiệu đáp ứng ∆A
Lượng chuẩn thêm vào (mg)
Lượng chuẩn tìm thấy (mg)
Nhận xét: Tỷ lệ thu hồi bromelain trong các mẫu LQC, MQC và HQC đều từ
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng theo yêu cầu của sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc
3.3.4 Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian)
Tiến hành định lượng trên 6 mẫu thử độc như mục 2.3.4 Kết quả đo quang được thể hiện ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại
Khối lượng trung bình viên (g)
Lượng cân mẫu thử (g) Hiệu đáp ứng % Hàm lượng hoạt chất so với nhãn
Nhận xét: Độ lặp lại của phương pháp thỏa mãn yêu cầu RSD ≤ 10,0 %
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ lặp lại theo yêu cầu của sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc
3.3.4.2 Độ chính xác trung gian
• Độ chính xác khác ngày
Chúng tôi chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập và làm theo quy trình đã được xây dựng để bảo đảm tính nhất quán của quá trình đo; hàm lượng bromelain trong viên nén được định lượng tại ba ngày khác nhau nhằm đánh giá sự biến động theo thời gian; kết quả định lượng được trình bày trong bảng 3.8, cung cấp dữ liệu định lượng và phân tích liên quan đến hàm lượng bromelain trong viên nén.
Bảng 3.8 Kết quả độ chính xác khác ngày
Khối lượng trung bình viên (g)
% Hàm lượng hoạt chất so với nhãn
Nhận xét: Kết quả cho thấy sự lặp lại giữa các ngày khác nhau và độ đồng nhất cao giữa các lần đo RSD của mỗi ngày và RSD của 3 ngày đều nhỏ hơn 10%, cho thấy biến động giữa các ngày là rất thấp Trung bình hàm lượng hoạt chất được duy trì ở mức ổn định so với chuẩn, mang lại kết quả đáng tin cậy và phù hợp với yêu cầu kiểm tra chất lượng.
32 hàm lượng ghi trên nhãn của mỗi ngày và của 3 ngày đều nằm trong khoảng từ 127,4% đến 132,6 % (± 2% của 130%)
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ chính xác khác ngày theo sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc
• Độ chính xác khác kiểm nghiệm viên
Mỗi kiểm nghiệm viên chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập và tiến hành làm theo quy trình đã được xây dựng Kết quả được thể hiện trong bảng 3.9
Bảng 3.9 Kết quả độ chính xác khác người
Khối lượng trung bình viên (g)
% Hàm lượng hoạt chất so với nhãn
Nhận xét cho thấy kết quả có sự lặp lại giữa hai kiểm nghiệm viên RSD của mỗi kiểm nghiệm viên và RSD của cả hai kiểm nghiệm viên đều nhỏ hơn 10%, cho thấy độ lặp lại và độ tin cậy của phép đo ở mức cao.
33 bình % hàm lượng hoạt chất so với ghi trên nhãn của mỗi kiểm nghiệm viên và của 2 kiểm nghiệm viên đều nằm trong khoảng từ 127,4 % đến 132,6 % (± 2 % của 130 %)
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ chính xác khác người theo sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc
Kết luận chung: Phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác của sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc
Phương pháp xây dựng đã đáp ứng đầy đủ các yêu cầu của sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc về độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác Điều này thể hiện mức độ tin cậy cao của phương pháp trong quy trình đánh giá chất lượng thuốc Độ đặc hiệu cho phép phân biệt hoạt chất chính với các thành phần khác, độ tuyến tính đảm bảo sự tương quan tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ trong phạm vi áp dụng, trong khi độ đúng và độ chính xác cho thấy kết quả đo gần đúng với giá trị thật và có tính lặp lại cao Nhờ vậy, phương pháp phù hợp để sử dụng trong quy trình đăng ký thuốc và kiểm tra chất lượng sản phẩm.
Ứng dụng thực tế
Kết quả định lượng bromelain trong viên nén bao tan trong ruột Bromanase được thực hiện trong thời gian nghiên cứu của Công ty Cổ phần Dược TW Mediplantex, và viên nén bao tan trong ruột được phát triển tại Viện Công nghệ Dược phẩm Các kết quả này được trình bày trong bảng 3.10 của báo cáo nghiên cứu.
Bảng 3.10 Kết quả định lượng bromelain trong viên nén bao tan trong ruột
Khối lượng trung bình viên (g)
% Hàm lượng bromelain so với nhãn
Viên nén bromelain của Viện công nghệ dược phẩm, CT2 ngày
Bàn luận
3.5.1 Về lựa chọn phương pháp phân tích
Theo các tài liệu đã trình bày ở phần 1.3, có hai phương pháp chính để định lượng bromelain: định lượng trực tiếp bằng HPLC và định lượng dựa trên xác định hoạt tính enzym Tuy nhiên, phương pháp HPLC không phù hợp với bromelain vì đây là một hỗn hợp các enzym có phân tử lượng không cố định; enzym là protein và rất dễ bị biến động cấu trúc, chỉ cần một thay đổi nhỏ về bố trí cấu trúc không gian cũng có thể làm mất hoạt tính Do đó, HPLC và các phương pháp hóa lý thông thường không thể đánh giá chính xác hoạt tính của enzym trong mẫu, đây là nhược điểm của HPLC nói riêng và các phương pháp hóa lý nói chung Vì lý do này, đề tài quyết định định lượng bromelain trong viên nén bằng phương pháp xác định hoạt tính enzym, mặc dù độ ổn định của phương pháp này kém hơn do nhiều yếu tố ảnh hưởng trong quá trình phân tích Phương pháp xác định hoạt tính enzym được chia làm 3 nhóm phương pháp sau [4].
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzym xác định
- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzym nhất định
- Chọn nồng độ enzym như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, bài viết tập trung vào lựa chọn và tối ưu hóa phương pháp đo lượng sản phẩm hình thành theo thời gian, ứng với một nồng độ enzyme đã cho Đối tượng nghiên cứu là dung dịch chứa bromelain và cơ chất là casein, cho phép đánh giá quá trình thủy phân protein bởi enzyme này Phương pháp đo được lựa chọn phải đảm bảo độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng tái lặp, phù hợp với chuẩn phân tích để xác định lượng sản phẩm sinh ra theo thời gian và nồng độ bromelain Nghiên cứu cũng xem xét các yếu tố như thời gian phản ứng, nồng độ bromelain và mức độ phá vỡ liên kết của casein, nhằm xây dựng đường cong chuẩn và hiểu động học của quá trình thủy phân.
Trong thực tế, khóa luận tiến hành phương pháp định lượng dựa trên tiêu chuẩn cơ sở của Biozym [18] Tuy nhiên đề tài sử dụng đệm phosphate pH 7,15 ở 25℃ làm dung môi pha mẫu thay cho đệm tris pH 7,15 ở 25℃ Với các phương pháp hóa lý thông thường, đệm đóng vai trò cố định pH ở một giá trị nhất định Đối với enzyme, khi sử dụng các hệ đệm khác nhau thì độ tan và khả năng phản ứng của enzyme có thể bị ảnh hưởng.
Hoạt động của bromelain có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi cấu trúc không gian, làm giảm hoặc mất hoạt tính enzym Sử dụng đệm phosphat có thể không phân tán được toàn bộ lượng casein như trong tài liệu [18], vì vậy đề tài đã giảm một nửa lượng casein để phù hợp Khi xác định hoạt tính của bromelain, cần dùng một lượng cơ chất ở mức dư thừa vừa đủ để bão hòa enzym, tránh để lượng substrate quá nhiều gây ức chế hoạt động Do đó, cần khảo sát lại nồng độ bromelain thực tế để tối ưu hóa quá trình thủy phân casein.
3.5.2 Về xây dựng phương pháp
Trong các tài liệu tham khảo [5-7, 18], các tác giả đều định lượng bromelain dựa trên nguyên tắc thủy phân casein và định lượng sản phẩm tạo thành, nhưng lại sử dụng các đệm với các giá trị pH khác nhau.
Nhóm tác giả Ali J R AL-Sa'ady và các cộng sự [14] cho thấy bromelain đạt hoạt tính tối ưu khi được sử dụng với đệm phosphate ở pH 7,0, được thể hiện rõ qua hình 3.9 và hình 3.10.
Hình 3.9 Hoạt tính của bromelain trong các đệm Đệm
Hình 3.10 Hoạt tính của bromelain trong đệm phosphat tại các pH khác nhau
Do đó, đề tài quyết định lựa chọn đệm phosphat pH = 7,0 vì đây là một hệ đệm phổ biến và rẻ tiền hơn so với đệm tris như trong tài liệu [18]
Cũng trong nghiên cứu tác giả Ali J R AL-Sa'ady và cộng sự (hình 3.11) đã cho thấy nồng độ phù hợp nhất của dung dịch đệm phosphat sử dụng là 0,1 M [14]
Hình 3.11 Hoạt tính bromelain trong đệm phosphat ở những nồng độ khác nhau
Việc sử dụng đệm phosphat pH 7,0 ở 35°C với nồng độ 0,1 M làm dung môi pha mẫu cho khóa luận là hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ali J R AL-Sa'ady và các cộng sự.
• Lựa chọn bước sóng đo
Về lý thuyết, bromelain có thể xúc tác phản ứng thủy phân casein để tạo ra tyrosin Tuy nhiên trên thực tế, quá trình thủy phân casein có thể không hoàn toàn và tạo ra các axit amin khác cùng với tyrosin, điều này có thể ảnh hưởng đến phổ hấp thụ của tyrosin Dù có sự biến động này, phổ hấp thụ của sản phẩm vẫn có đỉnh tại bước sóng λ = 275 ± 1 nm, đây là cực đại hấp thụ của tyrosin.
3.5.3 Về thẩm định phương pháp
Phương pháp xác định hoạt tính enzym có sự khác biệt rõ rệt so với các phương pháp hóa lý, do đó quy trình thẩm định với chế phẩm enzym đòi hỏi tiêu chí riêng Việc thẩm định phương pháp với chế phẩm enzym cần xác định những yêu cầu đặc thù về độ nhạy, độ đặc hiệu và tính lặp lại của kết quả, khác với phần chung áp dụng cho các mẫu chất khác Điều này bảo đảm kết quả đo đúng với đặc tính của từng chế phẩm, tối ưu hóa điều kiện thử nghiệm và đáp ứng các chuẩn mực chất lượng liên quan đến quản lý và đánh giá hoạt tính enzym.
Trong quy trình thẩm định phương pháp phân tích dành cho đối tượng là enzym, các hướng dẫn của AOAC, ICH, ASEAN và FDA không có phần riêng nói về thẩm định cho enzym nên việc xác định giới hạn của các thông số như độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chính xác khi phân tích enzym gặp khó khăn; bromelain là một protein có tính bất ổn cao, chỉ cần thay đổi nhỏ về cấu trúc không gian đã có thể làm giảm hoặc mất hoạt tính, và các điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ, độ ẩm, ion kim loại ảnh hưởng đáng kể đến khả năng thủy phân casein của bromelain; ngoài các yếu tố môi trường, loại cơ chất, thao tác và kỹ năng của kiểm nghiệm viên cũng là những nguyên nhân gây biến động kết quả; do đó khi làm việc với enzym, công tác chuẩn bị mẫu thẩm định yêu cầu kiểm nghiệm viên có tay nghề cao và phòng thí nghiệm phải kiểm soát tốt các yếu tố môi trường; vì thế các tiêu chí thẩm định như độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác cho enzym được nới rộng và thường ở mức thấp hơn rất nhiều so với chuẩn thẩm định chung của AOAC, ICH hoặc ASEAN.
Thông số cần thẩm định
AOAC/ICH/ASEAN Với chế phẩm chứa enzym Độ đặc hiệu Kết quả định lượng không bị ảnh hưởng bởi các tá dược khác
Khoảng tuyến tính 0,995 ≤ R 2 ≤ 1 R ≥ 0,98 Độ đúng Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 97,0-103,0% Độ đúng của phương pháp nằm trong khoảng 90,0–110,0% và giá trị RSD ≤ 10,0% Độ chính xác RSD ≤ 2,7% RSD ≤ 10,0%
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã đạt được các mục tiêu sau:
Chúng tôi đã xây dựng và thẩm định một phương pháp định lượng bromelain trong viên nén bằng phương pháp xác định hoạt tính enzym (phụ lục 1) Phương pháp này có độ đặc hiệu cao và đường chuẩn được thiết lập từ 1,3 ppm đến 3,9 ppm với hệ số xác định R² = 0,976 Độ đúng của phương pháp đạt yêu cầu với tỷ lệ thu hồi từ 90% đến 110% và RSD ≤ 10%, đồng thời độ chính xác cũng đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng.
≤ 10% và trung bình % hàm lượng bromelain so với hàm lượng thực tế từ 98,0–102,0
% tức là 127,4 – 132,6 % so với hàm lượng ghi trên nhãn)
Đã áp dụng phương pháp định lượng nồng độ bromelain trong viên nén bao tan trong ruột do Viện Công nghệ Dược phẩm sản xuất với lô CT2 ngày 15/12/2021 và viên nén bao tan trong ruột Bromanase đang trong giai đoạn nghiên cứu của Mediplantex với hai lô 233821 và 215822 Kết quả định lượng bromelain so với hàm lượng ghi trên nhãn lần lượt là 130,4%, 133,2% và 142,2%.
4.2 Đề xuất Áp dụng phương pháp định lượng đã được thẩm định để định lượng viên nén chứa bromelain trên thị trường Đề xuất khảo sát thêm và đưa vào dược điển Việt Nam để định lượng bromelain trong các chế phẩm từ dứa
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1 Bộ Y Tế (2018), Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, Phụ lục 8
2 Drugbank (2022), Pedonase, truy cập ngày 06-04-2022, tại trang web https://drugbank.vn/thuoc/Pedonase&VD-18019-12
3 Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzym, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh
4 Nguyễn Văn Rư và Nguyễn Xuân Thắng (2014), Hóa sinh học, Trường đại học