LƯU VIỆT HOÀNG NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG bảo vệ GAN TRÊN mô HÌNH gây VIÊM GAN cấp BẰNG PARACETAMOL của CAO CHIẾT một LOÀI NGŨ vị tử THU hái ở NGỌC LINH KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Về kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh .... Tuy nhiên Ngũ vị tử Ngọc Linh Schisandra sphenanthera cũng là một loài tương đối mới ở Việt Nam do đó các ngh

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯU VIỆT HOÀNG

TỬ THU HÁI Ở NGỌC LINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp tại khoa Dược lý - Hóa sinh và khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu, em đã nhận được sự giúp đỡ, và động viên vô cùng lớn từ các thầy cô, anh chị, bạn bè và gia đình

Lời đầu tiên em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo trường Đại học Dược Hà Nội; khoa Dược lý – Hóa sinh, khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu đã tạo điều kiện cho em được tham gia học tập và hoàn thành khóa luận trong suốt thời gian qua

Đặc biệt em xin gửi tới lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Nguyễn Thị

Phượng khoa Dược lý – Hóa sinh Viện Dược liệu, cô là người đã trực tiếp hướng

dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em xuyên suốt trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp

Tiếp đến em xin cảm ơn TS Hà Vân Oanh bộ môn Dược học Cổ truyền trường Đại

học Dược Hà Nội Cô đã tạo điều kiện cho phép em được tiếp cận tham gia nghiên cứu khoa học, cảm ơn sự động viên và quan tâm sát sao của cô trong quá trình em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Đào Thị Thanh Hiền đã giúp đỡ em trong quá

trình hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Hà Ly khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược

liệu đã tạo điều kiện tối đa về cơ sở vật chất cho em hoàn thành việc nghiên cứu thực nghiệm của đề tài khóa luận tốt nghiệp

Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu, em đã nhận được sự giúp đỡ to lớn từ

anh Nguyễn Văn Hiệp, chị Trần Thị Hồng Vân cùng các anh chị trong khoa Dược

lý – Hóa Sinh và khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành trong suốt quá trình học tập và công tác, và là chỗ dựa vững chắc cả về vật chất lẫn tinh thần mỗi khi em gặp khó khăn trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 27 tháng 6 năm 2022

Sinh viên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Ngũ vị tử 2

1.1.1 Thực vật học 2

1.1.2 Thành phần hóa học 3

1.1.3 Tác dụng và công dụng trong y học cổ truyền 8

1.1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học 8

1.2 Mô hình gây viêm gan cấp 10

1.2.1 Các mô hình gây tổn thương gan cấp 10

1.2.2 Mô hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol 11

1.2.3 Mô hình gây viêm gan bằng tác nhân CCl4 12

1.2.3 Các thông số đánh giá 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.1 Nguyên liệu 13

2.1.2 Hóa chất 13

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 14

2.1.4 Động vật nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp trong mẫu dược liệu 15 2.3.2 Phương pháp định lượng polyphenol, flavonoid có trong mẫu cao dược liệu 17

2.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Ngũ vị tử 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong Ngũ vị tử 23

3.2 Kết quả định lượng một số hoạt chất trong Ngũ vị tử 25

3.2.1 Xác định hàm ẩm trong mẫu cao dược liệu 25

3.2.2 Định lượng polyphenol 25

3.2.3 Định lượng flavonoid 27

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol 28

3.3.1 Kết quả hình ảnh gan đại thể 28

3.3.2 Kết quả đo hoạt độ AST 29

3.3.3 Kết quả đo hoạt độ ALT 30

3.3.4 Kết quả định lượng TBARs 31

3.3.5 Kết quả định lượng GSH 32

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 34

4.1 Về kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh 34

4.2 Về kết quả định lượng polyphenol, flavonoid 34

4.3 Về tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36

1 Kết luận 36

2 Đề xuất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO:

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ, kí hiệu viết tắt Ý nghĩa hoặc chữ viết đầy đủ

SCP-0-1, SCPP11 Polysaccharide từ quả khô S.chinensis

thiobarbituric

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp chất được phân lập từ Schisandra sphenanthera……… 8

Bảng 2.1 Các chất độc với gan được dùng để gây tổn thương gan thực nghiệm ở

chuột……… 11

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong Ngũ vị tử Ngọc Linh……….… 24 Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm ẩm trong mẫu cao dược liệu………… ………… 25 Bảng 3.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn polyphenol ………… ………….…… 25 Bảng 3.4 Kết quả định lượng polyphenol.………… ………… ………… …… 26 Bảng 3.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn flavonoid ………… ……… … 27 Bảng 3.6 Kết quả định lượng flavonoid.………… ………… ……… 28 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của CNVT lên hoạt độ AST trong huyết thanh chuột……… 29 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của CNVT lên hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột……… 30 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của CNVT lên giá trị TBARs trong gan chuột…… ……… 31 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của CNVT lên giá trị GSH trong gan chuột……… 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số hình ảnh Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh……….2

Hình 1.2 Cấu trúc của lignan dibenzocyclooctadien từ Schisandra sphenanthera… 4

Hình 1.3 Cấu trúc của 5 lignan khác từ Schisandra sphenanthera………5

Hình 1.4 Cấu trúc của 3 triterpene trong quả của S.sphenanthera……… 5

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của 6 nortriterpenoid và 5 lignan được phân lập từ S.sphenanthera ……… 6

Hình 2.1 Quy trình bào chế cao chiết cồn Ngũ vị tử Ngọc Linh… ……….….13

Hình 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong Ngũ vị tử Ngọc Linh………… …24

Hình 3.2 Đường chuẩn polyphenol ……… 26

Hình 3.3 Đường chuẩn flavonoid……… … 27

Hình 3.4 Hình ảnh gan đại thể của các lô chuột……….…… …29

Hình 3.5 Kết quả phân tích hoạt độ AST……….………….30

Hình 3.6 Kết quả phân tích hoạt độ ALT……… 31

Hình 3.7 Kết quả phân tích hàm lượng TBARs……… 32

Hình 3.8 Kết quả phân tích hàm lượng GSH………33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Schisandra (Ngũ vị tử) hiện có khoảng 22-25 loài phân bố trên thế giới trong đó

chủ yếu được tìm thấy ở Trung Quốc [12], [16], [39] Trước năm 2000, tại Việt Nam

mới chỉ phát hiện 2 loài là Schisandra cocinea và Schisandra sinensis với tên gọi

chung là Ngũ vị tử phân bố chủ yếu ở các tỉnh biên giới giáp với Trung Quốc như Lào Cai và Lai Châu [2] Năm 2006, Viện Dược liệu công bố loài Ngũ vị tử

Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils được tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh thuộc

địa phận hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam Trong y học cổ truyền Ngũ vị tử là một

vị thuốc bổ giúp phục hồi sức khỏe, trị lỵ, lậu, cảm lạnh, say nóng, viêm phế quản, hen phế quản, chữa ho, liệt dương,…[1], [2] Hiện nay các nghiên cứu đã xác định

được thành phần hóa học chính của Schisandra sphenanthera là các hợp chất lignan,

ngoài ra còn có chứa các thành phần tinh dầu, triterpene, acid hữu cơ,…[1], [2], [13]

Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý chỉ ra Schisandra sphenanthera có tác dụng

ức chế tế bào ung thư, chống oxy hóa,…[11], [14] Tuy nhiên Ngũ vị tử Ngọc Linh

(Schisandra sphenanthera) cũng là một loài tương đối mới ở Việt Nam do đó các

nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý còn tương đối hạn chế Theo thống kê của Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng hơn 8 triệu người mắc các vấn đề

về gan trong đó có viêm gan Do đó nhu cầu chăm sóc và chi phí điều trị là rất lớn Trên thế giới hiện này đã có nhiều sản phẩm được chiết xuất từ Ngũ vị tử có tác dụng bảo vệ gan Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay có rất ít các nghiên cứu chuyên sâu về tác dụng bảo vệ gan từ Ngũ vị tử Điều này đã bỏ phí cơ hội phát triển những sản phẩm tiềm năng điều trị viêm gan có tác dụng, an toàn và chi phí thấp từ vị dược liệu quý của Việt Nam

Từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol của cao chiết một loài Ngũ vị tử thu hái ở Ngọc Linh” được thực hiện với mục tiêu chính là nghiên cứu các thành phần hóa học và làm sáng tỏ tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Ngũ vị tử Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

1 Định tính các nhóm chất chính có trong dược liệu Ngũ vị tử bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

2 Định lượng một số hoạt chất có trong cao chiết Ngũ vị tử

3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Ngũ vị tử trên mô hình gây viêm gan cấp bằng Paracetamol

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Ngũ vị tử Ngọc Linh

1.1.1 Thực vật học

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Ngũ vị tử thu hái tại Ngọc Linh, Việt Nam có tên khoa học là Schisandra

sphenanthera Rehd.et Wils., thuộc chi Ngũ vị tử (Schisandra), họ Ngũ vị

(Schisandraceae), bộ Hồi (Illiciales), phân lớp Hoàng liên (Rancunulidae), lớp Hai lá mầm (Dicotyledones), ngành Hạt kín (Angiospermae)

Hình 1.1 Một số hình ảnh Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh

(A - Quả chưa chín; B: Hoa; C: Quả chín)

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.) là loại cây thân

leo gỗ, dài 3 – 5 m rụng lá vào mùa khô (tháng 10-11) Toàn cây không lông, rất ít gặp trên gân, mặt dưới lá non có lông nhỏ mềm thưa thớt Khi cây đâm chồi (tháng 2) vẩy chồi có lông mềm Cành nhỏ có mầu hồng cánh gián Thân cành có nốt sần, cành non hơi có cạnh Lá mọc so le, hình trứng đảo, rộng hơn về phía cuối lá, gốc hình nêm, đỉnh nhọn, kích thước lá trung bình dài 5-11 cm, rộng 3-7 cm Mặt trên lá xanh đậm, mặt dưới lá nhạt mầu hơn Mép lá có răng cưa thô về phía cuối lá Lá có gân hình lông chim Cuống lá mầu hồng nhạt, dài 2-3 cm Gân lá 4-5 đôi, lồi ở mặt dưới, hơi lõm ở mặt trên Hoa đơn tính, khác gốc, tràng có 6-9 cánh, màu vàng trắng,

có mùi thơm, nhị 5 Hoa mọc ở nách lá, cuống dài 2-4 cm, gốc có phiến bao (vẩy) dài 3-4 mm Cánh hoa 5-9 màu cam, hình trứng đảo dạng tròn dài, kích thước 6-12 x 5-

8 mm Hoa đực nhị nhiều, thành bó hình trứng đảo, đường kính 4-5mm Đế hoa lồi hình trụ tròn, nhị nhiều, ô phấn hướng nội, 2 ô Hoa cái có 30-60 tâm bì tập hợp thành

bó hình cầu dạng trứng, đường kính 5cm Trục đế hoa tập hợp quả dài 6-17 cm, đường kính 4mm, cuống quả dài 5-10cm Quả mọng khi chín có mầu hồng sau đỏ sẫm, hình cầu dạng trứng, đường kính 5-7 mm Hạt tròn màu vàng, hình thận 8 dài 4 mm, rộng 3,8 mm, rốn hạt hình chữ V, vỏ hạt lưng có vân sần sùi [12], [16], [39]

7.2-19.2% [1], [2]

Có 3 triterpene được phân lập từ quả của S.sphenanthera bao gồm acid

schizandronic (acid ganwuweizic)(24), acid anwuweizic(25) và schisanol(26) [13]

Ngoài ra, vào năm 2019, Nguyen Thi Mai và các cộng sự đã phân lập được 6

hợp chất nortriterpenoid (27-32) và 5 lignan (33-37) [14]

Hình 1.3 Cấu trúc của 5 lignan khác từ S.sphenanthera

Hình 1.4 Cấu trúc của 3 triterpene trong quả của S.sphenanthera

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của 6 nortriterpenoid và 5 lignan được phân lập từ

S.sphenanthera

Bảng 1.1 Các hợp chất được phân lập từ Schisandra sphenanthera

1.1.3 Tác dụng và công dụng trong y học cổ truyền

Tính vị, công năng: Ngũ vị tử Ngọc Linh có vị chua chát, tính ấm, quy kinh phế và thận có tác dụng liễm phế chỉ ho, sáp tinh, ích thận, thu mồ hôi, sinh tân dịch [2], [5]

Công dụng: Ngũ vị tư được dùng trị phế hư, ho tực ngực, suyễn, miệng khô, khát nước, mỏi mệt, thận hư, liệt dương, di tinh, mồ hôi trộm, tả lỵ lâu ngày, đái dầm Mỗi lần uống 2-4g, ngày 3 lần dưới dạng thuốc sắc hoặc thuốc bột Thường phối hợp với các vị thuốc khác [2], [5] Ngoài ra trong y học cổ truyền Trung Quốc, ngũ vị tử dùng để bồi bổ, hồi phục sức khỏe, trị lỵ, lậu, cảm lạnh, say nóng, viêm phế quản, hen phế quản, chữa ho, liệt dương [1], [2]

Một số bài thuốc có chứa Ngũ vị tử:

+ Chữa tỳ thận dương hư di tả: Ngũ vị tử 6g; phá cố chỉ 12g; nhục đậu khấu; ngô thù du mỗi vị 4g Các vị tán nhỏ, luyện thành viên hoàn với đại táo và sinh khương Mỗi lần uống 10g, ngày một lần [2]

+ Chữa suy nhược cơ thể do phế khí hư: Ngũ vị tử 10g; thục địa; tử uyển; tang bạch bì mỗi vị 12g; đảng sâm; hoàng kì mỗi vị 10g Sắc uống ngày một thang [2]

+ Chữa hen suyễn ở người già: Ngũ vị tử 10g; mạch môn 16g; sa sâm; ngưu tất mỗi vị 12g Sắc uống ngày 1 thang [2]

+ Hỗ trợ điều trị nhồi máu cơ tim: Ngũ vị tử; nhân sâm; mạch môn mỗi vị 8g; cam thảo 6g Sắc uống [2]

+ Chữa thiếu máu: Ngũ vị tử 10g; đảng sâm 16g; phục linh; hoàng kì; thục địa; bạch thược; đại táo mỗi vị 12g; đương quy; viễn chí mỗi vị 10g; bạch truật 8g; quế tâm; cam thảo; trần bì mỗi vị 6g; gừng 2g Sắc uống ngày 1 thang [2]

+ Chữa chóng mặt ù tai, hay quên: Ngũ vị tử 8g, toan táo nhân, long nhãn, hoài sơn mỗi vị 12g; đương quy 8g Sắc uống ngày 1 thang [2]

1.1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.1.4.1 Tác dụng bảo vệ gan

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh polysaccharide từ các loài thuộc chi

Schisandra trong đó có S.sphenanthera có tác dụng bảo vệ gan [12], [42]

Ngũ vị tử có tác dụng bảo vệ gan trong thử nghiệm gây độc tế bào in vitro với

Carbontetraclorid (CCl4) và D.galactosamin Gormisin A - một lignan được phân lập

từ quả Ngũ vị tử có tác dụng ức chế sự tăng hoạt độ AST (Aspartate aminotransferase)

và ALT (Alanine aminotransferase) và có xu hướng bảo vệ mô tế bào gan [2]

Năm 2016 Wang và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng polysaccharide từ

S.sphenanthera trên mô hình chuột mắc bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu

(NAFLD) với mức liều 100 mg/kg/ngày trong vòng 12 tuần Kết quả cho thấy các chỉ

số TG (Triglycerid), TC (Total cholesterol), LDL (Low density lipoprotein cholesterol), ALT, AST lần lượt giảm 31,3%; 28,3%; 42,8%; 20,1%; và 15,5% HDL (High density lipoprotein cholesterol) trong huyết thanh tăng 26,9% [42]

Các lignans phân lập được đặc biệt là dibenzocyclooctadiene lignans từ quả

của S.chinensis và S.sphenanthera đã được nghiên cứu rộng rãi: Deoxyschizandrin,

gomisin A, schizandrin C, schisanhenol, gomisin J, and schisandrene đã được báo cáo cho thấy các đặc tính chống oxy hóa mạnh, làm giảm hoạt độ ALT, AST trong huyết thanh [15]

1.1.4.2 Tác dụng trên tuần hoàn

Ngũ vị tử có hoạt tính chống đông máu trong thử nghiệm in vitro Lignan của

Ngũ vị tử có hoạt tính đối kháng với yếu tố hoạt hóa tiểu cầu, yếu tố này có vai trò trong nhiều tác dụng trên người như hạ huyết áp, tăng độ thẩm thấu mao mạch, viêm cấp, hen suyễn, loét dạ dày,… [2]

Tác dụng trên tim mạch: K.V Drake, V.A Ephimova, L.N Markova (1949,1954) đã chứng minh rằng với liều nhỏ và liều trung bình (0.2-0.5mg/kg thể trọng) tiêm vào mạch máu (dạng nước hãm) có tác dụng làm mạnh hệ thống tim mạch của những động vật máu nóng, làm mạnh huyết áp và tăng biên độ co bóp tim [1]

1.1.4.4 Tác dụng chống oxy hóa

Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất

polysaccharide có trong quả của S.sphenanthera [45], [46], [48], [50] Ngoài ra các

hợp chất polyphenol bao gồm: flavonoid, acid phenolic và lignan cũng được báo cáo

là có tác dụng chống oxy hóa [28]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra schisandrin B (một chất thuộc nhóm lignan) đóng vai trò thiết yếu trong việc bảo vệ gan, chống oxy hóa và ung thư [36] Năm 2015 Jiang và các cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính sinh học của schisandrin B ở nồng độ

10 μM Kết quả cho thấy schisandrin B làm tăng mức độ superoxide dismutase (SOD) trong tế bào, ức chế peroxid hóa lipid và giảm lactate dehydrogenase và malondialdehyde [27]

Năm 2017 Niu và các cộng sự đã tiến hành 3 thí nghiệm in vivo bao gồm thanh

thải gốc tự do anion superoxid, gốc hydroxyl và gốc tự do diphenyl picryl hydrazinyl (DPPH) kết quả cho thấy có mối quan hệ phụ thuộc giữa liều lượng polysaccharide

hòa tan trong nước từ quả của S.sphenanthera Ở nồng độ 1 mg/ml đặc tính chống

oxy hóa với độ thải trừ các gốc tự do lần lượt là 62,08%, 39,27% và 41,83% [50]

Trong một nghiên cứu được công bố vào năm 2019, Xiaoyi Chen và các cộng

sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống gốc tự do từ S.sphenanthera Kết quả cho thấy dịch chiết nước sau khi làm khô của S.sphenanthera có tỉ lệ thanh thải gốc tự do

DPPH dao động từ 31.9%-64.9% với EC50 là 0,584 mg/l [11]

1.1.4.5 Tác dụng chống ung thư

Polysaccharid từ S.sphenanthera đã được báo cáo có tác dụng chống lại hoạt động của tế bào ung thư cả in vivo và in vitro [12], [31], [38], [49] Hầu hết các

polysaccharid có tác dụng điều hòa miễn dịch mà không gây độc tế bào đáng kể [12]

Trên tế bào ung thư vú: các nghiên cứu đã chỉ ra rằng schirubrisin B từ quả

S.sphenanthera cho thấy độc tính tế bào mạnh trên dòng tế bào PC3 và MCF7 với giá

trị IC50 lần lượt là 3.21±0.68 và 13.30±0.68 µM [14]

1.2 Mô hình gây viêm gan cấp

1.2.1 Các mô hình gây tổn thương gan cấp

Có nhiều mô hình khác nhau được sử dụng để gây viêm gan cấp trong đó có thể kể đến tác nhân: Paracetamol (PAR), CCl4, Aflatoxin B, Amanita phaloides, D-galactosamin, Thioacetamid, Plasmodium berghei,… Trong đó Paracetamol và CCl4

là 2 tác nhân được sử dụng nhiều nhất [8], [32]

Bảng 2.1 Các chất độc với gan được dùng để gây tổn thương gan thực

nghiệm ở chuột [32]

mmol/kg)

1.2.2 Mô hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol

Paracetamol sử dụng ở mức liều thông thường có tác dụng hạ sốt, giảm đau Tuy nhiên khi sử dụng quá liều quy định chúng gây độc tính trên gan theo cơ chế sau: 90% paracetamol được chuyển hóa ở gan theo con đường sulphat hóa và glucuronide hóa, phần còn lại được hệ enzym cytochrome P450 ở gan chuyển hóa thành N-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI) NAPQI là một chất gây độc với gan Với liều thông thường NAPQI kết hợp với glutathion được dự trữ ở gan để tạo thành cystein và acid mercapturic không độc và được đào thải qua nước tiểu Khi uống quá liều paracetamol thì quá trình sulfat hóa bị bão hòa làm lượng NAPQI tăng lên khiến glutathion dự trữ suy giảm gây độc với gan NAPQI gắn với màng tế bào gan và gây tổn thương lớp màng lipid kép của tế bào gan [6]

Mô hình gây viên gan bằng paracetamol được tiến hành trên nhiều đối tượng bao gồm chuột cống, chuột lang, mèo, và chuột hamster [32] Tuy nhiên chuột nhắt

là loài điển hình nhất khi áp dụng mô hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol [8], [32], [33] do dễ thực hiện, liều gây độc cũng tương tự như của người Chuột nhắt trắng cũng được nhiều tác giả ở Việt Nam lựa chọn trong nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các hợp chất được chiết xuất từ thảo dược [7], [9]

Paracetamol có thể được sử dụng bằng đường uống, tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm phúc mạc Tổn thương gan xuất hiện sớm ở được tiêm phúc mạc (trong vòng 2 giờ) thậm chí sớm hơn khi tiêm tĩnh mạch [35] Trong khi đường uống gây tổn thương gan muộn và ổn định hơn (đạt đỉnh sau 12-24 giờ) [32]

Parcetamol gây độc tính ở liều ≥150 mg/kg và rất rõ ở liều 500 mg/kg [40]

Sử dụng paracetamol liều 600 mg/kg đường uống gây chết 80% chuột và liều 1 g/kg gây chết 100% chuột [34] Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, có rất nhiều nghiên cứu viêm gan bằng paracetamol trên chuột nhắt trắng với mức liều uống rất khác nhau

từ 250mg, 400 mg, 600 mg thậm chí có tài liệu ghi 1000mg/kg cân nặng [7], [9], [32] Thời gian lấy máu sau khi uống paracetamol cũng thay đổi: 12 h, 24 h, 26 h thậm chí

48 h sau khi uống Tại Viện Dược liệu, năm 2008 có đề tài chỉnh lý một số mô hình, trong đó có mô hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol cho thấy khi cho chuột uống liều 300 mg/kg đã có thể có chuột chết trong khi đó vẫn có chuột men gan tăng chưa cao Sau 24 h uống paracetamol thì men gan tăng cao sau đó trở dần về mức bình thường Vì vậy, để chuột không chết (nếu chết thì rất ít) và để men gan tăng đều hơn, cho chuột uống 2 liều paracetamol cách nhau 24 giờ, liều thứ nhất chuột được uống liều 200 mg/kg, liều thứ 2 uống 350 mg/kg và lấy máu để định lượng men gan sau 24

h uống liều thứ 2

1.2.3 Mô hình gây viêm gan bằng tác nhân CCl4

Cùng với Paracetamol, CCl4 cũng là một tác nhân được sử dụng nhiều trên

mô hình gây viêm gan cấp [32] Mô hình gây viêm gan bằng CCL4 được tiến hành trên nhiều động vật như chuột nhắt [8], [29], thỏ [8], [47], chuột cống [8], [37] Tuy nhiên hiện nay tác nhân CCl4 ít được sử dụng hơn do CCl4 dễ bay hơi và gây độc tính ngay cả khi hít phải

1.2.4 Các thông số đánh giá

Việc đánh giá hiệu quả của các mô hình gây viêm gan cấp thường được tiến hành thông qua việc so sánh sự thay đổi các chỉ số sinh hóa, mô bệnh học giữa các lô dùng thuốc thử nghiệm, lô thuốc chứng, lô chứng sinh lý và lô bệnh lý

Đánh giá các chỉ số sinh hóa trong huyết thanh/huyết tương: ALT, AST, ALP, bilirubin, protein, albumin, cholesterol…

Đánh giá các chất chống oxy hóa trong gan: Superoxide dismutase (SOD), MDA Malondialdehyde (MDA), Glutathion (GSH) ,…

Đánh giá mô bệnh học gan: Khối lượng gan, hình thái màu sắc của gan, nhuộm hematoxylin- eosin (HE), nhuộm Massive trichrome (nguyên bào sợi),…

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Dược liệu: quả Ngũ vị tử thu tại khu vực Kon Tum, vùng núi Ngọc Linh vào tháng 10/2020 (ký hiệu NVT-05) Mẫu nghiên cứu được rửa sạch, sấy khô ở 55oC, bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo thoáng mát Mẫu được lưu tại Phòng lưu mẫu, khoa Hoá Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Cao chiết cồn toàn phần (viết tắt là CNVT) (hiệu suất chiết 24,5%; độ ẩm

13,89%, phân loại: cao đặc) từ dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra

Sphenanthera Rehd.Et Wills) được chiết xuất theo sơ đồ Hình 2.1

Hình 2.1 Quy trình bào chế cao chiết cồn từ Ngũ vị tử Ngọc Linh

Mô tả quy trình: dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh (đã sấy khô có hàm ẩm <10%

và có hàm lượng lignan >0,5%) được xay nhỏ đến kích thước 1-3 mm Dược liệu được chiết xuất 2 lần trong ethanol 80% dưới nhiệt độ 60oC Lần thứ nhất dược liệu được chiết với tỉ lệ dược liệu : dung môi là 1:8 Lần thứ 2 dược liệu được chiết với tỉ

lệ dược liệu : dung môi là 1:5 Gộp dịch chiết 2 lần đem đi lọc Dịch lọc sau đó được

cô đặc dưới áp suất giảm (-0,8 đến -1,0 atm) ở nhiệt độ 70oC Cô tới khi thu được cao đặc và hàm ẩm đạt yêu cầu

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất và dung môi được dùng trong định tính: Nước cất, ethanol, dung dịch

FeCl3 5%, tinh thể Na2CO3, Ninhydrin, dung dịch Chì acetat 10%, dung dịch Gelatin 5%, thuốc thử Fehling A, thuốc thử Fehling B, thuốc thử Lugol, dung dịch H2SO4

2%, dung dịch H2SO4 25%, dung dịch NH4OH 6N, Cloroform (CHCl3), thuốc thử Dragendorff, ether, dung dịch KOH 10%, n-hexan

Hóa chất và dung môi dùng trong định lượng: Nước cất, methanol, chất chuẩn acid gallic hàm lượng 95%, dung dịch NaCO3 2%, thuốc thử FC, chất chuẩn catechin hàm lượng 95%, dung dịch NaNO2 5%, dung dịch NaOH 10%, dung dịch NaOH 10%

Hóa chất dung môi dùng trong nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan:

+ Paracetamol (PAR) của Sigma

+ Silymarin hoạt chất (Sigma)

+ Acid thiobarbituric và 5,5’- Dithiobis(2-nitrobenzoic) (DTNB) của Sigma + Kít định lượng ALT, AST của hãng Erba (Séc)

+ Các dung môi hóa chất khác: Methanol, acid acetic băng, HCl, n-butanol, đệm RIPA…

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu

- Máy định lượng sinh hóa Humalyser 2000 của Human (Đức)

- Máy ly tâm Mikro 22 R của hãng Hettich (Đức)

- Máy ly tâm Allegra-X-15R Centriguge (BECKMAN COULTER)

- Máy nghiền đồng thể Tissulyser II (Đức)

- Máy li tâm labofuge 400 (Đức)

- Máy đọc elisa HumanReader HS (Human)

- Máy đo quang phổ UV mini 1240 (Shimadzu)

- Bếp cách thủy GFL (Đức)

- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường của bộ môn Dược lý – Hóa sinh; Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

2.1.4 Động vật nghiên cứu

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 25,0

 2,0 do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật được nuôi trong điều

kiện nhiệt độ duy trì 25 ± 1oC, độ ẩm không khí và ánh sáng thích hợp Chuột được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp Chuột được uống nước tự do theo nhu cầu Chuột được nuôi ổn định trước khi thí nghiệm 7 ngày

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Định tính các nhóm chất chính có trong dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

Nội dung 2: Định lượng polyphenol toàn phần và flavonoid có trong cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh

Nội dung 3: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh trên mô hình gây viêm gan cấp bằng Paracetamol

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp trong mẫu dược liệu

Định tính sơ bộ một số nhóm hoạt chất bằng phương pháp hóa học theo các tài liệu [3], [4]

Chuẩn bị các dịch chiết:

Dịch chiết n-hexan: Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình soxhlet Chiết bằng

n-hexan đến khi dung môi trong bình không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung

môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm phản ứng định tính chất béo

Dịch chiết ethanol 90 %: Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml

ethanol 90 %, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, acid amin

Dịch chiết nước: Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 30 ml

nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc lấy dịch lọc làm các phản ứng định tính tannin, đường khử và polysaccharid

- Phản ứng mở đóng vòng lacton: cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 mL dịch

chiết cồn Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Đun

sôi cả 2 ống nghiệm, để nguội Quan sát nếu có các hiện tượng sau thì dương tính Ống 1 dung dịch có tủa vàng hoặc tủa đục có màu vàng, ống 2 trong + Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều Quan sát nếu thấy hiện tượng sau thì dương tính Ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục

- Phản ứng diazo hoá: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết cồn thêm

vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy sôi 5 phút rồi để nguội Thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ gạch

2.3.1.5 Định tính đường khử

Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm Thêm vào đó 0,5 ml TT Fehling

A và 0,5 ml TT Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa đỏ gạch

2.3.1.6 Định tính polysaccharid

Cho vào 2 ống nghiệm: Ống 1: 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol, ống 2:

4 ml dịch chiết nước + 5 giọt thuốc thử Lugol Quan sát màu ống 2 đậm hơn ống 1 thì phản ứng dương tính

2.3.1.7 Định tính acid amin

Lấy 3 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm Thêm 1-3 mảnh ninhydrin, đun sôi 2 phút, phản ứng dương tính khi thấy dung dịch chuyển màu tím

2.3.1.8 Định tính alkaloid

Chiết xuất: lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15

ml dung dịch H2SO4 2%, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm Chiết alkaloid bằng cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết CHCl3 được gộp lại và lắc với

H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước acid, cho vào ống nghiệm khoảng 1ml để làm các phản ứng

Tiến hành phản ứng: thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff, phản ứng dương tính khi có tủa vàng cam hoặc đỏ

2.3.1.9 Định tính flavonoid

- Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm một ít

bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đậm đặc Đun nóng cách thủy sau

vài phút Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện màu tím đỏ

- Phản ứng với FeCl 3 5% : Cho 1 ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm

2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu

xanh lục, xanh hoặc nâu

- Phản ứng với kiềm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt

dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm

2.3.1.10 Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn và cô tới cắn Hòa cắn trong 1 ml nước và thêm vài tinh thể natri carbonat Phản ứng dương tính khi thấy có bọt khí nổi lên

2.3.2 Phương pháp định lượng polyphenol, flavonoid có trong mẫu cao dược liệu

2.3.2.1 Xác định hàm ẩm trong mẫu cao dược liệu

Xác định hàm ẩm trong mẫu cao dược liệu theo phương pháp mất khối lượng

do làm khô được trình bày ở phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam V