Để đánh giá chính xác nồng độ các chất xả thải ra môi trường nhằm phục vụ phương pháp WBE thì ngoài việc phân tích trong nước thải còn cần đến dữ liệu dư lượng các chất này trong bùn thả
TỔNG QUAN
Tổng quan về ma túy
Theo Tổ chức Liên Hợp Quốc: Ma túy là “Các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, khi xâm nhập vào cơ thể sẽ làm thay đổi trạng thái tâm sinh lý của người sử dụng”
Luật Phòng, chống ma túy số 73/2021/QH14 do Quốc hội Việt Nam thông qua vào ngày 30/3/2021 và có hiệu lực từ 01/01/2022, quy định khái niệm chất ma túy gồm hai nhóm là chất gây nghiện và chất hướng thần, được liệt kê trong danh mục do Chính phủ ban hành Chất gây nghiện được hiểu là các chất kích thích hoặc ức chế thần kinh có khả năng gây nghiện cao ở người sử dụng Chất hướng thần là các chất kích thích hoặc ức chế thần kinh hoặc gây ảo giác, và việc sử dụng nhiều lần có thể dẫn tới nghiện.
Danh mục các chất ma túy và tiền chất được quy định trong Nghị định số 73/2018/NĐ-CP do Chính phủ ban hành năm 2018, và hiện đã được sửa đổi bổ sung bởi Nghị định số 60/2020/NĐ-CP ban hành năm 2020 của Chính phủ.
Dựa trên nguồn gốc, tác dụng trên hệ thần kinh trung ương người ta đưa ra các cách phân loại ma tuý như sau:
1.1 1 Phân loại theo nguồn gốc
Ma túy tự nhiên là các chất ma túy có sẵn trong tự nhiên, là alcaloid của một số thực vật như cây thuốc phiện (anh túc), cây cần sa (cây gai dầu), cây coca (cocain).
Ma túy bán tổng hợp là các chất ma túy được tổng hợp một phần từ các loại ma túy có sẵn trong tự nhiên và có tác dụng mạnh hơn chất ma túy ban đầu Đây là nhóm ma túy vừa khai thác nguồn tự nhiên vừa trải qua quá trình tổng hợp hóa học để tăng cường hiệu lực, đồng thời làm tăng nguy cơ gây nghiện và tác hại cho sức khỏe người dùng Ví dụ: morphin và heroin.
Ma túy tổng hợp là nhóm chất ma túy không có trong tự nhiên, được tổng hợp từ các loại hóa chất (được gọi là tiền chất) Những tiền chất này được dùng để sản xuất các loại ma túy tổng hợp khác nhau Ví dụ điển hình gồm amphetamin (AMP), 3,4-methylenedioxy methamphetamin (MDMA) — còn được biết đến là ecstasy — và ma túy đá.
1.1 2 Phân loại theo tác động lên thần kinh trung ương
Nhóm gây ức chế hệ thần kinh trung ương là tập hợp các chất làm giảm hoạt động của não bộ, gây buồn ngủ, an thần, làm chậm nhịp tim và ức chế hô hấp khi được dùng Các thành phần điển hình của nhóm này gồm thuốc phiện và các nguồn gốc phiện như morphin và heroin, cùng với một số thuốc an thần gây ngủ như seduxen (diazepam) và phenobarbital Hiểu về tác dụng và nguy cơ của nhóm ức chế hệ thần kinh trung ương là rất quan trọng cho an toàn sức khỏe, phòng ngừa biến chứng và giáo dục cộng đồng về lạm dụng thuốc.
Nhóm gây kích thích thần kinh trung ương gồm AMP (amphetamine) và các dẫn xuất của nó; khi được sử dụng, nhóm này gây tăng hoạt động của hệ thần kinh, tăng sinh lực và sự tỉnh táo, đồng thời kích thích tim và hô hấp, dẫn đến tăng nhịp tim và nhịp thở Các tác dụng này cho thấy vai trò tiềm ẩn của nhóm chất này trong y học song song với nguy cơ tác dụng phụ và rủi ro sức khỏe, do đó cần thận trọng và giám sát khi tiếp xúc với chúng.
Nhóm gây ảo giác là các chất gây thay đổi nhận thức và môi trường xung quanh, khiến người dùng nghe thấy những âm thanh không có thật Các ví dụ phổ biến gồm LSD (lysergic acid diethylamide), MDMA (thuốc lắc) và cần sa, mỗi loại có tác động và rủi ro riêng [43].
1.1.3 Một số ma túy nghiên cứu
1.1.3.1 Amphetamin (AMP) a Công thức hóa học
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của AMP
AMP có công thức phân tử là C9H13N, khối lượng phân tử là 135,21 g/mol Danh pháp IUPAC của amphetamin là 1-phenylpropan-2-amin [46] b Tính chất vật lý
AMP là dạng lỏng hoặc rắn không màu, dễ bay hơi, có mùi đặc trưng của amin và vị chát, hòa tan được trong nước, axit, ethanol, cloroform và diethyl ether Giá trị logP của AMP là 1,76 Độ tan trong nước là 28 g/L ở 25ºC Giá trị pKa là 9,9 và nhiệt độ nóng chảy là 25ºC.
[46] c Cơ chế và tác dụng
Cơ chế tác dụng của AMP làm tăng nồng độ noradrenalin trong vỏ não trước trán và dopamin trong thể vân, tùy thuộc vào liều lượng và thời gian sử dụng AMP tăng cường nhận thức và có những cải thiện được ghi nhận trên các điểm kiểm tra trí thông minh Ở người lớn mắc hội chứng tăng động giảm chú ý, AMP đã được chứng minh là mang lại những cải thiện.
Năm đặc điểm đáng chú ý về biểu hiện, hành vi và cử chỉ của amphetamine cho thấy hiệu quả được tạo ra từ cả hai dạng đồng phân, với việc dùng các dạng racemic ở tỷ lệ 3:1 (D:L) vẫn phổ biến Tác dụng điều trị của AMP đối với serotonin hầu như không có trên lâm sàng; tuy nhiên, tác động gián tiếp lên serotonin có thể ảnh hưởng đến chứng trầm cảm và lo âu ở người lớn mắc hội chứng tăng động giảm chú ý (ADHD) Các nghiên cứu về việc sử dụng bất hợp pháp AMP ở liều cao cho thấy sự xuất hiện của trạng thái hoang tưởng, cho thấy AMP là một hợp chất có nguy cơ tâm thần cao Độ ổn định của chất này cũng được xem là một yếu tố quan trọng khi đánh giá tính an toàn và hiệu lực của amphetamine.
Giá trị hệ số riêng phần carbon hữu cơ Koc của AMP khoảng 760 cho thấy AMP có tính di động thấp trong đất, được ước tính từ cấu trúc và chỉ ra mức di động hạn chế trong hệ đất–nước pKa của AMP là 9,9 cho thấy AMP tồn tại chủ yếu ở dạng cation trong môi trường; các cation có khả năng hấp phụ mạnh vào đất chứa carbon hữu cơ và đất sét, nổi bật hơn so với các hợp chất trung tính Sự bay hơi từ đất ẩm thấp do AMP tồn tại ở dạng cation và cation không bay hơi; tuy nhiên AMP có áp suất hơi thấp 0,24 mm Hg và tồn tại dưới dạng chất lỏng trong điều kiện môi trường nên có thể bay hơi từ đất khô Sự suy giảm 76% trong 15 ngày ở nước sông/trầm tích cho thấy phân hủy sinh học có thể là một quá trình chuyển hóa quan trọng trong môi trường đất e Chất gốc và quá trình chuyển hóa tạo AMP.
Phần lớn amphetamine (AMP) được đào thải qua nước tiểu ở dạng nguyên trạng theo nghiên cứu [24] Quá trình đào thải qua nước tiểu chủ yếu diễn ra ở dạng nguyên trạng, với khoảng 40% liều bài tiết ra nước tiểu ở dạng này Khoảng 90% lượng amphetamine được dùng sẽ được thải trừ trong vòng 3 ngày sau khi uống Tốc độ đào thải amphetamine phụ thuộc vào pH nước tiểu: nước tiểu có pH acid sẽ làm tăng bài tiết amphetamine so với nước tiểu kiềm.
1.1.3.2 Methamphetamin (MAMP) a Công thức hóa học
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của MAMP
MAMP có công thức phân tử là C10H15N, khối lượng phân tử là 149,23 g/mol Danh pháp IUPAC Methamphetamin: (2S)-N-methyl-1- phenylpropan-2-amin [40] b Tính chất vật lý
MAMP là dạng bột kết tinh màu trắng, có mùi đặc trưng và vị không cảm nhận được; nó hòa tan trong nước, ethanol và diethyl ether Giá trị logP của MAMP là 2,07 cho thấy đặc tính phân phối lipophilic ở mức trung bình, độ tan trong nước tại 25°C là 13,29 g/L và pKa là 9,87; nhiệt độ nóng chảy của MAMP là 170°C Những chỉ số hóa học này đóng vai trò quan trọng khi đánh giá tính chất, cơ chế tác dụng và an toàn của MAMP trong các ứng dụng khác nhau.
Tổng quan về phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu
1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổi
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trên một pha tĩnh được chứa trong cột, nhờ sự di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên các cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại kích thước tùy thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng trong hệ thống [1], [2].
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng một dòng
Trong hệ thống sắc ký chất lỏng liên tục (pha động), các chất tan trong mẫu di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động Nhờ sự khác biệt về tốc độ di chuyển này, các thành phần của mẫu được tách riêng thành các dải trên cột, làm nền tảng cho phân tích định tính và định lượng [1], [2].
Sắc ký lỏng khối phổ
LC-MS, hay sắc ký lỏng khối phổ, là kỹ thuật phân tích kết hợp giữa khả năng tách chất trong hỗn hợp của bộ phận HPLC và khả năng phân tích số khối (m/z) của phân tử bằng bộ phận khối phổ Mass Spectrometry (MS) Phương pháp này cho phép tách riêng và nhận diện các thành phần mẫu ở nồng độ thấp, đồng thời xác định khối lượng phân tử và cấu trúc thông qua dữ liệu m/z thu được từ MS Nhờ sự kết hợp giữa phân tách và phân tích khối lượng, LC-MS được ứng dụng rộng rãi trong phân tích dược phẩm, sinh học phân tử, thực phẩm và nghiên cứu hóa học nhằm định danh, định lượng và theo dõi các hợp chất một cách nhanh chóng và nhạy bén Đây là công cụ thiết yếu cho các phòng thí nghiệm cần độ đặc hiệu cao và quy trình phân tích phức tạp.
Trong kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đóng vai trò then chốt trong việc phân tách một phần hoặc toàn bộ hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất có trong nền mẫu, đồng thời hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải đi cùng với hoạt chất vào nguồn ion, từ đó góp phần tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp phân tích.
Một máy khối phổ thường có năm bộ phận chính là: bộ phận nạp mẫu, bộ nguồn ion hóa, bộ phân tích khối, detector và bộ phận xử lý số liệu Trong đó, bộ phận phân tích khối được coi là trái tim của máy khối phổ có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành các phần riêng biệt Bộ phận phân tích khối có 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích thời gian bay và bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ được thể hiện ở Hình 1.5 [1], [2].
Dư lượng ma túy trong bùn thải ở mức rất nhỏ do nền mẫu nhiều thành phần, đòi hỏi phương pháp phân tích có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Từ bảng 1.2 cho thấy hầu hết các nghiên cứu hiện nay sử dụng hệ thống sắc ký LC‑MS/MS đi kèm detector ESI‑MS để phân tích dư lượng này Để tăng cường nhạy và độ ổn định của phép đo, áp suất hệ thống được giảm xuống khoảng 10^-5–10^-6 Torr.
Detector Ghi/ xử lý số liệu
Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ
1.2.2 Tổng quan về chiết pha rắn (SPE)
Xác định dư lượng các chất trong bùn thải gặp nhiều khó khăn do hầu hết các chất cần phân tích có nồng độ rất thấp và nền mẫu lại phức tạp với nhiều thành phần Vì vậy, phần lớn mẫu bùn không thể được định lượng trực tiếp mà phải trải qua quá trình chiết tách và xử lý nhằm loại bỏ tạp chất, giảm ảnh hưởng của nền và làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích Hiện nay, để xử lý mẫu bùn thải, người ta thường áp dụng kỹ thuật chiết pha rắn.
Chiết pha rắn (SPE) là quá trình tách dựa trên sự phân bố của các chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó chất phân tích được chiết từ pha lỏng sang pha rắn và sau đó được rửa giải bằng dung môi thích hợp Nguyên liệu để tạo pha rắn trong SPE tương tự như trong sắc ký lỏng và có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên kết hoặc pha không liên kết.
Quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bước như sau:
Chọn pha rắn: tùy theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha rắn có bản chất phù hợp Mặt khác, tùy thuộc vào lượng chất phân tích trong mẫu mà lựa chọn cột có lượng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau để tối ưu quá trình tách.
Qui trình chiết pha rắn gồm 4 giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, loại tạp chất và rửa giải Chiết pha rắn là kỹ thuật mới khắc phục nhược điểm của chiết lỏng-lỏng: dùng ít dung môi hơn, có khả năng kết nối với GC và HPLC, đồng thời tăng khả năng làm giàu mẫu và đa dạng hóa cơ chế chiết phù hợp với nhiều chất phân tích, cho tính chọn lọc cao hơn Tuy nhiên, nhược điểm của chiết pha rắn là khó lưu giữ các chất phân cực mạnh, khó xây dựng quy trình chiết tối ưu, lượng dung môi đã giảm nhưng vẫn còn lớn, chi phí phương pháp còn cao và khó áp dụng ở quy mô rộng.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
- Chất nghiên cứu: MAMP, KET, MDMA, AMP
- Mẫu thử: cách lấy mẫu và bảo quản được tiến hành như sau:
Vị trí lấy mẫu bùn thải được xác định ở sông Kim Ngưu, Hà Nội với hai vị trí khảo sát khác nhau: một điểm phát lộ đầu tiên trên sông Kim Ngưu và một điểm cách đầu vào nhà máy xử lý nước Yên Sở khoảng 500 m, nhằm đảm bảo mẫu đại diện cho khu vực thải và ảnh hưởng của nhà máy đến chất lượng bùn tại hạ lưu.
+ Thời điểm lấy mẫu: mẫu được lấy cách tuần (vào một ngày cố định), trong 4 tuần liên tiếp tháng 10/2021 và 3 tuần liên tiếp tháng 01/2022
+ Dụng cụ lấy mẫu: lấy bằng ống inox đường kính khoảng 5 cm, vát 1 đầu nối với que dài khoảng 2 m
Phương pháp lấy mẫu trên bờ: Lấy mẫu cách bờ 0,5 m, bỏ 0,5 cm lớp phía trên và loại bỏ bằng mắt thường các chất rắn không đặc trưng như cát vón, cành lá khô, sỏi đá Đồng nhất mẫu và làm nhỏ mẫu, nhằm tăng độ đồng đều cho phân tích Lấy khoảng 100 g mẫu cho vào ống Falcon 50 ml và đậy kín để bảo quản trước khi phân tích.
+ Bảo quản: bảo quản ở -20 ºC cho đến khi phân tích
Mẫu nền là mẫu bùn ao không có chất phân tích Địa điểm lấy mẫu nền được thực hiện tại ao riêng của hộ gia đình ở thôn Lưu Tùy, xã Hải Thanh, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định.
- Mẫu tự tạo: Mẫu nền có thêm các chất chuẩn nghiên cứu với tỉ lệ nhất định
Các chất chuẩn - hóa chất dùng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2
Bảng 2.1 Các ngoại chuẩn và nội chuẩn
STT Tên nội chuẩn, ngoại chuẩn Hãng cung cấp Nồng độ Số lô
1 AMP Cerilliant – Mỹ 1 mg/ml MeOH FE5061406
2 KET Cerilliant – Mỹ 1 mg/ml MeOH FE012110-01
3 KET - d4 Cerilliant – Mỹ 100 àg/ml MeOH FE04141401
4 MAMP Cerilliant – Mỹ 1 mg/ml MeOH FE082712-03
5 MAMP - d5 Cerilliant – Mỹ 1 mg/ml MeOH FE012012-02
6 MDMA Cerilliant – Mỹ 1 mg/ml MeOH FE043013-07
7 MDMA - d5 Cerilliant – Mỹ 1 mg/ml MeOH FE051413-01
STT Hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
2 Acid formic Fisher - Mỹ LC - MS
3 Acid formic Scharlau - Tây Ban Nha PA
4 Dicloromethan Scharlau - Tây Ban Nha PA
5 Dinatri hydrophosphat Scharlau - Tây Ban Nha PA
6 Acid citric Scharlau - Tây Ban Nha PA
7 EDTA Scharlau - Tây Ban Nha PA
2.1.3 Máy móc - trang thiết bị
Các máy móc - trang thiết bị dùng cho nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.3
Bảng 2.3 Thiết bị nghiên cứu
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Cân phân tích Sartorius CP224S (chính xác đến 0,01mg) Đức
2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LC - MS/MS Waters
3 Máy siêu âm Elma S100H Đức
4 Máy lắc xoáy Velp ZX3 Ý
5 Bơm hút chân không Leybord và KNF Mỹ
6 Bộ dụng cụ chiết pha rắn Phenomenex 12 vị trí Mỹ
7 Thiết bị cô đuổi dung môi bằng khí nitơ Thermo 24 vị trí
8 Máy ly tâm lạnh Sigma 4-16KS Đức
9 Cột chiết pha rắn InertSep HLB FF (500 mg/6 ml) GL-Nhật Bản
Thông tin về cột SPE được sử dụng trong nghiên cứu (InertSep HLB FF 500 mg/6 ml) cho biết đây là cột chiết có sự phối hợp polymer gồm styren-divinylbenzen (SDB) và một monome vinyl chứa nitơ Styren-divinylbenzen có khả năng hấp phụ các chất phân cực, trong khi monome vinyl chứa nitơ hấp phụ các chất kém phân cực, giúp tối ưu hóa quá trình tách và xử lý mẫu trước khi phân tích Cột InertSep HLB hoạt động như một cột pha rắn đa chức năng, phù hợp cho các bước tiền xử lý, cô đặc và làm sạch mẫu trong nghiên cứu hóa học và phân tích chất hữu cơ.
FF 500 mg/6 ml là cột chiết pha đảo nhưng có ái lực vượt trội với các chất thân nước
Đối tượng phân tích chính là các dược chất có trong mẫu sinh học như huyết tương và nước tiểu, đồng thời là dư lượng dược chất trong môi trường Cột phân tích có khả năng chịu áp suất cao, phù hợp với các mẫu có độ nhớt lớn Khối lượng hạt nhồi trong cột là 500 mg, thể tích cột 6 ml [21], [44].
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng dư lượng một số ma túy trong bùn thải bằng LC-MS/MS
Dựa theo các bài báo [10], [14], [20], [29] và dựa trên tính chất hóa lý của chất phân tích cùng với điều kiện sẵn có, chuẩn nội được lựa chọn là đồng vị của các chất phân tích nghiên cứu MAMP-d5, MDMA-d5 và KET-d4 là các chuẩn nội tương ứng của MAMP, MDMA và KET Do AMP có cấu trúc gần tương tự với MAMP, nên MAMP-d5 được chọn làm chuẩn nội cho AMP Các chất này có công thức cấu tạo và tính chất lý hóa tương tự với chất phân tích, chỉ khác nhau về khối lượng phân tử và không có trong tự nhiên, do đó giúp giảm sai số xử lý mẫu và giảm hiện tượng khử ion.
2.2.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Trên thiết bị phân tích khối phổ tứ cực chập ba, tiến hành lựa chọn nguồn ion, thiết lập thế ion hóa, xác định ion mẹ và điều kiện phân mảnh để tối ưu các ion con, nhằm phân tích đồng thời các chất nghiên cứu trong hỗn hợp dựa trên tính năng tối ưu hóa của hệ thống Quá trình khảo sát được thực hiện để tìm điều kiện khối phổ cho phân tích đồng thời các chất nghiên cứu và chuẩn nội (internal standard), đảm bảo tính lặp lại và độ chính xác của phép đo Việc tối ưu hóa các tham số như cường độ nguồn ion, cấu hình phân mảnh và lựa chọn ion đặc trưng giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu khi phân tích các chất trong hỗn hợp phức tạp.
Để tối ưu điều kiện của hệ thống khối phổ, có thể tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn đơn của các chất phân tích và nội chuẩn vào hệ thống khối phổ không có cột Phương pháp này cho phép đánh giá nhanh các tham số vận hành và xác định độ nhạy, độ tuyến tính cũng như sự ổn định của thiết bị ở chế độ phân tích trực tiếp Việc loại bỏ cột giúp tối ưu hóa các yếu tố như dòng mẫu, áp suất và điều kiện ion hóa, từ đó đạt được điều kiện khối phổ tối ưu cho cả chất phân tích và nội chuẩn.
+ Xác định mảnh ion con có cường độ tín hiệu cao và ổn định
+ Tối ưu năng lượng phân mảnh ion mẹ thành ion con đã xác định ở trên để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất
2.2.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu [10], [14], [20], [27], [29], các điều kiện sắc ký được khảo sát nhằm tối ưu hóa quá trình tách và phát hiện đồng thời, tập trung vào các yếu tố như pha tĩnh, thành phần pha động và thể tích tiêm.
25 các chất nghiên cứu, nội chuẩn ở nồng độ khoảng ppb, pic đẹp, thời gian phân tích không quá dài
Pha tĩnh: Khảo sỏt cỏc cột sắc kớ C18 là Agilent Eclipse XBD C18 (5 àm; 4,6 x 150 mm), Acquity BEH C18 (1,7 μm; 2,1 x 50 mm)
Pha động: Khảo sát 2 hệ pha động:
- Hệ 1: Kênh A là MeOH và kênh B là H2O (đều có 5 mM amoni acetat, acid formic pH = 3,8)
- Hệ 2: Kênh A là MeOH và kênh B là H2O (đều có FA 0,1 %) Đối với mỗi hệ pha động thay đổi tỷ lệ các thành phần theo chương trình gradient
Khảo sát 3 tốc độ dòng: 0,1 ml/phút; 0,2 ml/phút; 0,3 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát thể tích tiêm 5, 10 μl
2.2.1.4 Phương pháp thu thập mẫu và khảo sát quy trình xử lý mẫu a Phương pháp thu thập và xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết tách
Tham khảo tài liệu [6], [14], [20], [27], [29], xây dựng phương pháp thu thập mẫu bùn như sau:
- Lấy bùn thải sinh hoạt từ địa điểm dự kiến
- Bảo quản ở - 20 ºC tới khi phân tích
- Rã đông trước khi phân tích, rây qua rây 1 mm để loại tạp thô như sỏi đá, cành cây, lá cây…
Trong nghiên cứu phân tích bùn thải để nhận diện các hợp chất ma túy, công tác chuẩn bị mẫu đóng vai trò then chốt nhằm đảm bảo độ tin cậy của kết quả Việc chuẩn bị mẫu bao gồm trải bùn lên nền phân tích và tiến hành làm khô, sau đó nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc và độ đồng nhất của mẫu Các phương pháp chiết tách ma túy từ bùn thải được áp dụng dựa trên nguyên lý phân tách và phân tích, đồng thời tuân thủ nghiêm ngặt yêu cầu an toàn, đạo đức và quy định pháp lý, nhằm đảm bảo kết quả phân tích chính xác và giảm thiểu rủi ro môi trường.
Trong hầu hết các nghiên cứu, cột chiết pha rắn HLB hoạt động như một cột hấp phụ cân bằng dầu-nước, phù hợp với các chất phân tích được lựa chọn Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng cột chiết pha rắn InertSep HLB FF (500 mg, 6 ml) để chiết các chất phân tích từ bùn thải.
Để xây dựng mẫu tự tạo, sử dụng 1 g mẫu bùn đã phơi khô và nghiền nhỏ, đảm bảo không chứa các chất phân tích Sau đó thêm 30 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp vào mẫu để chuẩn hóa thành phần và nồng độ, từ đó tạo ra mẫu chuẩn đáng tin cậy cho các phép đo phân tích.
Trong nghiên cứu này, AMP, KET, MAMP và MDMA được chuẩn bị ở nồng độ 100 ppb cho mỗi chất (tương ứng với khoảng 3 ng cho mỗi chất khi phân tích) Mẫu chuẩn nội gồm hỗn hợp MAMP-d5, MDMA-d5 và KET-d4 ở nồng độ 100 ppb cho mỗi chất, với thể tích 50 µL, nhằm khảo sát sự lựa chọn dung môi hòa tan mẫu và dung môi rửa giải chiết pha rắn Kết quả được so sánh với đáp ứng diện tích pic của dung dịch chuẩn chứa các chất phân tích AMP, KET, MAMP và MDMA ở nồng độ 6 ppb và các nội chuẩn MAMP-d5, MDMA-d5, KET-d4 ở 10 ppb, được trích từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb và nội chuẩn hỗn hợp.
Tham khảo tài liệu [14], [20], [29] và điều kiện sẵn có xây dựng phương pháp chiết tách các chất phân tích trong bùn thải như sau:
Bước 1 : Lấy 1 g mẫu bùn đã xử lý thô
Thêm 3 ng các chất phân tích và 5 ng các nội chuẩn (như trên) Lắc đều trong
60 giây, để ổn định 15 phút
Bước 2 : Phân tán mẫu trong dung môi:
Quy trình phân tán mẫu được thực hiện ba lần bằng 5 ml hỗn hợp dung môi hòa tan cho mỗi lần để đảm bảo sự đồng nhất Sau mỗi lần phân tán, lắc xoáy 15 giây Mẫu được siêu âm 10 phút để tăng cường hiệu quả phân tán và giải phóng các thành phần hoà tan Tiếp theo, tiến hành ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 15 phút để tách phần rắn và thu phần dịch trong Cuối cùng hút phần dịch trong và đổ vào bình đựng có thể tích 250 ml.
- Thêm nước vừa đủ 250 ml, lắc đều, đưa toàn bộ 250 ml mẫu lên cột chiết pha rắn
- Hoạt hóa: 6 ml MeOH, 6 ml H2O
- Rửa giải: bằng dung môi thích hợp
Bước 4 : Cô dịch rửa giải dưới dòng khí N2 ở nhiệt độ 40 ºC
Bước 5 : Hòa tan cắn trong 0,5 ml hỗn hợp dung môi H2O : MeOH = 9:1, lắc xoáy 60 giây
Bước 6 : Phân tích: Lấy dịch phân tích trên hệ thống LC - MS/MS
Lựa chọn các điều kiện xử lý mẫu gồm dung môi phân tán mẫu, dung môi rửa giải chiết pha rắn để đạt được hiệu suất chiết các chất phân tích cao và loại tạp tốt Để đạt được hiệu suất chiết các chất phân tích cao, loại tạp tốt, nghiên cứu thực
27 hiện khảo sát dung môi phân tán mẫu và dung môi rửa giải chiết pha rắn
* Khảo sát dung môi phân tán mẫu:
+ Hệ 1 : Đệm McIlvain pH 4,5 (có chứa EDTA 0,1 %) : MeOH = 1 : 1
(Thành phần đệm McIlvain pH 4,5 gồm 90,85 ml dung dịch Na2HPO4 0,062 M và 9,5 ml acid citric 0,091 M, thêm nước vừa đủ 1000 ml)
+ Hệ 2 : H2O (có chứa FA 0,5 %, EDTA 0,1 %) : MeOH = 1 : 1
* Khảo sát dung môi rửa giải chiết pha rắn:
+ 6 ml MeOH, 3 ml hỗn hợp MeOH : dicloromethan (1:1)
2.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
Để khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu (mẫu bùn thải chứa nhiều thành phần) đến chất phân tích trong phân tích khối phổ, tiến hành thêm chuẩn các chất AMP, MAMP, MDMA và KET ở nồng độ 6 ppb vào mẫu nền đã qua chiết, chuẩn bị 3 mẫu độc lập và bổ sung nội chuẩn MAMP-d5, MDMA-d5, KET-d4 ở nồng độ 5 ppb Đồng thời tiến hành phân tích song song với mẫu chuẩn có cùng nồng độ được pha trong dung môi H2O và không qua chiết Để đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu, so sánh đáp ứng của chất phân tích và nội chuẩn giữa mẫu nền đã được bổ sung chuẩn sau chiết và mẫu chuẩn tương ứng, từ đó tính toán hiệu ứng nền.
Yêu cầu: ảnh hưởng của nền mẫu nhỏ hơn 15 %
Chuẩn bị các mẫu chuẩn:
Để có dung dịch chuẩn gốc 10 µg/ml cho các chất Ketamine (KET), Methamphetamine (MAMP), MDMA và Amphetamine (AMP), lấy 1 ml dung dịch chuẩn 1 mg/ml của mỗi chất cho vào bình định mức 100 ml và bổ sung MeOH đến vạch Dung dịch này được dùng làm chuẩn cho phân tích định lượng các chất kích thích trong mẫu.
Để dung dịch chuẩn nội gốc MAMP-d5 và MDMA-d5 ở nồng độ 10 µg/mL, thực hiện: lấy 1 mL dung dịch chuẩn 1 mg/mL của mỗi chất cho vào bình định mức 100 mL và bổ sung MeOH đến vạch.
Dung dịch chuẩn nội gốc KET-d4 ở nồng độ 10 µg/mL được tạo bằng cách lấy 1 mL dung dịch chuẩn KET-d4 có nồng độ 100 µg/mL cho vào bình định mức 10 mL và bổ sung MeOH để đạt thể tích cuối 10 mL Dung dịch này được dùng làm chuẩn trong các phương pháp phân tích nhằm đảm bảo độ chính xác và độ ổn định của kết quả.
Trong phân tích hóa học, dung dịch chuẩn hỗn hợp được xây dựng làm tham chiếu để hiệu chuẩn và đánh giá độ nhạy của phương pháp đo, giúp xác định chính xác nồng độ và độ lặp lại của kết quả Quá trình chuẩn hóa đòi hỏi lựa chọn dung môi phù hợp, phối trộn các chuẩn ở cùng mức nồng độ và thể tích, và điều chỉnh sao cho tổng thể tích đáp ứng yêu cầu kỹ thuật Việc hiệu chuẩn đúng cách nâng cao độ tin cậy của phép đo, tối ưu hóa hiệu suất phân tích trên các kỹ thuật như HPLC hay GC-MS và đảm bảo chất lượng kết quả phân tích mẫu.
+ Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp 100 ppb: lấy 1 ml dung dịch chuẩn gốc 10 àg/ml của mỗi nội chuẩn MAMP - d5, MDMA - d5, KET - d4 cho vào bỡnh định mức
100 ml và bổ sung MeOH đến vạch
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 ppb: lấy 1 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb cho vào bình định mức 10 ml và bổ sung dung môi H2O
+ Dãy chuẩn: từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb, dung dịch chuẩn hỗn hợp
10 ppb pha dãy hỗn hợp các dung dịch chuẩn của 4 chất phân tích với các nồng độ khác nhau, thêm dung dịch chuẩn nội, sử dụng dung môi H2O
Bảo quản ở nhiệt độ 2 - 4ºC
Thẩm định phương pháp dựa trên các tiêu chí của AOAC [15] và 2002/657/EC
[19] Bao gồm các tiêu chí: a Độ thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị
Phương pháp xử lý số liệu
Những số liệu quan trọng như diện tích đỉnh (peak area), thời gian lưu (retention time) và các mảnh khối (fragment ions) của chất phân tích thu được trên sắc ký đồ bằng phần mềm tích hợp của thiết bị LC-MS/MS sẽ được thể hiện rõ nét trên cả sắc ký đồ và phổ đồ, từ đó hỗ trợ nhận diện và định lượng chính xác chất mục tiêu trong phân tích bằng LC-MS/MS.
Để tính nồng độ các ma túy trong bùn thải, ta dựa vào một phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa đáp ứng phân tích và nồng độ chất phân tích, trong đó đáp ứng được thể hiện dưới dạng tỷ số diện tích peak của chất phân tích và IS (internal standard) Với hệ số tương quan tuyến tính R ≥ 0,995, phương trình cho phép ước lượng nồng độ chất phân tích một cách chính xác và lặp lại Việc chuẩn hóa đáp ứng bằng tỷ số diện tích giúp giảm ảnh hưởng của biến động nền và điều kiện đo, từ đó tăng độ tin cậy của kết quả Nhờ mối quan hệ tuyến tính có R rất cao, phương pháp này cho phép xác định nồng độ ma túy trong bùn thải một cách tin cậy và phù hợp cho các ứng dụng phân tích môi trường.
Các số liệu phân tích được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng phương pháp phân tích
3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn đơn AMP, KET, MAMP, MDMA và các isotop d5/d4 như MAMP-d5, MDMA-d5, KET-d4 ở nồng độ 100 ppb vào hệ thống khối phổ (MS) không qua cột, với hệ dung môi methanol và nước chứa 0,1% acid formic để xác định ion mẹ và hai ion con nhằm tối ưu hóa điều kiện phân tích; từ hai ion con, ion có tín hiệu lớn và ổn định được chọn làm ion định lượng, còn lại dùng cho định tính Các thông số phân mảnh ion như điện thế Cone và năng lượng phân mảnh được tối ưu tự động bởi thiết bị khối phổ.
Kết quả khảo sát các điều kiện của nguồn ion hóa và điều kiện phân mảnh được trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2, cung cấp thông tin chi tiết về tham số tối ưu cho quá trình MS/MS Hình 3.1 thể hiện phổ MS/MS của MAMP, cho thấy đặc trưng phân tích và mức độ nhạy của hợp chất này Phổ đồ của các chất còn lại được trình bày trong Phụ lục 2 để thuận tiện tham khảo và so sánh kết quả giữa các chất.
Bảng 3.1 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa
Thông số (đơn vị) Giá trị tối ưu
Tốc độ khí (L/H) 800 Điện thế mao quản (kV) 1,0
Bảng 3.2 Các điều kiện khối phổ để phân tích các ma túy và nội chuẩn nghiên cứu
TT Tên chất/nội chuẩn
Ion định lượng Ion định tính
Hình 3.1 Phổ đồ MS/MS của MAMP
Nhận xét: các điều kiện ion hóa và điều kiện phân mảnh ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2 đã xác định được điều kiện MS/MS để phân tích các chất phân tích nghiên cứu và chất chuẩn nội Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của AMP, MAMP, MAMP-d5, MDMA, MDMA-d5, KET, KET-d4 ở dạng [M-H]+ có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z = M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Chế độ phát hiện là ESI(+) Từ đó, mỗi chất được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định danh Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS của châu Âu với số điểm nhận dạng (IP) là 4.
3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký Để khảo sát các điều kiện sắc ký, từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb và dung dịch nội chuẩn hỗn hơp 100 ppb tiến hành pha dung dịch hỗn hợp các chất phân tích AMP, KET, MAMP, MDMA nồng độ 5 ppb và nội chuẩn MAMP - d5, MDMA - d5, KET - d4 nồng độ 5 ppb bằng dung môi H2O
Tiến hành khảo sát trên cột sắc kí HPLC và UPLC C18 là Agilent Eclipse XBD C18 (5 àm; 4,6 x 150 mm) (cột 1) và Acquity BEH C18 (1,7 μm; 2,1 x 50 mm) (cột
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cùng hệ pha động nước-methanol, methanol chứa axit formic (FA) 0,1% Sắc đồ sắc ký của các chất phân tích và nội chuẩn được trình bày ở Hình 3.2, cho thấy sự phân ly giữa các thành phần và mức nhạy của hệ phân tích Đồng thời, hai loại cột khác nhau cũng được thử nghiệm và so sánh trong Hình 3.2, cho phép đánh giá ảnh hưởng của cột lên hiệu suất phân giải và độ ổn định của tín hiệu.
100 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
1.44e6 7.64 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
1.35e6 7.65 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
3.95e6 6.61 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
2.47e6 6.61 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
1.53e6 6.67 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
3.24e6 6.67 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
1.51e6 6.65 thay cot dem2 MRM of 16 Channels ES+
7.64 a Cột Agilent Eclipse XBD C18 (5àm; 4,6 x 150 mm)
Hình 3.2 Sắc đồ của các chất phân tích trong khảo sát cột sắc ký
Nhận xét cho thấy cả hai cột sắc ký đều có khả năng tách hiệu quả hỗn hợp ma túy và các nội chuẩn trong phân tích, tuy nhiên cột thứ hai với kích thước hạt nhồi nhỏ cho thấy tăng đáng kể hiệu lực tách.
MAMP AMP Sắc đồ tổng
MAMP AMP Sắc đồ tổng
Chiều dài cột ngắn 35 mm giúp giảm thời gian phân tích so với cột 1 Đồng thời, phổ phân tích từ cột 1 không cân xứng (peak bị méo), và cường độ tín hiệu cho tất cả các chất ở cột 2 lại thấp hơn Do đó, để cân bằng giữa thời gian phân tích và chất lượng dữ liệu, chúng tôi lựa chọn cột Acquity BEH C18 (1,7 μm; 2,1 x 50 mm) để nghiên cứu.
Pha động trong sắc ký lỏng khối phổ có hai mục đích chính: phân tách chất phân tích khi đưa chúng qua cột sắc ký và tác động đến quá trình ion hóa của chúng trong LC-MS Trong kỹ thuật ion hóa ESI(+), các chất cung cấp proton như axit formic, axit acetic, ammonium formate và ammonium acetate thường được thêm vào pha động để tăng cường khả năng ion hóa của chất phân tích Pha động thường gồm hai kênh riêng biệt: kênh nước và kênh dung môi hữu cơ (MeOH, MeCN).
Dung dịch chuẩn chứa hỗn hợp các chất phân tích và nội chuẩn ở nồng độ 5 ppb được dùng để tiếp tục khảo sát thành phần của pha động Quá trình khảo sát được thực hiện với các thông số khác nhau nhằm tối ưu hóa hiệu suất phân tích và độ tin cậy của phép đo; các tham số bổ sung liên quan sẽ được trình bày chi tiết ở phần tiếp theo.
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Các điều kiện khối phổ theo Bảng 3.1 và 3.2
Tiến hành khảo sát 2 hệ pha động:
- Hệ 1: Kênh A là MeOH và kênh B là H2O (đều có 5 mM amoni acetat, acid formic pH = 3,8) Với chương trình gradient như sau:
Thời gian cân bằng cột giữa các lần tiêm là 5 phút
- Hệ 2: Kênh A là MeOH và kênh B là H2O (đều có FA 0,1 %) Với chương trình gradient như sau:
Thu được kết quả như sau:
100 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
3.96 2.85 3.20 3.75 4.22 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
2.42 4.10 5.16 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
2.28 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
194.07 > 163.04 (MDMA_1) 3.08e5 2.14 2.22 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
2.28 3.05 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
2.14 2.22 2.25 2.46 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
5.43 6.35 6.76 7.03 7.15 7.60 7.80 7.85 chuanthem thu 5ppb MRM of 16 Channels ES+
Hình 3.3 Kết quả khảo sát pha động
- Hệ pha động 1: pic các chất phân tích đều bị chẻ ngọn, đối với AMP xuất hiện
MAMP-d5 MAMP AMP Sắc đồ tổng
37 nhiều pic tạp, đường nền không thẳng
- Hệ pha động 2: pic các chất phân tích đều cân xứng, gọn, đẹp
Do đó, chọn hệ pha động 2 và chương trình gradient tương ứng để tiến hành nghiên cứu
Đối với phương pháp LC-MS/MS, tốc độ dòng pha động phải phù hợp với lượng khí phun và áp suất đầu phun Nghiên cứu này được thực hiện trên cột ngắn, hạt nhỏ nên thông thường tốc độ dòng tối đa là 0,3 ml/phút Thực hiện khảo sát với 3 tốc độ dòng là 0,1 ml/phút; 0,2 ml/phút và 0,3 ml/phút để đánh giá ảnh hưởng của tốc độ dòng lên hiệu suất phân tích Kết quả thu được như sau:
- Tốc độ dòng 0,1 ml/phút: pic các chất phân tích hơi kéo đuôi, thời gian phân tích dài
- Tốc độ dòng 0,2 ml/phút: pic các chất phân tích cân đối, đáp ứng tín hiệu cao, thời gian phân tích ngắn
- Tốc độ dòng 0,3 ml/phút: thời gian phân tích ngắn, tuy nhiên đáp ứng tín hiệu thấp (hình ảnh sắc đồ chi tiết được trình bày ở Phụ lục 1)
Do vậy, chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng 0,2 ml/phút để phân tích
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LC-MS/MS Waters Xevo TQD cho phép thể tích tiêm tối đa là 10 μl Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký với các điều kiện như đã mô tả ở trên, sử dụng các thể tích 5 μl và 10 μl để đánh giá độ lặp lại và hiệu suất phân tích.
Kết quả cho thấy với thể tích tiêm 10 μl, pic các chất phân tích và nội chuẩn vẫn gọn, đẹp và cân xứng, đồng thời đáp ứng tín hiệu cao hơn so với tiêm 5 μl, và hình ảnh sắc đồ chi tiết được trình bày ở Phụ lục 1 Vì vậy, chúng tôi lựa chọn thể tích tiêm 10 μl để nghiên cứu.
3.1.3 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu a Lựa chọn dung môi phân tán mẫu
Các chất phân tích AMP, KET, MAMP và MDMA tồn tại chủ yếu ở dạng cation liên kết với các tiểu phần rắn trong bùn, nên dung môi có tính acid có thể chuyển chúng sang dạng muối và phân tán vào dung môi Nghiên cứu tiến hành khảo sát khả năng phân tán của các chất phân tích từ nền mẫu bằng hai hệ dung môi khác nhau nhằm đánh giá hiệu quả phân tích, độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp, đồng thời làm rõ ảnh hưởng của đặc tính nền mẫu đến quá trình hòa tan và phân tán muối của AMP, KET, MAMP và MDMA.
+ Hệ 1: Đệm McIlvain pH 4,5 (có chứa 0,1 % EDTA) : MeOH = 1 : 1
+ Hệ 2: H2O (có chứa 0,5 % FA và 0,1 % EDTA) : MeOH = 1 : 1
Tiến hành chiết mẫu tự tạo theo quy trình ở mục 2.2.1.4 với hai hệ dung môi; mỗi hệ dung môi tiến hành chiết ba lần Dịch chiết được đưa lên cột SPE đã hoạt hóa để thực hiện quá trình xử lý và tinh sạch Rửa giải bằng 6 ml MeOH và 3 ml hỗn hợp MeOH: dicloromethan (1:1) nhằm loại bỏ tạp chất Mẫu tự tạo sau khi chiết tách được tiêm vào hệ thống sắc ký để phân tích.
Pha mẫu chuẩn gồm các chất phân tích nồng độ 6 ppb và nội chuẩn 10 ppb Tiêm vào hệ thống sắc ký với cùng điều kiện như trên
Hiệu suất chiết được tính bằng tỷ số diện tích pic của chất phân tích trong mẫu tự tạo và mẫu chuẩn
Kết quả độ thu hồi của các chất nghiên cứu được như sau:
Hình 3.4 Kết quả khảo sát dung môi phân tán mẫu
Nhận xét cho thấy sử dụng hệ dung môi 1 cho hiệu suất chiết AMP cao hơn hệ dung môi 2 (22,67% so với 14,94%) Tuy nhiên, với các chất còn lại gồm KET, MAMP, MDMA, MAMP-d5, MDMA-d5 và KET-d4, hiệu suất chiết khi dùng hệ dung môi 2 lại cao hơn nhiều so với hệ dung môi 1; số liệu chi tiết được trình bày trong phụ lục.
Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp dựa trên các tiêu chí của AOAC [15] và 2002/657/EC
3.2.1 Độ thích hợp của hệ thống Độ thích hợp của hệ thống được đánh bằng kết quả tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất phân tích nồng độ 10 ppb và chuẩn nội nồng độ 5 ppb pha bằng dung môi H2O vào hệ thống LC - MS/MS Kết quả phân tích thu được như sau:
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC - MS/MS
Nhận xét: Kết quả cho thấy hệ số biến thiên (RSD %) của thời gian lưu rất thấp
Kết quả cho thấy RSD của tỉ lệ diện tích peak giữa các chất phân tích và chuẩn nội dao động nằm trong khoảng 0,29% đến 2,99% (dưới 5%) Như vậy, hệ thống đáp ứng đầy đủ các yêu cầu theo AOAC và cho thấy các điều kiện sắc ký đã được tối ưu, với hệ thống LC-MS/MS được sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định cho phép phân tích định lượng AMP, MAMP, MDMA và KET.
3.2.2 Độ chọn lọc/đặc hiệu
Theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) về phân tích dư lượng, một phương pháp được coi là đạt chuẩn khi có tối thiểu 4 điểm IP Trong phương pháp LC-MS này, khi tiến hành phân tích, mỗi chất phải được xác định bằng 1 ion mẹ và 2 ion con.
Việc phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn được trình bày ở Hình 3.6, trong khi sắc kí đồ của mẫu trắng thêm chuẩn được nêu ở Phụ lục 1.
100 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
2.89e3 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
4.47e4 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
7.35e3 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
2.94e3 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
2.65e3 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
1.20e4 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
2.75e5 bank 3 MRM of 16 Channels ES+
Hình 3.6 Sắc đồ mẫu trắng và mẫu chuẩn
KET-d4 KET MDMA-d5 MDMA MAMP-d5 MAMP AMP Sắc đồ tổng
Bảng 3.5 Tỷ lệ hai mảnh bắn phá của các chất nghiên cứu trong mẫu trắng thêm chuẩn
Mẫu chuẩn Thêm chuẩn Chênh lệch tỷ lệ mảnh đt/đl của mẫu chuẩn và thêm chuẩn (%)
Tỷ lệ mảnh đt/đl
Tỷ lệ mảnh đt/đl KET 167853 56051 0,3339 220328 73400 0,3331 0,24
Ghi chú: Nồng độ các chất phân tích ở 6 ppb và các nội chuẩn ở 5 ppb Nhận xét cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu trắng khi thêm chuẩn, các pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của các pic trên sắc ký đồ của các mẫu chuẩn Trong khi đó, trên sắc ký đồ mẫu trắng tại thời gian lưu của các chất phân tích AMP, MAMP, MDMA, KET đáp ứng rất thấp, không đáng kể; MAMP-d5, MDMA-d5, KET-d4 không có pic Mỗi chất phân tích đều được xác nhận bằng 1 ion mẹ và hai ion con, đạt yêu cầu về độ đặc hiệu của phương pháp LC-MS/MS với số điểm IP là 4 Ngoài ra, mỗi chất phân tích còn được xác nhận bằng chênh lệch tỷ lệ giữa các mảnh phá (tất cả đều nhỏ hơn 20%) Như vậy, độ chọn lọc của phương pháp đã đạt theo các quy định hiện hành của AOAC và châu Âu (2002/657/EC).
3.2.3 Độ tuyến tính/khoảng nồng độ định lượng Để định mối tương quan giữa nồng độ và đáp ứng của các chất phân tích, nội chuẩn tiến hành tiêm dãy chuẩn các hỗn hợp chất phân tích nồng độ từ 0,125 ppb đến
Trong các mẫu phân tích, nồng độ của chất phân tích đạt 15 ppb, trong khi nồng độ của các nội chuẩn được dùng là 5 ppb cho mỗi mẫu Dựa trên dữ liệu này, chúng tôi tính tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích so với nội chuẩn tương ứng, và kết quả được trình bày chi tiết ở phần tiếp theo Việc chuẩn hóa bằng nội chuẩn giúp ổn định tín hiệu, tăng độ lặp lại và độ tin cậy của phép đo, đồng thời cho phép so sánh tỷ lệ diện tích giữa các mẫu một cách hiệu quả.
Bảng 3.6 Kết quả xây dựng đường chuẩn
Tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và nội chuẩn tương ứng
AMP/IS MAMP/IS KET/IS MDMA/IS
Phương trình hồi quy và Hệ số tương quan
T ỷ lệ diện tích p ic ch ất ph ân tích v à nộ i c hu ẩn
Nồng độ (ppb) KET/KET-d4 MDMA/MDMA-d5 MAMP/MAMP-d5 AMP/MAMP-d5
Hình 3.7 Đường chuẩn của các chất phân tích nghiên cứu
Nhận xét: Đường tuyến tính của cả 4 chất nghiên cứu có hệ số tương quan r >
Trong khoảng nồng độ khảo sát, hệ số tương quan R = 0,995 cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích đỉnh của các chất phân tích với chuẩn nội và nồng độ của các chất phân tích được nghiên cứu Số liệu cụ thể được trình bày trong Phụ lục 4, xác nhận mối quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích đỉnh và nồng độ phân tích.
3.2.4 Độ đúng - Độ chính xác
Mẫu nền được bổ sung các chất phân tích ở nồng độ thấp 0,5 ppb, nồng độ trung bình 5 ppb và nồng độ cao 10 ppb, đồng thời cố định nồng độ nội chuẩn ở 5 ppb Mẫu được tiến hành chiết tách và phân tích theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.1.5 Để tính kết quả lượng chuẩn tìm lại, dựa vào đường chuẩn phân tích cùng ngày với hệ số tương quan r ≥ 0,995 và tỷ lệ đáp ứng giữa chất phân tích và nội chuẩn, cùng với hệ số chuyển đổi cho AMP (bằng tỷ số hiệu suất chiết của MAMP-d5 và AMP) Phân tích được lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ Kết quả phân tích thu được như sau:
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của phương pháp
Nhận xét cho thấy tại nồng độ 0,5 ppb, độ đúng của các chất phân tích dao động từ 69,96% đến 114,47% (nằm trong khoảng 40%–120%), với hệ số biến thiên RSD từ 1,87% đến 7,25% (< 30%) Ở nồng độ 5 ppb và 10 ppb, độ đúng dao động từ 88,40% đến 108,11% (nằm trong khoảng 60%–115%), và hệ số biến thiên RSD từ 0,68% đến 1,88% (< 21%) Như vậy, phương pháp được xây dựng cho độ đúng và độ chính xác đáp ứng đầy đủ yêu cầu của AOAC và 2002/657/EC.
3.2.5 Giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp xử lý mẫu và phân tích
Tiến hành chiết tách và phân tích các mẫu tự tạo chứa các chất phân tích ở nồng độ 0,1 ppb; 0,2 ppb; 0,3 ppb và nội chuẩn 5 ppb theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.1.5 Lượng chuẩn thêm vào được tính dựa trên đường chuẩn xây dựng cùng ngày phân tích với r > 0,995 Đối với AMP, do hiệu suất chiết của AMP (14,94%) và chuẩn nội MAMP (39,09%) chênh lệch lớn nên phải kết hợp với hệ số chuyển.
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát LOQ của phương pháp Nồng độ
Nhận xét cho thấy tại các nồng độ khảo sát LOQ của quy trình xử lý mẫu và phân tích, giá trị tín hiệu/nhiễu (S/N) của các chất tương ứng đều lớn hơn nhiều lần so với ngưỡng 10, cho thấy độ đúng và độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC và 2002/657/EC Như vậy, LOQ của quy trình xử lý mẫu và phân tích đối với KET và MDMA là 0,1 ppb; LOQ của MAMP là 0,2 ppb; LOQ của AMP là 0,5 ppb.
Giới hạn phát hiện (LOD)
Thêm chuẩn vào mẫu nền đã qua chiết tách, sau đó pha loãng dần bằng mẫu trắng đến khi đáp ứng S/N > 3 Kết quả được thu được như sau:
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát LOD
STT Tên chất LOD của quy trình phân tích
MRM of 16 channels,ES+ 194.07 > 163.04 0,018 ppb-1 Smooth(Mn,2x3)
Hình 3.8 Sắc đồ các chất phân tích ở mức nồng độ LOD
Nhận xét: Từ kết quả phân tích cho thấy LOD của AMP và KET là 0,054 ppb;
MAMP là 0,036 ppb và MDMA là 0,018 ppb
Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AMP, MAMP, KET và MDMA trong nước thải bằng LC-MS/MS, sử dụng chuẩn nội MAMP-d5, MDMA-d5 và KET-d4, với quy trình xử lý mẫu được phân tán trong dung môi ở áp suất thường kết hợp với chiết pha rắn Kết quả cho thấy phương pháp có độ chọn lọc cao, tuyến tính từ 0,125 đến 15 ppb, và độ đúng, độ chính xác đạt yêu cầu của AOAC, với giới hạn định lượng thấp từ 0,1 đến 0,5 ppb.
Ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng ma túy trong một số mẫu bùn thải thu thập được
Mẫu bùn được lấy từ sông Kim Ngưu, nơi mật độ dân cư đông đúc và nước thải sinh hoạt được xả thẳng vào sông mà không qua xử lý.
Các mẫu được thu thập theo quy trình 2.1.1 và sau đó được xử lý qua giai đoạn xử lý mẫu thô, bổ sung nội chuẩn đồng vị và tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng (Phụ lục 6).
Cách kí hiệu vị trí lấy mẫu: Pa - xxyyzz
Trong đó: a: kí hiệu vị trí lấy mẫu
- a = 1: điểm phát lộ đầu tiên ở sông Kim Ngưu
- a = 2: điểm cách đầu vào nhà máy xử lý nước Yên Sở khoảng 500 m xx, yy, zz: lần lượt là ngày, tháng, năm lấy mẫu
Kết quả phân tích mẫu thử được minh họa ở Hình 3.10 và thể hiện ở Bảng 3.10, Hình 3.9 Các sắc ký đồ mẫu thử còn lại được trình bày trong Phụ lục 5
Hình 3.9 Sắc đồ phân tích mẫu bùn Bảng 3.10 Kết quả phân tích mẫu bùn
Tên mẫu Trong mẫu phân tích (ppb) Tính trên bùn khan (ppb)
KET MDMA MAMP AMP KET MDMA MAMP AMP
KET-d4 KET MDMA-d5 MDMA MAMP-d5 MAMP
KET-d4 KET MDMA-d5 MDMA MAMP-d5 MAMP AMP Sắc đồ tổng
(-) Không phát hiện trong mẫu (< LOD) (+) Nồng độ trong khoảng LOD đến LOQ
Hình 3.10 Biểu đồ nồng độ các chất phân tích trong mẫu bùn nghiên cứu
Phân tích 14 mẫu cho thấy tất cả các mẫu đều có KET, MDMA, MAMP; có 2 mẫu chứa AMP Cụ thể:
- KET nồng độ từ đến 0,85 ppb đến 5,36 ppb;
- MDMA nồng độ từ 0,63 ppb đến 2,26 ppb;
- MAMP nồng độ từ 2,89 ppb đến 11,27 ppb;
Trong tổng số mẫu được kiểm tra, có 2 mẫu chứa AMP với nồng độ 0,56 ppb và 0,60 ppb; 9 mẫu phát hiện AMP có nồng độ nằm trong khoảng từ LOD đến LOQ; 3 mẫu không phát hiện AMP.
53 MAMP có nồng độ trung bình cao nhất (5,29 ± 2,16 ppb) sau đó đến KET (2,42 ± 1,18 ppb), MDMA (1,35 ± 0,47 ppb) và AMP