TRỊNH THỊ QUỲNH TRANG NGHIÊN cứu CHIET XUẤT và TINH CHE TANSHINON IIA từ dược LIỆU ĐAN sâm làm CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIEM NGHIỆM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae được nghiên cứu với các mục tiêu: • Xây dựng

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ QUỲNH TRANG

Mã sinh viên: 1701618

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ

DƯỢC LIỆU ĐAN SÂM LÀM CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG

TÁC KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Chử Thị Thanh Huyền

2 ThS Bạch Thị Thắm

Nơi thực hiện:

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Bộ môn DHCT – Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2022

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày những nội dung thuộc đề tài nghiên cứu của mình, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã luôn đồng hành, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học tại Khoa Đông Dược – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn của tôi là

TS Chử Thị Thanh Huyền – giảng viên Bộ môn Dược học Cổ truyền, trường Đại học

Dược Hà Nội và ThS Bạch Thị Thắm – Khoa Đông Dược, Dược liệu – Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung ương đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị Khoa Đông Dược, Dược liệu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn chân thành nhất cho gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt những năm tháng học tập và nghiên cứu ở mái trường

này Đặc biệt, tôi xin cảm ơn bạn Bùi Thị Ngân đã luôn đồng hành, chia sẻ buồn vui và

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu ở bộ môn

Hà Nội, ngày 27 tháng 06 năm 2022

Sinh viên

Trịnh Thị Quỳnh Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về dược liệu Đan sâm 2

1.1.1 Mô tả 2

1.1.2 Tác dụng 2

1.1.3 Thành phần hóa học 3

1.1.3.1 Thành phần tan trong dầu 3

1.1.3.2 Thành phần tan trong nước 3

1.1.3.3 Các thành phần khác 4

1.2 Tổng quan về tanshinon IIA 4

1.2.1 Đặc tính và tính chất của tanshinon IIA 5

1.2.2 Tác dụng dược lý 6

1.3 Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế tanshinon IIA 6

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.1.1 Nguyên liệu 10

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 10

2.1.3 Hóa chất, dung môi 10

2.1.4 Chất chuẩn 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.2.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm 11

2.2.2 Chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu 11

2.3.1 Phương pháp đánh giá hàm lượng tanshinon IIA trong dược liệu Đan sâm 11

2.3.1.1 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 11

2.3.1.2 Định tính, định lượng tanshinon II A bằng phương pháp HPLC 12

2.3.2 Phương pháp đánh giá hàm lượng tanshinon IIA trong cao Đan sâm 13

2.3.3 Chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 14

2.3.3.1 Chiết xuất 14

2.3.3.2 Tinh chế sử dụng phương pháp sắc ký cột 14

2.3.4 Định tính chất tanshinon IIA tinh chế được 15

2.3.5 Xác định hàm lượng của chất tanshinon IIA tinh chế được 15

2.3.6 Xác định giới hạn tạp chất liên quan của tanshinon IIA tinh chế được 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU 18

3.1 Quy trình chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 18

3.1.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm 18

3.1.1.1 Mô tả 18

3.1.1.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 18

3.1.1.3 Định tính, định lượng tanshinon II A bằng phương pháp HPLC 19

3.1.2 Quy trình chiết xuất tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 21

3.1.3 Quy trình tinh chế tanshinon IIA 23

3.1.3.1 Tinh chế tanshinon II A trên cột sắc ký pha thuận 23

3.1.3.2 Tinh chế tanshinon II A trên cột sắc ký pha đảo 26

3.2 Định tính chất tinh chế được 32

3.2.1 Tính chất 32

3.2.2 Phổ hồng ngoại 32

3.2.3 Phân tích khối phổ 32

3.2.4 Định tính bằng HPLC 34

3.3 Xác định hàm lượng tanshinon IIA tinh chế được 35

3.4 Xác định giới hạn tạp chất 37

3.5 Tóm lược kết quả nghiên cứu 39

BÀN LUẬN 40

KẾT LUẬN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

A Tài liệu tiếng Việt

B Tài liệu tiếng Anh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ASB Acid salvianolic B

BP Dược điển Anh

CP Chinese Pharmacopeia (Dược điển Trung Quốc)

DAD Diod Array Detector

DĐVN Dược điển Việt Nam

DMSO Dimethyl sulfoxide

EtOAc Ethyl acetat

HLPC High Performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

IR Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại)

MeOH Methanol

RP Reversed phase (Pha đảo)

RSD Realative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SKĐ Sắc ký đồ

Tan IIA Tanshinon IIA

TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

USP United State Pharmacopeia (Dược điển Mỹ)

UV-VIS Ultraviolet visble (Tử ngoại – khả kiến)

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Độ tan của tanshinon IIA trong các dung môi 5

Bảng 2.1: Các dung môi hóa chất sử dụng trong đề tài 11

Bảng 2.2: Các chuẩn sử dụng trong đề tài 11

Bảng 3.1: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn tanshinon IIA 20

Bảng 3.2: Kết quả tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon IIA

trong dược liệu

20

Bảng 3.3: Kết quả định lượng tanshinon IIA trong dược liệu 21

Bảng 3.4: Kết quả tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon IIA

trong cao

22-23

Bảng 3.5: Kết quả định lượng tanshinon IIA trong cao dược liệu 23

Bảng 3.6: Các thông số cột sắc ký tinh chế tanshinon IIA trên cột RP 28

Bảng 3.7: Tổng hợp các kết quả đo phổ khối 32

Bảng 3.8: Kết quả thời gian lưu của chất chuẩn và mẫu thử 34

Bảng 3.9: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn tanshinon IIA 35

Bảng 3.10: Kết quả tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon IIA

tinh chế được

35-36

Bảng 3.11: Kết quả định lượng tanshinon IIA tinh chế được 36

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 37-38

Bảng 3.13: Kết quả xác định hàm lượng tạp chất 38

DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm 2

Hình 1.2: Cấu trúc một số diterpenoid có trong rễ cây Đan sâm 3

Hình 1.3: Cấu trúc một số acid phenolic 4

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA 5

Hình 3.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm (mẫu nghiên cứu) 18

Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng định tính Đan sâm 18

Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b), kết quả chồng

phổ DAD (c)

19

Hình 3.4: Sơ đồ chiết xuất tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 22

Hình 3.5: Hình ảnh sắc ký đồ HPLC cao Đan sâm 22

Hình 3.6: Hình ảnh TLC khảo sát dung môi đưa lên cột sắc ký pha

Hình 3.10a: SKĐ TLC lọ số 1.1 đến 1.10 trong cột pha đảo số (1) 29

Hình 3.10b: SKĐ TLC lọ số 1.11 đến 1.80 trong cột pha đảo số (1) 29

Hình 3.11: SKĐ HPLC phát hiện sự có mặt của tanshinon IIA trên cột

sắc ký pha đảo (2)

30

Hình 3.12: Sơ đồ tóm tắt quy trình tinh chế tanshinon IIA 31

Hình 3.13: Phổ IR của mẫu thử và mẫu chuẩn tanshinon IIA 32

Hình 3.14: Phổ khối của mẫu chuẩn tan IIA và chất tinh chế được 33

Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi, mẫu thử và mẫu chuẩn 34

Hình 3.16: Chồng phổ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn tanshinon IIA 34

Hình 3.17: Sắc ký đồ dung môi, mẫu đối chiếu (2), (1) và mẫu thử 37

Hình 3.18: Tóm tắt quy trình chiết xuất, tinh chế tanshinon IIA từ

dược liệu Đan sâm

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dược liệu Đan sâm là một vị thuốc quý, được sử dụng rộng rãi, phổ biến ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ và Châu Âu trong điều trị bệnh liên quan đến tim mạch [13], [31], sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với thuốc khác để điều trị cho hiệu quả tốt và ít tác dụng phụ [7] Theo Y học cổ truyền, Đan sâm có công năng hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, thanh tâm lương huyết; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyền tích hòn cục, tâm phiền mất ngủ, đau thắt ngực [2], [6] Theo

Y học hiện đại, Đan sâm đã được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về mạch máu, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu và đột quỵ ở nhiều nước trên thế giới [11], [19]

Nhằm kiểm soát chất lượng của dược liệu Đan sâm, Dược điển của các nước (Dược điển Việt Nam V, Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ dữ liệu dược liệu chuẩn của Hồng Kông, Dược điển Nhật Bản 17, Dược điển Mỹ, Dược điển Anh,….) đã đưa ra nhiều phương pháp khác nhau Về hóa học, các chuyên luận ở các dược điển thường quy định

về chỉ tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng bằng phương pháp HPLC có xác định hàm lượng hai marker là acid salvianolic B và tanshinon IIA Trong đó, hàm lượng tanshinon IIA được quy định không dưới: 0,2% (DĐVN V); 0,25% (CP2015); 0,12% (Hồng Kông, BP 2020); và 0,1% (USP 42) Theo các tài liệu công bố, tanshinon IIA là thành phần hoạt chất chính và được sử dụng làm chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm như quy định trong Dược điển Trung Quốc (CP 2015) Hiện tại, các chế phẩm đông dược Đan sâm ở Việt Nam cũng được đánh giá về hàm lượng tanshinon IIA theo quy định

Việc kiểm soát chất lượng dược liệu Đan sâm đòi hỏi phải có các chất chuẩn trong đó có tanshinon IIA Đến nay chuẩn tanshinon IIA phải đặt mua từ nước ngoài, giá thành cao, thời gian cung cấp bị kéo dài gây khó khăn cho các đơn vị kiểm nghiệm Ở nước ta, tanshinon IIA đã được phân lập, tinh chế [1], [3] nhưng chưa có chuẩn tanshinon IIA được thiết lập tại Việt Nam

Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ

dược liệu Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) được nghiên cứu với các

mục tiêu:

• Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm

• Chiết xuất và tinh chế được tanshinon IIA đạt hàm lượng trên 90,0 %

Dược liệu từ cây trồng tương đối mập chắc, đường kính 0,5 cm đến 1,5 cm Mặt ngoài màu nâu đỏ, có nếp nhăn dọc, phần vỏ bám chặt vào gỗ khó bóc ra Thể chất chắc, mặt bẻ gãy tương đối phẳng, hơi có dạng chất sừng [2]

Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm

1.1.2 Tác dụng

- Theo Y học cổ truyền: Đan sâm có vị đắng, tính mát, quy kinh tâm, can; công

năng hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, thanh tâm lương huyết; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyền tích hòn cục, tâm phiền mất ngủ, đau thắt ngực [2], [6]

- Theo Y học hiện đại: Đan sâm đã được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về

mạch máu, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu và đột quỵ ở nhiều nước trên thế giới [11], [19] Các thuộc tính có lợi của Đan sâm cũng bao gồm cải thiện lưu lượng máu và giải quyết ứ máu [23]

1.1.3 Thành phần hóa học

- Thành phần hóa học: Hiện nay đã có hơn 100 chất hóa học được chiết tách và xác định từ Đan sâm Dựa vào tính tan của các chất hóa học có thể chia các nhóm trong thành phần Đan sâm gồm 3 loại: Thành phần tan trong dầu, thành phần tan trong nước và các thành phần khác [31]

1.1.3.1 Thành phần tan trong dầu

Thành phần tan trong dầu là các diterpenoid bao gồm 7 nhóm chính: Các dẫn chất phenanthro furan quinon, các phenanthren, spiro ketal lacton, dẫn chất phenalenofuran diterpen, dẫn chất phenanthropyrandion, dẫn chất furonaphthopyrane và phenathro [1,2-b] furan-10,11-dion Các nhóm trên bao gồm trên 40 hợp chất: tanshinon IIA, tanshinon IIB, przewaquinon A, cryptotanshinon, có nhiều tác dụng sinh học và tạo ra màu của Đan sâm

Trong số các thành phần tan trong dầu, tanshinon IIA, cryptotanshinon, dihydrotanshinon và tanshinon I là các diterpen chính có trong Đan sâm [29]

Hình 1.2: Cấu trúc một số diterpenoid có trong rễ cây Đan sâm 1.1.3.2 Thành phần tan trong nước

Thành phần tan trong nước: Bao gồm các acid phenolic và dẫn chất Các acid phenolic đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trong 20 năm qua vì chúng có tác dụng dược lý đáng chú ý và sự thuận tiện của việc sử dụng các loại thảo mộc thông thường bằng cách sắc với nước Hơn 30 acid phenolic đã được phân lập từ Đan sâm bao gồm acid salvianolic A, acid salvianolic B, acid salvianolic C, acid protocatechuic, danshensu, acid lithospermic và các dẫn xuất khác [8], [23]

Hình 1.3: Cấu trúc một số acid phenolic 1.1.3.3 Các thành phần khác

Các thành phần khác: Các thành phần thu được từ cao chiết ethanol như: Sitosterol, baicalin, ursolic acid và daucosterol, trong khi vitamin E, tannin và 5,31-dihydroxy-7,41-dimethoxy flavanone được phân lập từ dịch chiết ethyl acetate [17]

1.2 Tổng quan về tanshinon II A

Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Mỹ, Anh

và Việt Nam cùng với acid salvianolic B thì tanshinon IIA là chất chuẩn được dùng để định tính, định lượng dược liệu Đan sâm và các chế phẩm có chứa Đan sâm Tanshinon IIA là một trong hơn 40 chất thuộc nhóm diterpeniod tan trong dầu [5]

1.2.1 Đặc tính và tính chất của tanshinon II A

- Tên khoa học: 1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-naphthol[1,2-g] 10,11-dion [8]

benzofuran Công thức phân tử: C19H18O3

- Khối lượng phân tử: 294,34 g/mol

- Tính chất vật lý:

+ Tanshinon IIA là chất kết tinh màu đỏ đến đỏ cam

+ Độ tan: Thực tế không tan trong nước, khó tan trong methanol và ethanol, tan trong các dung môi hữu cơ như ethyl acetat, hexan, …, độ tan thể hiện qua bảng sau [14]

Bảng 1.1: Độ tan của tanshinon IIA trong các dung môi

Dung môi Độ tan (25ºC) (mg/l) Số ml dung môi hòa tan 1 g mẫu

- Tanshinon IIA có nhân thơm nên có thể hấp thụ mạnh UV-VIS, hấp thụ mạnh UV

ở bước sóng từ 254-280 nm và có cực đại hấp thụ UV trong methanol ở bước sóng 270

nm [4]

1.2.2 Tác dụng dược lý

- Tác dụng hạ lipid máu: tanshinon IIA có tác dụng hạ nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết tương, giảm đáng kể nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết tương, kèm theo giảm đáng kể nồng độ cholesterol toàn phần của gan và triglyceride [5], [13]

- Chống xơ vữa: tanshinon IIA có thể làm mất sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu và làm giảm sự tăng sản nội bào trong sự phát triển của chứng xơ vữa động mạch [9], [13], [28] Ngoài ra, tanshinon IIA làm giảm xơ vữa động mạch bằng cách ức chế phản ứng chống viêm nhờ vào tác động ngăn chặn hiệu quả sự bất thường của NF-

κB và làm giảm mức độ biểu hiện của các cytokine tiền viêm [30]

- Chống thiếu máu cơ tim: tanshinon IIA có tác dụng bảo vệ cơ tim chống lại những rối loại về chức năng và chuyển hóa gây ra bởi thiếu hụt oxy [26]

- Chống tăng huyết áp: tanshinon IIA tác động lên huyết áp thông qua giảm áp lực động mạch trung bình phổi ở chuột bị tăng huyết áp do thiếu oxy [18]

- Bảo vệ hệ thần kinh: nghiên cứu của Lin và cộng sự cho thấy tanshinon IIA có khả năng cân bằng sự thiếu hụt bộ nhớ thông qua Ab1-42 ở chuột [22] Nghiên cứu của Qian và cộng sự chứng minh rằng tashinon IIA có khả năng bảo vệ thần kinh chống lại độc tính của tế bào do Aβ gây ra (thông qua việc kích hoạt Bcl-xL pNeuroprotection) [25]

- Chống ung thư: tanshinon IIA gây ra quá trình apotosis thông qua các cơ chế phân

tử khác nhau và ức chế sự lây lan của ung thư [10], [12]

1.3 Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế tanshinon II A

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Sự chú ý dành cho các tanshinon nói chung và tanshinon IIA nói riêng trên thế giới

đã xuất hiện từ những thập kỷ cuối của thế kỷ XX bởi vai trò quan trọng của nó trong hoạt tính sinh học của dược liệu Đan sâm Với tính chất thân dầu, tanshinon IIA tan tốt trong các dung môi hữu cơ không hoặc ít phân cực hơn so với trong các dung môi phân cực Do đó, các dung môi thường dùng để chiết xuất tanshinon IIA (cùng với các tanshion khác) cũng là các dung môi hữu cơ có khả năng hòa tan các hợp chất ít phân cực như: methanol, ethanol, aceton, ethyl acetat, n-hexan, tetrafloroethan, dicloromethan, ether dầu hỏa,… Để tăng tốc độ và hiệu suất chiết, quá trình chiết thường là chiết nóng hoặc chiết bằng siêu âm Phương pháp chiết xuất tiên tiến hơn là dùng CO2 siêu tới hạn, về bản chất cũng là sử dụng một dung môi không phân cực Quá trình phân lập và tinh chế tanshinon IIA từ hỗn hợp chiết được hay được thực hiện bằng phương pháp: tách bằng các nhựa hấp phụ có lỗ xốp thô (macroporous resin), có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký: sắc ký ngược dòng tốc độ cao (High-speed counter-current chromatography (HSCCC)), sắc ký ngược dòng tốc độ cao đa chiều (Multidimensional high-speed

counter-current chromatography (HSCCC)), sắc ký ngược dòng hiệu năng cao performance counter-current chromatography), sắc ký lỏng điều chế hiệu năng cao,… Năm 1998, J.R Dean và cộng sự so sánh chiết xuất tanshinon IIA từ Đan sâm bằng phương pháp chiết xuất với CO2 siêu tới hạn và bằng tetrafloroethan phối hợp thêm dung môi hữu cơ khác Kết quả cho thấy chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn có thêm 10% methanol cho hiệu suất chiết cao nhất (0,038% kl/kl), chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn không phối hợp methanol và chiết xuất bằng tetrafloroethan phối hợp thêm dung môi hữu cơ khác cho hiệu suất tương tự nhau (0,029 – 0,032% kl/kl) [15]

(High-Năm 2001, Hua-Bin Li và cộng sự nghiên cứu phân lập và tinh chế 6 hợp chất diterpenoid trong đó có tanshinon IIA từ Đan sâm bằng phương pháp sắc ký ngược dòng tốc độ cao (High-speed counter-current chromatography (HSCCC)) Đầu tiên, hỗn hợp các diterpenoid được chiết xuất từ rễ Đan sâm bằng hỗn hợp dung môi ethanol–n-hexan (1:1, tt/tt) Sắc ký ngược dòng tốc độ cao được triển khai với hệ 2 loại dung môi là hỗn hợp n-hexane–ethanol–water (10:5.5:4.5, tt/tt) và hỗn hợp n-hexane–ethanol–water (10:7:3, tt/tt) đã cho ra 6 terpenoid có độ tinh khiết đạt 88,1 – 98,8%, trong đó độ tinh khiết của tanshinon IIA đạt 96,8% [21]

Năm 2002, Guilian Tian và cộng sự nghiên cứu phân lập và tinh chế 4 hợp chất diterpenoid trong đó có tanshinon IIA từ Đan sâm bằng phương pháp sắc ký ngược dòng tốc độ cao đa chiều (Multidimensional high-speed counter-current chromatography (HSCCC)) Đầu tiên, hỗn hợp các diterpenoid được chiết xuất từ rễ Đan sâm bằng dầu hỏa nhẹ Sắc ký ngược dòng tốc độ cao được triển khai với hệ dung môi gồm dầu hỏa nhẹ, ehtyl acetat, methanol và nước với các tỷ lệ khác nhau (1:1:1:1), (1:4:2:2), (2:3:3:2), (2:3:2.5:1,7) và (2:3:2.5:1,8) Tất cả các hệ dung môi này đều tách được tanshinon IIA

ra khỏi các chất chưa biết khác trong hỗn hợp chiết được bằng dầu hỏa nhẹ Cả 4 hợp chất diterpenoid được phân lập và tinh chế đều đạt độ tinh khiết trên 95% [27]

Năm 2011, Min Zhang và cộng sự nghiên cứu phân lập và tinh chế tanshinon IIA

và cryptotanshinon từ Đan sâm bằng phương pháp sắc ký ngược dòng hiệu năng cao (High-performance counter-current chromatography) Đầu tiên, rễ Đan sâm được chiết siêu âm bằng hỗn hợp dung môi methanol và dicloromethan (4:1, tt/tt) ở nhiệt độ phòng Quá trình phân lập phân đoạn chứa các tanshinon được thực hiện trên nhựa có lỗ xốp thô, thu được phân đoạn tanshinon IIA với tỷ lệ tanshinon IIA trong hỗn hợp là 17,0% Sau đó tanshinon IIA và cryptotanshinon tiếp tục được phân lập qua hai giai đoạn với phương pháp tiêm nhiều lần trên hệ thống sắc ký ngược chiều điều chế (Preparative counter-current chromatography) Nghiên cứu đã tinh chế được tanshinon IIA với độ tinh khiết 97% và tỷ lệ thu hồi là 34,4% từ cao chiết thô [24]

Năm 2016, Wei-Der Lee và cộng sự nghiên cứu so sánh hiệu suất chiết các tanshinon trong đó có tanshinon IIA từ Đan sâm bằng 2 phương pháp là chiết siêu âm

với dung môi hữu cơ (gồm có methanol, ethanol, aceton và ethyl acetat) và chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn Hiệu suất chiết tổng các tanshinon cao nhất chiết được bằng CO2 siêu tới hạn là 2869,9 µg/g đạt được với các thông số: nhiệt độ chiết xuất là 70 oC, áp suất 400 bar Đối với phương pháp chiết bằng các dung môi hữu cơ, hiệu suất chiết tổng các tanshinon cao nhất đạt được khi sử dụng methanol hoặc ethanol, hiệu suất tương ứng là 3103,1 µg/g và 3021,6 µg/g Các tác giả đề xuất để chiết xuất các tanshinon với quy mô lớn, có thể sử dụng ethanol thay vì methanol hoặc CO2 siêu tới hạn vì tính an toàn và hiệu suất cao khi chiết bằng dung môi này Nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chiết xuất hỗn hợp các tanshinon, chưa phân lập, tinh chế các tanshinon này [20]

Năm 2018, Hongwei Gao và cộng sự nghiên cứu phân lập và tinh chế đồng thời 4 hợp chất tanshinon trong đó có tanshinon IIA từ Đan sâm trong đó tanshinon IIA có độ tinh khiết là 98,6% Quá trình chiết xuất Đan sâm được thực hiện bằng cách đun hồi lưu với dung môi ethanol 95% Nghiên cứu sử dụng nhựa hấp phụ có lỗ xốp thô (các loại D101, HPD100, HPD600, LX-11, LX-38, XDA-6 và AB-8) kết hợp với sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế để phân lập và tinh chế các tanshinon Phương pháp này có hiệu quả cao, kinh tế và ít nhiễm tạp, có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp [16]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

So với Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận “Đan sâm” trong Dược điển Việt Nam V đã có thêm chỉ tiêu định lượng với 2 chất chuẩn là tanshinon IIA và acid salvianolic B Trong nước, một vài năm gần đây cũng đã có những nghiên cứu bước đầu

về chiết xuất, phân lập và tinh chế tanshinon IIA

Năm 2017, Đào Thị Hồng Bích nghiên cứu phân lập và định lượng tanshinon IIA

từ cây Đan sâm Rễ Đan sâm được chiết bằng phương pháp chiết siêu âm với dung môi

là ethanol 80% ở 40oC Cao cồn toàn phần sau khi loại dung môi được phân tán lại vào

nước, sau đó phân lập bằng cách chiết lỏng – lỏng với n-hexan Chất chiết được được

tiếp tục phân lập bằng sắc ký với cột nhồi silica gel với dung môi rửa giải là EtOAc (5:1) thu được 7 phân đoạn Phân đoạn 2 được tiếp tục phân lập bằng sắc ký với cột nhồi silica gel với dung môi rửa giải là hexan - CH2Cl2 (1:1) kết hợp với sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ pha động MeOH - H2O (4:1) đã phân lập được tanshinon IIA Sản phẩm sau đó được kiểm tra các tính chất lý hóa, chứng minh cấu trúc để xác nhận là tanshinon IIA [1]

hexan-Tiếp nối kết quả nghiên cứu trên, năm 2018, Nguyễn Thị Chuyên nghiên cứu bước đầu thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA So với quy trình của Đào Thị Hồng Bích năm 2017, quy trình của Nguyễn Thị Chuyên có thêm bước tinh chế lại sản phẩm sau khi phân lập bằng methanol để thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao hơn Đánh giá độ tinh khiết của tanshinon IIA phân lập được bằng phương pháp TLC và HPLC cho thấy tanshinon IIA tinh

chế được có độ tinh khiết cao (96,57%), các pic phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi pic chất chính Sản phẩm tanshinon IIA tinh chế được có giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan không quá 5,0%, có tiềm năng phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu [3]

Năm 2020, Nguyễn Thị Phương Dung đã thực hiện nghiên cứu chiết xuất bằng phương pháp chiết ngâm nóng với dung môi ethanol 50% cho hiệu suất chiết của tanshinon IIA tới 90,23% và ASB là 73,28% Sau đó làm giàu đồng thời hai hoạt chất này trong cao Đan sâm bằng nhựa macroporous D101 Kết quả của nghiên cứu đạt được hiệu suất thu hồi ASB là 66,59% và tanshinon IIA là 70,09% [4]

Qua các tài liệu tham khảo được, quy trình chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA được

dự kiến đưa ra như sau:

Giai đoạn 1: Chiết xuất tanshinon IIA ra khỏi nền mẫu dược liệu, tạo cao Đan sâm

Giai đoạn 2: Tinh chế tanshinon IIA từ cao Đan sâm bằng cách cho lần lượt qua cột sắc ký pha thuận và pha đảo với dung môi rửa giải thích hợp

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Dược liệu Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) được mua của công ty

Dược phẩm Bách Thông (382 Ngọc Thụy – Long Biên – Hà Nội)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu được quản lý theo hệ thống quản lý chất lượng đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương bao gồm:

- Máy HPLC SHIMADZU;

- Máy đo phổ hồng ngoại NILOLET iS50 NIR (Thermo);

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Xevo TQD;

- Cân kỹ thuật METTLER TOLEDO (d=1mg);

- Cân phân tích METTLER TOLEDO (d=0,1mg);

- Tủ sấy MEMMERT UL40;

- Tủ bảo quản lạnh TOSHIBA;

- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S100;

- Cột sắc ký Inertsil RP-18 (250 x 4,6 mm; 5 µm);

- Bản mỏng Silica gel 60 GF254 (Merck);

- Bản mỏng Silica gel 60 RP-18 GF254 (Merck);

- Silica gel 60 (40-63 µm) (Merck);

- Silica gel 60 (63-200 µm) (Merck);

- Silica gel RP-18 nhồi cột cỡ hạt 75 µm (YMC*GEL ODS - A);

- Silica gel RP-18 nhồi cột cỡ hạt 150 µm (YMC*GEL ODS - A);

- Nồi cách thủy;

- Bộ cất quay chân không BÜCHI V-850;

- Tủ hốt;

- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45μm;

- Bộ dụng cụ sinh hàn;

- Pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác

2.1.3 Hóa chất, dung môi

Hóa chất, thuốc thử đáp ứng yêu cầu sử dụng trong phòng thí nghiệm đạt chứng nhận về hệ thống quản lý chất lượng theo ISO/IEC 17025 và GLP

Danh mục dung môi hóa chất đã sử dụng trong đề tài được liệt kê dưới Bảng 2.1

Bảng 2.1: Các dung môi hóa chất sử dụng trong đề tài STT Tên dung môi, hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

3 Ethanol tuyệt đối Việt Nam Tinh khiết phân tích

5 Ether dầu hỏa (60°C đến 90°C) Merck Tinh khiết phân tích

2.1.4 Chất chuẩn

Chuẩn sử dụng trong đề tài bao gồm chuẩn dược liệu và chất chuẩn hóa học:

Bảng 2.2: Các chuẩn sử dụng trong đề tài

STT Chuẩn Nguồn gốc Số lô Hàm lượng

(nguyên trạng)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu theo chuyên luận Đan sâm trong dược điển Việt Nam V [trang 1152-1153] các chỉ tiêu hình thức, định tính bằng phương pháp TLC, định lượng tanshinon IIA bằng phương pháp HPLC

2.2.2 Chiết xuất và tinh chế tanshinon II A từ dược liệu Đan sâm

- Nghiên cứu tìm quy trình chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm có tính khoa học và ổn định

- Áp dụng quy trình trên để chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan

sâm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đánh giá hàm lượng tanshinon II A trong dược liệu Đan sâm

Tiến hành kiểm tra nguyên liệu theo chuyên luận Đan sâm trong DĐVN V [trang 1152-1153] các chỉ tiêu: mô tả, định tính và định lượng

2.3.1.1 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành định tính nguyên liệu Đan sâm như mô tả trong DĐVN V

- Điều kiện sắc ký

Bản mỏng: Silica gel G

Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa (60 °C đến 90 °C) - ethyl acetat (4 : 1)

- Chuẩn bị các dung dịch

Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml ether, lắc kỹ, để yên 1 h, lọc Bốc

hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn, hòa tan cắn trong 1 ml ethyl acetat dùng làm dung dịch thử

Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 1 g bột Đan sâm (mẫu chuẩn), tiến hành chiết

như mô tả ở phần Dung dịch thử

(TT) để thu được dung dịch có nồng độ 2 mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên Sau khi

triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí Quan sát dưới ánh sáng thường

- Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng giá trị Rf và màu

sắc với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu và có một vết màu đỏ đậm có cùng màu sắc và giá trị Rf với vết của tanshinon IIA trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu

Tiến hành phân tích định tính, định lượng tanshinon IIA trong nguyên liệu dược liệu Đan sâm nghiên cứu bằng phương pháp HPLC theo DĐVN V

- Điều kiện sắc ký

Cột RP-18 (250 × 4,6 mm; 5µm);

Pha động: methanol - nước (75 : 25);

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 270 nm;

Thể tích tiêm: 10 μl;

Tốc độ dòng: 1,5 ml/min

- Chuẩn bị các dung dịch

được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 16 µg/ml

Cách chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,3 g bột dược liệu (qua rây

số 355) vào bình nón có nút mài, thêm chính xác 50 ml methanol, đậy nút, cân, sau đó đun hồi lưu trên cách thủy trong 1 h, để nguội, cân lại và bổ sung methanol để được khối

lượng ban đầu Trộn đều, lọc dịch chiết thu được qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc 0,45

µm, thu được dung dịch tiêm sắc ký

- Cách tiến hành:

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với dung dịch chuẩn, các dung dịch thử Ghi sắc ký

đồ, thời gian lưu và diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử

- Cách tính toán kết quả

Hàm lượng (%) tanshinon IIA (C19H18O3) trong dược liệu, tính theo dược liệu khô kiệt được tính theo công thức:

100100

1001000

C S

S

T C C

T

Trong đó:

+ ST, SC: Diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng

+ CC: Nồng độ dung dịch chuẩn tanshinon IIA (mg/ml)

+ mT: Khối lượng cân mẫu thử (g)

+ DT: Độ pha loãng của dung dịch thử

+ a: Độ ẩm của mẫu thử (%)

- Phép thử chỉ có giá trị khi:

+ Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic tanshinon IIA trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không được lớn hơn 2,0 %

+ Số đĩa lý thuyết tính theo pic tanshinon IIA trong dung dịch chuẩn không ít hơn

5000

2.3.2 Phương pháp đánh giá hàm lượng tanshinon II A trong cao Đan sâm

Tiến hành phân tích định lượng tanshinon IIA trong cao Đan sâm nghiên cứu bằng phương pháp HPLC theo DĐVN V

- Điều kiện sắc ký

Cột RP-18 (250 × 4,6 mm; 5µm);

Pha động: methanol - nước (75 : 25);

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 270 nm;

Thể tích tiêm: 10 μl;

Tốc độ dòng: 1,5 ml/min

- Chuẩn bị các dung dịch

được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 0,0263 mg/ml

Cách chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10 mg bột cao Đan sâm vào bình nón 50 ml có nút mài, thêm khoảng 40 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút, để nguội

và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Hút chính xác 2,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 20 ml, pha loãng và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, trộn đều

- Cách tiến hành:

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với dung dịch chuẩn, các dung dịch thử Ghi sắc ký

đồ, thời gian lưu và diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử

- Phép thử chỉ có giá trị khi:

+ Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic tanshinon IIA trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không được lớn hơn 2,0 %

+ Số đĩa lý thuyết tính theo pic tanshinon IIA trong dung dịch chuẩn không ít hơn

S

T C

C T

Trong đó:

+ ST, SC: Diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng

+ mT, mC: Khối lượng cân mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng (mg)

+ P: Hàm lượng (%) chuẩn tanshinon IIA

Yêu cầu: Chuyên luận tanshinones - CP 2015 mô tả một sản phẩm chiết xuất đặc

trưng từ rễ Đan sâm chứa chủ yếu các hoạt chất thân dầu nhóm tanshinon, trong đó quy định sản phẩm chiết chứa không ít hơn 9,8% tanshinon IIA

2.3.3 Chiết xuất và tinh chế tanshinon II A từ dược liệu Đan sâm

2.3.3.1 Chiết xuất

Dựa theo chuyên luận tanshinones - CP 2015 (trang 523 - 524) tiến hành chiết xuất

tanshinon IIA ra khỏi nền mẫu dược liệu theo phương pháp chiết nóng với dung môi là ethanol, sau đó loại tạp bằng nước nóng

2.3.3.2 Tinh chế sử dụng phương pháp sắc ký cột

- Cột sắc ký pha thuận: Sử dụng pha tĩnh hấp phụ (silica gel của Merck) với các

cỡ hạt khác nhau, khảo sát hệ dung môi chạy cột thích hợp Kiểm tra các phân đoạn bằng phương pháp TLC

- Cột sắc ký pha đảo: Sử dụng pha tĩnh hấp phụ (silica gel RP-18 của YMC), khảo

sát hệ dung môi chạy cột thích hợp Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC và HPLC

* Các phương pháp sắc ký sử dụng trong đề tài

- Điều kiện sắc ký lớp mỏng (TLC)

+ Dung môi triển khai:

Hệ 1: Ether dầu hỏa (60 °C đến 90 °C) - ethyl acetat (4 : 1);

Hệ 2: n-hexan - ethyl acetat (2 : 1);

Hệ 3: Dicloromethan - methanol (9 : 1)

+ Phát hiện vết: UV 254 nm hoặc 366 nm

+ Dung môi triển khai: Ethanol tuyệt đối

2.3.4 Định tính chất tanshinon II A tinh chế được

- So sánh phổ IR, MS của chất tinh chế được và chất chuẩn tanshinon IIA

- HPLC: So sánh thời gian lưu kết hợp chồng phổ UV của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tanshinon IIA theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn để định tính tanshinon IIA tính chế được

2.3.5 Xác định hàm lượng của chất tanshinon II A tinh chế được

- Lựa chọn phương pháp:

Qua tham khảo DĐVN V, CP 2015, USP42 về phương pháp định lượng tanshinon IIA trong dược liệu Đan sâm bằng phương pháp HPLC với detector DAD, chúng tôi đã khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau từ đó đưa ra được điều kiện thích hợp để định lượng tanshinon IIA tinh chế được bằng HPLC với detector DAD như sau:

- Điều kiện sắc ký:

Cột RP-18 (5µm; 250 × 4,6 mm);

Pha động: Methanol – nước (75:25);

Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 270 nm;

Tốc độ dòng: 1,5 ml/min;

Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

- Chuẩn bị các dung dịch:

tanshinon IIA (mẫu chuẩn) vào trong bình định mức 25 ml, thêm 20 ml methanol, lắc siêu

âm 10 phút, để nguội và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Hút chính xác 2,0

ml dung dịch trên vào bình định mức 20 ml, pha loãng và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, trộn đều

Dung dịch thử: Khoảng 0,04 mg/ml tanshinon IIA Cân chính xác khoảng 10 mg mẫu thử vào trong bình định mức 25 ml, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút, để nguội và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Hút chính xác 2,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 20 ml, pha loãng và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, trộn

đều

- Cách tiến hành:

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với dung dịch chuẩn, các dung dịch thử Ghi sắc ký

đồ, thời gian lưu và diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử

- Phép thử chỉ có giá trị khi:

+ Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic tanshinon IIA trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không được lớn hơn 2,0 %

+ Số đĩa lý thuyết tính theo pic tanshinon IIA trong dung dịch chuẩn không ít hơn

S

T C

C T

Trong đó:

+ ST, SC: Diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng

+ mT, mC: Khối lượng cân mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng (mg)

+ P: Hàm lượng (%) chuẩn tanshinon IIA

2.3.6 Xác định giới hạn tạp chất liên quan của tanshinon II A tinh chế được

Pha động: methanol – nước (75:25);

Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 270 nm;

Tốc độ dòng: 1,5 ml phút;

Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

Thời gian chạy: Gấp khoảng 3 lần thời gian lưu của pic tanshinon IIA

- Chuẩn bị các dung dịch:

Dung dịch mẫu trắng: methanol

Dung dịch thử: Khoảng 0,4 mg/ml tanshinon IIA Cân chính xác khoảng 10 mg mẫu thử vào trong bình định mức 25 ml, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút, để nguội

và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều

10 mg tanshinon IIA (chất chuẩn) vào trong bình định mức 25 ml, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút, để nguội và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Hút chính xác 2,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 20 ml, pha loãng và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, trộn đều

Dung dịch đối chiếu (2): Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thử vào bình định mức 100

ml, pha loãng và vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều

- Cách tiến hành:

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch mẫu trắng, dung dịch đối chiếu (1), lặp lại

6 lần với dung dịch đối chiếu (2) và dung dịch thử, ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích của tất cả các pic ngoại trừ pic dung môi

Phép thử chỉ có giá trị khi:

+ Số đĩa lý thuyết tính theo pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) không ít hơn 5000

+ Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic tanshinon IIA trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu (2) không được lớn hơn 3,0 %

+ Hệ số kéo đuôi của pic tanshinon IIA trong dung dịch đối chiếu (2): 0,8-2,0 + Độ phân giải của pic tanshinon IIA và pic tạp lân cận trong dung dịch thử không nhỏ hơn 1,0

- Yêu cầu: Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử, diện tích của bất kỳ pic phụ nào

không được lớn hơn hai lần diện tích của pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (2) (2,0 %) Tổng diện tích các pic phụ không được lớn hơn 5,0 lần diện tích của pic chính trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (2) (5,0 %) Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,05 lần diện tích của pic chính trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (2) (0,05%)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU

3.1 Quy trình chiết xuất và tinh chế tanshinon II A từ dược liệu Đan sâm

3.1.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm

3.1.1.1 Mô tả

Dược liệu dạng thân rễ ngắn, cứng chắc, thỉnh thoảng còn sót lại gốc của thân ở đỉnh Rễ hình trụ dài, hơi cong, có khi phân nhánh và có rễ con, dài 10 cm đến 20 cm, đường kính 0,3 cm đến 1 cm Mặt ngoài màu đỏ nâu, thô ráp, có vân nhăn dọc Chất cứng

và giòn, mặt bẻ gãy không chắc có vết nứt, hoặc hơi phẳng và đặc, phần vỏ màu đỏ nâu

và phần gỗ màu vàng xám với bó mạch màu trắng vàng, xếp theo hướng xuyên tâm Mùi nhẹ, vị hơi đắng và se

Hình 3.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm (mẫu nghiên cứu)

Nhận xét: Mẫu nghiên cứu có hình thức phù hợp với mô tả chuyên luận Đan sâm trong DĐVN V

3.1.1.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành định tính dược liệu nghiên cứu theo điều kiện như mục 2.3.1.1, kết quả

thu được là sắc ký đồ thể hiện trên Hình 3.2

Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng định tính Đan sâm

Nhận xét: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu Đan sâm và có một vết màu đỏ đậm có cùng màu sắc và giá trị Rf với vết tanshinon IIA trên sắc ký đồ của dụng dịch chất đối chiếu

- Tiến hành chuẩn bị mẫu dung môi, mẫu chuẩn tanshinon IIA, mẫu thử theo mục 2.3.1.2 Sau đó, tiến hành chồng phổ sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử Kết quả được thể

hiện ở Hình 3.3

Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b), kết quả chồng phổ DAD (c)

Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu thử cho một pic có thời gian lưu tương ứng pic Tanshinon IIA trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và hệ số chồng phổ tương ứng là 0,997

- Chuẩn bị hai dung dịch chuẩn trong methanol để được các dung dịch có nồng độ

chính xác khoảng 16 μg/ml Chi tiết được thể hiện qua Bảng 3.1

Bảng 3.1: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn tanshinon IIA

Chuẩn Lượng cân

(mg) Hòa tan, pha loãng

Chuẩn 1 5,59

Trong bình định mức 10 ml, hòa tan và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Hút chính xác 3,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 100 ml, thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều

Chuẩn 2 5,62 Chuẩn bị như dung dịch chuẩn 1

- Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn 1 vào hệ thống sắc ký, ghi lại thời

gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng

+ Đánh giá độ ổn định của hệ thống sắc ký dựa vào 2 đại lượng thời gian lưu và diện tích pic của dung dịch chuẩn 1

+ Dựa vào diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn 1 để tính hàm lượng % tanshinon IIA trong dược liệu

- Tiến hành tiêm 1 lần dung dịch chuẩn 2 để kiểm tra tính đúng của dung dịch chuẩn 1

Kết quả tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon IIA trong dược liệu được ghi

Thời gian lưu

(phút)

Diện tích pic (mAu.S)

Số đĩa lý thuyết

Hệ số

đối xứng

Diện tích pic (mAu.S)

1 23,368 603180 10201 1,075 600705

Đạt (0,991) (yêu cầu: 0,98-1,02)

- Hệ số đối xứng có giá trị 1,078 → Thể hiện pic cân đối

- Hệ số tương quan đáp ứng hai chuẩn tính theo công thức:

K = 𝑆𝐶2

𝑆𝐶1 × 𝑚𝐶1

𝑚𝐶2Thay số được K = 0,991 đạt yêu cầu (0,98-1,02)→ Dung dịch chuẩn 1 đạt tính đúng

Kết luận: Điều kiện sắc ký lựa chọn có độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích pic,

số đĩa lý thuyết và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo để phân tích định lượng tanshinon IIA

- Tiến hành tiêm vào hệ thống lần lượt 3 dung dịch thử Kết quả định lượng tanshinon IIA trong dược liệu được ghi lại trong Bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả định lượng tanshinon IIA trong dược liệu

STT Khối lượng

mẫu thử (g) Độ ẩm (%) Diện tích pic

(mAu.S)

Hàm lượng tanhinon II A

(%)

Trung bình (%)

Kết luận: Mẫu dược liệu nghiên cứu đạt yêu cầu chất lượng các chỉ tiêu đã kiểm tra

theo chuyên luận Đan sâm DĐVN V được lựa chọn làm nguyên liệu chiết xuất tanshinon IIA

3.1.2 Quy trình chiết xuất tanshinon II A từ dược liệu Đan sâm

Bước 1: Chiết xuất tạo cao đan sâm

Dược liệu đạt yêu cầu về hàm lượng tanshinon IIA theo DĐVN V (Bảng 3.3) được thái thành các lát nhỏ, sấy khô ở 60°C trong 12h, để nguội, xay thành bột thô, trộn đều Cân 100 g mẫu vào bình nón nút mài 500 ml, đun hồi lưu (cách thủy) với ethanol tuyệt đối trong 1 giờ, lặp lại 3 lần, mỗi lần dùng 300ml dung môi ethanol tuyệt đối, sau đó để nguội, lọc lấy dịch lọc qua giấy Gộp các dịch lọc đem cô quay chân không ở 60°C đến cao đặc (có tỷ trọng 1,30-1,35) Dùng nước nóng (70°C - 80°C) phân tán lại cao trong bình và đem lọc qua giấy Tủa trên giấy lọc được rửa lại nhiều lần bằng nước nóng (70°C

- 80°C), đến khi dịch rửa không màu, cắn thu được đem sấy ở 80°C trong 5h đến khi khô, nghiền thành bột mịn được cao Đan sâm (1,25 g) Tiến hành lặp lại thí nghiệm 24 lần với lượng mẫu là 2,4 kg Dược liệu Đan sâm (đã xay thành bột)

Sơ đồ và hình ảnh thực nghiệm như trong Hình 3.4:

Hình 3.4: Sơ đồ chiết xuất tanshinon II A từ dược liệu Đan sâm

Với quy trình chiết xuất trên, trong quy mô phòng thí nghiệm, đề tài đã tạo được

30 g bột cao Đan sâm từ 2,4 kg dược liệu Đan sâm

Bước 2: Đánh giá hàm lượng tanshinon IIA trong cao Đan sâm

Phương pháp sắc ký lỏng, điều kiện sắc ký tương tự 2.3.2

Hình 3.5: Hình ảnh sắc ký đồ HPLC cao Đan sâm

- Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, ghi lại thời

gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng Kết quả tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon IIA trong cao được thể hiện ở Bảng 3.4

Bảng 3.4: Kết quả tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon IIA trong cao

STT Thời gian lưu

(Phút)

Diện tích pic (mAu.S)

Số đĩa lý thuyết

Hệ số kéo đuôi

STT Thời gian lưu

(Phút)

Diện tích pic (mAu.S)

Số đĩa lý thuyết

Hệ số kéo đuôi

TB 13,350 1031909 10413 1,159

RSD% 2,0 0,26

- Tiến hành tiêm vào hệ thống lần lượt 3 dung dịch thử Kết quả định lượng

tanshinon IIA trong cao Đan sâm được ghi lại trong Bảng 3.5

Bảng 3.5: Kết quả định lượng tanshinon IIA trong cao dược liệu

Thử Khối lượng

cân (mg)

Thể tích pha loãng (ml)

Diện tích pic (mAu.S)

%, tính theo nguyên trạng

Trung bình (%)

12,96%

Nồng độ dung dịch chuẩn: 0,0263 mg/ml

Kết luận: Điều kiện sắc ký có độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa

lý thuyết và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo để phân tích định lượng tanshinon IIA trong Cao Đan sâm (Phép thử đạt yêu cầu theo mục 2.3.3) Kết quả định lượng là giá trị trung bình khi tiêm 3 dung dịch thử vào hệ thống trên: Cao Đan sâm sau quá trình chiết xuất đạt 13,0% tanshinon IIA, được dùng làm nguyên liệu cao để tinh chế tanshinon IIA bằng kỹ thuật sắc ký cột

3.1.3 Quy trình tinh chế tanshinon II A

Dựa vào các tài liệu tham khảo [1], [3], [4], lựa chọn cách tinh chế tanshinon IIA từ nguyên liệu cao giai đoạn chiết xuất bằng phương pháp tách phân đoạn trên sắc ký cột Qua khảo sát, nhận thấy do mẫu nguyên liệu ban đầu có nhiều thành phần phức tạp, để tinh chế được chất tanshinon IIA với hiệu suất cao đồng thời tiết kiệm dung môi rửa giải và chất nhồi, tiến hành tinh chế tanshinon IIA từ cao đan sâm lần lượt trên sắc ký cột pha thuận và pha đảo:

a) Nghiên cứu lựa chọn phương pháp

Do tanshinon IIA có cấu trúc là một diterpenoid tan tốt trong một số dung môi hữu

cơ và dung môi phân cực ít, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký cột dựa trên kết quả sắc

ký lớp mỏng pha thuận với pha tĩnh là bản mỏng Silica gel 60 F254 trên 3 hệ dung môi Dicloromethan – methanol (9 : 1), Ether dầu hỏa (60oC đến 90oC) – ethyl acetat (4 : 1),

n-hexan – ethyl acetat (2 : 1) Sau khi tiến hành sắc ký, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng

thường, ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm, kết quả được thể hiện ở Hình

3.6

Hình 3.6: Hình ảnh TLC khảo sát dung môi đưa lên cột sắc ký pha thuận

Nhận xét: Kết quả cho thấy các hệ dung môi lựa chọn phân tách tốt tanshinon IIA ra khỏi các thành phần khác trong cao Tuy nhiên để việc phân tách trên cột có hiệu quả thì chúng tôi lựa chọn hệ có dung môi n-hexan, ethyl acetat và điều chỉnh tỷ lệ dung môi cho phù hợp với các thông số cột sắc ký

- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh trung tính có đường kính 10 cm, chiều dài cột

80 cm, có van để điều chỉnh tốc độ dung môi, được lắp thẳng đứng trên giá Đáy cột được lót một lớp bông mỏng, trên lớp bông chèn thêm một lớp giấy lọc có kích thước vừa khít trong lòng cột

- Nhồi cột: Cân 400 g chất nhồi silica gel cỡ hạt 63-200 µm, thêm 800 ml hỗn hợp dung môi n-hexan – ethyl acetat (2:1), trộn đều, đổ từ từ lên cột đồng thời mở khóa cho dung môi chảy ra từ từ Trong quá trình các hạt nhồi lắng xuống, thỉnh thoảng dùng búa cao su gõ nhẹ vào thành cột với mục đích tăng quá trình lắng, loại bọt khí Cho 500 ml hỗn hợp rửa giải qua cột với tốc độ 2 ml/phút đến khi khoảng cách từ mặt trên của dung môi đến mặt trên lớp chất nhồi còn khoảng 0,5 cm thì khóa van cột

- Đưa mẫu lên cột: Lấy 30 g bột cao Đan sâm, thêm từ từ 50 ml ethyl acetat, lắc cho phân tán đều, thêm từ từ 10 g silica gel trên, trộn đều rồi chuyển toàn bộ hỗn hợp trên đem cô quay chân không đến cắn khô hoàn toàn Nghiền mịn hỗn hợp cao và silica gel, sau đó dùng thìa cân chuyển nhẹ nhàng vào cột, tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột,

mở khóa van cho dung môi đến mặt trên lớp chất nhồi còn khoảng 0,2 cm, dùng pipet hút dung môi rửa giải tráng vòng quanh bên trong cột nhiều lần để mẫu nghiên cứu cố định được trên cột cho đến khi lớp dung môi phía trên không màu, điều chỉnh tốc độ rửa giải 2-3 ml/phút

- Rửa giải: Hứng dịch rửa giải vào bình 100ml, đánh số các lọ từ 1 cho đến hết Tiến hành kiểm tra sự có mặt của tanshinon IIA bằng TLC với hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat (4:1) Chấm song song với dung dịch chuẩn tanshinon IIA trong ethyl acetat nồng

độ 1 (mg/ml) Kết quả thu được là sắc ký đồ Hình 3.7

Hình 3.7: Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các phân đoạn trên cột sắc ký pha thuận (1)

Nhận xét: Cột sắc ký pha thuận (1) với hạt chất nhồi silica gel có kích thước hạt lớn

(63 đến 200 µm), dùng hệ dung môi là n-hexan – ethyl acetat là bước đầu để loại một số

tạp màu rửa giải sớm và một số tạp màu hữu cơ còn lưu giữ trên cột Gộp tất cả các bình

có chứa tanshinon IIA đen cô quay chân không ở 60°C thu cắn NP1 Cắn NP 1 tiếp tục được tinh chế trên cột sắc ký pha thuận với hạt chất nhồi là silica gel có kích thước hạt nhỏ hơn (40 đến 63 µm), dùng hệ dung môi là n-hexan – ethyl acetat với tỷ lệ (4:1) Các

bước tiến hành tương tự cột sắc ký pha thuận (1) Kết quả thu được là SKĐ Hình 3.8

Hình 3.8: Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các phân đoạn trên cột sắc ký pha thuận (2)

Từ bình số 14 đến 60 có sự xuất hiện của tanshinon IIA (Hình 3.8) Gộp các bình hứng từ số 14 đến 60, đem cô quay chân không ở 60 oC thu cắn NP 2

a)Nghiên cứu lựa chọn phương pháp

Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký cột pha đảo dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng pha đảo có pha tĩnh là bản mỏng Silica gel 60 RP-18 F254S trên 3 hệ dung môi:

Hệ 1: Methanol – nước (80:20);

Hệ 2: Aceton – nước (80:20);

Hệ 3: Ethanol – nước (80:20)

Sau khi tiến hành sắc ký, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm Kết quả khảo sát các hệ dung môi và tỷ lệ dung

môi được thể hiện ở Hình 3.9

Hình 3.9: Hình ảnh TLC khảo sát tỷ lệ dung môi cho cột sắc ký pha đảo

Nhận xét: Qua hình ảnh TLC, việc lựa chọn hỗn hợp dung môi MeOH 80% phù hợp cho tanshinon IIA phân tách trên cột sắc ký pha đảo và dung môi ethanol tuyệt đối được

sử dụng để triển khai bản mỏng xác định sự có mặt của tanshinon IIA trong các lọ hứng Quá trình tinh chế tanshinon IIA được dự kiến tiến hành trên 2 cột sắc ký pha đảo với pha động là dung môi MeOH 80% và pha tĩnh có kích thước hạt nhồi khác nhau Cụ thể như sau:

Cột (1): Cắn NP 2 sau tinh chế trên cột sắc ký pha thuận được tinh chế tiếp trên cột pha đảo với pha động là dung môi MeOH 80% và pha tĩnh là hạt nhồi slicagel RP-18 (cỡ hạt 150 μm) Tiến hành sắc ký lớp mỏng, sử dụng bản mỏng pha đảo để xác định phân đoạn có tanshinon IIA

Gộp các lọ chứa tanshinon IIA, cô quay chân không ở 60°C thu được cắn RP1

Cột (2): Cắn RP 1 tiếp tục tinh chế trên cột số (2), tiến hành cột với pha động MeOH 80% và pha tĩnh có kích thước hạt nhồi silicagel RP-18 nhỏ hơn cột pha đảo (1) (cỡ 75 μm) Kiểm tra các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lỏng để xác định phân đoạn chứa

từ 90% Tanshinon IIA

Gộp các lọ chứa từ 99% tanshinon IIA theo phương pháp chuẩn hóa diện tích, cô

quay chân không ở 60°C tới thể tích bằng 2/10 thể tích dịch ban đầu thu được dịch cô

RP 2

b) Quy trình tinh chế Tanshinon IIA trên cột pha đảo

Cắn NP 1 thu được sau giai đoạn tinh chế trên cột sắc ký pha thuận được tiến hành cho qua lần lượt 2 cột sắc ký với chất nhồi silica gel pha đảo RP-18 và các thông số cột

thể hiện ở Bảng 3.6 như sau:

Bảng 3.6: Các thông số cột sắc ký tinh chế Tanshinon IIA trên cột RP

STT Tên thông số Cột 1 Cột 2

1 Kích thước cột (Dài x đường kính) 60 cm x 4 cm 60 cm x 4 cm

5 PP phát hiện sự có mặt của tan IIA TLC HPLC

- Nhồi cột: Cân 400 g chất nhồi silica gel pha đảo RP-18 (cỡ hạt 150 µm), thêm 200

ml methanol, trộn đều, đổ từ từ lên cột đồng thời mở khóa cho dung môi chảy ra từ từ Trong quá trình các hạt nhồi lắng xuống, thỉnh thoảng dùng búa cao su gõ nhẹ vào thành cột với mục đích tăng quá trình lắng và số đĩa lý thuyết cho cột tách, thỉnh thoảng bổ sung dung môi tránh cho cột đỡ bị khô Ổn định cột trong vòng 1 giờ, và đến khi khoảng cách

từ mặt trên của dung môi đến mặt trên lớp chất nhồi còn khoảng 1 cm thì khóa van cột và để yên cột qua đêm

- Hoạt hóa cột: Hoạt hóa cột lần lượt với MeOH 100%-80% (mỗi tỉ lệ 500 ml) chảy qua cột với tốc độ 2,0 ml/phút Đến khi khoảng cách từ mặt trên của dung môi đến mặt trên lớp chất nhồi còn khoảng 1 cm thì khóa van cột

- Đưa mẫu lên cột: Đưa 3,3 g Cắn NP 2 được phân tán đều trong 5 ml methanol, dùng pipet nhẹ nhàng chuyển hỗn hợp trên lên bề mặt, mở van cột, điều chỉnh tốc độ 1,0 ml/ phút Đến khi chuyển hết hỗn hợp lên cột, dùng dung môi methanol tia nhẹ nhàng nhiều

lần lên thành cột, điều chỉnh tốc độ khoảng 2ml/ phút đến khi lớp dung môi phía trên không màu

- Rửa giải: Dùng MeOH 80% rửa giải, tốc độ rửa giải khoảng 2-3 ml/phút Hứng dịch rửa giải vào bình hứng 100 ml Tiến hành kiểm tra sự có mặt của tanshinon IIA bằng bản mỏng pha đảo với điều kiện sắc ký ethanol 100% Chấm song song với dung dịch tanshinon IIA chuẩn nồng độ 1 mg/ml trong methanol Kết quả SKĐ TLC các lọ hứng cột

số (1) thể hiện ở Hình 3.1a và Hình 3.10b

Hình 3.10a: SKĐ TLC lọ số 1.1 đến 1.10 trên cột sắc ký pha đảo (1)

Hình 3.10b: SKĐ TLC lọ số 1.11 đến 1.80 trên cột sắc ký pha đảo (1)

Nhận xét: Các lọ từ 1.1 đến 1.9 không có vết tanshinon IIA.Từ lọ 1.11 đến 1.80 có vết tanshinon IIA Gộp các lọ có chứa tanshinon IIA đem cô quay chân không dưới áp suất

giảm ở nhiệt độ 60°C thu được Cắn RP 1 Cho cắn Cắn RP 1 tiếp tục tinh chế trên cột sắc

ký pha đảo với hạt chất nhồi là RP-18 (cỡ hạt cỡ hạt 75 µm)

Cột 2:

- Giai đoạn chuẩn bị cột tương tự cột số (1)

- Dung môi rửa giải hỗn hợp methanol 80% Hứng dịch rửa giải vào bình hứng 50

ml Tiến hành kiểm tra sự có mặt của tanshinon IIA trong các lọ hứng bằng HPLC theo điều kiện sắc ký mục 2.3.2.2

Kết quả HPLC các lọ hứng cột số (2) thể hiện ở Hình 3.11

chuẩn hóa diện tích

- Nhận xét: Trên sắc ký đồ HPLC thể hiện rõ hàm lượng tanshinon IIA biến đổi qua các phân đoạn Tiến hành gộp các lọ từ số 115 đến 176 có độ tinh khiết trên 99% Các phân đoạn nhỏ hơn 99% tiếp tục tinh chế trên cột pha đảo

Gộp các lọ chứa phân đoạn từ 99% đem lọc qua màng lọc 0,45μm, dịch lọc đem

cô quay chân không ở 60°C đến thể tích bằng 2/10 thể tích dịch cô ban đầu Để tủa 2 - 8°C trong 12 giờ sau đó tiến hành lọc Rửa tủa bằng nước đến dịch rửa không màu, tiếp tục rửa với EtOH có nồng độ từ 20% đến 100% Đem cắn sấy trong tủ sấy chân không

50oC có P2O5 trong 10h thu Cắn RP 2

Sơ đồ quá trình tinh chế tanshinon IIA được tóm tắt như sơ đồ sau (Hình 3.12):

3.2 Định tính chất tinh chế được

3.2.1 Tính chất

Sản phẩm là bột kết tinh, màu đỏ đến đỏ cam

3.2.2 Phổ hồng ngoại

Tiến hành đo phổ hồng ngoại mẫu tinh chế được và mẫu chuẩn theo phụ lục 4.2

Dược điển Việt Nam V Kết quả đo phổ IR các mẫu được thể hiện ở Hình 3.17

Nhận xét: Phổ hồng ngoại của mẫu tinh chế phù hợp với phổ hồng ngoại chuẩn tanshinon IIA USP với hệ số Match là 98,56%

3.2.3 Phân tích khối phổ

Để xác định khối lượng phân tử của chất tinh chế được, chúng tôi sử dụng thiết bị LC-MSMS, bắn phá mẫu bằng nguồn ESI, tác nhân H+ đã được sử dụng

Kết quả thu được, trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử đều cho mảnh phổ có số khối m/z ≈ 295,1, tương ứng với ion [M+H]+ , phù hợp với khối lượng phân tử của tanshinon IIA (M = 294,1 g/mol) Ngoài ra, mảnh ion con thu được với số

khối m/z lần lượt thể hiện ở Bảng 3.7

Bảng 3.7: Tổng hợp các kết quả đo phổ khối

STT

Mẫu tinh chế Chuẩn tanshinon II A

Mảnh mẹ (m/z) Mảnh con (m/z) Mảnh mẹ (m/z) Mảnh con (m/z)

Như vậy chất tinh chế được có phổ khối tương ứng phổ khối tanshinon IIA chuẩn và phù hợp với công thức phân tử của tanshinon IIA (C19H18O3)

Hình 3.14: Phổ khối của mẫu chuẩn tanshinon IIA và chất tinh chế được