Giáo trình nguyên lý kỹ thuật di truyền

Trong dung dịch tự do và dưới tác dụng của điện trường, các phân tử tích điện âm này sẽ di chuyển về phía cực dương với tốc độ bằng nhau không phân biệt kích thước lớn hay nhỏ.. Ví dụ nh

DƯƠNG VĂN CƯỜNG (Chủ biên)

NGUYỄN HUY THUẦN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP

GIÁO TRÌNH

NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT DI TRUYỀN (Dành cho sinh viên đại học ngành Công nghệ Sinh học)

Mục lục ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������iii Lời nói đầu ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������v

C hương 1 TÁCh ChIẾT AXIT nUCLEIC 1

1.1 Tách chiết axit nucleic 1 1.2 Xác định nồng độ axit nucleic 6 1.3 Điện di trên gel 7 1.4 Lai phân tử 13

C hương 2 CẮT VÀ nỐI DnA 19

2.1 Cắt DNA bằng enzyme giới hạn 19 2.2 Nối dna bằng ligase 26 2.3 Biến đổi đầu phân tử DNA 33

C hương 3 CÁC hỆ ThỐng VECTOR 39

3.1 Vector plasmid 39 3.2 Vector dựa trên thực khuẩn thể lambda 47 3.3 Vector dựa trên thực khuẩn thể m13 55 3.4 Cosmid 56 3.5 Vector biểu hiện 58 3.6 Vector dùng cho tế bào nhân chuẩn 60 3.7 Siêu vector: YAC và BAC 65

C hương 4 KỸ ThUẬT PCR 67

4.1 Nguyên lý 67 4.2 Các điều kiện của phản ứng 71 4.3 Các thành phần chính của phản ứng 74 4.4 Các dạng PCR cải biên 77

C hương 5 TÁCh DÒng gEnE 83

5.1 Thư viện hệ gene 83 5.2 Thư viện cDNA 89 5.3 Chọn lọc dòng 97

C hương 6 gIẢI TRÌnh TỰ, PhÂn TÍCh gEnE VÀ hỆ gEnE 107

6.1 Giải trình tự gene 107 6.2 Giải trình tự hệ gene 114 6.3 Xác định gene thành phần trong hệ gene 120 6.4 Ứng dụng giải trình tự gene và hệ gene trong nghiên cứu Metagenomics 122

C hương 7 PhÂn TÍCh BIẾn DỊ DI TRUYỀn 125

7.1 Phân loại biến dị 125 7.2 Nghiên cứu biến dị 127

C hương 8 BIỂU hIỆn PROTEIn TÁI TỔ hỢP 139

8.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện gene 140 8.2 Biểu hiện gene ở vi khuẩn 144 8.3 Biểu hiện ở tế bào chủ nhân chuẩn 152 8.4 Gắn đuôi và chuỗi tín hiệu 156 8.5 Gây đột biến in vitro 158

C hương 9 PhÂn TÍCh BIỂU hIỆn gEnE 163

9.1 Phân tích phiên mã 163 9.2 So sánh transcriptome 171 9.3 Nghiên cứu promoter 178 9.4 Phân tích dịch mã 185

Tài liệu tham khảo ���������������������������������������������������������������������������������������������201

Cuốn sách “Nguyên lý Kỹ thuật di truyền” được biên soạn cho sinh viên hệ đại học

ngành Công nghệ Sinh học Theo khung chương trình đào tạo ngành Công nghệ Sinh học tại một số trường đại học, nhóm tác giả đặt cuốn sách này vào trục dọc

gồm ba học phần có tính chất nối tiếp liên tục, bao gồm Di truyền học đại cương, Sinh

học phân tử và Kỹ thuật di truyền Với tư duy như vậy và trên cơ sở tham khảo một số

cuốn sách Kỹ thuật di truyền trên thế giới, nhóm tác giả đưa nội dung giáo trình đi thẳng vào khối kiến thức mang tính chất nền tảng và tư duy của các nguyên lý thao tác với axit nucleic và công nghệ DNA tái tổ hợp

Giáo trình gồm 9 chương với các nội dung như sau:

• Chương 1: Tách chiết axit nucleic

• Chương 2: Cắt và nối DNA

• Chương 3: Các hệ thống vector

• Chương 4: Kỹ thuật PCR

• Chương 5: Tách dòng gene

• Chương 6: Giải trình tự, phân tích gene và hệ gene

• Chương 7: Phân tích biến dị di truyền

• Chương 8: Biểu hiện protein tái tổ hợp

• Chương 9: Phân tích biểu hiện gene

TS Dương Văn Cường chủ biên, biên soạn các chương 1–5, 7–9 và hiệu đính

TS Nguyễn Huy Thuần tham gia biên soạn chương 6 và phần Thuật ngữ chuyên ngành

Giáo trình có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giáo viên phổ thông trung học giảng dạy môn Sinh học, sinh viên, học viên cao học các ngành liên quan đến Công nghệ Sinh học, bao gồm: Cử nhân Sinh học, Sư phạm Sinh học, Y dược, Nông nghiệp, Lâm nghiệp…

Lần đầu xuất bản giáo trình không tránh khỏi thiếu sót Nhóm tác giả chân thành cảm ơn và mong muốn nhận được những góp ý của độc giả để cuốn sách được hoàn thiện hơn trong các lần tái bản

Ý kiến đóng góp xin gửi về địa chỉ thư điện tử duongvc@gmail.com

C áC táC giả

Chương 1 TÁCHCHIẾTAXITNUCLEIC

Để bắt đầu một thí nghiệm kỹ thuật di truyền, việc đầu tiên là phải thu được vật

liệu di truyền, DNA hoặc RNA, để làm nguyên liệu Các kỹ thuật hiện đại đã làm cho công việc này trở nên đơn giản hơn so với trước kia Trong chương này, trước hết chúng ta sẽ cùng xem xét các nguyên lý nền tảng của phương pháp tách chiết và tinh sạch axit nucleic Tiếp theo, ta sẽ tìm hiểu những phương án dùng để tách riêng từng loại DNA Sau khi tách chiết, cần phải đánh giá chất lượng của DNA thu được theo các tiêu chí

hàm lượng, độ tinh khiết và độ nguyên vẹn Các tiêu chí này được đánh giá bằng phương

pháp đo quang phổ kết hợp với điện di Phần cuối của chương mô tả hiện tượng căn bản của DNA gồm biến tính và hồi tính, đồng thời thảo luận nguyên lý của hiện tượng và ứng dụng trong phản ứng lai phân tử

1.1 TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC

Bước đầu tiên của hầu hết các thí nghiệm kỹ thuật di truyền là thu nhận axit nucleic (DNA hoặc RNA) từ tế bào Quá trình này bao gồm bốn bước cơ bản như sau:

• Phá vỡ tế bào

• Loại bỏ các thành phần khác của tế bào

• Thu nhận axit nucleic

DNA nhiễm sắc thể trong nhân, DNA của các bào quan như ti thể, lạp thể Đặc điểm của

DNA hệ gene là kích thước lớn Plasmid là các yếu tố di truyền ngoài nhân có ở vi khuẩn

Chúng là các phân tử DNA dạng vòng, mạch kép với kích thước nhỏ hơn rất nhiều so với DNA hệ gene Chúng có khả năng tự sao chép độc lập mà không phụ thuộc vào sự sao chép DNA trong nhân Trong thực nghiệm, tách chiết plasmid là một công việc được tiến

hành hàng ngày ở các phòng thí nghiệm sinh học phân tử DNA phage là toàn bộ hệ gene

của phage xâm nhiễm vi khuẩn Trong các nghiên cứu về virus thì điều cần thiết là tách chiết được riêng rẽ hệ gene nhỏ bé của virus ra khỏi lượng DNA khổng lồ của vật chủ

1.1.1 PHÁ VỠ TẾ BÀO VÀ MÔ

Mặc dù có nhiều phương pháp tách chiết axit nucleic nhưng chúng đều có chung những nguyên lý cơ bản Đầu tiên, người ta cần có vật liệu khởi đầu Chất lượng của vật liệu khởi đầu có ý nghĩa quyết định tới sự thành công hay thất bại của thí nghiệm Dạng vật liệu khởi đầu thường gặp nhất là dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn hay tế bào nhân chuẩn Sinh khối tế bào được thu nhận và tách riêng ra khỏi môi trường nuôi cấy bằng cách dễ dàng nhất là ly tâm Dạng vật liệu khởi đầu thứ hai là các mẫu mô phức tạp của sinh vật bậc cao Đối với dạng này thì trước hết mẫu cần được đồng nhất hóa Cho dù là loại vật liệu nào thì tốt nhất là chúng ta nên thu mẫu nhanh chóng, sạch và bảo quản ở nhiệt độ thấp cho tới khi cần sử dụng

Tiếp theo, tế bào cần được phá vỡ để giải phóng các thành phần nội bào Các phương pháp phá vỡ tế bào có thể phân chia thành 2 nhóm là cơ học và hóa học Tùy thuộc từng loại tế bào mà phương pháp phù hợp sẽ được lựa chọn Đối với vi khuẩn, thành tế bào của chúng có thể bị làm yếu đi bằng lysozyme, acid ethylenediamine tetraacetic (EDTA) hoặc kết hợp cả hai Lysozyme là enzyme có trong lòng trắng trứng và nước mắt có tác dụng phân hủy các hợp chất polymer cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn EDTA có tác dụng loại bỏ các ion Mg2+ là nhân tố thiết yếu trong việc duy trì tính ổn định tổng thể của vỏ tế bào vi khuẩn Một vai trò nữa của EDTA là ức chế hoạt động của DNase để bảo vệ DNA khỏi sự phân huỷ của các enzyme này Trong một số điều kiện, xử lý tế bào vi khuẩn bằng lysozyme và EDTA là đủ để phá vỡ lớp vỏ của chúng, nhưng thông thường một loại chất tẩy rửa như sodium dodecyl sulphate (SDS) cũng được bổ sung Chất tẩy rửa có tác dụng hoà tan lớp lipid của màng

Tế bào thực vật có thành (vách) cấu tạo từ cellulose nên có cấu trúc vững chắc hơn vi khuẩn do đó chúng cần xử lý bằng lực cơ học Quy trình phổ biến áp dụng trong trường hợp cần tách axit nucleic từ mô thực vật là nghiền trong nitrogen lỏng Tế bào động vật thì không có thành tế bào nên chỉ cần xử lý bằng một chất tẩy nhẹ

Sau khi phá vỡ tế bào ta sẽ thu được một hỗn hợp các thành phần nội bào bao gồm DNA, RNA, protein, lipid và đường Cần lưu ý rằng việc phá vỡ tế bào một cách đột ngột thường làm cho DNA nhiễm sắc thể bị đứt gãy Riêng trường hợp của nhiễm sắc thể vi khuẩn vốn dĩ có dạng vòng tự nhiên thì sẽ bị đứt gãy thành các đoạn mạch thẳng

Nếu mục đích của thí nghiệm cần có DNA lớn, thậm chí nguyên vẹn, thì cần áp dụng những biện pháp ly giải tế bào nhẹ nhàng hơn Tuy nhiên, thật may mắn là plasmid của

vi khuẩn có thể được thu nhận khá dễ dàng ở dạng vòng nguyên vẹn trong điều kiện ly giải tế bào tiêu chuẩn

Bước tiếp theo trong quy trình có nhiệm vụ phân tách loại axit nucleic cần thiết ra khỏi những thành phần khác

1.1.2 LOẠI BỎ CÁC THÀNH PHẦN KHÁC

1.1.2.1 Xử lý bằng enzyme

Việc loại bỏ RNA ra khỏi mẫu DNA có thể thực hiện tương đối đơn giản bằng cách xử

lý với ribonuclease (RNase) Bởi vì RNase là loại enzyme rất bền nhiệt nên rất dễ để đảm bảo trong dung dịch không bị lẫn DNase, một enzyme không bền nhiệt có tác dụng phân hủy DNA, bằng cách xử lý với nhiệt độ cao trước khi sử dụng Ngược lại, việc loại bỏ DNA khỏi mẫu RNA khó khăn hơn vì cần có enzyme DNase hoàn toàn không bị lẫn RNase RNase có rất nhiều ở đầu ngón tay của con người do vậy rất dễ nhiễm vào các dung dịch

và bám vào các dụng cụ thí nghiệm Hiện nay, nhà nghiên cứu có thể mua enzyme RNase tinh khiết không lẫn DNase và ngược lại, DNase tinh khiết không lẫn RNase, do đó công việc thí nghiệm cũng dễ dàng hơn Tạp nhiễm protein được loại bỏ bằng một loại enzyme phân giải protein, ví dụ như Proteinase K

Những bước xử lý này được áp dụng tùy theo yêu cầu của thí nghiệm Trong một số quy trình tách chiết chúng ta có thể bỏ qua một hay một số bước kể trên vì sự tạp nhiễm các thành phần khác không ảnh hưởng đến một mục tiêu cụ thể mà mẫu được sử dụng, hoặc bởi vì tạp nhiễm đó đằng nào thì cũng bị loại bỏ khi tiến hành những bước tiếp theo trong quy trình

1.1.2.2 Phân tách bằng Phenol-Chloroform

Việc loại bỏ protein có ý nghĩa quan trọng vì trong tế bào có nhiều loại enzyme có thể phân hủy axit nucleic Một vấn đề nữa là có những protein có khả năng bám vào DNA và do

đó gây ra những ảnh hưởng

không tốt khi DNA này

được sử dụng làm mẫu cho

các thí nghiệm tiếp theo

Phương pháp cổ điển đến

nay vẫn được sử dụng rộng

rãi để loại bỏ protein là tách

chiết bằng phenol lỏng Một

cách khác được ưu chuộng

hơn là tách chiết với hỗn

hợp phenol và chloroform h Ình 1.1. Tách chiết DNA bằng phenol

Phenol và chloroform không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế bào sẽ làm cho dịch này chia thành 2 lớp (pha) Hỗn hợp được ly tâm tốc độ cao để phân tách các lớp như trong hình 1.1. Protein bị kết tủa nằm ở pha giữa Nếu dung dịch có pH trung tính thì cả DNA và RNA sẽ hòa tan và nằm ở pha lỏng phía trên Ngược lại, trong điều kiện pH acid thì DNA sẽ nằm lại trong pha hữu cơ tạo điều kiện dễ dàng cho nhà nghiên cứu thu nhận RNA nằm trong pha lỏng Tính chất tự nhiên của phenol là tính acid, do đó

sử dụng phenol với nước hay với dung dịch đệm acid đều cung cấp điều kiện phù hợp với mục đích tách chiết DNA

Lưu ý: Phenol là chất độc hấp thụ qua da, do đó khi tiến hành thí nghiệm phải đeo

găng tay bảo vệ Phenol và chloroform là chất độc bay hơi tác động lên hệ thần kinh thông qua hô hấp, do đó khi thao tác phải thực hiện trong tủ hút khí độc

1.1.3 CÔ ĐẶC DỊCH CHIẾT

Kết thúc bước chiết bằng phenol chúng ta đã thu được mẫu axit nucleic trong đó protein

đã bị loại bỏ Tuy nhiên, nồng độ axit nucleic thu được sẽ rất thấp và vẫn còn còn sót lại phenol-chloroform trong mẫu Sự có mặt của phenol sẽ làm biến tính các enzyme trong các bước tiếp theo Để giải quyết hai vấn đề này, axit nucleic cần được kết tủa và tinh sạch Việc này được thực hiện bằng một chất alcohol, phổ biến nhất là cồn và isopropanol, với

sự có mặt của các cation hóa trị một (Na+, K+, hay NH4+) Axit nucleic bị kết tủa được thu lại bằng ly tâm Một số muối lẫn trong dung dịch cũng được kết tủa theo và sẽ được loại

bỏ bằng cách rửa với cồn 70%

Có nhiều quy trình kết tủa DNA bằng alcohol khác nhau phụ thuộc vào bản chất của axit nucleic cần kết tủa DNA có khối lượng phân tử thấp sẽ khó kết tủa hơn nhiều Đây là điểm cần lưu ý khi cần tách chiết các phân đoạn DNA nhỏ

• Loại thứ nhất dựa trên nguyên lý sắc ký chọn lọc kích thước Dung dịch chứa DNA hòa tan chảy qua một mạng lưới cấu tạo bởi các lỗ nhỏ và các hạt hấp thụ Các phân

tử nhỏ như muối và các nucleotide riêng lẻ sẽ chui vào trong các hạt hấp thụ, còn các phân tử lớn như các phân đoạn axit nucleic sẽ đi qua các lỗ Đây là một phương pháp khá nhanh và đơn giản để tinh sạch acid nucleid

• Loại cột tinh sạch thứ 2 dựa trên nguyên lý sắc ký ái lực Các đại phân tử trong mẫu

sẽ bám vào chất hấp thụ trên cột Chất hấp thụ này có thể là chất tích điện dương liên kết với các nhóm phosphate tích điện âm trên phân tử DNA, hoặc có thể là một trình tự oligo-dT liên kết với đuôi poly-A của các phân tử mRNA của sinh vật eukaryote Trong cả 2 trường hợp, các thành phần tạp nhiễm được loại bỏ bằng cách rửa cột Sau khi rửa sạch, cột bị thay đổi điều kiện khiến cho chúng không còn

ái lực với axit nucleic Cuối cùng, axit nucleic được đẩy ra khỏi cột trong một thể tích nhỏ nước tinh khiết hoặc dung dịch đệm

Toàn bộ những nội dung trình bày trên là nguyên lý chung tách chiết axit nucleic Tách chiết DNA hệ gene về cơ bản là tuân theo các bước như vậy

1.1.5 TÁCH CHIẾT PLASMID

Tách chiết plasmid là công việc thiết yếu đối với các nghiên cứu sinh học phân tử Khó khăn ở đây là phải tách được DNA plasmid ra khỏi DNA hệ gene của vi khuẩn Biến tính bằng kiềm là cách làm phổ biến nhất để thực hiện nhiệm vụ này Trong dịch chiết

vi khuẩn, DNA hệ gene tồn tại ở dạng các phân đoạn mạch thẳng do bị đứt gãy ở bước phá tế bào Tăng pH lên khoảng 12 sẽ phá vỡ các liên kết hydro làm cho các đoạn DNA mạch kép bị tách thành 2 mạch đơn Tuy nhiên, đối với plasmid mà đặc biệt là những loại plasmid tương đối nhỏ thường dùng trong tách dòng gene, thì chúng có thể ở một trong

2 trạng thái:

• Thứ nhất, chúng vẫn tồn tại nguyên vẹn ở trạng thái mạch vòng siêu xoắn.

• Thứ hai, mặc dù pH cao làm đứt liên kết hydro, 2 mạch DNA vòng đơn không tách

khỏi nhau hoàn toàn mà vẫn được móc với nhau

Khi pH giảm, 2 mạch đơn của plasmid nhanh chóng khớp trở lại với nhau tạo thành plasmid mạch vòng kép Các plasmid dạng siêu xoắn và dạng vòng vừa tái hợp nằm trong dung dịch ở trạng thái hòa tan Trong khi đó, các DNA mạch đơn dạng thẳng của

hệ gene do khối lượng lớn, mạch dài nên không thể khớp lại với nhau như cũ Chúng bị lẫn vào với các thành phần không hòa tan Phần không tan này bao gồm cả các thành phần khác của tế bào như màng lipid, các loại protein… dễ dàng bị loại bỏ bằng ly tâm Plasmid thu được bằng cách này có độ tinh khiết đủ dùng cho nhiều mục đích Nếu cần

độ tinh khiết cao hơn nữa thì nhà nghiên cứu có thể sử dụng phương pháp pháp tinh sạch qua cột

1.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ AXIT NUCLEIC

Phương pháp định lượng axit nucleic được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp quang phổ do tính tiện dụng và chỉ số tin cậy ở mức cho phép Nguyên lý của phương pháp này dựa trên sự hấp thụ tia tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các nucleotide Một dung dịch chứa càng nhiều axit nucleic, hay nói cách khác nồng độ axit nucleic càng cao, thì càng hấp thụ nhiều ánh sáng Do đó, nồng độ axit nucleic được tính theo tương quan giá trị mật độ quang học tại bước sóng 260 nm (Optical Density260 – OD260) Một đơn vị OD260

tương ứng với nồng độ 50 µg/ml đối với dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml đối với RNA và DNA mạch đơn

h Ình 1.3. Tách chiết DNA plasmid

Tế bào vi khuẩn chứa plasmid bị phá vỡ dưới tác dụng của SDS Sự có mặt của NaOH làm biến tính DNA hệ gene Trong quá trình trung hòa, DNA hệ gene vón cục cùng với các thành phần khác của tế bào Phần không tan được loại bỏ bằng ly tâm Plasmid hòa tan trong pha lỏng được thu nhận

Phương pháp này có những nhược điểm sau:

• Thứ nhất, không xác định được mức độ toàn vẹn của DNA vì các nucleotide đơn lẻ

hay các đoạn DNA vụn cũng có khả năng hấp thụ tia tử ngoại

• Thứ hai, không xác định được độ sạch của DNA mẫu vì các chất tạp nhiễm như

protein và phenol cũng có khả năng hấp thụ tia tử ngoại

Nhược điểm thứ nhất được khắc phục bằng cách điện di DNA, sau đó nhuộm ethidium bromide và soi dưới tia cực tím (xem mục 1.3) Nhược điểm thứ hai được giải quyết bằng cách đo thêm giá trị OD280, vì đây chính là bước sóng tại đó protein hấp thụ tia tử ngoại tối đa Mẫu DNA được coi là sạch (không bị tạp nhiễm bởi protein) khi tỉ số

OD260/OD280 vào khoảng 1.8 đến 2.0

1.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL

Điện di trong gel (gel electrophoresis) là một kỹ thuật thiết yếu đối cả hai mục đích phân tích và tinh sạch axit nucleic Axit nucleic tích điện âm trên các nhóm phosphate của các nucleotide hay ribonucleotide Phân tử axit nucleic càng lớn thì càng mang nhiều nhóm phosphate, do đó tích điện âm càng mạnh Tuy nhiên, trên cùng một đơn vị chiều dài thì

độ tích điện của phân tử axit nucleic lớn hay nhỏ là như nhau Trong dung dịch tự do và dưới tác dụng của điện trường, các phân tử tích điện âm này sẽ di chuyển về phía cực dương với tốc độ bằng nhau không phân biệt kích thước lớn hay nhỏ Gel (thạch) có cấu tạo gồm các hệ thống lưới đan xen chằng chịt Khi di chuyển trong gel, tốc độ di chuyển của axit nucleic phụ thuộc vào khả năng luồn lách của các phân tử xuyên qua các khoảng trống của mạng lưới Các phân tử nhỏ sẽ di chuyển trong gel nhanh hơn các phân tử lớn

do chúng luồn lách tốt hơn, ít bị cản trở hơn Do đó, điện di trên gel có thể giúp phân tách DNA theo kích thước

1.3.1 GEL AGAROSE

Agarose là một chất keo tách chiết từ rong biển Gel agarose được pha chế bằng cách cho bột agarose vào dung dịch đệm với nồng độ khoảng 0.8 đến 3.0 phần trăm, sau đó đun sôi hỗn hợp cho đến khi agarose tan hoàn toàn Gel dạng lỏng được làm nguội xuống khoảng

600C, sau đó rót vào khuôn có cắm sẵn lược và để nguội tự nhiên ở nhiệt độ phòng để tạo thành gel dạng rắn

Khả năng phân tách của gel agarose được quy định bởi nồng độ Đáng lưu ý là không thể kiểm soát kích thước của các lỗ trong gel một cách chính xác Một bản gel agarose 1% mang các lỗ với nhiều kích thước khác nhau, trong khi đó bản gel 2% mang nhiều lỗ nhỏ hơn so với bản 1% nhưng vẫn còn tồn tại các lỗ có kích thước lớn

Giới hạn phân tách tốt nhất của DNA trong

gel agarose nằm trong khoảng 200 bp–15 kb Hai

nhân tố chính quyết định tốc độ di chuyển của

DNA trong điện di là khối lượng phân tử (hay độ

dài của mạch) và hình dạng Nhìn chung, các đoạn

DNA nhỏ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn Tuy

nhiên, nếu chúng ta xem xét kỹ cách di chuyển của

phân tử DNA trong gel agarose, ta sẽ thấy không

có mối liên hệ ngược trực tiếp giữa kích thước của

phân tử DNA và khoảng cách di chuyển

Sau khi các đoạn DNA đã được phân tách

bằng điện di trên gel agarose, chúng cần được

nhuộm để có thể phát hiện Phương pháp nhuộm

phổ biến nhất là ngâm bản gel trong dung dịch

ethidium bromide Đây là một phân tử phẳng, dẹp

có khả năng bám xen vào giữa hai mạch đơn của phân tử DNA mạch kép làm cho DNA

bị biến tính cục bộ Ethidium bromide bám rất hiệu quả vào DNA mạch kép nhưng bám rất kém hiệu quả vào DNA mạch đơn và RNA vì các phân tử này không có các liên kết hydro Bản gel sau khi ngâm trong dung dịch ethidium bromide sẽ được soi dưới tia cực tím (260–300 nm) và các băng DNA sẽ hiển thị do ethidium bromide bám xen trong các phân tử DNA mạch kép phát sáng huỳnh quang

Nếu chúng ta đo khoảng cách di chuyển trong gel của phân tử DNA có kích thước

đã biết và biểu đồ hóa dữ liệu đó, ta sẽ thấy khoảng cách di chuyển tỉ lệ nghịch với giá trị logarit của kích thước phân tử Những đoạn DNA từ 500 bp đến 1 kb được phân tách rõ ràng trên bản gel, trong khi đó những đoạn DNA từ 8 kb đến 10 kb nằm rất sát nhau Kết quả của mối quan hệ logarit ngược chỉ ra rằng từ 30 kb trở lên, các đoạn DNA

sẽ di chuyển tới cùng 1 vị trí bất kể chúng có kích thước lớn đến đâu chăng nữa Điều này có nghĩa là các đoạn DNA kích thước lớn không thể phân tách khỏi nhau trong gel agarose Đoạn DNA 30 kb sẽ di chuyển giống như đoạn 60 kb Cả hai đoạn DNA này đều có thể di chuyển xuyên qua mạng lưới agarose nhưng chúng không thể tách biệt Việc tăng thời gian điện di hay giảm nồng độ gel cũng không đem lại kết quả Để hiểu được vấn đề này, chúng ta cần hiểu bản chất quá trình di chuyển của DNA xuyên qua các lỗ trong bản gel

DNA là một phân tử polymer dài, mỏng, tích điện âm Để có thể di chuyển xuyên qua các lỗ trong mạng lưới của gel, phân tử DNA có xu hướng tìm kiếm con đường dễ đi nhất

và sẽ đưa một đầu đi trước Đã có nhiều mô hình lý thuyết được đề xuất nhằm lý giải sự chuyển động của DNA trong gel Cách tư duy đơn giản nhất là tưởng tượng sự di chuyển ngoằn ngoèo của DNA xuyên qua các lỗ của mạng lưới gel Các phân tử DNA ngắn sẽ di chuyển dễ dàng hơn trong mạng lưới này vì ít bị cản trở hơn Các phân tử DNA dài cũng

di chuyển như vậy nhưng chúng thường bị mắc kẹt hoặc bị rối tung trong ma trận này, do

h Ình 1.4. Ethidium bromide bám vào DNA

Ethidium bromide là một phân tử phẳng, dẹp

có khả năng bám xen vào giữa 2 mạch đơn của phân tử DNA mạch kép DNA chứa ethidium bromide phát sáng huỳnh quang dưới tia cực tím.

đó tốc độ di chuyển bị chậm lại tỉ lệ thuận với chiều dài Với kích thước từ 30 kb trở lên, phân tử DNA đủ rối để bị mắc kẹt hoàn toàn trong mạng lưới của gel.

Sự di chuyển này có thể bị mắc kẹt bởi nhiều lý do Phân tử DNA càng dài thì khả năng bị mắc kẹt càng lớn

h Ình 1.5. Điện di trên gel agarose

Dung dịch agarose được đun thành dạng lỏng và được rót vào khuôn cắm sẵn lược Sau khi gel đông cứng bằng cách để nguội tự nhiên, lược được rút bỏ tạo nên các giếng để tra mẫu DNA vào Khi đưa vào điện trường, các phân tử DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương Ở trong gel, các phân tử DNA kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn so với các phân tử kích thước lớn Độ đậm, nhạt (sáng rõ hay mờ) của băng DNA tỉ lệ với hàm lượng DNA Thang DNA chuẩn (L: ladder) là tập hợp các đoạn DNA biết trước kích thước và hàm lượng; 1 và 2, các mẫu DNA khác nhau.

Nhân tố chủ chốt thứ hai quyết định khả năng di chuyển của DNA trong gel là cấu trúc không gian của phân tử này Thường có một tỉ lệ lớn các plasmid tách chiết từ

E coli tồn tại ở dạng mạch vòng kép siêu xoắn Cấu trúc gọn gàng này cho phép plasmid

di chuyển dễ dàng hơn trong ma trận gel Nếu một trong hai sợi đơn của plasmid này bị đứt làm cho trạng thái siêu xoắn bị phá vỡ, khi đó cấu trúc của plasmid sẽ trở nên loằng ngoằng khiến nó khó di chuyển hơn trong gel Vẫn plasmid này, nếu mạch kép bị đứt hẳn thì nó sẽ trở thành dạng mạch thẳng và có tốc độ di chuyển ở giữa hai dạng kể trên Thực

h Ình 1.6. Sự di chuyển của các phân tử DNA trong gel agarose

(a) Một bản gel agarose trong đó các phân tử DNA với kích thước đã biết được phân tách

(b) Kích thước của phân tử DNA và khoảng cách di chuyển được trong bản gel

(c) Biểu đồ tương quan ngược giữa kích thước phân tử DNA và khoảng cách di chuyển, dữ liệu lấy từ (b) Biểu đồ này cho thấy mối quan hệ giữa kích thước phân tử DNA và khoảng cách di chuyển được không có mối quan hệ tuyến tính (d) Biểu đồ tương quan ngược giữa log của kích thước phân tử DNA và khoảng cách di chuyển Biểu đồ này cho thấy có mối tương quan ngược trực tiếp giữa khoảng cách di chuyển và giá trị log của kích thước phân tử DNA.

nghiệm đã đưa đến kết luận là một phân tử DNA sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc không gian của nó.

1.3.2 GEL POLYACRYLAMIDE

Điện di trên gel polyacrylamide (Polyacrylamide Gel Electrophoresis—PAGE) được tiến hành lần đầu tiên năm 1959 trong một thí nghiệm phân tách protein Tuy nhiên, kỹ thuật này hoàn toàn có thể được áp dụng để phân tách axit nucleic Kích thước lỗ của gel poly-acrylamide cũng có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi nồng độ gel từ 3 đến 30% PAGE có khả năng phân tách các phân tử DNA có kích thước chênh nhau chỉ một nucle-otide Nhờ có độ phân giải cao như vậy nên kỹ thuật này được ứng dụng trong việc giải trình tự DNA Nhược điểm của PAGE là chỉ dùng được cho các đoạn DNA có kích thước khoảng 1000 bp trở lại Các phân tử DNA kích thước lớn không thể đi xuyên qua các lỗ trong ma trận của gel polyacrylamide và do đó không thể được phân tách trên bản gel Gần như không có vector nào sử dụng trong tách dòng gene có kích thước dưới 1 kb nên PAGE rất ít khi được sử dụng trong các phòng thí nghiệm

h Ình 1.8. DNA di chuyển như con rắn xuyên qua các lỗ trong ma trận gel

h Ình 1.7. DNA di chuyển xuyên qua lỗ theo mô hình “đầu xuôi đuôi lọt”

DNA đi xuyên qua ma trận mạng lưới gel DNA mắc kẹt trong ma trận mạng lưới gel

Hướng di chuyển của DNA trong điện trường

1.3.3 THU NHẬN LẠI DNA TỪ GEL AGAROSE

Trong tiếng Anh công việc này có tên là gel elution, tiếng Việt tạm gọi là “chiết gel” hoặc

“thôi gel” Trong rất nhiều trường hợp ta cần thu nhận lại đoạn DNA cần thiết sau khi điện di trong gel Ví dụ như sau khi cắt vector và đoạn xen bằng enzyme giới hạn, ta cần tách chúng khỏi các đoạn DNA khác trong hỗn hợp phản ứng cắt Thực hiện công việc này bằng điện di trên gel là cách làm đơn giản và rõ ràng nhất Sau khi điện di, công đoạn tiếp theo là thu nhận lại vector và đoạn xen đang nằm trong gel Có một số phương pháp như sau:

Hòa tan gel Nếu gel là agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp, thao tác sẽ tương đối

đơn giản Ta chỉ việc cắt lấy phần gel có chứa đoạn DNA đích và làm cho gel tan chảy bằng cách tăng nhiệt độ Trong trường hợp gel agarose có nhiệt độ nóng chảy cao, gel cần được làm tan bằng các nhân tố phụ hoặc bằng enzyme agarase Sau khi gel đã tan chảy, DNA trong gel được thu lại bằng cách tinh sạch qua cột silica Đây là phương pháp được

sử dụng rộng rãi nhất

Khuếch tán Sau khi cắt ra, miếng gel chứa DNA được ép và ngâm trong dung dịch

đệm Sau vài giờ đồng hồ, phần lớn DNA sẽ khuếch tán ra khỏi gel Phần gel bị loại bỏ bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm

Đông cứng Lát cắt gel chứa đoạn DNA đích được ngâm trong nitơ lỏng Nhiệt độ

-1760C của nitơ lỏng sẽ phá vỡ cấu trúc gel Hỗn hợp này sau đó được ly tâm qua một loại màng lọc có đặc tính chỉ cho chất lỏng đi qua, nhờ đó ta loại bỏ được phần gel và thu được phần dịch lỏng có chứa DNA

Chiết rút bằng điện trường Có nhiều cách để thực hiện Dưới đây là 3 phương

pháp phổ biến

• Lát cắt gel được đóng kín trong một ống thẩm tách chứa dung dịch đệm và đưa vào điện trường để tiếp tục quá trình điện di Dưới tác dụng của điện trường DNA di chuyển ra khỏi gel và đi vào dung dịch đệm chứa trong ống thẩm tách

h Ình 1.9. Ảnh hưởng của cấu trúc không gian đến khả năng di chuyển của phân tử DNA

Ba dạng cấu trúc khác nhau của cùng một loại phân tử DNA di chuyển tới các

vị trí khác nhau trong gel Dạng siêu xoắn

có cấu trúc gọn gàng di chuyển nhanh nhất Nếu bị đứt một mạch đơn, phân

tử DNA sẽ trở nên rối rắm và di chuyển chậm Dạng mạch thẳng có tốc độ di chuyển trung gian giữa hai dạng kia.

• Người ta cắt một rãnh phía trước băng DNA đích, cho dung dịch đệm vào đó và tiếp tục quá trình điện di DNA di chuyển hết gel sẽ chuyển hết vào rãnh này Dung dịch đệm chứa DNA được hút ra bằng pipet.

• Cắm một miếng nhỏ một loại màng chuyên dụng vào gel liền kề phía trước băng DNA đích và tiếp tục điện di DNA sẽ di chuyển ra khỏi gel và dính lên màng Màng được thu lại và đem rửa với một dung dịch phù hợp để thu lại DNA Loại màng hay được dùng là DEAE-cellulose DNA bám trên màng này được thu nhận bằng cách rửa với dung dịch đệm có nồng độ muối cao

1.4 LAI PHÂN TỬ

1.4.1 HIỆN TƯỢNG BIẾN TÍNH CỦA AXIT NUCLEIC

Cấu tạo phân tử DNA gồm hai loại liên kết hóa học:

Liên kết phosphodiester giữa các nucleotide liền

kề trong một mạch đơn và liên kết hydro giữa các

nucleotide bổ sung với nhau nằm trên hai mạch

đơn của mạch kép Liên kết phosphodiester bền

vững còn liên kết hydro yếu hơn nhiều Do đó, hai

mạch đơn của một sợi DNA mạch kép có thể tách

rời nhau, trong tế bào cũng như trong ống nghiệm,

ở những điều kiện không làm thương tổn liên kết

cộng hóa trị của mạch đơn Đặc tính này được gọi là

biến tính (denaturation).

Trong phòng thí nghiệm, cách thường dùng

nhất để làm biến tính sợi DNA mạch kép là nhiệt

độ, vì vậy hiện tượng biến tính của DNA còn được

gọi một cách dân dã là nóng chảy (melting) Bằng thực nghiệm người ta thấy có sự tăng

đột biến giá trị mật độ quang học (optical density—OD) trong một giải nhiệt độ nhất định và sau đó giá trị này ổn định khi hai mạch đơn đã hoàn toàn tách khỏi nhau (Hình 1.10) Nguyên nhân của hiện tượng này là do ở dạng mạch kép, các nucleotide được sắp xếp chồng lên nhau khiến chúng bị che lấp một phần Cấu trúc này làm giảm sự tiếp xúc với ánh sáng đồng nghĩa với việc khả năng hấp thụ ánh sáng sẽ thấp hơn khi phân tử DNA ở dạng mạch đơn Điểm trung bình của vùng nhiệt độ tại đó hai sợi đơn của một

mạch DNA kép tách khỏi nhau được gọi là nhiệt độ nóng chảy (melting temperature),

ký hiệu là Tm Trong điều kiện sinh lý bình thường, Tm thường nằm trong khoảng 85–950C

Quá trình chuyển từ dạng mạch đôi sang mạch đơn diễn ra đột ngột là do tính “cộng hưởng” của phản ứng Hiện tượng cộng hưởng có thể được hình dung như một dây xích Khi lực tác động chưa đạt đến ngưỡng đủ lớn thì dây xích vẫn bền vững, nhưng khi lực

h Ình 1.10. Nhiệt độ nóng chảy của DNA

tác động vượt qua ngưỡng đó để làm bật tung ra một mắt xích thì toàn bộ các mắt xích còn lại sẽ bung ra.

Lưu ý rằng nhiệt độ không phải là yếu tố duy nhất có thể làm biến tính DNA mạch kép Các enzyme như DNA helicase, topoisomerase hay hóa chất như NaOH cũng thực hiện được nhiệm vụ này

1.4.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN NHIỆT ĐỘ

NÓNG CHẢY CỦA DNA

Đối với các đoạn DNA dài hơn 100 nucleotide, nhiệt độ nóng chảy được coi mặc định ở khoảng 94–1000C Ở đây chúng ta chỉ xét tới các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của các đoạn DNA ngắn Nắm được các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA sẽ rất hữu ích khi thiết kế mồi PCR là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng

16 đến 35 nucleotide

1.4.2.1 Thành phần nucleotide

Lý do thứ nhất làm cho nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào

thành phần nucleotide của phân tử DNA là cặp đôi guanine

– cytosine liên kết với nhau bởi 3 liên kết hydro, trong khi cặp

đôi adenosine – thymidine chỉ có 2 liên kết hydro Nếu có một

đoạn DNA lạ, ta có thể ước lượng tỉ lệ G/C của nó bằng cách đo

Tm Ngược lại, nếu ta biết trình tự của đoạn DNA thì ta có thể

tính được Tm Trong điều kiện sinh lý tiêu chuẩn, Tm được tính

theo công thức sau:

Tm = 69.3 + 0.41% (G+C)

Lý do thứ hai là tương tác kỵ nước với nucleotide liền kề

có ảnh hưởng đến tính bền vững của liên kết hydro giữa 2

nucleotide bổ sung Trên hình 1.11 ta thấy năng lượng tự do (∆G

– năng lượng được giải phóng khi tạo thành liên kết bổ sung)

của tổ hợp CG/GC là khác với tổ hợp GC/CG Càng nhiều năng

lượng được giải phóng nghĩa là liên kết càng bền vững

Đối với các đoạn DNA ngắn, việc tính toán Tm phải dựa

chính xác trên trình tự của chúng Thật may là ngày nay có một

số công cụ máy tính giúp cho việc tính toán này trở nên đơn

giản hơn nhiều

1.4.2.2 Độ dài của đoạn DNA

Rõ ràng là đoạn DNA càng dài thì càng có nhiều liên kết hydro giữa hai mạch đơn, do

đó nhiệt độ nóng chảy càng cao Ví dụ, trong điều kiện tiêu chuẩn đoạn oligo gồm 13 nucleotide CTGCTGCTGAATC có Tm là 25,60C Vẫn trình tự này, khi ta gấp đôi chiều

h Ình 1.11. Năng lượng của liên kết hydro giữa các cặp nucleotide

dài của nó thành 26 nucleotide, CTGCTGCTGAATCCTGCTGCTGAATC, thì Tm tăng lên 640C Giá trị khi gấp 3, 4, 5, 6, 7 lần lần lượt là 78, 85, 89, 92, 94 Tiếp theo, mặc dù tăng lên gấp 10 hay thậm chí gấp 100 lần thì giá trị Tm tăng lên không đáng kể và không lớn hơn 1000C.

1.4.2.3 Điểm bắt cặp sai lệch

Mặc dù liên kết bổ sung tiêu chuẩn chỉ hình thành giữa A và T, G và C, nhưng trên phân

tử DNA vẫn có thể có những vị trí không bắt cặp bổ sung, ví dụ A với G hoặc T với T Khi

độ dài đủ lớn thì mặc dù có chứa các điểm bắt cặp sai lệch nhưng phân tử DNA vẫn duy trì được ở trạng thái mạch kép Tuy nhiên, các điểm bắt cặp sai lệch này sẽ làm giảm tính bền vững của DNA Theo ước tính cứ mỗi 1% bắt cặp sai lệch sẽ làm Tm giảm đi 10C

1.4.2.4 Điều kiện môi trường

Trong phòng thí nghiệm ta có thể điều chỉnh một số yếu tố để tăng hay giảm nhiệt độ nóng chảy theo mục đích thí nghiệm

Đầu tiên là những yếu tố ảnh hưởng đến tương tác kị nước Cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA được duy trì không chỉ nhờ liên kết hydro mà còn nhờ vào tương tác kị nước giữa các nucleotide trên 2 mạch đối diện Cần phân biệt lực này với lực tương tác kị nước giữa các nucleotide liền kề như đã đề cập ở phần trên Trong môi trường lỏng, bản chất

kị nước của các nucleotide khiến cho phân tử DNA mạch đơn trở nên không bền vững

Sự bắt cặp của các nucleotide theo nguyên tắc bổ sung sẽ hạn chế tương tác của chúng với môi trường nước bao quanh Khác với liên kết hydro, tương tác kị nước giữa hai phân tử DNA mạch đơn không mang tính đặc hiệu Các phân tử axit nucleic mạch đơn luôn có xu hướng bắt cặp với nhau cho dù trình tự nucleotide của chúng không bổ sung Các phân

tử RNA là minh chứng rõ ràng cho xu hướng này Do RNA thường có cấu trúc mạch đơn

và không có sợi đối nghĩa bổ sung nên chúng phải tự gấp khúc tạo nên các vùng mạch kép cục bộ, ví dụ như cấu trúc kẹp tóc hay cấu trúc hình cái chảo Thực nghiệm đã chứng minh, trong điều kiện nhiệt độ phòng và không có các tác nhân biến tính thì một sợi axit nucleic mạch đơn thường tồn tại dưới dạng phức hệ bao gồm nhiều vùng bắt cặp cục bộ Dựa vào nguyên lý này người ta có thể tăng hay giảm nhiệt độ nóng chảy của DNA bằng cách điều chỉnh nồng độ formamide, một chất có tác dụng làm suy yếu tương tác kị nước Công thức ước lượng ảnh hưởng của nồng độ formamide tới Tm của những đoạn DNA mạch kép dài hơn 100 nucleotide như sau:

∆Tm = -0,6 × (% formamide)Trong thực nghiệm, formamide là chất được sử dụng phổ biến để làm giảm nhiệt độ phản ứng lai phân tử theo quy tắc bổ sung 50% formamide để hạ 300C

Nhân tố quan trọng tiếp theo ảnh hưởng đến độ bền của DNA mạch kép là tích điện

âm tích lũy trên các nhóm phosphate, 1 trong 3 thành phần cấu tạo nên nucleotide Tác động của nhân tố này ngược lại với liên kết hydro và tương tác kị nước, tức là làm cho

DNA mạch kép kém bền vững vì 2 sợi đơn cùng tích điện âm nên giữa chúng có lực đẩy tĩnh điện Trong môi trường muối, yếu tố này bị trung hòa do sự có mặt của một đám mây các cation tích điện dương xung quanh phân tử DNA làm trung hòa điện tích âm của gốc phosphate Khi giảm nồng độ muối, những vị trí liên kết lỏng lẻo, ví dụ như tại các điểm bắt cặp sai lệch, sẽ trở nên dễ bị phá vỡ bởi lực đẩy tĩnh điện Dữ liệu thực nghiệm cho thấy Tm giảm khoảng 150C khi giảm 1 logarithme nồng độ ion hóa trị 1 Các cation hóa trị 2 có tác động mạnh hơn.

Tất cả các yếu tố trên không tách rời mà có quan hệ chặt chẽ đến Tm của DNA Công thức tính Tm dựa trên tất cả các yếu tố như sau:

Tm = 16,6 log[Na+] + 0,41 (%GC) + 81,5–%M – 675/L – 0,65 (% formamide)

L (length) là chiều dài của trình tự bắt cặp tính theo đơn vị bp

M (mismatch) là các điểm sai lệch không bắt cặp

1.4.3 KHÁI NIỆM LAI PHÂN TỬ

Sau khi biến tính, trong những điều kiện nhất định thì hai mạch đơn có thể tự bắt cặp trở

lại với nhau tạo ra phân tử DNA mạch kép ban đầu Đặc tính này của DNA được gọi là hồi

tính (renaturation) và là cơ sở của các phương pháp lai phân tử.

Nếu ta đem hai phân tử DNA mạch kép có trình tự gần tương đồng trộn lẫn với nhau, biến tính rồi để nhiệt độ hạ xuống từ từ, các mạch đơn sẽ bắt cặp lẫn lộn với nhau tạo ra hai loại phân tử DNA gốc ban đầu và một loại phân tử DNA lai Quá trình này được gọi là

lai phân tử (molecular hybridization) (hình 1.12)

h Ình 1.12. Lai phân tử

Lai phân tử có tính đặc hiệu, tức là chỉ diễn ra giữa các mạch đơn có trình tự tương đồng cho dù chúng bị lẫn trong hàng triệu mạch đơn khác Trong trường hợp lai giữa các phân tử họ hàng, các điểm bắt cặp sai lệch sẽ làm giảm tính bền vững của phân tử lai.Phân tử DNA lai là một phân tử mạch kép trong đó hai mạch đơn đến từ hai nguồn khác nhau Có thể lai giữa DNA-DNA, DNA-RNA và RNA-RNA.

1.4.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG LAI PHÂN TỬ

Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của axit nucleic mạch kép chính là các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng lai phân tử Ngoài ra còn có các yếu tố dưới đây

Nhiệt độ Sự hồi tính của DNA chỉ xảy ra khi nhiệt độ ở trạng thái biến tính được

hạ xuống từ từ Nếu nhiệt độ hạ đột ngột, các mạch DNA đơn sẽ tồn tại ở trạng thái không gian vô trật tự Phản ứng lai thường đạt được tốc độ tối đa khi diễn ra ở nhiệt độ thấp hơn

Tm của chính axit nucleic đó khoảng 250C

Nồng độ DNA và thời gian phản ứng Bản chất ảnh hưởng của hai yếu tố này là

làm tăng khả năng tiếp xúc giữa các phân tử tham gia phản ứng Để phản ứng lai có thể xảy ra thì điều kiện tiên quyết là hai mạch đơn phải tiến đến gần và nằm ở vị trí đối diện nhau Nồng độ DNA càng lớn có nghĩa là số lượng các mạch DNA đơn càng nhiều thì tần số gặp gỡ giữa chúng càng lớn, do đó tốc độ phản ứng lai càng cao Tương tự như vậy, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất gặp gỡ giữa các phân tử lai càng cao Tuy nhiên, không phải cứ để phản ứng diễn ra càng lâu càng tốt bởi vì các thành phần tham gia phản ứng có thể bị phân hủy

Chương 2 CẮTVÀNỐIDNA

Công nghệ DNA tái tổ hợp, một hợp phần trọng tâm của Kỹ thuật di truyền, là việc

tạo ra phân tử DNA từ ít nhất hai nguồn khác nhau Để thực hiện được điều này cần có hai thao tác căn bản là cắt và nối DNA Trong chương này chúng ta sẽ xem xét sử dụng endonuclease giới hạn để cắt DNA và ligase để nối hai đoạn với nhau Tiếp theo, chương này thảo luận một số cách thực hiện những quá trình trên nhằm cải thiện hiệu quả và độ linh hoạt của quá trình

2.1 CẮT DNA BẰNG ENZYME GIỚI HẠN

Endonuclease giới hạn hay còn gọi là enzyme giới hạn là những enzyme có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết phosphodiester ngay tại đó

2.1.1 HIỆN TƯỢNG GIỚI HẠN Ở VI KHUẨN

Tên gọi của loại enzyme này bắt nguồn từ hiện tượng biến đổi và giới hạn tùy thuộc vật chủ Hiện tượng này có thể xảy ra khi dùng phage bắt nguồn từ chủng vi khuẩn này gây

nhiễm vào chủng vi khuẩn khác Ví dụ, phage phát triển trong chủng E coli C lây nhiễm sang chủng E coli K rất không hiệu quả Chủng E coli K giới hạn khả năng phát triển của phage bắt nguồn từ E coli C Bằng thực nghiệm, người ta thấy rằng DNA của phage tách chiết từ E coli K bị cắt thành những đoạn nhỏ có kích thước xác định, còn DNA của phage tách chiết từ E coli C được giữ nguyên vẹn Nguyên nhân của hiện tượng này là do E coli

K sở hữu các endonuclease (gọi là endonuclease giới hạn) có khả năng cắt DNA ngoại lai thành nhiều mảnh, do vậy DNA của phage xâm nhiễm bị phân hủy nhanh chóng và rất

hiếm khi thoát khỏi quá trình này để tạo

ra thế hệ phage con (hình 2.1).Ban đầu, hiện tượng giới hạn được chứng minh xảy ra khi gây nhiễm thực khuẩn thể, nhưng sau đó người ta thấy

nó xảy ra bất cứ khi nào chuyển DNA giữa các chủng vi khuẩn, bao gồm chuyển plasmid hay DNA biến đổi di truyền Nếu chủng nhận có hệ thống biến đổi/giới hạn khác với vật chủ gốc, hiệu quả chuyển nạp hay tái tổ hợp rất thấp

Câu hỏi đặt ra là bằng cách nào mà DNA của vật chủ lại không bị enzyme giới hạn của chính nó cắt vụn? Cho đến thời điểm hiện tại thì câu trả lời là DNA vật chủ được methyl hóa (methylation) nên không bị nuclease tấn công Enzyme methylase của vật chủ có tác dụng gắn nhóm methyl vào A hoặc C ở các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn làm cho các enzyme này không còn xác định được điểm cắt

2.1.2 PHÂN LOẠI VÀ HỆ THỐNG TÊN GỌI ENZYME GIỚI HẠN

Enzyme giới hạn của E coli K không phù hợp với mục tiêu thao tác trên vật liệu di truyền

do không tạo ra các đoạn đặc hiệu Nó nhận biết các trình tự đặc hiệu trên DNA nhưng không cắt ngay tại vị trí đó mà lại cắt tại các điểm cách vị trí nhận biết những khoảng khác nhau, đôi khi kéo dài tới 5 kb Các enzyme hoạt động kiểu này có tên là endonuclease giới hạn loại I

Có một quan niệm phân biệt enzyme giới hạn loại III là những enzyme cắt DNA tại

vị trí cách trình tự nhận biết một vài cho đến 20 nucleotide Tuy nhiên, khái niệm này về bản chất là một khái niệm con của enzyme giới hạn loại I

Những enzyme thường sử dụng trong kỹ thuật di truyền có đặc tính cắt ngay tại trình

tự nhận biết đặc hiệu Chúng được gọi là endonuclease giới hạn loại II Một số lượng rất lớn enzyme giới hạn loại II đã được tinh chế thành công và hiện đang được sử dụng trong thao tác DNA Enzyme giới hạn loại I và III có ít ứng dụng và sẽ không được đề cập tiếp

Kể từ nay thuật ngữ enzyme giới hạn được hiểu mặc định là các enzyme loại II

Tên của enzyme giới hạn cấu thành từ ký tự đầu của chủng và hai ký tự đầu của tên loài phát sinh ra enzyme, cuối cùng là hậu tố chỉ ra các loại enzyme giới hạn khác nhau

từ cùng một sinh vật theo thứ tự phát hiện Một số enzyme có thêm chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng Ví dụ:

h Ình 2.1. Hiện tượng giới hạn ở vi khuẩn

• PstI là enzyme đầu tiên thu được từ vi khuẩn Providencia stuartii.

• HaeI, HaeII, HaeIII là ba enzyme có tính đặc hiệu khác nhau từ Haemophilus aegyptius.

• EcoRV là enzyme thứ 5 được phát hiện ở Escherichia coli chủng RY13.

Thông thường, ba ký tự đầu trong tên enzyme giới hạn được viết nghiêng (từ tên của sinh vật nguồn), như khi viết tên loài Bảng 2.1 thể hiện một số ví dụ, cùng với trình tự nhận biết và vị trí cắt DNA

2.1.3 TÍNH ĐẶC HIỆU

Tính đặc hiệu của enzyme giới hạn có nghĩa là một enzyme giới hạn chỉ nhận biết và cắt DNA tại một trình tự nucleotide duy nhất

Một trong những yếu tố quan trọng quyết định việc sử dụng những enzyme này

là độ dài vị trí nhận biết Tham số này ảnh hưởng đến tần số cắt DNA và kích thước

trung bình đoạn tạo ra bởi enzyme giới hạn Ví dụ, enzyme Sau3A có vị trí nhận biết

4 nucleotide GATC Nếu giả định rằng tỷ lệ bốn nucleotide bằng nhau và chúng phân

bố ngẫu nhiên, như vậy tại bất kỳ vị trí nào trong nhiễm sắc thể, một trong bốn cơ hội

là G Do đó, một phần tư cơ hội để nucleotide kế tiếp là A; cơ hội để có trình tự GA do

đó là 1/42 (1/16) Mở rộng tiếp, cơ hội tồn tại của GAT là 1/43 và của GATC là 1/44 hay 1/256

Vì vậy, enzyme này (và bất cứ enzyme nào có vị trí nhận biết 4 nucleotide) sẽ cắt DNA (theo giả định trên) sau mỗi 44 nucleotide và tạo ra các đoạn có kích thước trung bình

256 nucleotide Kích thước thực tế của các đoạn sẽ khác nhau rất lớn so với giá trị trung

bình Vị trí sáu nucleotide như trường hợp nhận biết của EcoRI (GAATTC) sẽ nằm trung

bình sau mỗi 46 (hay 4096) nucleotide Để dễ tưởng tượng hơn, protein kích thước trung bình mang khoảng 300 amino acid mã hóa bởi một đoạn do DNA dài 900 bp (bỏ qua khả năng chứa intron) Do vậy, enzyme có vị trí nhận biết 4 nucleotide sẽ tạo ra các đoạn nhỏ hơn nhiều so với toàn hệ gene Nói cách khác, hệ gene của vi khuẩn có độ lớn khoảng

4 × 106 nucleotide (4 Mb) có thể (với cùng giả định) bị cắt thành khoảng 1000 đoạn bởi

các enzyme như EcoRI.

Bảng 2.1 Một số enzyme giới hạn phổ biến

EcoRI G/AATTC 6 Đầu dính 5’ Escherichia coli RY 13

BamHI G/GATCC 6 Đầu dính 5’ Bacillus amyloliquefaciens H BglII A/GATCT 6 Đầu dính 5’ Bacillus globigii

Sau3A /GATC 4 Đầu dính 5’ Staphylococcus aureus 3A

Những giả định trong tính toán trên không hoàn toàn chính xác trong thực tế Đầu tiên, chúng ta giả định rằng bốn nucleotide có tỷ lệ bằng nhau Nếu quan tâm đến hai mạch của DNA xoắn kép, số gốc G và C là bằng nhau, khi mà với mỗi G trên một mạch sẽ

có một C ở mạch kia và ngược lại Tương tự, số gốc A và T bằng nhau (Sự cân bằng của

G và C, A và T không đúng khi tách rời hai mạch, nhưng trên thực tế chúng gần như cân bằng) Vì vậy, chúng ta có thể đơn giản hóa tính toán thành phần nucleotide bằng cách so sánh số nucleotide G + C với A + T Điều này thường thể hiện ở phần trăm (G + C), hay

%GC Tham số này có thể khác nhau lớn giữa các loài Với E coli, giả định trên đúng do tỷ

lệ GC trên thực tế là 50%, nhưng hệ gene có dải %GC từ 37% (Staphylococcus aureus) tới 72% (Streptomyces coelicolor) Với một sinh vật có tỷ lệ GC cao trong DNA, số vị trí nhận biết của EcoRI sẽ thấp hơn tiên đoán ở trên.

Hơn nữa, trình tự nucleotide phân bố ngẫu nhiên Do nhiều lý do khác nhau, một số

tổ hợp nucleotide thường tồn tại ít hơn mong đợi Do đó, một số vị trí có mức đại diện thấp đáng kể trong hệ gene Thậm chí một vị trí đặc hiệu có thể tồn tại khác nhau giữa các vùng trong hệ gene

Mặc dù hầu hết enzyme sử dụng phổ biến trong thực nghiệm nhận biết bốn hoặc sáu nucleotide (một số trường hợp là năm nucleotide), một số enzyme đóng vai trò quan

trọng có vị trí cắt tồn tại với tần số thậm chí thấp hơn, như NotI và PacI (xem bảng 2.1) Chúng có vị trí nhận biết tám nucleotide, nên tồn tại (trung bình) sau mỗi 48 nucleotide (khoảng 65 kb) Tuy nhiên, do trình tự phân bố không ngẫu nhiên (gồm toàn bộ G + C hay A + T tương ứng) nên một trình tự DNA nhất định có thể chứa ít (hoặc thậm chí không chứa) vị trí nhận biết của một trong những enzyme này, phụ thuộc vào thành phần nucleotide

2.1.4 METHYL HÓA

Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng cắt DNA của endonuclease giới hạn là sự methyl hóa DNA Mỗi endonuclease giới hạn trong vật chủ của nó tồn tại song hành với enzyme biến đổi DNA nhiễm sắc thể Enzyme biến đổi này methyl hóa trình tự nhận biết của enzyme giới hạn do đó không bị endonuclease phân cắt Ngoài ra, hầu hết các chủng

E coli trong phòng thí nghiệm chứa hai methyltransferase DNA đặc hiệu vị trí Dam methylase xúc tác methyl hóa gốc adenine của trình tự GATC, trong khi Dcm methylase

biến đổi cytosine thứ hai của trình tự CCAGG và CCTGG Methyl hóa tại những vị trí này giúp DNA không bị enzyme giới hạn với khả năng nhận biết những vị trí này tấn công (xem bảng 2.1)

Methyltransferase cũng tồn tại trong eukaryote, đặc biệt là CpG methylase, enzyme biến đổi cytosine trong một số vị trí chứa dinucleotide CpG Mặc dù không liên quan trong hệ thống biến đổi/giới hạn, chúng có thể tác động đến khả năng cắt những vị trí nhất định trong DNA eukaryote bậc cao hơn của enzyme giới hạn Phức tạp hơn khi một

số chủng E coli có hệ thống giới hạn (McrA, McrBC, Mrr) tấn công DNA bị methyl hóa

tại vị trí CpG, dẫn tới khả năng tách dòng DNA của động vật và thực vật bậc cao bị giảm trong những chủng này.

Toàn bộ những gì về methyl hóa DNA là quá phức tạp để đề cập ở đây, ngoại trừ việc

cần để ý những yếu tố trên khi chọn enzyme giới hạn và chủng E coli chủ.

2.1.5 TRÌNH TỰ ĐỌC XUÔI NGƯỢC NHƯ NHAU

Cần chú ý rằng hầu hết vị trí nhận biết của

endonuclease giới hạn có tính chất đọc xuôi

ngược như nhau (palindromic) Ví dụ như từ

radar đọc từ trái qua phải hay từ phải qua trái

đều không khác biệt Cần nhớ rằng hai mạch

DNA có cấu trúc đối song song Trình tự nhận

biết GAATTC có trình tự của sợi có nghĩa theo

chiều 5’–3’ là 5’GAATTC3’ Ở sợi đối nghĩa (sợi

bổ sung) theo chiều 5’–3’ cũng sẽ là 5’GAATTC3’

(xem hình 2.2)

2.1.6 ĐẦU DÍNH VÀ ĐẦU BẰNG

Do tính chất đọc xuôi ngược như nhau (palindromic), enzyme giới hạn EcoRI cắt DNA

giữa G và A trên mỗi mạch tạo ra các đoạn với bốn nucleotide không bắt cặp tại đầu 5’ (hình 2.3) Bốn nucleotide này (AATT) bất biến tại tất cả đầu cắt bởi enzyme này Những đầu này có trình tự bổ sung với nhau

nên gọi là đầu dính Cần chú ý rằng

liên kết hydro tạo thành từ bốn cặp

nucleotide rất yếu và không ổn định

nên cần dùng DNA ligase để gắn nối

các đoạn lại với nhau thông qua liên

kết cộng hóa trị để tạo thành phân tử

tái tổ hợp Tuy nhiên, sự có mặt của

các đầu dính giúp phản ứng gắn nối

hiệu quả hơn nhiều

Theo chiều 5’–3’ của mạch

DNA có thể phân chia thành ba loại

đầu cắt của enzyme giới hạn (xem

hình 2.4):

• Đầu dính 5’: Trình tự mạch

đơn treo ở tận cùng là đầu 5’

Ví dụ như EcoRI. h Ình 2.3. Tạo đầu dính bằng EcoRI

h Ình 2.2. Trình tự đọc xuôi ngược như nhau

Hai đầu dính đã bắt cặp có thể gắn nối Trộn và bắt cặp bổ sung đặc hiệu

Vị trí cắt

Đoạn cắt EcoRI từ

nguồn khác

• Đầu dính 3’: Trình tự mạch đơn treo ở tận cùng là đầu 3’ Ví dụ như PstI.

• Đầu bằng: Không có mạch đơn thò ra Ví dụ như SmaI.

Enzyme tạo đầu dính được sử dụng chủ yếu trong tách dòng gene do hiệu quả phản ứng gắn nối cao và làm cho khâu thí nghiệm tiếp theo là phản ứng nối ghép có tính đặc hiệu Người ta chỉ có thể nối hai đoạn với nhau khi mà các đầu có tính bổ trợ Hai đoạn

xen cắt bởi EcoRI có thể nối với nhau Hai đoạn xen cắt bởi BamHI cũng vậy Tuy nhiên, không thể nối đoạn cắt EcoRI với đoạn cắt BamHI.

Có một số trường hợp các enzyme giới hạn khác nhau tạo ra đầu dính như nhau Ví

dụ, enzyme BamHI và BglII có trình tự nhận biết khác biệt (xem bảng 2.1) nhưng tạo ra đầu dính giống nhau (GATC) và do đó có thể nối với nhau

Độ linh động của phản ứng gắn nối sẽ cao hơn nhiều nếu sử dụng enzyme giới hạn

đầu bằng, ví dụ như SmaI Enzyme này nhận biết trình tự sáu nucleotide CCCGGG và cắt

đối xứng tại vị trí trung tâm (xem hình 2.4) Mặc dù hiệu quả phản ứng gắn kém hơn nhiều nhưng ưu điểm là có thể nối với bất kỳ đoạn đầu bằng nào khác

2.1.7 ISOSCHIZOMER

Isoschizomer là khái niệm để chỉ những enzyme nhận biết cùng trình tự nucleotide Theo

tiếng Hy Lạp, iso là ngang bằng, skhizo là phân tách.

Trường hợp thứ nhất là các isoschizomer không chỉ có cùng vị trí nhận biết mà còn cắt tại cùng vị trí trong trình tự đó Những enzyme này ít có tính ứng dụng nên sẽ không được đề cập ở đây

h Ình 2.4. Ba loại đầu cắt của đoạn giới hạn

Trường hợp thứ hai quan trọng hơn là các isoschizomer có cùng trình tự nhận biết

nhưng cắt tại vị trí khác nhau trong trình tự này Ví dụ, Acc65I và KpnI đều có trình tự

nhận biết là GGTACC (hình 2.5), nhưng cắt nó tại vị trí khác nhau, tạo ra các đầu dính khác nhau Điều này mang lại khả năng gắn các đoạn DNA có trình tự đồng nhất nhưng

đầu dính khác nhau với các đoạn khác nhau Ví dụ khác là cặp isoschizomer XmaI và

SmaI XmaI cắt bất đối xứng và tạo ra đầu dính có đoạn xen với đoạn cắt bởi XmaI khác,

trong khi SmaI, như đề cập ở trên sẽ tạo ra đầu bằng tại cùng vị trí, cho phép gắn với các

trình tự DNA đầu bằng khác

2.1.8 XỬ LÝ CÁC ĐOẠN CẮT

Nếu sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn gồm nhiều hơn một đoạn DNA thì các đoạn đó thường được phân tách trên gel agarose có điểm nóng chảy thấp, sau đó cắt lấy phần gel chứa đoạn DNA mong muốn và đem đi tinh sạch (xem chương 1) Nếu sản phẩm cắt chỉ là một đoạn, hoặc nếu hỗn hợp sản phẩm cắt dùng cho mục đích tạo thư viện (xem chương

7) thì chỉ cần bất hoạt enzyme trước khi tiếp tục bước sau Thông thường có thể tiến hành bất hoạt bởi nhiệt Hiệu quả bất hoạt tùy thuộc bản chất của enzyme Nếu enzyme ổn nhiệt thì cần phải chiết bằng phenol để đảm bảo sự bất hoạt

Phần sau trong chương này sẽ đề cập các cách biến đổi đầu cắt của đoạn giới hạn nhằm làm quá trình tách dòng dễ dàng và linh hoạt hơn Các phương pháp bao gồm chuyển đầu dính thành đầu bằng hay cắt tỉa các vùng mạch đơn Chúng ta cũng sẽ đề cập

h Ình 2.5. Isoschizomer

đến linker và adaptor—các đoạn DNA tổng hợp ngắn, bổ sung thêm vị trí giới hạn mới vào đầu đoạn, do đó cho phép nối những đoạn tạo ra từ các cách khác nhau.

Cũng cần biết rằng có thể tạo ra các đoạn DNA dùng trong phản ứng gắn nối bằng những phương pháp khác Ví dụ như các đoạn ngẫu nhiên, không đặc hiệu (bằng lực cơ học hay nuclease không đặc hiệu), thông qua phiên mã ngược mRNA thành DNA (xem

chương 7), khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA nhất định bằng PCR (chương 4), và sử dụng DNA tổng hợp (chương 8)

2.1.9 CẮT BẰNG HAI ENZYME

Các vector luôn có nhiều vị trí tách dòng nên có thể cắt vector với hai enzyme, ví dụ,

EcoRI và BamHI Nếu nhà nghiên cứu có thể cắt DNA một cách hiệu quả bởi cả hai

enzyme thì họ sẽ tránh được khả năng vector tự gắn vốn là một vấn đề hóc búa trong trường hợp chỉ cắt bằng một enzyme duy nhất Khi tiến hành nối ghép với đoạn gắn xen được cắt bởi cùng 2 enzyme đó thì tỉ lệ tạo ra vector tái tổ hợp thành công là rất cao Mặc

dù vẫn tồn tại một số phản ứng phụ khác, như hai phân tử vector gắn với nhau, nhưng tỉ

lệ này tương đối thấp

Có hai cách ly giải kép:

• Thứ nhất, tìm điều kiện ở đó cả hai enzyme đều có thể hoạt đông Sách hướng dẫn

của nhà cung cấp thường chứa bảng khuyến cáo đệm cho các tổ hợp enzyme giới hạn khác nhau Rất khó để sử dụng đồng thời hai enzyme mà trong đó mỗi enzyme cần một nhiệt độ khác nhau

• Thứ hai, tiến hành hai phản ứng độc lập Phản ứng thứ nhất sử dụng enzyme thứ

nhất Sản phẩm của phản ứng này được tinh sạch và trở thành DNA mẫu cho phản ứng thứ hai sử dụng enzyme thứ hai

Một vấn đề cần lưu ý là khi hai vị trí cắt giới hạn nằm gần nhau, dĩ nhiên sẽ có một enzyme hoạt động trước và phân tử DNA bị cắt đôi Enzyme còn lại khi đó sẽ nằm rất sát với đầu tận cùng của DNA Một số enzyme giới hạn không cắt hiệu quả khi vị trí nhận biết nằm ở gần đầu phân tử DNA Cách dễ nhất để tránh khó khăn này là tra trong sách hướng dẫn của nhà cung cấp xem enzyme định sử dụng có gặp phải vấn đề này hay không Tuy nhiên, cho dù thực hiện đúng theo sách hướng dẫn, vẫn có thể xảy ra trường hợp ly giải không hoàn toàn và cần thực hiện đối chứng phản ứng gắn nối để kiểm tra hiệu quả của ly giải kép

2.2 NỐI DNA BẰNG LIGASE

Bước tiếp theo trong tách dòng gene là gắn đoạn DNA vào vector nhằm nhân chúng lên trong vật chủ sau khi biến nạp Công đoạn này được thực hiện bằng enzyme DNA ligase

Vai trò tự nhiên của DNA ligase là sửa các vết khía trong khung phosphate–đường của phân tử DNA mạch kép Vết khía có thể xảy ra do DNA bị tổn hại (hoặc sau khi sửa chữa những tổn hại này), cũng như khi kết nối các đoạn Okazaki trong quá trình tái bản DNA của “mạch chậm”.

Hoạt tính ligase cần vết khía phơi bày nhóm 3’OH và 5’phosphate (hình 2.6) Có thể coi sự bắt cặp không ổn định của hai đoạn giới hạn với các đầu dính tương thích là phân

tử DNA mạch kép với vết khía rất gần nhau trên mỗi mạch, và đó chính là cơ chất của DNA ligase

Một số DNA ligase, như T4 DNA ligase (do thực khuẩn thể T4 mã hóa), ngoài khả năng gắn các đoạn đầu dính còn có khả năng gắn các đoạn đầu bằng mặc dù hiệu quả

thấp hơn nhiều Một số ligase khác (đáng chú ý là DNA ligase của E coli) thì chỉ có đoạn

xen đầu dính Chúng cần sự bắt cặp của các đầu chồng lấp Để đơn giản hóa, chương này

sẽ chỉ đề cập hoạt tính của enzyme được sử dụng phổ biến nhất là T4 DNA ligase Chúng

ta sẽ gọi enzyme này là T4 ligase (hay đơn giản là ligase) mặc dù cũng có enzyme T4 RNA ligase (hiếm khi được sử dụng)

h Ình 2.6. Hoạt tính của T4 DNA ligase

Đoạn DNA bị khía được nối lại

DNA bị khía

Ligase-AMP

Ligase Khía

T4 ligase cần ATP làm đồng cơ chất Trong bước đầu tiên, ligase phản ứng với ATP, tạo thành phức hệ enzyme–AMP cộng hóa trị Phức hệ này sau đó phản ứng với 5’phosphate trên một mặt của vết khía, truyền AMP tới nhóm phosphate Giai đoạn cuối

là tấn công nhóm 3’OH, tạo liên kết phosphodiester mới và giải phóng AMP Cơ chất cần cho 5’phosphate là rất quan trọng Có thể ngăn chặn phản ứng gắn không mong muốn bằng cách loại bỏ 5’phosphate (xem dưới đây)

2.2.1 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG NỐI GHÉP DNA

Phản ứng nối ghép là một trong những bước không thể dự đoán và thường gây nản lòng nhà nghiên cứu trong quá trình tách dòng Các yếu tố có thể gây tổn hại thành công của phản ứng này bao gồm:

• Các chất kìm hãm tồn tại từ khi tách DNA

• Hoạt tính của enzyme không được bảo đảm

• DNA mẫu bị phân hủy, ví dụ mất đầu 5’phosphate

Ngoài ra, cần điều chỉnh chính xác các điều kiện nhằm thu hiệu quả tối đa Một trong những điều kiện thường gây tranh cãi là nhiệt độ Bản chất của quá trình gắn nối là sửa các vết khía mạch đơn trong phân tử mạch kép, do đó cần tối ưu hóa sự bắt cặp của các đầu cần gắn nối Trước đây người ta thực hiện phản ứng gắn tại 10oC (hay thậm chí

4oC) Các quy trình như vậy cần thời gian ủ dài do enzyme có hoạt tính thấp tại nhiệt độ này Hiện nay, sau khi đã đúc kết được nhiều

kinh nghiệm thì hầu hết các quy trình thực

hiện tại 16oC Một cách khác rất dân dã là

đặt ở nhiệt độ phòng Các tiến bộ công nghệ

cũng tạo ra dung dịch đệm đã thương mại

hóa cho phép tiến hành phản ứng gắn nối

hiệu quả và nhanh hơn nhiều

Phản ứng gắn nối đặc biệt nhạy cảm với

nồng độ DNA khi sản phẩm mong muốn

gồm hai phân tử DNA khác nhau Thông

thường cần sử dụng nồng độ DNA cao Câu

hỏi đặt ra là thành phần DNA, hay nói cách

khác là tỉ lệ giữa vector và đoạn xen như thế

nào là phù hợp? Có thể xảy ra nhiều kiểu

kết hợp khác nhau (hình 2.7) Bằng cách điều

chỉnh lượng tương đối các thành phần cũng

như nồng độ cuối cùng của DNA, ta có thể

tổng kết được điều kiện hợp lý cho những

Khi nồng độ DNA thấp, dễ xảy ra việc kết nối hai đầu của cùng một phân tử do tốc độ phản ứng một thành phần tương quan tuyến tính với nồng độ chất tham gia Tốc độ phản ứng gồm hai thành phần khác nhau sẽ phức tạp hơn.

Nếu tăng nồng độ vector và giữ nguyên nồng độ đoạn xen thì khả năng lai giữa hai phân tử vector với nhau sẽ cao hơn vector–đoạn xen Đây là điều không được mong đợi

vì phân tử này có thể hoạt động giống như plasmid tái tổ hợp, do đó phải mất một số thao tác để phân biệt chúng với các vector tái tổ hợp mong muốn Ngược lại, tăng nồng độ đoạn xen sẽ làm tăng khả năng tạo nhị trùng đoạn xen Điều này cũng nằm ngoài mong đợi mặc

dù ít gây vấn đề hơn do không tạo ra thể biến nạp

Bởi vậy, cần giữ nồng độ DNA tổng số cao cũng như tạo tỷ lệ vector–đoạn xen tối ưu Theo kinh nghiệm, tỷ lệ hợp lý có thể nằm trong khoảng 3:1 tới 1:3 Chú ý rằng, các tỷ lệ

số mole này phải tương quan với kích thước tương đối của vector và đoạn xen Ví dụ, nếu vector 5 kb và đoạn xen 500 bp, khi đó tỷ lệ số mole 1:1 sẽ chứa lượng vector cao gấp 10 lần (theo khối lượng) đoạn xen (ví dụ 500 ng vector và 50 ng đoạn xen) Ngược lại, cùng vector

5 kb này với đoạn xen kích thước 50 kb, nếu sử dụng 500 ng vector sẽ cần 5 µg đoạn xen để thu được tỷ lệ số mole 1:1 Nhìn chung, để chuyển trọng lượng DNA thành giá trị có thể

sử dụng để tính tỷ lệ số mole, chia khối lượng sử dụng cho kích thước DNA Do đó, nếu

WV và WI là khối lượng của vector và DNA đoạn xen tương ứng, còn SV, SI là kích thước của vector và đoạn xen (theo đơn vị kb), khi đó tỷ lệ vector–đoạn xen là WV/SV : WI/SI.Mức độ phức tạp của phản ứng nối sẽ lớn hơn nhiều khi sử dụng tập hợp các đoạn xen khác nhau như trong trường hợp tạo thư viện hệ gene (xem chương 5) Bổ sung nhiều hơn DNA đoạn xen vào hỗn hợp phản ứng nối sẽ tăng khả năng tạo trùng hợp của các đoạn xen Nói cách khác, có thể tạo plasmid tái tổ hợp mang hai hay nhiều đoạn DNA khác nhau Đây không phải là một ý tưởng tốt Nó có thể dẫn tới các sai lầm nghiêm trọng khi muốn xác định tính chất các dòng trong thư viện và cố gắng kết nối chúng với cấu trúc của hệ gene từ sinh vật nguồn

Do đó, tỷ lệ vector và đoạn xen không chỉ ảnh hưởng đến thành công của phản ứng gắn nối mà còn có tác động đến bản chất của sản phẩm tạo thành Phân tử vector tự gắn hay các vector nhị trùng tạo ra thể biến nạp không mang đoạn xen, trong khi dùng quá nhiều đoạn xen sẽ tạo ra các nhị trùng đoạn xen (không tạo thể biến nạp) hoặc plasmid tái tổ hợp mang nhiều đoạn xen May mắn rằng, chúng ta không phụ thuộc hoàn toàn vào việc điều chỉnh hàm lượng DNA để thu kết quả mong muốn Trong phần tiếp, chúng ta sẽ xem xét việc sử dụng alkaline phosphatase để loại bỏ các nhóm 5’phosphate (do đó ngăn chặn một số loại phản ứng gắn nối), và trong chương 3 chúng ta sẽ đề cập đến việc thiết kế vector cho phép phân biệt giữa thể biến nạp tái tổ hợp và không tái tổ hợp

2.2.2 ALKALINE PHOSPHATASE

Như đề cập ở trên, quá trình gắn nối phụ thuộc tuyệt đối vào sự có mặt của 5’phosphate tại

vị trí vết khía Nếu loại bỏ nhóm phosphate tại vị trí này thì phản ứng nối ghép không thể

xảy ra Alkaline phosphatase là enzyme giúp loại bỏ các nhóm 5’ phosphate Phosphatase

từ ruột bê (CIP) là enzyme thương mại thường được sử dụng nhất cho mục đích này Xử lý vector với CIP trước phản ứng gắn sẽ loại bỏ 5’phosphate nên ngăn chặn khả năng vector tái gắn (nội phân tử hay giữa các phân tử) Tuy nhiên, vector vẫn có thể nối với đoạn xen

do đoạn xen vẫn chứa 5’phosphate Chắc chắn cần loại bỏ CIP trước phản ứng gắn nối và cách tốt nhất là chiết phenol rồi kết tủa bằng ethanol Một cách khác đơn giản hơn là bất hoạt nhiệt bằng cách ủ hỗn hợp phản ứng ở 600C trong 10 phút Nếu sử dụng lặp lại cùng một vector, có thể thực hiện phản ứng CIP ở quy mô lớn hơn và giữ vector đã xử lý cho các thí nghiệm tiếp theo Điều này là hợp lý khi xử lý CIP không hoàn toàn đáng tin cậy

và việc thực hiện dephosphoryl hóa lượng lớn vector rồi xác nhận sự thành công của phản ứng cho phép tạo ra độ tin cậy cho những thí nghiệm sau đó Nếu sử dụng vector chuẩn,

có thể mua loại đã dephosphoryl hóa và kiểm tra sẵn

Xem xét kỹ hơn (hình 2.8) ta sẽ thấy điều thú vị Tại mỗi cầu nối giữa hai đoạn DNA có hai vết khía cần sửa chữa Vết khía thứ nhất nối đầu 3’ của vector với đầu 5’ của đoạn xen hoạt động bình thường vì nhóm 5’ phosphate được cung cấp bởi đoạn xen Tuy nhiên, vết khía thứ hai nối đầu 5’ của vector với đầu 3’ của đoạn xen thì không có nhóm 5’ phosphate

do nhóm này nằm trên vector và đã bị loại bỏ bởi phosphatase Vì vậy, vết khía thứ hai không thể được khôi phục Vậy, giải quyết vấn đề này như thế nào?

Trên thực tế, plasmid tái tổ hợp sẽ có hai vết khía không bắt cặp trong DNA mạch vòng của nó, mỗi vết nằm ở một đầu của đoạn xen Bản chất của cấu trúc này là hai sợi DNA mạch đơn liên kết bổ sung với nhau thành một mạch vòng kép Cấu trúc này có thể

h Ình 2.8. Phản ứng gắn–hiệu ứng khi dephosphoryl hóa vector

duy trì ổn định tại 37oC nhờ lực liên kết bổ sung của toàn bộ nucleotide dọc theo hai sợi đơn Kích thước plasmid thường lớn hơn 2 kb tức là có hàng ngàn cặp nucleotide giữ hai mạch với nhau.

Khi đưa phân tử bị vết khía này vào tế bào vi khuẩn bằng biến nạp, các enzyme trong

tế bào sẽ nhanh chóng sửa chữa các vết khía còn lại bằng cách bổ sung phosphate bị thiếu

và gắn các đầu không toàn vẹn Plasmid sau đó dễ dàng tái bản

Ngoài các plasmid tái tổ hợp là kết quả mong muốn, sản phẩm phản ứng nối còn có các dạng nhị trùng hay thậm chí là đa trùng đoạn xen Tuy nhiên, các dạng này không chứa gene kháng kháng sinh, do đó tế bào chủ mang chúng bị loại bỏ hoàn toàn trên môi trường nuôi cấy bổ sung kháng sinh tương ứng Vì vậy, ta có thể tăng nồng độ tương đối của đoạn xen so với vector để đạt hiệu suất gắn nối tối ưu Cho dù là vậy, khi tạo thư viện

hệ gene, việc tạo ra đa trùng đoạn xen ở mức độ nghiêm trọng nhất sẽ gây ra vấn đề Giải pháp đưa ra là xử lý phosphatase đoạn xen để ngăn chặn đa trùng đoạn xen, đồng thời ngăn chặn sự tồn tại của các thể biến nạp không tái tổ hợp (mang vector tự gắn) Đoạn xen đã bị xử lý phosphatase được gắn vào các vector đặc biệt không thể tạo ra các dòng trừ khi mang đoạn DNA gắn vào

Có một số lý do để cố gắng tránh sử dụng alkaline phosphatase đến mức có thể Xử

lý này dễ bị quá mức, dẫn tới không chỉ loại bỏ nhóm phosphate mà còn biến đổi và phá hỏng đầu dính Ngoài ra, bước chiết phenol và kết tủa bằng ethanol có nhược điểm là tốn thời gian và có thể làm mất hay tổn hại DNA Nếu có phương pháp hiệu quả để phân biệt những vector tự gắn thì ta cũng không cần phản ứng gắn phải cho kết quả tối ưu Điều này hoàn toàn có thể chấp nhận được vì trên thực tế, nhiều thí nghiệm chỉ cần thu được một dòng chứa vector tái tổ hợp là thành công mà không cần rà soát hàng trăm dòng khác

2.2.3 DNA TOPOISOMERASE VÀ TÁCH DÒNG T-A

DNA ligase được sử dụng phổ biến nhất để nối hai phân tử DNA nhưng nó không phải enzyme duy nhất có hoạt tính này DNA topoisomerase I là một ví dụ khác Vai trò tự nhiên của topoisomerase điều khiển mức độ siêu xoắn của DNA Topoisomerase loại I có hoạt tính cắt một mạch DNA, tạo ra mạch DNA tự do quay (do đó giảm độ siêu xoắn),

và cuối cùng nối các đầu bị cắt của mạch DNA lại Enzyme gắn cộng hóa trị với nhóm phosphate ở đầu mạch bị đứt sau khi cắt, do đó duy trì năng lượng gắn và nằm đúng chỗ

để sau đó tái nối (xem hình 2.9) Trong các hệ thống đã thương mại hóa, nhóm phosphate tại đầu 3’ của vector mạch thẳng gắn cộng hóa trị với topoisomerase I của virus Vaccinia Khi trộn vector này với đoạn DNA cần tách dòng, enzyme chuyển liên kết phosphate tới đầu 5’ để nối đoạn xen với vector Do topoisomerase luôn gắn sẵn với vector, phản ứng chỉ cần 2 phân tử (vector và đoạn xen) tiến tới tiếp xúc, do đó nhanh hơn phương pháp gắn thông thường cần đồng thời tiếp xúc giữa ba phân tử (vector, đoạn xen và ligase)

Chú ý rằng, không như phản ứng của DNA ligase, đoạn xen trong phản ứng topoisomerase phải không có nhóm 5’phosphate Hệ thống này chủ yếu áp dụng trong

h Ình 2.10. Tách dòng TA

h Ình 2.9. Hoạt tính của topoisomerase

tách dòng sản phẩm PCR Đầu 5’ của sản phẩm PCR chính là đoạn mồi Bản chất của mồi

là một đoạn oligonucleotide tổng hợp nhân tạo nên thường không được phosphoryl hóa, trừ khi đặt mua mồi 5’phosphoryl hóa đặc biệt

Tách dòng TA sản phẩm PCR Một số polymerase sử dụng trong PCR ( chương 4) cũng có hoạt tính terminal transferase cho phép thêm một gốc adenosine vào đầu 3’ của mạch tổng hợp Điều này gây vấn đề khi tách dòng do các đầu không thật sự là đầu bằng, dẫn tới tách dòng đầu bằng có thể không thành công Tuy nhiên, khó khăn luôn đi cùng với cơ hội Người ta đã sản xuất các “vector TA” thương mại hóa ở dạng mạch thẳng với một “đầu treo” 3’T tương hợp với 3’A không bắt cặp trong sản phẩm PCR có đầu treo 3’A (hình 2.10) Hệ thống này được gọi là Tách dòng TA (TA cloning)

Sự kết hợp tuyệt vời giữa Tách dòng TA và topoisomerase đã tăng cường hiệu suất tách dòng lên rất cao Đầu treo 3’T của vector TA được gắn cộng hóa trị với topoisomerase Đầu treo 3’A của sản phẩm PCR sẽ bắt cặp với T này

2.3 BIẾN ĐỔI ĐẦU PHÂN TỬ DNA

Trong kỹ thuật di truyền, các đoạn giới hạn đầu dính rất hữu dụng do chúng dễ dàng tham gia phản ứng gắn Tuy nhiên, chúng cũng có nhược điểm đó là chỉ có thể nối với các đoạn

khác có đầu tương thích Vì vậy, các đoạn cắt từ EcoRI có thể nối với nhau nhưng không thể nối với các đoạn tạo ra từ BamHI Lựa chọn thay thế là các đoạn đầu bằng lại có nhược

điểm là hiệu suất gắn nối thấp Thao tác thiết kế vector tái tổ hợp sẽ bất tiện nếu vector sử dụng chỉ có một số giới hạn các vị trí để có thể chèn DNA vào Hơn nữa, rất nhiều trường hợp nhà nghiên cứu bắt buộc phải gắn đoạn xen vào một vị trí đặc biệt nhưng lại không thể tạo ra các đoạn xen phù hợp với vị trí đó Để giải quyết vấn đề này, chúng ta có thể sử dụng các biện pháp biến đổi các đầu của đoạn DNA theo ý muốn

2.3.1 CẮT TỈA VÀ LẤP ĐẦY

Một chiến lược tạo đoạn xen với độ linh động cao hơn là chuyển đầu dính thành đầu bằng bằng cách lấp đầy mạch bổ sung hoặc chặt bỏ trình tự không bắt cặp (xem hình 2.11) Nếu

đoạn giới hạn có đầu treo 5’ như khi tạo ra bởi EcoRI, nhóm 3’OH sẽ được sử dụng với vai

trò của mồi để khuếch đại bằng DNA polymerase, do vậy lấp đầy đầu thiếu hụt và chuyển

nó thành mạch kép Tuy nhiên, một số DNA polymerase như E coli DNA polymerase I

lại có hoạt tính exonucleasse 5’–3’ Hoạt tính này sẽ phân hủy đầu treo 5’, do đó những enzyme này không phù hợp đề lấp đầy các đầu Với mục đích này cần sử dụng enzyme

không có hoạt tính exonuclease 5’–3’ như đoạn Klenow của E coli DNA polymerase I Enzyme này là sản phẩm thủy phân của E coli DNA polymerase I trong đó vùng chịu

trách nhiệm cho hoạt tính 5’–3’ exonuclease bị loại bỏ

Không thể lấp đầy đoạn giới hạn với đầu

treo 3’ như khi tạo ra bởi PstI vì nhóm 5’–P

không thể đóng vai trò làm mồi của phản

ứng PCR Tuy nhiên, ta có thể chặt bỏ đầu

treo 3’ sử dụng hoạt tính 3’–5’ exonuclease

của enzyme như T4 DNA polymerase

2.3.2 LINKER VÀ ADAPTOR

Cả hai phương pháp chặt bỏ và lấp đầy có

tác dụng làm chuyển đầu dính thành đầu

bằng, sau đó có thể sử dụng DNA đầu bằng

để gắn với bất kỳ đoạn đầu bằng nào khác

Tuy nhiên, vẫn có một số cách ngắn hơn

để hoàn thành một cách linh hoạt mục tiêu

này, đặc biệt khi phản ứng gắn đầu bằng

không hiệu quả và cần nồng độ DNA cao

hơn nhiều Có thể tiến hành quá trình hiệu

quả và linh hoạt hơn nhiều bằng cách sử

dụng linker Chúng là các đoạn DNA tổng

hợp ngắn chứa vị trí giới hạn Ví dụ, trình

tự CCGGATCCGG chứa vị trí BamHI

(GGATCC) Hơn nữa, nó tự bổ sung, nên

h Ình 2.11. Chuyển đầu dính thành đầu bằng

h Ình 2.12. Nguyên lý hoạt động của Linker