Nghiên cứu điều chế dung dịch vệ sinh phụ nữ chứa tinh dầu trầu không

Với mong muốn tạo tiền đề khoa học cho việc tạo ra một chế phẩm vệ sinh phụ nữ có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chủng VSV gây bệnh, đề tài “Nghiên cứu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MÃ SỐ 8720202

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Khắc Tiệp

PGS.TS Đàm Thanh Xuân

HÀ NỘI 2022

LỜI CẢM ƠN

“Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự cảm kích đặc biệt tới thầy cô hướng dẫn

của tôi, TS Nguyễn Khắc Tiệp và PGS.TS Đàm Thanh Xuân - Người đã định

hướng, trực tiếp dẫn dắt và cố vấn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học Xin chân thành cảm ơn những chỉ dẫn tận tình của thầy cô

đã giúp cho tôi mở mang thêm nhiều kiến thức hữu ích và cách thức làm khoa học để cuối cùng đề tài đã đi đến thành quả

Với tấm lòng biết ơn chân thành tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, phòng Đào tạo sau đại học, bộ môn Công nghiệp Dược và các em sinh viên đã tạo điều kiện và quan tâm giúp đỡ để tôi hoàn thành được luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Công ty TNHH Đầu tư Quốc

tế Tường Ngọc và Công ty CP tinh dầu thiên nhiên Hà Nội đã tư vấn và tài trợ hóa chất, nguyên liệu cho tôi để thực hiện đề tài

Sau cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và các đồng nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên tôi trong thời gian hoàn thành luận văn thạc sĩ

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!”

Hà Nội, ngày 12 tháng 4 năm 2022

Học viên Nguyễn Thị Cẩm Vân

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về tinh dầu 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Thành phần hóa học 2

1.1.3 Tác dụng sinh học 2

1.2 Tổng quan về tinh dầu trầu không 3

1.2.1.Phân loại thực vật 3

1.2.2.Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.2.3.Nghiên cứu thành phần hóa học 3

1.2.4.Hoạt tính sinh học và công dụng 5

1.2.5.Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6

1.2.6.Tình hình nghiên cứu trong nước 8

1.3 Tổng quan về viêm âm đạo 9

1.3.1.Dịch tễ viêm âm đạo 9

1.3.2.Một số bệnh viêm âm đạo thường gặp 10

1.4.2.1 Viêm âm đạo do nấm Candida 10

1.4.2.2 Nhiễm khuẩn âm đạo 11

1.4 Tổng quan DDVS phụ nữ 14

1.4.1.Yêu cầu chung 14

1.4.2.Các thành phần của một DDVS 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Đánh giá khả năng diệt VSV của tinh dầu trầu không 21

2.2.1.1 Đánh giá MIC (nồng độ tối thiểu ức chế VSV) với các đối tượng VSV 21 2.2.1.2 Đánh giá MBC (nồng độ tối thiểu diệt khuẩn) với các đối tượng VSV 22 2.2.1.3 Đánh giá khả năng diệt VSV ở các nồng độ khác nhau 23

2.2.1.4 Xác định tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh 23

2.2.2.Xây dựng công thức và đánh giá khả năng diệt khuẩn của các DDVS 25

2.2.2.1 Xây dựng công thức DDVS 25

2.2.2.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các DDVS 28

Chương 3 KẾT QUẢ 29

3.1 Khả năng kháng VSV của tinh dầu trầu không 29

3.1.1.MIC, MBC của tinh dầu 29

3.1.2.Khả năng diệt khuẩn theo nồng độ của tinh dầu trầu không 30

3.1.3.Khả năng hiệp đồng tác dụng với một số loại kháng sinh 32

3.1.3.1 Nhóm Betalactam với S aureus ATCC 33591 MRSA 32

3.1.3.2 Một số kháng sinh khác 36

3.2 Xây dựng công thức DDVS 36

3.2.1.Xác định công thức, nghiên cứu sơ bộ ảnh hưởng của các tá dược lên vi nấm: 36

3.2.2.Nghiên cứu đánh giá tác dụng diệt vi nấm của các mẫu DDVS 38

Chương 4 BÀN LUẬN 44

4.1 Khả năng kháng VSV của tinh dầu trầu không 44

4.2 Xác định công thức để bước đầu điều chế một DDVS có chứa tinh dầu trầu không, có khả năng diệt nấm Candida albicans 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 56

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu chữ

ATCC American Type Culture

khí

CLSI Clinical Laboratory Standard

SDA Sabouraud Dextrose Agar Môi trường thạch

Sabouraud-dextrose

MHB-Ca cation-adjusted Mueller

Hinton broth

Môi trường Mueller Hinton lỏng, có bổ sung cation

PBS Phosphate-Buffered Saline Dung dịch đệm phosphate pH

7.4

Agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách hợp chất thiên nhiên từ tinh dầu trầu không 4

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh lý tự nhiên vùng âm hộ, âm đạo 12

Bảng 1.3 Yêu cầu chất lượng DDVS 15

Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

Bảng 2.2 Trang thiết bị, máy móc và hóa chất 20

Bảng 2.3 Mô tả nồng độ thí nghiệm trong xác định MIC (μl/ml) 22

Bảng 2.4 Mô tả nồng độ sử dụng trong đánh giá tác dụng hiệp đồng Kháng sinh – Tinh dầu 25

Bảng 2.5 Công thức dung dịch vệ sinh 26

Bảng 3.1 Giá trị MIC, MBC của tinh dầu trầu không (μl/ml & %) trên các chủng VSV 29

Bảng 3.2 Kết quả đo OD600 của một thí nghiệm checkerboard giữa tinh dầu trầu không và meropenem 33

Bảng 3.3 Khả năng tác động lên vi nấm của các thành phần trong DDVS 37

Bảng 3.4 Chỉ tiêu cảm quan DDVS 38

Bảng 3.5 Thành phần các mẫu DDVS đánh giá khả năng tác động lên vi nấm 40 Bảng 4.1 So sánh giá trị MIC của tinh dầu trầu không (kết quả nghiên cứu của nghiên cứu này) với một số tinh dầu phổ biến trên các chủng VSV 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các hợp chất hoạt tính sinh học chính trong dịch chiết lá và tinh dầu

trầu không 4

Hình 2.1 Quy trình pha chế dung dịch vệ sinh 27

Hình 3.1 Đáp ứng của tinh dầu trầu không với các chủng VSV tại các nồng độ khác nhau 31

Hình 3.2 Đường cong nồng độ - đáp ứng của meropenem khi sử dụng đơn và khi phối hợp với tinh dầu trầu không tại thời điểm 24h 34

Hình 3.3 Đường cong nồng độ - đáp ứng của ceftriaxone khi sử dụngc và khi phối hợp với tinh dầu trầu không tại thời điểm 24h 36

Hình 3.4 Đáp ứng của các mẫu DDVS với C albicans sau 15s 41

Hình 3.5 Đáp ứng của các mẫu DDVS với C albicans sau 5 phút 41

Hình 3.6 Đáp ứng của các mẫu DDVS với C albicans sau 1 giờ 42

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm âm đạo là bệnh thường gặp ở phụ nữ, trong đó nguyên nhân do vi

khuẩn chiếm 40-50% và nhiễm nấm Candida chiếm 20-25% các trường hợp [25] Vệ sinh vùng kín thường xuyên bằng dung dịch vệ sinh (DDVS) có công thức phù hợp và được đánh giá lâm sàng sẽ đem đến các lợi ích kháng khuẩn và các lợi ích khác mà không ảnh hưởng tiêu cực đến hệ vi sinh vật (VSV) tự nhiên của âm đạo [19]

Để điều trị viêm âm đạo, y học cổ truyền sử dụng nước lá trầu để rửa hoặc xông đem lại hiệu quả tốt Lá trầu không cho thấy hiệu quả cao đối với các

chủng VSV gây viêm âm đạo bao gồm vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli, Gram dương như Staphylococcus aureus và vi nấm Candida albicans Sự kết

hợp của dịch chiết lá hoặc tinh dầu trầu không với kháng sinh có thể mang lại đặc tính kháng khuẩn mạnh mẽ [32]

Hiện tại trên thị trường Việt Nam có rất nhiều chế phẩm DDVS có nguồn gốc tự nhiên, bổ sung dịch chiết trầu không hoặc tinh dầu trầu không nhưng chưa rõ về hiệu quả kháng VSV Với mong muốn tạo tiền đề khoa học cho việc tạo ra một chế phẩm vệ sinh phụ nữ có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chủng VSV gây bệnh, đề tài “Nghiên cứu điều chế dung dịch vệ sinh phụ nữ chứa tinh dầu trầu không” sẽ thực hiện mục tiêu sau:

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu trầu không và bước đầu điều chế, đánh giá khả năng diệt vi sinh vật của dung dịch vệ sinh phụ nữ chứa tinh dầu trầu không

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về tinh dầu

- Dẫn chất của sesquiterpen: zingiberen, curcumen, nerolidol…

- Dẫn chất có nhân thơm: eugenol, p-cymen, thymol…

- Dẫn chất chứa N và S: mythyl, isothiocyanat, alicin…

1.1.3 Tác dụng sinh học

Tinh dầu được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm và nước hoa, ngoài ra chúng có nhiều ứng dụng trong y học nhờ khả năng chữa bệnh cũng như sử dụng trong nông nghiệp vì tác dụng kháng khuẩn và chống oxy hóa

Một số tác dụng của tinh dầu trong y học [6]:

- Tác dụng trên đường tiêu hóa

- Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn

- Tác dụng kích thích thần kinh trung ương

- Tác dụng diệt ký sinh trùng: giun, sán, sốt rét

- Tác dụng chống viêm, làm lành vết thương khi dùng ngoài da

- Ngoài ra, tinh dầu được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc y học cổ truyền

3

1.2 Tổng quan về tinh dầu trầu không

1.2.1 Phân loại thực vật

Trầu không còn được gọi là trầu, thược tương Tên khoa học: Piper betle

L., thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) [34]

1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Trầu không là một loại cây mọc leo, thân nhẵn Lá mọc so le, cuống có

bẹ, dài 1,5-3,5 cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10-13 cm, rộng 4,5-9 cm, phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lên thấy nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường 5, hoa khác gốc mọc thành bông Quả mọng không có vòi sót lại [8] Đánh giá bằng kính hiển vi lá trầu không cho thấy

sự hiện diện của các khí khổng ở biểu bì dưới và biểu bì trên, biểu bì, tế bào tiết, lông hạt ngọc, mạch gỗ, mạch rây, sợi chất xơ Đánh giá hóa thực vật cho thấy

sự hiện diện của steroid, tanin, protein và aminoacid, flavonoid, terpenoid, chất nhầy, dầu dễ bay hơi, saponin, carbohydrat và không có alkaloid, dầu thực vật [34]

Cây trầu không được trồng ở khắp nơi trong nước ta để lấy lá ăn trầu Trên thế giới trầu không được trồng tại nhiều nước khác ở châu Á, vùng nhiệt đới như Malaysia, Indonesia, Phillipine, Ấn Độ

1.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học

Trầu không có chứa nhiều hợp chất hóa học tùy thuộc vào nguồn gốc và dung môi chiết xuất Một phân tích thành phần hóa học sơ bộ của lá trầu không

ở Malaysia, dịch chiết nước của lá trầu có chứa alcaloid, tanin, glycosid, đường khử và saponin Ngoài ra, một nghiên cứu đã xác định tổng hàm lượng phenol, flavonoid và tanin trong nước, ethanol, ethyl acetat, aceton, và dichloromethan trong chiết xuất từ lá trầu không ở Mô-ri-xơ (châu Phi) Lượng phenol, flavonoid và tanin cao nhất được tìm thấy trong các chất chiết xuất lần lượt là aceton, diclometan và ethanol Mẫu lá trầu được thu thập từ Tamilnadu (Ấn Độ)

có chứa steroid, tanin, protein, acid amin, flavonoid, terpenoid, chất nhầy, chất

4

dễ bay hơi, saponin, carbohydrat và dầu thực vật, nhưng không có alcaloid Hơn nữa, một số nghiên cứu đã phân lập hiệu quả các hợp chất hoạt tính sinh học từ chiết xuất lá trầu không (Hình 1) như phytol, rượu diterpen mạch hở, 4-chromanol, hydroxychavicol hoặc 4-allylpyrocatechol, và allylpyrocatechol [32]

(a) phytol ; (b) 4-cromanol; (c) hydroxychavicol; (d) eugenol; (e) carvacrol; (f)

chavicol; (g) chavibetol; (h) allylpyro-catechol

Hình 1.1 Các hợp chất hoạt tính sinh học chính trong dịch chiết lá và tinh dầu

trầu không [32]

Bảng 1.1 Danh sách hợp chất thiên nhiên từ tinh dầu trầu không [32]

Dẫn chất của Monoterpen Dẫn chất của Sesquiterpen

δ-Elemen α-Copaen β-Elemen

α-Muurolen cis-β-Guaien δ-Cadinen hoặc

α-Terpineol L-limonen

Linalyl acetat

E-β-Caryophyllen β-Copaen

γ-Elemen

Aromadendren

α-Humulen γ-Muurolen

Germacrene D Germacrene B

β-Selinene α-Selinen

Bicyclogermacren

δ-amorphen

Palustrol Spathulenol Caryophyllene oxid Globulol

Viridiflorol Cubenol

Undecanal Phenyl acetaldehyd

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Xuân Dũng (1996) về thành phần hóa học

của tinh dầu lá trầu không (P betle L.) thu hái tại Phú Lộc, thành phố Huế cho kết quả: thành phần chính của tinh dầu lá trầu không là O-eugenol (29,3%), terpinen-4-ol (8,0%) và α-cadinol (8%) Tinh dầu lá trầu không loại này có hàm

lượng monoterpen thấp, ngược lại hàm lượng sesquiterpen lại cao Các hoạt chất chứa oxy tạo nên mùi thơm đặc trưng của tinh dầu Về mặt định tính tinh dầu lá gần tương tự như tinh dầu thân rễ [4]

1.2.4 Hoạt tính sinh học và công dụng

Từ thời cổ đại, trầu không đã được sử dụng cho mục đích tôn giáo, giải trí

và làm thuốc ở Đông Nam Á Lá là bộ phận cây được sử dụng phổ biến nhất, có

vị cay nồng và thơm và được sử dụng rộng rãi như một chất làm thơm miệng Lá trầu là chất chống đầy hơi, chất kích thích, chất làm se và có hiệu quả chống lại

6

giun ký sinh Các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng lá trầu có các tác dụng sinh học và dược lý đa dạng, bao gồm các hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, diệt ấu trùng, chống sinh vật nguyên sinh, chống sâu răng, tác dụng bảo vệ dạ dày, loại bỏ gốc tự do, chất chống oxy hóa, chống viêm bảo vệ gan, điều hòa miễn dịch, chống loét và là thuốc hóa trị liệu [23]

Ngoài công dụng dùng để ăn trầu nhân dân nhiều nơi còn dùng lá trầu không giã nhỏ, cho thêm nước sôi vào dùng rửa những vết loét, mẩn ngứa, viêm mạch bạch huyết Nước pha lá trầu không còn được dùng làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, chữa bệnh tràm mặt ở trẻ em Trầu không ít khi dùng trong, chỉ hay dùng ngoài với liều lượng tùy tiện Có nơi giã lá trầu không đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để chữa tắc tia sữa [8]

Trầu không được sử dụng ở nhiều quốc gia Bangladesh, Trung Quốc, Ấn

Độ, Malaysia, Nepal và Pakistan[38] Indonesia [45] Trầu không giúp ngăn ngừa và điều trị các vấn đề âm đạo, giảm ngứa âm đạo và điều trị vết thương [21],[45] Tại Việt Nam, phụ nữ sử dụng trầu không giã với nước hoặc đun để rửa vệ sinh âm hộ hoặc xông nước lá để điều trị viêm nhiễm phụ khoa

Chiết xuất lá trầu không, tinh dầu, các chế phẩm và các chất phân lập có thể ức chế sự phát triển của VSV và tiêu diệt các vi khuẩn Gram âm và Gram dương khác nhau cũng như các loài nấm, bao gồm cả những loài đa kháng thuốc

và loài gây bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng Lá trầu cho thấy hiệu quả cao đối

với vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa, Gram dương như Staphylococcus aureus và Candida albicans Ngoài ra, sự kết hợp

của chiết xuất lá trầu không và tinh dầu với thuốc kháng sinh (streptomycin,

chlo-cithenicol và gentamicin) có thể mang lại đặc tính kháng khuẩn mạnh mẽ [32]

1.2.5 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

- Nghiên cứu về thành phần hóa học:

nhau Eugenol, estragol, linalool, α-copaen, anethol, chavicol và caryophyllen

được tìm thấy có nhiều trong cả tinh dầu lá trầu tươi và lá trầu được phơi khô với tỷ lệ phần trăm khác nhau [29] Trong một nghiên cứu khác, tinh dầu lá trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất cũng chứa các hợp chất tương tự như chavicol, eugenol, germacren D, caryophyllen, eugenol acetat, 2-allyphenol,

β-chamigren, α-cadinen, terpineol và α-humulen [42]

- Nghiên cứu về hoạt tính kháng VSV:

Các nghiên cứu về tính kháng VSV của tinh dầu trầu không cho thấy hiệu

quả với nhiều chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Micobacterium smegmatis, S aureus[29] Streptococcus pyogenes [42] Lactobacillus

acidophilus [24], Chủng Gram âm Aeromonas hydrophila, E coli, E coli O157:H7, Salmonella Enteritidis, P aeruginosa [29]; Chủng nấm C albicans, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces rouxii với MIC trong khoảng

1.25-10% [42] Tuy nhiên khả năng kháng nấm của tinh dầu trầu không thấp hơn tinh dầu Origanum vulgare (Kinh giới cay) và fluconazol MIC của tinh

dầu O vulgare, huyền phù fluconazol và tinh dầu lá trầu không lần lượt là 0,4%,

0,8%, và 1,6% [30]

8

Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết lá trầu không bằng các dung môi khác nhau cho thấy dịch chiết ethylacetat và aceton cho hiệu quả kháng khuẩn mạnh hơn nước sắc lá truyền thống, ethanol và dichloromethan Dịch chiết lá trầu không cho thấy hiệu quả hiệp đồng với các kháng sinh thông thường như streptomycin và chloramphenicol trên một số chủng vi khuẩn Tác động hiệp đồng tốt nhất được quan sát khi kết hợp dịch

chiết ethylacetat và streptomycin với các chủng E coli, Propionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis, đặc biệt ở tỷ lệ 50%-50% Khi phối hợp

với chloramphenicol, chiết xuất trầu không thể hiện tác dụng hiệp đồng với các

chủng E coli, P aeruginosa, S aureus, S epidermidis và S pyogenes [43].

- Nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa:

Tinh dầu trầu không cho thấy khả năng ức chế quá trình oxy hóa caroten, tạo ra một vùng màu vàng bao quanh giếng với đường kính 8,40 mm (Nồng độ tối thiểu ức chế oxy hóa tẩy trắng - Minimum oxidative bleaching inhibitory concentration - MOBIC: 100 µL/mL) cho thấy tiềm năng trong công nghệ đóng gói thực phẩm sử dụng chất chống oxy hóa [41] Trong một nghiên cứu khác, giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) của tinh dầu trầu không (3,6 µg/ml ) gần với giá trị của acid ascorbic (3,2 µg/ml) và thấp hơn giá trị của các chất chống oxy hóa tổng hợp như butylat hydroxytoluen (BHT) (7,4 µg/ml) và butylat hydroxyanisol (BHA) (4,5 µg/ml) thể hiện tiềm năng chống oxy hóa mạnh và thay thế được các chất chống oxy hóa tổng hợp [36]

b-1.2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước

- Nghiên cứu về thành phần hóa học:

Phân tích thành phần hóa học chính của tinh dầu Trầu không ở khu vực

Hậu Giang bao gồm các hợp chất thuộc nhóm terpen (4- terpineol, γ-muurolen, δ-cadinen, (+)-taumuurolol, α-cadinol) và các hợp chất là dẫn xuất của phenol

như phenol, 2-methoxy-3-(2-propenyl); acetyleugenol; methyl eugenol Tổng hàm lượng của tất cả các cấu tử chiếm gần 90% lượng tinh dầu ly trích được

9

Trong đó, hợp chất methyl eugenol (4- allyl-1,2-diacetoxybenzen) chiếm hàm lượng cao nhất (34,55%), kết quả này phù hợp với tài liệu tham khảo về thành phần của tinh dầu trầu không ở vùng Nam Bộ [2] Sàng lọc hợp chất hữu cơ có

hoạt tính sinh học kháng nấm trong tinh dầu P betle phát hiện được chất ức chế

S pyogenes và nấm C albicans hiệu quả nhất là: (i) chavicol acetat, eugenol

acetat và eugenol [17]

- Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn:

Chiết xuất toàn phần từ lá trầu không đã được chứng minh hoạt tính in

vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori và so sánh tác dụng điều trị viêm dạ dày mạn tính có H Pylori của hai phác đồ sucrategel với amoxicillin và sucrategel

với chiết xuất trầu không [11] Tinh dầu trầu không cho thấy khả năng kháng

khuẩn vi khuẩn Gram (+) Bacillus subtillis, nấm mốc Aspergillus niger và Fusarium oxysporum với giá trị MIC lần lượt là 100, 200 và 200 µg/mL [2], kháng S pyogenes [17]; C albicans [7],[17], bất hoạt virus tay chân miệng EV

71 [13]

Ngoài ra tinh dầu trầu không cũng được nghiên cứu nhiều ứng dụng diệt khuẩn trong nông nghiệp và thủy sản: sử dụng các hợp chất từ lá trầu không để

ức chế một số vi khuẩn Aeromonas hydrophina và Vibro parahaemolyticus gây

bệnh trên thủy sản [10] hay vi khuẩn gây bệnh gan tụy cấp tính trên tôm nuôi nước lợ [9] hay phòng trừ bệnh đốm đen hai lạc [14], ức chế vi khuẩn

Aeromonas app và Streptococcus agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi

[12]

- Nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa:

Dịch chiết từ lá trầu không cho hàm lượng polyphenol cao, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và ức chế polyphenoloxidase tự nhiên, tạo ra tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực thực phẩm [5]

1.3 Tổng quan về viêm âm đạo

1.3.1 Dịch tễ viêm âm đạo

10

Viêm âm đạo thường gặp ở phụ nữ trưởng thành và không phổ biến ở các

bé gái trước tuổi dậy thì Viêm âm đạo do vi khuẩn chiếm 40-50% các trường

hợp viêm âm đạo; nhiễm nấm Candida âm đạo 20-25%; và nhiễm trùng roi

trichomonas 15 - 20% [25],[27]

Với phụ nữ Hoa Kỳ trong độ tuổi sinh đẻ, viêm âm đạo do vi khuẩn là bệnh nhiễm trùng âm đạo phổ biến nhất Ước tính có khoảng 7,4 triệu trường hợp nhiễm khuẩn âm đạo mới xảy ra mỗi năm Dữ liệu quốc gia cho thấy tỷ lệ hiện mắc là 29% Tuy nhiên, tỷ lệ khác nhau ở các nhóm dân số khác nhau: là 5-25% ở sinh viên đại học và 12-61% ở bệnh nhân mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục (STDs) Tại Hoa Kỳ, có tới 16% phụ nữ mang thai bị viêm âm đạo do

vi khuẩn 85% những người bị viêm âm đạo do vi khuẩn không có triệu chứng Hơn một tỷ đô la được ước tính sẽ được chi hàng năm cho cả việc tự điều trị và thăm khám tại nhà cung cấp dịch vụ y tế [25]

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm nấm Candida ở nữ bệnh nhân viêm sinh dục

trong độ tuổi sinh đẻ là 52,2% Tỷ lệ nhiễm cao hơn ở các nhóm tuổi dưới 30, đang mang thai, sử dụng dụng cụ tử cung và sử dụng bao cao su khi quan hệ tình dục Sự thay đổi số lượng, mùi, tính chất khí hư và ngứa âm đạo là các triệu

chứng gặp phổ biến nhất Bốn loài nấm Candida: C albicans, C glabrata, C tropicalis và C krusei chiếm trên 75% các trường hợp viêm âm đạo do nấm Candida Trong đó, nhiễm nấm C albicans chiếm tỷ lệ cao nhất (57,1%), tiếp đến là nhiễm nấm C glabrata (17,6%) [3]

1.3.2 Một số bệnh viêm âm đạo thường gặp

1.4.2.1 Viêm âm đạo do nấm Candida

Viêm âm hộ do nấm Candida phổ biến và là nguyên nhân của một phần

ba tổng số các trường hợp viêm âm hộ ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản 70% phụ

nữ cho biết đã từng bị viêm âm hộ do nấm Candida tại một thời điểm nào đó trong đời Khoảng 8% phụ nữ bị tái phát viêm âm hộ do nấm Candida Tác nhân gây bệnh phổ biến nhất là C albicans (trong khoảng 90% trường hợp), với hầu

11

hết các trường hợp còn lại do Candida glabrata gây ra Bệnh nhân có thể có

biểu hiện tiết dịch, thường đặc và dính hoặc đi ngoài ra máu, tiểu khó, ngứa âm

hộ, nóng rát âm đạo hoặc sưng tấy Viêm âm hộ do nấm Candida gây ra do

những thay đổi viêm ở biểu mô âm đạo và âm hộ thứ phát sau nhiễm các loài

Candida Candida là một phần của hệ VSV bình thường ở nhiều phụ nữ và thường không có triệu chứng Do đó, viêm âm hộ do nấm Candida đòi hỏi cả sự hiện diện của nấm Candida ở âm đạo/ âm hộ cũng như các triệu chứng kích ứng,

ngứa, khó tiểu hoặc viêm nhiễm [27]

1.4.2.2 Nhiễm khuẩn âm đạo

a) Viêm âm đạo do vi khuẩn

Viêm âm đạo do vi khuẩn (Bacterial Vaginosis – BV) là một bệnh rối loạn

sinh lý âm đạo do sự thay thế các lợi khuẩn Lactobacillus sản xuất hydro và acid

lactic bình thường trong âm đạo bằng số lượng lớn các vi khuẩn kỵ khí, bao gồm Gardnerella vaginalis, các loài Prevotella, các loài Mobiluncus, Atopobium vaginale, và các loài vi khuẩn khác có liên quan đến BV Một số phụ nữ trải qua

những rối loạn này thoáng qua, trong khi ở một số người tình trạng này diễn ra lâu hơn BV là tình trạng và cũng là nguyên nhân phổ biến nhất của tiết dịch âm đạo trên toàn thế giới [44]

b) Viêm âm đạo do vi khuẩn hiếu khí

Viêm âm đạo do vi khuẩn hiếu khí (Aerobic Vaginosis - AV) có liên quan

đến các VSV hiếu khí, nguyên nhân chủ yếu là do liên cầu nhóm B và E coli

Tình trạng nghiêm trọng nhất của AV là viêm âm đạo bong vảy AV lần đầu tiên được mô tả vào năm 2002 là một tình trạng âm đạo khác biệt so với BV, nguyên nhân và phương pháp điều trị cũng khác nhau Giống như BV, AV được định

nghĩa là sự giảm của vi khuẩn Lactobacillus nhưng đi kèm với những thay đổi

về viêm nghiêm trọng hơn so với BV và sự hiện diện chủ yếu của các vi khuẩn

hoặc mầm bệnh đường ruột hiếu khí, bao gồm Streptococcus nhóm B (S

12

agalactiae), Enterococcus faecalis, E coli và S aureus AV đã được quan sát

thấy ở 8-11% phụ nữ mang thai và 5-24% phụ nữ có vấn đề về âm đạo [28]

Trong một số trường hợp nhất định, AV có liên quan đến tình trạng viêm nhiễm ở bộ phận sinh dục nhiều hơn, trong phết tế bào âm đạo xuất hiện nhiều bạch cầu Phụ nữ bị AV có xu hướng có niêm mạc âm đạo mỏng hơn so với những người bị BV, với số lượng tế bào trung gian và tế bào đáy tăng lên trong phết tế bào âm đạo, cho thấy sự gia tăng sự thay đổi và bong tróc của các lớp tế bào biểu mô bề ngoài [28]

và các bệnh da liễu khác nếu chức năng bảo vệ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như

độ ẩm (nước tiểu, dịch tiết âm đạo), enzym (cặn phân), ma sát và nhiệt độ [22]

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh lý tự nhiên vùng âm hộ, âm đạo [19]

Cấu

trúc

mô

Vùng mu, môi âm hộ, âm vật và đáy chậu:

cấu trúc vảy sừng hóa, phân tầng với các

tuyến mồ hôi, tuyến bã nhờn và nang lông

Ống sợi cơ cấu tạo chủ yếu bởi

cơ trơn với lớp biểu mô vảy dạng tuyến, không sừng hóa

Hệ vi

sinh

Vi khuẩn bạch hầu Staphylococci,

Micrococci và Lactobacilli không sinh

coagulase; Liên cầu; Trực khuẩn Gram

âm; Neisseria; G vaginalis; và/ hoặc nấm

men

Lactobacillus spp., A vaginale, Megasphaera spp.,

Leptotrichia spp., G vaginalis,

S aureus và/ hoặc C albicans

13

Hệ VSV âm đạo góp phần duy trì và bảo vệ ngách niệu sinh dục khỏi

nhiễm trùng và các di chứng của bệnh Các loài Lactobacillus (lợi khuẩn) thường gặp nhất ở phụ nữ bình thường là L iners (69,4%), L crispatus (24,5%),

L reuteri (20,4%) Có sự giảm về số loài và số lượngcủa Lactobacillus ở bệnh nhân BV không có triệu chứng Trong khi ở phụ nữ mắc BV tỉ lệ là L iners (62,1%); L rhamnosus (41,4%); L salivarius (13,7%) và L reuteri (7 2%) Hơn nữa, L crispatus có liên quan đến hệ VSV bình thường, trong khi

L iners là thành viên thường xuyên của hệ VSV bình thường và rối loạn sinh học Ngoài ra các loài L crispatus, L fermentum, L acidophilus và L delbruckii không có ở những phụ nữ này Sự khác nhau về lactobacilli trong số

80,8% phụ nữ bình thường cho thấy tác động của các loài này trong việc bảo vệ môi trường vi mô âm đạo Vì hệ VSV âm đạo ở bệnh nhân BV không có triệu chứng khác so với người khỏe mạnh, nên việc tầm soát và quản lý có nên khuyến khích để tránh các biến chứng của nhiễm trùng [37]

Lactobacilli có vai trò bảo vệ chống lại các tác nhân gây bệnh cơ hội do vi

khuẩn thường gặp trong bệnh viêm âm đạo Người ta nhận thấy dụng cụ tử cung

là một yếu tố dễ gây viêm âm đạo Phân lập vi khuẩn cơ hội phổ biến nhất là S aureus, E coli, S agalactiae và K pneumoniae Tất cả các Lactobacilli đều sản

xuất hydrogen peroxid, một số chủng phân lập sản xuất bacteriocin có tác dụng

ức chế một số mầm bệnh cơ hội (S aureus, E coli) Lactobacilli nhạy cảm với

erythromycin trong khi 93,3% đề kháng với ciprofloxacin và 40%, 53,3% trong

số chúng đề kháng với amoxicillin và gentamycin Có mối quan hệ nghịch đảo

giữa sự hiện diện của Lactobacilli và các sinh vật gây viêm âm đạo Nguyên nhân có thể là do vi khuẩn Lactobacilli sản xuất các yếu tố bảo vệ Các loại

kháng sinh được sử dụng để điều trị viêm âm đạo cần phải được lựa chọn kỹ

càng để không tiêu diệt vi khuẩn có lợi (Lactobacilli) giúp bảo vệ sức khỏe âm

đạo và hệ sinh thái vi khuẩn probiotic [37]

14

1.4 Tổng quan DDVS phụ nữ

1.4.1 Yêu cầu chung

Phụ nữ ngày nay sử dụng rất nhiều các loại DDVS khác nhau hàng ngày Việc vệ sinh vùng kín bằng các sản phẩm DDVS có công thức phù hợp được thử nghiệm lâm sàng có thể mang lại lợi ích kháng khuẩn và các lợi ích khác mà không ảnh hưởng đến hệ VSV âm đạo tự nhiên [19] Theo hướng dẫn của ủy ban Trung Đông và Trung Á (MECA) về vệ sinh bộ phận sinh dục nữ, tất

cả phụ nữ ở mọi lứa tuổi cần vệ sinh vùng kín hàng ngày để đảm bảo vệ sinh vùng kín Trong đó nên sử dụng chất tẩy rửa nhẹ, dạng lỏng, không gây kích ứng, độ pH từ 4.2-5.6 và tránh xà phòng dạng thỏi và sữa tắm dạng bọt do có tính mài mòn và độ pH kiềm hơn; dung dịch chứa acid lactic có pH acid có thể làm tăng cân bằng nội môi của da và đã được chứng minh là hữu ích trong nhiễm trùng âm đạo như một liệu pháp bổ trợ [26]

Dựa trên đặc điểm sinh lý vùng âm hộ, để duy trì được pH sinh lý thì dung dịch cần có độ pH phù hợp (4.2-5.6), chất tẩy rửa nhẹ và không chứa chất kích ứng do bao gồm cả vùng niêm mạc, bổ sung acid lactic và thêm các thành phần kháng lại các VSV có hại mà không ảnh hưởng đến hệ VSV có lợi Dựa trên công thức nền phù hợp, tinh dầu trầu không được bổ sung ở các nồng độ phù hợp để đánh giá khả năng kháng VSV

Trong các nghiên cứu về thành phần hóa học đã chỉ ra trong thành phần tinh dầu trầu không tại một số vùng có chứa methyl eugenol, là thành phần bị hạn chế hàm lượng theo Hiệp định mỹ phẩm ASEAN (ANNEX) với chất tẩy rửa không được vượt quá 0.001% Do vậy, để đảm bảo chất lượng đầu ra của chế phẩm, tinh dầu được lựa chọn không chứa methyl eugenol

Sau đây là một số yêu cầu đối với DDVS:

15

Bảng 1.3 Yêu cầu chất lượng DDVS

Hiệp định Mỹ phẩm ASEAN (ANNEX)

4 Methyl Eugenol < 0.001%

Hiệp định Mỹ phẩm ASEAN (ANNEX)

5 Chỉ tiêu kích ứng

da

Không gây kích ứng trên da động vật

Theo TCVN 7391-10:2007 ISO 10993-10:2020 (E)

bề mặt và ít bọt, dễ rửa sạch, tạo hiệu ứng sảng khoái, có hoạt tính kháng khuẩn,

có độ pH phù hợp, v.v DDVS được đăng ký dưới dạng mỹ phẩm hoặc thuốc (trong điều trị một số bệnh viêm nhiễm vùng kín), sử dụng cho vùng sinh dục ngoài và được bào chế để tránh viêm da gần âm đạo

16

Một dung dịch tẩy rửa thông thường bao gồm: chất hoạt động bề mặt, dung môi và chất bảo quản Do đặc điểm sinh lý đặc biệt của âm đạo nên DDVS cần bổ sung chất làm ẩm và đệm để đảm bảo pH của dung dịch dịu nhẹ với da Ngoài ra, bổ sung các thành phần kháng khuẩn, kháng nấm hóa học hoặc tự nhiên

Việc lựa chọn các thành phần phải dựa trên đặc điểm nhạy cảm của vùng kín và tính chất của thành phần

a) Chất hoạt động bề mặt

Hoạt động làm sạch của sản phẩm vệ sinh phụ nữ thường dựa trên chất hoạt động bề mặt, giúp loại bỏ tế bào da chết trên bề mặt cơ thể, khử mùi khó chịu và loại bỏ cặn bã của quá trình trao đổi chất trên da và bất kỳ chất bẩn nào còn sót lại sau khi đi vệ sinh Việc diệt vi khuẩn và nấm có hại cũng cần thiết Tác động cần thiết là làm ướt da nhanh chóng và loại bỏ chất bẩn nhanh chóng

mà không tẩy nhờn da quá mức, dịu nhẹ nhất với da Hơn nữa, dư lượng chất hoạt động bề mặt không được để lại trên da sau khi rửa sạch Việc vệ sinh vùng kín thường khó sạch hoàn toàn do sự phức tạp về giải phẫu của khu vực này và thời gian rửa ngắn Ngoài ra, lông mu vùng kín cũng cản trở quá trình rửa sạch hoàn toàn Các chất hoạt động bề mặt trong DDVS cũng không được tạo ra nhiều bọt, mà phải đảm bảo trạng thái cân bằng của da Thông thường sử dụng hỗn hợp tẩy rửa bằng cách pha trộn các chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động

bề mặt tạo bọt cao như natri, magie hoặc amoni lauryl ete sulfat ở 1-6% để ít gây hại cho da hơn bằng cách trộn với một hoặc nhiều chất hoạt động bề mặt nhẹ ở 1-4% Nồng độ tuyệt đối phụ thuộc vào tỷ lệ pha loãng dự kiến của sản phẩm cuối cùng với nước Nồng độ của các chất hoạt động bề mặt nói chung thường thấp, dễ dàng rửa sạch và không để lại cặn trên da [40]

b) pH

pH của chế phẩm nên để ở cân bằng tự nhiên, từ 4,5-5,5 giúp cho việc sử dụng nhẹ nhàng hàng ngày để không làm sạch vùng kín quá mức Việc làm sạch

17

quá mức có thể làm mất cân bằng sự phát triển bình thường của vi khuẩn pH âm đạo khỏe mạnh là ≤4,5 ở độ tuổi sinh sản và >4,5 trước và sau khi mãn kinh Khi pH âm đạo quá cao, âm đạo bị mất cơ chế bảo vệ và có thể dẫn đến sự phát triển quá mức của vi khuẩn Điều này có thể dẫn đến viêm âm đạo do vi khuẩn, có mùi hôi, ngứa và khó chịu [40]

c) Acid đệm

Một trong các chỉ tiêu quan trọng của DDVS là giá trị pH Theo tài liệu chuyên khoa, pH càng gần 3,5-4,5 càng tốt, đặc biệt khi dung dịch được pha loãng với nước Sau khi pha với nước, độ pH của DDVS đã pha loãng giảm xuống khoảng 7 Để ngăn chặn hiện tượng này, trong công thức bào chế có một

hệ thống đệm ở độ pH có tính acid để có thể duy trì giá trị của dung dịch ngay

cả sau khi pha loãng Hệ đệm lý tưởng là acid lactic vì phù hợp với sinh lý và an toàn Nồng độ acid lactic phụ thuộc vào tỷ lệ pha loãng dự kiến trong công thức Acid lactic thường được đệm bằng kiềm, bao gồm acid amin arginine Acid citric đôi khi được sử dụng, ngay cả khi dễ bị vi khuẩn tấn công hơn Nồng độ acid được đệm cẩn thận có thể đạt 5% [40]

d) Chất tạo độ nhớt

Độ nhớt của sản phẩm làm sạch vùng kín phải đảm bảo cho việc sử dụng liều lượng thích hợp do khu vực này được cấu trúc phức tạp và cho phép sử dụng dụng công cụ hỗ trợ làm sạch như miếng bọt biển [40]

e) Chất làm dịu và mềm da

DDVS có thể bổ sung thêm các chất làm dịu và làm mềm da, có khả năng

để lại cảm giác sảng khoái và dễ chịu sau khi dùng như các chất chiết xuất từ bạc hà và các dẫn xuất của tinh dầu bạc hà [40]

f) Chất khử mùi/ nước hoa

Hiệu suất làm sạch hiệu quả thường yêu cầu để lại mùi hương dễ chịu, điều này đạt được bằng loại bỏ mùi hôi và sự phát triển của các nốt hương dễ bay hơi Tuy nhiên, đối với sự nhạy cảm của vùng âm đạo, phải đảm bảo độ

18

tương thích với da và độ an toàn của nước hoa được sử dụng để không gây kích ứng vùng kín Hơn nữa, tỷ lệ sử dụng phải thấp Tuy nhiên, sự tồn tại của chất tạo hương/ nước hoa sẽ khiến cho người dùng tự tin rằng mùi cơ thể sạch sẽ được đảm bảo [40]

g) Dưỡng ẩm

Da vùng kín gặp rất nhiều căng thẳng do các tác động tổng hợp của nhiệt

độ, ma sát, vi khuẩn Khả năng duy trì độ ẩm thích hợp của da và các đặc tính

cơ học giảm dần theo thời gian Da mỏng của bộ phận sinh dục ngoài đối với cả nam giới và phụ nữ đều rất nhạy cảm và đòi hỏi khả năng làm mềm và dưỡng

ẩm hiệu quả Điều này đặc biệt cần thiết trong trường hợp sản xuất bã nhờn bị

suy giảm hoặc bất kỳ sự mất cân bằng da nào khác [40]

19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu

thiên nhiên Hà Nội

2 Một số mẫu DDVS trên thị trường

Các chủng VSV nghiên cứu

Kháng sinh (KS)

(*) Các chủng chuẩn ATCC được cung cấp bởi phòng nghiên cứu dược lý phân

tử và tế bào (FACM) - Đại học công giáo Louvain, Vương quốc Bỉ và Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Lưu trữ trong tủ -80ºC tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia - Đại học Dược Hà Nội

20

Lựa chọn tinh dầu trầu không từ Công ty CP Tinh dầu thiên nhiên Hà Nội (tinh dầu thu được bằng phương pháp cất kéo hơi nước từ lá trầu được thu hái tại khu vực trồng dược liệu) với yêu cầu không chứa methyl eugenol Do một số nghiên cứu về thành phần tinh dầu trầu không tại một số nơi, hàm lượng methyl eugenol tương đối cao, trong khi yêu cầu chế phẩm <0,001% Bảng thử nghiệm thành phần mẫu tinh dầu trầu không sử dụng không chứa methyl eugenol do nhà cung cấp thực hiện (xem phụ lục)

Bảng 2.2 Trang thiết bị, máy móc và hóa chất

STT Trang thiết bị, máy móc Hãng – Nước sản xuất

8 Pipet 1000-200; 200-20; 20-1 µL Nichiryo – Nhật Bản

10 Hộp đựng đầu típ loại 1000 μl, 200μl Hàn Quốc

12 Máy đọc vi đĩa 96 giếng huỳnh quang -

21

đĩa petri…

1 Môi trường Mueller Hinton lỏng Merck – Đức

2 Môi trường lỏng Tryptic Soy (TSB) Merck – Đức

3 Môi trường lỏng Sabouraud-dextrose (SD) Merck – Đức

4 Dimethyl sulfoxide (DMSO)

8 Dung dịch đệm phosphate pH 7.4

(Phosphate-buffered saline – PBS)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá khả năng diệt VSV của tinh dầu trầu không

2.2.1.1 Đánh giá MIC (nồng độ tối thiểu ức chế VSV) với các đối tượng VSV

➢ Quy trình đánh giá MIC:

MIC của tinh dầu trầu không được xác định bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng sử dụng canh thang MHB-Ca hoặc Sabouraud-

dextrose cho C albicans trên đĩa 96 giếng theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn

lâm sàng và xét nghiệm Hoa kỳ (Clinical & Laboratory Standards Institute – CLSI) Tinh dầu được hòa tan trong dung môi phù hợp, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong MHB-Ca Mẫu tinh dầu được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng (bao gồm 8 hàng từ A đến H, 12 cột từ 1 đến 12), từ các giếng

ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng tại cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân, như trong Bảng 2.3 Hỗn dịch VSV có độ đục tương đương 0,5 Mc Farland được chuẩn bị trong PBS, với các khuẩn lạc trên đĩa

22

thạch TSA hoặc SDA cho C albicans được ủ 37°C, qua đêm Hỗn dịch này được pha loãng 100 lần trong MHB-Ca hoặc Sabouraud-dextrose cho C albicans để thu được hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5 x 106 vi khuẩn/ml và

104 vi nấm/ml Hỗn dịch làm việc được bổ sung vào các giếng trong đĩa (trừ các giếng ở cột 12, vai trò chứng âm) Các đĩa được nắp kín, ủ ở 37 ℃ trong 20 giờ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không có sự phát triển của vi khuẩn Tất cả các thử nghiệm được thực hiện 3 lần độc lập

Bảng 2.3 Mô tả nồng độ thí nghiệm trong xác định MIC (μl/ml)

2.2.1.2 Đánh giá MBC (nồng độ tối thiểu diệt khuẩn) với các đối tượng VSV

➢ Xác định kết quả MBC dựa trên đĩa xác định MIC, tất cả các giếng không mọc được cấy lên đĩa thạch TSA đối với vi khuẩn và SDA đối với vi nấm

để xác định MBC

➢ Quy trình đánh giá MBC

23

- Tất cả các giếng không mọc trên đĩa xác định MIC được đem đi cấy

để xác định MBC Sau khi ủ ở 37 độ C trong 24 giờ, đếm số khuẩn lạc xuất hiện

- Nồng độ MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ của các tinh dầu/DDVS có thể tiêu diệt 99% vi khuẩn, vi nấm trong giếng

➢ Dạng kết quả đưa ra: Một bảng giá trị MBC của tinh dầu trầu không trên các chủng VSV

2.2.1.3 Đánh giá khả năng diệt VSV ở các nồng độ khác nhau

Chủng VSV: S aureus, B subtilis, C albicans, S enterica, E coli, L acidophillus

Nguyên tắc thực hiện: Dung dịch VSV làm việc được chuẩn bị tương tự như trong xác định MIC Cho dung dịch VSV tiếp xúc với với tinh dầu trầu

không nồng độ khác nhau Dãy nồng độ từ cao đến thấp gần với MIC (16MIC,

8MIC, 4MIC, 2MIC, MIC) Mẫu được ủ 37ºC trong 20h Lượng VSV sống trong mẫu, trước và sau khi tiếp xúc với tinh dầu, sẽ được đánh giá bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch Mẫu sẽ được pha loãng đến nồng độ phù hợp trong PBS, sau đó được cấy lên môi trường thạch phù hợp, TSA cho các vi khuẩn và SDA cho các vi nấm Số lượng khuẩn lạc được xác định bằng phương pháp đếm, sau khi ủ tại 37ºC trong tối thiểu 20h Khả năng diệt khuẩn của mẫu được đánh giá dựa trên khả năng diệt vi sinh vật, so sánh với thời điểm trước khi tiếp xúc với tinh dầu Kết quả được biểu diễn dưới dạng hiệu số log10 CFU/ml giữa mẫu

có tiếp xúc với tinh dầu và trước khi tiếp xúc với tinh dầu (delta log10 CFu/ml hoặc ∆log10 CFU/ml)

Dạng kết quả đưa ra: sự giảm lượng VSV so với thời điểm ban đầu chưa tiếp xúc với tinh dầu ở các nồng độ khác nhau Qua đó có các đánh giá về nồng

độ tinh dầu cần sử dụng phù hợp, tác dụng của tinh dầu trên các đối tượng VSV

2.2.1.4 Xác định tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh