Trong khuôn khổ đề tài cơ sở của nhóm nghiên cứu năm 2019: “Nghiên cứu sàng lọc tác dụng của một số cao chiết dược liệu trên mô hình ruồi giấm tự kỷ thực nghiệm” cho thấy 3 cao chiết dượ
TỔNG QUAN
BỆNH TỰ KỶ
1.1.1 Sơ lược bệnh tự kỷ
Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một rối loạn phát triển thần kinh ở người đặc trưng bởi tình trạng rối loạn thần kinh phức tạp bao gồm những khó khăn trong tương tác xã hội, các vấn đề về giao tiếp bằng lời nói và không bằng lời nói, có các hành vi, sở thích, hoạt động cứng nhắc lặp đi lặp lại và hạn chế[49] ASD hiện được ước tính xảy ra với tần suất 1% trong dân số nói chung khiến chúng trở thành một trong những rối loạn phát triển thần kinh phổ biến nhất [30]
1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di truyền học
Có nhiều giả thuyết khác nhau về nguyên nhân gây ra hội chứng rối loạn tự kỷ như: dị ứng, di truyền, nhiễm độc thủy ngân, cấu tạo não bất thường, căn nguyên tâm lý,… Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến yếu tố di truyền và gen ASD có nguyên nhân di truyền phức tạp, bao gồm biến đổi số lượng bản sao, đột biến gen đơn lẻ, nghiên cứu liên kết gen trong toàn bộ genome và các ước tính hiện tại cho thấy các yếu tố di truyền chiếm khoảng 10 - 20% trong số báo cáo các trường hợp ASD [16]
Các rối loạn đơn gen nổi trội liên quan đến ASD là hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy, hội chứng Rett, sao chép MECP2, hội chứng Angelman [50]
Hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy (Fragile X syndrome) được gây ra bởi sự đột biến của bộ ba nucleotit CGG lặp lại ở vùng chưa được dịch mã đầu 5’ của gen FMR1 ( Fragile X Mental Retardation gene 1), dẫn đến sự tăng cường quá trình sao chép của nó và đi kèm với sự ức chế phiên mã Tỷ lệ hiện mắc ước tính của ASD là 30 ~ 60% (chỉ dành cho nam) [50]
Hội chứng Rett là một rối loạn thần kinh tiến triển gây ra bởi đột biến mất chức năng trong gen mã hóa protein-2-methyl-CpG (MECP2) MECP2 có chức năng như một bộ điều hòa phiên mã toàn cầu trong cả việc ức chế và kích hoạt các gen mục tiêu, cũng như một bộ điều chỉnh của quá trình tách ARN Tỷ lệ mắc tự kỷ ước tính là 61% (chỉ dành cho nữ) Sự nhân đôi của vùng Xq28 chứa gen MECP2 gây ra hội chứng sao chép
MECP2 Tỷ lệ tự kỷ ước tính là hơn 90% (chỉ nam giới) cho hội chứng này [50]
Hội chứng Angelman là một rối loạn đơn sinh với tỷ lệ mắc ASD ước tính là 34%
[50] Nhiều trường hợp mắc hội chứng Angelman do đột biến mất chức năng ở alen mẹ
4 của gen Ubiquitin-protein ligase E3A (UBE3A) Chức năng của UBEA3A như một phức hợp protein gắn ubiquitin ligase và như một protein đồng hoạt hóa phiên mã Gen
UBE3A được biểu hiện ở các tế bào thần kinh, nhưng không phải là glia ở vùng đồi thị và tiểu não của não Các alen bình thường của UBE3A gốc bị mất biểu hiện kiểu hình bởi RNA không mã hóa dài Sự biểu hiện quá mức của UBE3A cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh tự kỷ được gọi là hội chứng trùng lặp 15q [22]
Các nghiên cứu đột biến trong các hệ thống mô hình động vật đã cho thấy một số protein được bảo tồn điều chỉnh cấu trúc và chức năng khớp thần kinh trong các kiểu hình giống ASD Trong một số trường hợp, người mắc ASD đã được chứng minh là có sự gián đoạn trong các gen mã hóa các protein synap này [16], dẫn đến khả năng các protein đó có thể đóng vai trò là mục tiêu điều trị Các nghiên cứu di truyền gần đây đã xác định neurobeachin (NBEA) là gen ứng cử viên cho ASD sau các báo cáo ban đầu rằng gen NBEA bị phá vỡ dẫn đến chứng tự kỷ vô căn ở nam thanh thiếu niên [19]
Nghiên cứu này được tiếp tục thực hiện và có các báo cáo bổ sung về bệnh nhân ASD bị xóa gen NBEA [41], [54] Gen NBEA ở vị trí dễ gãy phổ biến FRA13A và mã hóa một loại protein ban đầu được xác định là protein Kinase A protein neo (AKAP) Các nghiên cứu trong các hệ thống mô hình động vật đã chỉ ra rằng NBEA tham gia vào một loạt các quá trình tế bào như tạo võng mạc, trao đổi màng tế bào và giải phóng chất dẫn truyền thần kinh, củng cố trí nhớ ngắn hạn, và sự phát triển và chức năng tiểu cầu
Ngoài ra, một lượng lớn dữ liệu cho thấy các yếu tố môi trường và biểu sinh đóng góp đáng kể vào nguyên nhân của kiểu hình ASD và được công nhận là yếu tố điều biến
[16] Nhiều yếu tố môi trường tác động trước và trong quá trình mang thai được cho là có liên quan tới tự kỷ như bệnh đái tháo đường ở thai phụ, xuất huyết trong quá trình thai nghén hay liên quan tới các trị liệu trong thời gian mang thai Các tác nhân trong thai kỳ và ngay sau quá trình sinh nở cũng có liên quan tới chứng tự kỷ như tai biến nhau thai, các sang chấn trong quá trình chuyểnchu dạ, rọng lượng thai nhỏ dưới 2000g, sinh non, xung đột nhóm máu ABO hay Rh,… Một trong số những tác nhân thuộc yếu tố môi trường là trẻ phơi nhiễm với một số thuốc và chất gây độc như axit valproic, ethanol, thalidomid, thủy ngân, chì,… cũng cho thấy liên quan tới bệnh tự kỷ Tuy nhiên, nguyên nhân chính xác và các yếu tố rủi ro đáng tin cậy cho ASD là khó nắm bắt [5],
1.1.3 Tác động của stress oxy hoá đến ASD
Sự mất cân bằng giữa việc tổng hợp các gốc oxy hoá và khả năng ngăn chặn tác động có hại của cơ thể sống bằng cách sử dụng các hệ thống chống oxy hoá là nguyên nhân gây ra stress oxy hoá Bất thường ở ty thể và stress oxy hoá đóng vai trò quan trọng gây ra quá trình lão hoá và bệnh tật Để chống lại tình trạng này, cơ thể cần một số cơ chế giải độc để loại bỏ các hợp chất độc hại và trung hoà các gốc oxy, nitơ có trong mọi tế bào Superoxide (O 2- ) có thể được hình thành như một sản phẩm phụ của quá trình chuyển hoá oxy bình thường Tuy nhiên sự tích tụ superoxide có thể gây hại cho cấu trúc tế bào, do thúc đẩy quá trình oxy hoá Superoxide ngay lập tức được chuyển thành hydrogen peroxide (H2O2) bởi enzym superoxide dismutases (SODs) Sự hiện diện của
H2O2 gây độc cho tế bào vì nó đi qua màng tế bào và làm hỏng ADN Một số con đường trung hoà đã được phát triển để loại bỏ hydrogen peroxide Trong đó, enzym quan trọng nhất là catalase và glutathion peroxidase (GPx), cả hai đều chuyển hoá H2O2 thành H2O Tripeptid glutathion là một trong những chất giải độc quan trọng nhất, đóng vai trò cơ bản trong việc loại bỏ ROS Ở dạng khử (GSH), glutathion cho H2O2 một điện tử trong phản ứng được xúc tác bởi GPx và chuyển thành dạng oxy hoá GSH có thể được tái tạo lại bởi enzym glutathion reductase, enzym này sử dụng NAD(P)H làm chất cho điện tử Glutathion cũng có thể hoạt động như một cơ chất của các enzym khác như GSH transferase, giúp loại bỏ các phân tử độc hại khỏi tế bào Não là một trong những cơ quan chuyển hoá chính của oxy, dó đó một lượng lớn ROS tích tụ ở một số vùng não
Vì vậy, não có thể rất nhạy cảm với các gốc ROS [20], [42].Việc sản xuất ROS là đặc điểm chính của rối loạn thần kinh Các gốc oxy hoá đã được chứng minh đóng một vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh, sự tiến triển và mức độ nghiêm trọng của bệnh Alzheimer, Parkinson và Huntington, ASD và chứng xơ cứng teo cơ Ngoài ra, bệnh nhân ASD rất dễ bị stress oxy hoá và rất dễ bị tổn thương qua trung gian ROS và nhiễm độc tế bào thần kinh Vì vậy, một số nghiên cứu hiện nay đã liên kết ASD với việc tăng nồng độ ROS và giảm khả năng chống oxy hoá, không chỉ ở não mà còn ở toàn cơ thể Một số báo cáo đã nghiên cứu các phân tử liên quan đến stress oxy hoá trong não của những người bị ASD Đặc biệt nồng độ glutathion bị oxy hoá tăng lên, glutathion giảm thấp, và tỷ lệ oxy hoá khử glutathion giảm dần ở thái dương và tiểu não của bệnh nhân ASD [20], [42]
Các thông số liên quan đến stress oxy hoá ở ngoại vi là những dấu ấn sinh học tiềm năng để chẩn đoán sớm ASD Hoạt động SOD trong hồng cầu ở trẻ ASD cao hơn nhóm chứng Gonzales-Fraguela và các đồng nghiệp đã chứng minh được ở bệnh nhân tự kỷ, nồng độ malonyldialdehyd (MDA), 8-hydroxy-2-deoxyguanosin (8OHdG), GSH giảm Gần đây, vai trò sinh lý bệnh của ROS trong ASD đã được đánh giá trong một nghiên cứu thuần tập ở Ai Cập Mô hình phiên mã của 84 gen liên quan đến stress oxy hoá được đo trong các tế bào máu đơn nhân ở ngoại vi (PBMC) được phân lập từ bệnh nhân tự kỷ và nhóm chứng khoẻ mạnh Tám gen mã hoá cho các protein quan trọng liên quan đến quá trình chuyển hoá ROS (GCLM, SOD2, NCF2, PRNP, PTGS2, TXN và FTH1) giảm ở người tự kỷ Các phân tử này là dấu ấn sinh học hữu ích để chẩn đoán và điều trị bệnh sớm Ngoài ra, rối loạn chức năng ty thể mãn tính liên quan đến chuỗi vận chuyển điện tử (ETC), phức hợp I và III đã được xác định ở bệnh nhân ASD [20], [42]
Stress oxy hoá là một đặc điểm quan trọng ở bệnh nhân ASD Nhiều nghiên cứu được tiến hành để xem xét liệu các triệu chứng của ASD có được cải thiện sau khi dùng các chất chống oxy hoá hay không Sự biểu hiện của các enzym chống oxy hoá bị giảm trong ASD Ngoài ra, nồng độ các phân tử chống oxy hoá nội sinh giảm ở những người mắc ASD so với những người khoẻ mạnh Vì những lý do này, việc sử dụng các chất chống oxy hoá đưa vào trong cơ thể có thể thúc đẩy hệ thống dọn dẹp các ROS, chống stress oxy hoá Để việc điều trị ASD hiệu quả, chất chống oxy hoá phải qua được hàng rào máu não và đi được vào nhu mô não, tại đó chúng phải đạt được nồng độ điều trị tối ưu Coenzym Q10 (CoQ10) (ubiquinon) là một đồng yếu tố chống oxy hoá ty thể vượt qua hàng rào máu não Ở trẻ em ASD, việc sử dụng ubiquinol (dạng giảm hoạt tính của coenzym Q10) đã dẫn đến sự cải thiện giao tiếp bằng lời Một phân tử đầy hứa hẹn khác là N-acetylcystein (NAC), một chất chống oxy hoá mạnh giúp tăng nồng độ glutathion NAC được coi là một nguồn cystein quan trọng Tác dụng của NAC đối với các triệu chứng ASD đã được nghiên cứu ở chuột trong mô hình tự kỷ gây ra bởi acid valproic Các nghiên cứu chỉ ra rằng, ở những động vật này, NAC cải thiện hoạt động lặp đi lặp lại theo khuôn mẫu, đồng thời làm giảm mức độ stress oxy hoá bằng cách tăng glutathion và giảm malonidialdehyd so với nhóm đối chứng Các lợi ích khi sử dụng NAC cho trẻ em bị ASD cũng được ghi nhận Đặc biệt, một nghiên cứu cho thấy thuốc được dung nạp tốt và có thể làm giảm đáng kể tình trạng cáu gắt, hành vi rập khuôn, lặp lại Một chất chống oxy hoá khác được thử nghiệm điều trị ASD là vitamin C Khi bổ sung
7 vitamin C cho trẻ em ASD trong 30 tuần, quan sát thấy sự cải thiện đáng kể các hành vi vận động Nhiều thử nghiệm lâm sàng mù đôi, có đối chứng với giả dược sử dụng kết hợp các chất chống oxy hoá như vitamin C, carnosin, kẽm, vitamin B6 và magie đã được thực hiện Điều trị ASD bằng vitamin C liều cao hoặc carnosin hoặc kết hợp vitamin B6 và magie đã cải thiện hành vi của những người bị ASD Ở những bệnh nhân ASD, hàm lượng magie trong máu thấp Việc bổ sung magie làm cải thiện các triệu chứng như kém tập trung và tăng động Ngoài ra, nghiên cứu chỉ ra rằng ở chuột mẹ mang thai tiếp xúc với valproat (VPA bao gồm acid valproic, natri valproat, dinatri valproat), điều trị bằng acid folic liều cao, vitamin E và methionin (nguồn cung cấp methyl) có thể cải thiện hoặc ngăn ngừa hầu hết các tác hại do VPA gây ra ở chuột con Trong não, acid valproic ức chế quá trình peroxyd hoá lipid và glutathion Hormon melatonin cũng được chứng minh hoạt động như một chất chống oxy hoá mạnh Melatonin có thể tìm thấy ở nồng độ cao trong các loại thực vật, trái cây và thực phẩm Vì vậy, trong vài năm gần đây, nhiều liệu pháp dinh dưỡng đã được sử dụng để cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân ASD Do đó, các chất chống oxy hoá và vitamin được dùng dưới dạng thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm giúp bệnh nhân ASD giảm bớt các triệu chứng bệnh một cách rõ ràng [20], [42]
CHÈ ĐẮNG
1.2.1 Tên gọi – vị trí phân loại Ở Việt Nam, tên khoa học của cây Chè đắng mọc ở vùng núi đá vôi thuộc tỉnh Cao Bằng và một số địa phương khác là Ilex kudingcha C.J.Tseng (tên đồng nghĩa là
Ilex kaushue S.Y.Hu) Tên Việt Nam là Chè đắng, ché khôm (tiếng Tày-Nùng), khổ đinh trà[2] Chi Ilex thuộc họ Nhựa ruồi hay họ Bùi hay Trâm bùi (Aquifoliaceae, tên khác là Ilicaaceae), bộ Celetrales phân lớp Rosidae (phân lớp hoa hồng), ngành Ngọc Lan
1.2.2 Đặc điểm thực vật, phân bố
Cây thân gỗ, cao 6-20m, đường kính thân từ 20-60cm, có cây đường kính cao tới 1,2m ( Hình 1.1) Cành thô, màu nâu xám, không có long, cành non hình trụ có nhiều gờ nhỏ Lá đơn mọc cách, mép lá có rang cưa nhỏ và tù Phiến lá hình bầu dục đến thuôn hoặc hình mác ngược Ở cây trưởng thành lá thường dìa 12-17cm, rộng 5-6cm Mặt trên của lá màu lục sẫm và láng bóng, mặt dưới màu lục nhạt, cả hai mặt đều không có lông
Lá vò trong tay có mùi thơm mát, hơi hắc của tinh dầu Hoa màu trắng ngà, đơn tính khác gốc
Chè đắng là loại cây mọc tự nhiên, phân bố tản mạn ở một số địa phương miền núi phía bắc nước ta như Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình, Ninh Bình Trong đó, Cao Bằng là địa phương được xác định có 6/12 huyện có mật độ phát triển của cây Chè đắng cao, chiếm 32% diện tích toàn tỉnh
Hình 1 1 Hình ảnh cây Chè đắng và lá Chè đắng khô (Ilex kudingcha C.J Tseng )
Thành phần hóa học chủ yếu của Chè đắng gồm các triterpenoid, các acid phenolic, các flavonoid và các tinh dầu [33] Một số saponin triterpenoid trong Chè đắng: Các ursan triterpenoid với vòng lacton ở vị trí C20 và C28 được gọi là α- kudinlacton, β-kudinlacton và γ-kudinlacton được xem là thành phần hóa học chính trong các loài Chè đắng Ở Việt Nam, đã phát hiện trong lá Chè đắng thu hái tại Cao Bằng cũng có saponin triterpenoid tương tự như lá Chè đắng ở Trung Quốc Ngoài ra, còn có flavonoid , β- caroten, polysaccharid, coumarin, acid hữu cơ, acid amin [6], [9]
1.2.4 Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây Chè đắng
Sơ lược về lịch sử sử dụng cây Chè đắng làm thuốc:
Cây Chè đắng (Ilex kudingcha C J Tseng) đã được sử dụng làm thuốc và nước uống ở miền nam Trung Quốc từ cách đây 2000 năm [24] Theo kinh nghiệm, lá Chè đắng được sử dụng trong nhân dân để làm thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng cường trí nhớ, thuốc tăng lực, kích thích tiêu hóa, kéo dài tuổi thọ Ngoài ra, lá Chè đắng còn được sử dụng để giải độc, trị đau đầu, viêm mũi, viêm họng, viêm phế quản
Trong vài năm qua, Chè đắng đã được sử dụng như một loại đồ uống giảm béo dành cho người ăn kiêng và trở nên phổ biến với nhứng cái tên khác nhau như trà làm đẹp giảm béo, trà lâu năm, trà xanh, trà thanh đạm,… Chè đắng đã được báo cáo về chất chống oxy hóa rõ ràng, chống viêm, chuyển hóa lipid, bảo vệ gan và chống ung thư [34]
Uống Chè đắng thường xuyên như một loại trà thảo dược có vai trò tích cực trong ngăn ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, bệnh mạch não, tiểu đường, viêm họng và ung thư, đặc biệt là các vấn đề liên quan đến xơ cứng động mạch, cao huyết áp, chóng mặt, mất ngủ, đánh trống ngực, đau tức ngực do các bệnh tim mạch [59] CĐ có hoạt tính sinh học trên chuyển hóa lipid, chống oxy hóa, ức chế khối u, có tác dụng hạ đường huyết, và bảo vệ hệ thống tim mạch tương tự như trà xanh [35]
Các nghiên cứu trong nước:
- Nghiên cứu về thành phần hóa học, độc tính, tác dụng trên thần kinh
Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Diệu Anh (2009) [1] đã phân lập và xác định được cấu trúc 4 saponin triterpenoid pentacyclic, 2 flavonoid Đây là những hợp chất saponin và flavonoid lần đầu được phân lập và xác định cấu trúc hóa học từ lá CĐ thu hái tại Cao Bằng Saponin CĐ và cao nước CĐ có độc tính cấp thấp và được xếp vào
12 loại chế phẩm không xác định được LD50 Về độc tính bán trường diễn, cả 2 chế phẩm saponin và cao nước CĐ đều không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, tạo máu của thỏ, tế bào gan, cầu thận và ống thận trong giới hạn bình thường Saponin CĐ không ảnh hưởng đến sự phát triển của cơ quan sinh dục và khả năng thụ tinh của chuột cống trắng đục Đối với tác dụng tăng cường khả năng học tập và ghi nhớ: Saponin CĐ có tác dụng rút ngắn 8,57 % số ngày học tập phản xạ có điều kiện và kéo dài 69,14 % thời gian duy trì phản xạ đã học được so với lô chuột đối chứng
- Tác dụng chống oxy hóa, ức chế xơ gan, chống viêm cấp và mạn tính
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết saponin toàn phần từ lá CĐ có các tác dụng sau: ức chế xơ gan trên mô hình gây tổn thương gan và xơ gan bằng CCl4, tác dụng chống oxy hóa, lợi mật, chống viêm cấp và mạn [4]
Nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Mai Huy (2003) [9] cho thấy flavonoid trong lá Chè đắng có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan và não chuột do ức chế quá trình POL rất rõ Hoạt tính này tăng tỷ lệ thuận với nồng độ flavonoid Flavonoid toàn phần trong lá Chè đắng cũng có hoạt tính thu dọn gốc tự do anion superoxide trong hệ Xanthin/Xanthin oxidase, khả năng thu dọn gốc tự do cũng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ flavonoid toàn phần
Các tác giả trường Đại học Y Thái Nguyên đã thử tác dụng của địch chiết lá CĐ trên chuột bị gây độc bằng dioxin (2,4D) Kết quả cho thấy dịch chiết CĐ có tác dụng giảm 20 - 40% sự tác động của 2,4D tới dòng bạch cầu , đồng thời giảm 36% tác hại của 2,4D tới enzym ASAT; ngăn chặn ảnh hưởng của 2,4D tới NST ở mô tủy xương và mô tinh hoàn và dịch chiết lá CĐ không gây rối loạn NST chuột Saponin CĐ có thể dùng phòng độc hại cho người làm việc trong môi trường độc hại kéo dài do nghề nghiệp hoặc môi trường [12]
- Tác dụng cải thiện hội chứng Tự kỷ
Kết quả của nhóm nghiên cứu PGS TS Phạm Thị Nguyệt Hằng và cộng sự cho thấy: Cao chiết ethanol 80% từ lá Chè đắng (2 mg/ml) thể hiện tác dụng điều trị tự kỷ trên mô hình tương tác cộng đồng Social space thông qua tiêu chí làm giảm khoảng cách tương tác giữa các cá thể ruồi giấm, trên thử nghiệm đánh giá hành vi thức/ngủ Kết quả nghiên cứu bước đầu trên mẫu cao chiết ethanol 80% từ lá chè đắng (2 mg/ml) cho thấy có tác dụng kéo dài thời gian ngủ vào ban đêm và buổi trưa, đồng thời đỉnh hoạt động mạnh nhất được xác định vào buổi sáng (10 h) và buổi tối (20 h) [7]; Cao chiết ethanol
80% lá chè đắng có khả năng cải thiện các hội chứng tự kỷ như chống lo âu, tăng tương tác xã hội và cải thiện suy giảm trí nhớ/ nhận thức trên mô hình chuột tự kỷ thực nghiệm
RUỒI GIẤM
Drosophila melanogaster Meigen là một loài ruồi thuộc chi Ruồi giấm (Drosophila), họ Ruồi giấm (Drosophilidae), bộ Hai cánh (Diptera), lớp Côn trùng (Insecta) Chúng được biết đến với tên thông dụng là ruồi giấm hay ruồi trái cây (fruit fly) Ruồi giấm được coi là sinh vật có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử hay các vấn đề sinh học cơ bản từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hóa
Ruồi giấm có màu vàng nâu và có các vòng đen ngang bụng Con cái trưởng thành dài khoảng 2,5mm, con đực nhỏ hơn một chút với lưng hơi tối Con đực dễ dàng phân biệt được với con cái dựa trên sự khác biệt về màu sắc, với một mảng đen khác biệt ở bụng
1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm
Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên
4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính (XX, YY) trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể Sự đơn giản này là một
15 trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [43]
Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành (Hình 1.2) Ruồi cái có thể tạo ra khoảng 750- 1500 trứng trong suốt vòng đời của nó Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24h Các phôi sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau (ấu trùng bậc một, ấu trùng bậc hai, ấu trùng bậc ba tương ứng với một, hai, ba ngày tuổi) cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành chỉ mất 10 ngày kể từ khi thụ tinh Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở 29 º C khoảng 30-
Hình 1 2 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [56]
1.3.4 Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm
Hệ thống thần kinh cơ của ấu trùng ruồi giấm tương đối đơn giản, chỉ chứa 32 nơron vận động ở mỗi nửa phân đoạn ở bụng và cấu trúc thần kinh cơ của nó (NMJ) là lớn, cá thể hóa, dễ dàng quan sát [32] Các khớp thần kinh NMJ của ấu trùng sử dụng các thụ thể glutamat ionotropic (Glamour) tương đồng với các thụ thể glutamat loại AMPA trong não của động vật có vú NMJ ruồi giấm hiển thị một số tính năng, bao gồm khả năng tiếp cận cấu trúc, tính năng rập khuôn và khả năng tiếp cận các thao tác di truyền, do đó nó được coi là mô hình thuận tiện và hữu ích để làm sáng tỏ các cơ chế hình thành khớp thần kinh, truyền synap, tính mềm dẻo và thoái hóa khớp thần kinh
Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm được cấu tạo bởi các nút bouton bao gồm các vùng chức năng chính như vùng hoạt động trước synap (pre-synap active zone), vùng sau synap chứa các protein tín hiệu (protein signaling) và thụ thể glutamat (GluR) Các bouton tại NMJ của ấu trùng được bao quanh bởi một cấu trúc màng được gọi là mạng lưới sau synap (SSR), chứa các thụ thể dẫn truyền thần kinh, phần khung và các phân tử tín hiệu [23] (Hình 1.3.A)
Hình 1 3 Cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction - NMJ) ở ấu trùng ruồi giấm [15], [26] A: Các vùng chức năng chính của sợi thần kinh cơ; B: Phân loại một số dạng bouton chính dựa vào ảnh chụp tế bào thần kinh cơ với kháng thể anti –HRP và kháng thể anti-DLG dưới kính hiển vi huỳnh quang; C: Phân loại bouton dựa vào kích thước, số lượng mạng lưới sau synap (SSR) và loại chất dẫn truyền thần kinh (NT)
Có 3 loại bouton: Loại I, II và III (Hình 1.3.C) Chúng khác nhau về kích thước và hình dạng, chất dẫn truyền thần kinh, số lượng mạng lưới sau synap (SSR) bao quanh chúng Bouton loại I sử dụng chất dẫn truyền là glutamat, được chia thành hai lớp: Ib (lớn) và Is (nhỏ) SSR được nhuộm bởi kháng thể anti-Discs-Large (DLG), màng này có ở cả bouton Ib và Is Các bouton loại Ib được bao quanh bởi màng SSR nhiều hơn so với các bouton loại Is, dẫn đến sự khác biệt giữa hai loại Anti- DLG không đặc hiệu với loại II và loại III Kháng thể anti-HRP đặc hiệu với màng tế bào thần kinh tiền synap và cho phép quan sát tất cả các loại bouton (Hình 1.4.B, C) Hầu hết các nghiên cứu kiểm tra NMJ trên nhóm cơ số 4, nhóm cơ số 6/7, hoặc nhóm cơ số 12 [26]
1.3.5 Mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ
Các nghiên cứu di truyền gần đây đã xác định neurobeachin( NBEA) là gen ứng cử viên cho ASD sau các báo cáo ban đầu rằng gen NBEA bị phá vỡ dẫn đến chứng tự kỷ vô căn ở nam thanh thiếu niên [19] Năm 2015, nghiên cứu của Wise và cs đã xác định được mối liên quan giữa đột biến gen rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm Nhóm nghiên cứu chứng minh được gen rugose có khả năng tương tác với phức hệ EGFR và North trong nhiều con đường tín hiệu, đóng vai trò trung gian trong quá trình truyền tin giữa các con đường tín hiệu với nhau Theo đó, đột biến mất chức năng của gen rugose (Drosophila Neurobaechin) làm giảm khả năng vận động, gây nên bất thường trong cấu trúc và kiểu hình thần kinh của ấu trùng ruồi giấm Những cá thể trưởng thành mang đột biến cũng bị ảnh hưởng đến tập tính, cường độ hoạt động và hành vi tương tác xã hội [56] Hơn nữa, GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản- là đối tác nghiên cứu trao đổi khoa học của chúng tôi có nguồn cung cấp chủng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ Chính vì thế, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng ruồi giấm đột biến gen rugose để nghiên cứu đánh giá tác dụng và cơ chế hóa sinh của các mẫu cao chiết dược liệu cho các nghiên cứu về bệnh tự kỷ trên mô hình ruồi giấm từ trước tới nay.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Các cao chiết dưới phân đoạn n- butanol từ lá Chè đắng (Ilex kudingcha CJ.Tseng)
Chè đắng được thu hái tại Cao Bằng (tháng 6/2018) Dược liệu được PGS.TS
Phạm Thị Thanh Huyền (Trưởng khoa Tài Nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu) giám định mẫu và lưu mẫu tại Viện Dược liệu (Mã số tiêu bản: 20122)
Dược liệu thu hái được phơi khô, sau đó nghiền thành bột thô để chiết cao phục vụ cho nghiên cứu
2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Mẫu cao chiết sử dụng trong nghiên cứu là sản phẩm của tiểu dự án First: “Hợp tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngừa/hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng”, do ngân hàng thế giới tài trợ, được nhóm nghiên cứu thuộc khoa Hoá Thực vật – Viện Dược liệu điều chế Quy trình chiết xuất được mô tả tóm tắt như sau: 5,0 kg bột lá khô Chè đắng được chiết nóng với ethanol 80% với tỷ lệ 1/8 (kg/l),
3 lần x 3 h ở 70°C Lọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 501,16 g cao tổng ethanol (EtOH) 80% Lưu 200 g cao tổng và phân tán 301,16 g EtOH 80% trong nước nóng sau đó chiết lỏng - lỏng ti lệ 1:1, 3 lần với các dung môi có độ phân cực tăng dần: Dichloromethane (DCM) và n- butanol
(BuOH) Gộp các dịch chiết phân đoạn và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 20,14 g cao DCM, 215,55 g cao BuOH và 50,32 g cắn nước Phân đoạn BuOH được phân tách thành các phân đoạn nhỏ bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với dung môi rửa giải lần lượt là MeOH: CHCl3 và MeOH: CHCl3: H2O với các tỉ lệ khác nhau thu được 11 phân đoạn tương ứng (kí hiệu: IB1-11).
Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu
Chủng Rugose là ruồi giấm mang gen rugose bị đột biến với mã số FBst0009801-
CG44835 được sử dụng làm mô hình bệnh tự kỷ Chủng ruồi giấm hoang dại CantonS với mã số FBst0064349 được sử dụng làm nhóm chứng sinh lý Cả 2 chủng ruồi giấm được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto,
Nhật Bản Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản và ở điều kiện phòng
19 thí nghiệm nhiệt độ 25 ± 1 o C, độ ẩm 50%, chu kỳ sáng - tối 12 giờ (sáng từ 7 giờ đến
19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ
2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
⁕ Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1
Bảng 2 1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
8 N-amyl acetat Wako, Nhật Bản
12 Sữa bột nguyên kem Việt Nam
⁕ Dụng cụ, thiết bị: Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong bảng 2.2
Bảng 2 2 Dụng cụ và thiết bị trong nghiên cứu
STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
1 Buồng tam giác và kính Việt Nam
2 Bút lông để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung
3 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ
4 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi ấu trùng Việt Nam
6 Đĩa petri 90 mm, nắp đục lỗ Corning, Mỹ
7 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản
8 Kính hiển vi soi nổi Olympus, Nhật Bản
9 Lò vi sóng Electrolux, Thụy Điển
11 Máy quay phim Canon, Nhật Bản
13 Miếng lót mềm Việt Nam
14 Ống chứa mùi Corning, Mỹ
16 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus, Nhật Bản
17 Một số dụng cụ, thiết bị khác
Thiết kế nghiên cứu được mô tả trong hình 2.1
Hình 2 1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu
Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái (1:1) các cặp ruồi bố mẹ chủng Rugose để tạo dòng ruồi tự kỷ và chủng CantonS để tạo dòng ruồi đối chứng sinh lý Chủng ruồi lai tạo được chia thành các nhóm như sau:
- Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng CantonS được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản
- Nhóm bệnh lý: Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản
Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm Tất cả các ruồi mang gen nghiên cứu được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 1°C với chu kì 12 giờ sáng – 12 giờ tối (sáng từ
07 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm đánh giá hành vi được thực hiện trong giai đoạn sáng từ 9 giờ đến 18 giờ Thành phần cho 500 ml thức ăn ruồi giấm được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2 3 Thành phần cho 500ml thức ăn ruồi giấm
Thành phần Hàm lượng Đường 25 g (5% w/v)
Acid benzoic 20% hoặc Natri benzoate 20%
2 gram natri benzoat trong 10 ml H2O (0,4% w/v)
Quy trình chuẩn bị thức ăn
- Cân natri benzoate vào ống falcon thêm nước dùng máy vortex hoà tan đến khi dung dịch đồng nhất
- Cân sữa bột vào cốc thuỷ tinh hoà thêm một ít nước nguội và đánh đều tạo dạng kem
- Cân agar bổ sung ~200 ml H2O đun nóng đến khi dung dịch trong
- Bổ sung đường và nấm men vào trong bát sắt thêm ~ 100 ml H2O chứa agar đun sủi lăn tăn trong 10 phút
- Đổ dung dịch ra cốc dung tích 1 lít để nguội về 60 o C phối hợp sữa vào khuấy đều Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml khuấy đều
- Bổ sung acid propionic và natri benzoate tiếp tục khuấy đều
- Chia vào ống nuôi ~ 5 ml Bảo quản ở 4 o C đến khi sử dụng (tối đa trong sử dụng trong
Quy trình chuẩn bị thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu :
- Đối với ấu trùng: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới Tiến hành thu ấu trùng giai đoạn thích hợp cho thí nghiệm
- Đối với ruồi trưởng thành: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới Với ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu nghiên cứu sẽ không sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác Ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu thì sử dụng lặp lại trong 4-6 ngày (tức 1-2 lần chuyển) Ấu trùng nở và đóng kén trong 6-8 ngày, theo dõi ngày nở của kén, thu ruồi nở trong ngày xác định (sai khác
1 ngày) Ruồi nở được chuyển sang ống chứa thức ăn có mẫu nghiên cứu mới Để ruồi ăn thức ăn chứa mẫu 3 ngày Sau đó tiến hành thí nghiệm
- Chia ruồi trưởng thành đã thu được ở trên làm ít nhất 03 lô nghiên cứu:
Lô 1: Nhóm chứng sinh lý sử dụng chủng CantonS + nuôi trong ống thức ăn chuẩn
Lô 2: Nhóm chứng bệnh lý sử dụng chủng Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn
Lô 3: Nhóm ruồi rugose + nuôi trong ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu ( mỗi mẫu cao chiết từ IB1-11 được hòa tan trong 0.5ml nước trước, sau đó trộn đều vào thức ăn chuẩn để được 20ml thức ăn có nồng độ mẫu cao chiết là 0,8 và 2,0 mg/ml)
Đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với hành vi tương tác xã hội bằng thử nghiệm tương tác cộng đồng (Social space assay)
Khả năng tập trung cộng đồng, tương tác xã hội là yếu tố quan trọng đánh giá khả năng điều trị bệnh tự kỷ của dược liệu Do đó dựa trên mô hình đánh giá được tiến hành theo mô tả trước đây của tác giả Simon (2012) và Ueoka (2019) [46], [52], chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng cải thiện tính tập trung cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ được sử dụng cao chiết dược liệu
Hình 2 2 Hình ảnh mô phỏng thử nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội của ruồi giấm [49]
Buồng đánh giá có dạng hình tam giác cân bằng nhựa (có chiều dài các cạnh tam giác là 15,2 cm) dày 0,5 cm được đậy chặt bởi 2 tấm kính vuông (có kích thước 18 cm x 18 cm) cho phép ruồi hoạt động trong không gian hai chiều (Hình 2.2) Ruồi mới nở được phân con đực và con cái riêng và chuyển vào các ống chứa thức ăn chuẩn/ mẫu nghiên cứu với số lượng (~40 con/ống) và nuôi trong 3-4 ngày, tới ngày thí nghiệm ruồi được gây mê và chuyển vào buồng tam giác (thời gian thí nghiệm sau 3-4 tiếng bắt đầu chu kì sáng) Sau đó, buồng tam giác được đóng lại bằng 2 phiến kính Để buồng đếm dựng đứng để ruồi tỉnh và tương tác với nhau trong 20-30 phút, chụp ảnh
Đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với trí nhớ ngắn hạn trên mô hình ruồi giấm tự kỷ
Mô hình đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm là một trong những thử nghiệm được sử dụng để đánh giá khả năng học tập của Drosophila ASD [41], [50]
Chuẩn bị pha thạch: đĩa petri X chứa 1,5% thạch agar và đường sucrose 2M Đĩa petri
Y chứa 1,5 % thạch agar và không có đường
- Lấy 10 àl dung dịch mựi octanol cho vào ống đựng mựi Đặt là mựi OCT
- Pha loóng dung dịch mựi n-amyl acetat với parafin (1:50), lấy 10àl dịch pha loóng này cho vào các ống mùi còn lại Đặt là mùi AM
- Đánh dấu các ống để phân biệt 2 mùi
Chuẩn bị ấu trùng: Lựa chọn 24 ấu trùng 3-5 ngày tuổi còn ở dưới thức ăn, rửa sạch thức ăn còn bám trên ấu trùng
- Đặt ống đựng mùi AM (n-amyl acetat) lên đĩa X, đậy nắp để yên trong 1 phút
- Lấy những ấu trùng đã rửa sạch ở trên cho vào đĩa X, cho chúng làm quen với mùi AM và môi trường đĩa X có đường trong thạch trong 5 phút
- Đến phút thứ 4 của quá trình trên, đặt ống đựng mùi OCT (mùi còn lại) vào đĩa
Y, đậy nắp để yên trong 1 phút
- Sau khi hết 5 phút, chuyển các ấu trùng ở đĩa X sang đĩa Y, cho chúng làm quen với mùi OCT và đĩa Y không có đường trong thạch trong 5 phút
- Lặp lại quá trình trên 3 lần
- Đến phút thứ 4 của bước tập luyện cuối cùng, tiến hành đặt ống mùi vào 3 đĩa test Đặt mùi AM lên 1 bên trên đĩa test (đã kẻ sẵn vạch ở giữa), đặt mùi OCT lên bên còn lại của đĩa test, đậy nắp và để yên trong 1 phút
- Sau khi hết 5 phút của bước tập luyện cuối cùng, lần lượt chuyển 8 ấu trùng lên từng đĩa test và tiến hành kiểm tra trong 3 phút
- Sau khi hết thời gian kiểm tra, đếm số ấu trùng ở 2 bên, phía mùi AM và OCT, ghi nhận kết quả
- Quá trình được tiến hành nhiều lần, để hạn chế sai số tiến hành kết hợp mùi AM
25 với đĩa X, mùi OCT với đĩa Y; lần kế tiếp làm ngược lại với mùi OCT đĩa X và mùi AM đĩa Y
- Các ấu trùng khi cho vào đĩa thạch, được đặt vào khoảng chính giữa đĩa thạch đã kẻ từ trước Thí nghiệm được bố trí như Hình 2.3
Hình 2 3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm
PREF AM =Số ấu trùng bên AM − Số ấu trùng bên OCT
PREF OCT =Số ấu trùng bên OCT − Số ấu trùng bên AM
LI = PREF AM + PREF OCT
2 Trong đó: PREFAM là chỉ số ưu tiên AM
PREFOCT là chỉ số ưu tiên OCT
LI là chỉ số học tập (Learning Index)
LI > 0 cho thấy ấu trùng có khả năng học tập hay ghi nhớ
LI ~0 cho thấy ấu trùng không có khả năng học tập hay ghi nhớ
LI < 0 cho thấy mùi gây khó chịu cho ruồi giấm.
Đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm
Đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 (crawling assay): Dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự năm 2012 [38], chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm với mục tiêu đánh giá sự
26 khả năng cải thiện vận động cao chiết của các mẫu dược liệu được sàng lọc có tác dụng cải thiện bệnh tự kỷ trên thử nghiệm tương tác xã hội
Hình 2 4 Hình ảnh mô phỏng thử nghiệm và kết quả xử lý bằng phần mềm Image- J để đánh giá khả năng vận động bằng hành vi bò trên ấu trùng ruồi giấm bậc 3 [38]
- Chuẩn bị đĩa petri đường kính 10 cm
- Đổ thạch agar 1,5% lên đĩa, bề mặt láng đều, để mặt thạch khô trước khi tiến hành thí nghiệm
- Thu ấu trùng bậc 3 (khoảng 5 ngày tuổi), ấu trùng đực, nằm bên trong môi trường thức ăn, cách bề mặt môi trường khoảng 1-2 cm, các ấu trùng đang bò ổn định, kích thước lớn đều nhau
Lưu ý: Không thu ấu trùng yếu do mật độ ấu trùng quá đông, môi trường quá cứng không phù hợp cho phát triển, tránh tổn thương đến ấu trùng trong quá trình bắt
- Sau khi thu ấu trùng, giữ ẩm trên khăn giấy tẩm PBS 1X
- Chuẩn bị máy quay, đặt song song camera với bề mặt đĩa, tránh rung lắc trong suốt quá trình quay
- Chuẩn bị thước đo; giấy tối màu và ít phản quang được đặt bên dưới đĩa agar
- Chuyển ấu trùng lên đĩa agar, 4-6 cá thể ấu trùng/lần quay, bắt đầu quay, khung hình đề nghị 640*480, 30 khung hình /giây
- Bắt đầu quay khi ấu trùng bắt đầu di chuyển để hạn chế việc di chuyển ra rìa đĩa
- Dừng quay sau khoảng 1 phút
2.3.5 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của một số cao chiết dưới phân đoạn n- butanol từ lá chè đắng
Phương pháp đánh giá hoạt tính khử gốc tự do DPPH theo mô tả bởi Brand W (1958)
Nguyên lý: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím, phân tử không bị dimer hóa như một số gốc tự do khác và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử để hình thành 2,2- Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng (màu của nhóm picryl), làm giảm độ hấp thụ của các gốc tự do DPPH được mô tả ở hình 2.5 Đo độ hấp thụ ở bước sóng
517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa
Hình 2 5 Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxy hóa [17]
- Bước 1: Pha dung dịch DPPH gốc 1mg/mL: Cân chính xác 1 mg bột DPPH cho vào ống eppendorff 1,5 mL, thêm 1 mL MeOH, lắc đến tan hoàn toàn trên máy vortex
- Bước 2: Pha dung dịch DPPH nồng độ 0,25 mg/mL: Chuyển dung dịch DPPH gốc (bước 1) vào 1 ống falcon 15 ml mới, dùng micropipet thêm vào 1 mL MeOH, 2 mL EtOH, lắc đều
- Bước 3: Pha dãy dung dịch mẫu
- Bước 4: Thờm vào từng giếng của đĩa phản ứng 50 àL dung dịch DPPH 0,25 mg/mL và 230 àL mẫu thử cao chiết dưới phõn đoạn n- butanol từ lỏ chố đắng ở từng nồng độ Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần
Tiến hành làm song song với mẫu trắng chứa: 50 àL dung dịch DPPH và 230 àL methanol Đậy kín đĩa, tránh ánh sáng, cho phản ứng tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi đem đo độ hấp thụ quang ở 517 nm
Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết dưới phân đoạn n- butanol từ lá chè đắng được tính theo công thức:
% ức chế = OD mẫu trắng − OD mẫu thử
OD mẫu trắng Trong đó: ODmẫu trắng là độ hấp thụ quang của mẫu trắng
ODmẫu thử là độ hấp thụ quang của mẫu thử
Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số cao chiết dưới phân đoạn n- butanol từ lá chè đắng bằng thử nghiệm ex vivo trên dịch đồng thể đầu ruồi giấm
Quy trình thu dịch đồng thể đầu ruồi tiến hành như sau:
Ruồi được chuẩn bị làm 4 nhóm:
- (2) Ruồi bệnh lý (BL): Ruồi đột biến Rugose
- (4) Ruồi đột biến rugose sử dụng mẫu dưới phân đoạn n- butanol IB2, IB5 từ lá chè đắng nồng độ 2 mg/mL
- Mỗi lô gồm 20 con: 10 đực, 10 cái ruồi trưởng thành (3 ngày tuổi)
Quy trình tách đầu ruồi (Drosophila) làm phản ứng oxy hóa:
Bước 1: Cho 120 àl PBS 1X vào mỗi ống eppendorf 1,5 mL để trờn đỏ, ghi nhón từng nhóm rõ ràng
Bước 2: Tách đầu ruồi (10 cái + 10 đực) ruồi trưởng thành (3 ngày tuổi) cho vào ống eppendorf 1,5 mL tương ứng với từng nhóm
Bước 3: Nghiền bằng chày trong 5 phút (đồng nhất)
Bước 4: Ly tâm nhẹ với lực 800g ở - 4 o C trong 10 phút
Bước 5: Hỳt 80 àl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mới, ghi nhón
Bước 6: Bảo quản ống ở -20 o C trước khi làm phản ứng
Phương pháp đánh giá hoạt tính khử gốc tự do DPPH
Tiến hành tương tự phản ứng DPPH in vitro, dung dịch DPPH chuẩn bị cho phản ứng có nồng độ 0,2 mM trong MeOH Mẫu nghiên cứu được thay bằng dịch đồng thể đầu ruồi
- (1) Giếng trắng (chỉ chứa dung môi, không có mẫu nghiên cứu - solvent):
10 àL đệm PBS 1X và 90 àL MeOH (để hũa tan DPPH)
- (2) Giếng chuẩn đối chiếu (DPPH): 10 àL đệm PBS 1X và 90 àL
- (3) Giếng mẫu trắng (cú chứa mẫu nghiờn cứu - sample blank): 10 àL dịch đồng thể đầu ruồi và 90 àL MeOH
- (4) Giếng phản ứng (Sample + DPPH): 10 àL dịch đồng thể đầu ruồi và
Mỗi lô lặp lại 2 lần Đĩa được bọc kín, tránh ánh sáng, sau 30 phút tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm
% ức chế gốc tự do DPPH được biểu thị bằng công thức sau:
[OD (2) − OD (1) ] Trong đó: ODSample+DPPH là độ hấp thụ quang mẫu (4)
ODSample Blank là độ hấp thụ của mẫu (3)
ODDPPH là độ hấp thụ của mẫu (2)
ODSolvent là độ hấp thụ quang của mẫu (1)
Phương pháp định lượng MDA (Malondialdehyd)
Sự peroxy hóa lipid được xác định bằng phương pháp TBARS (Thiobarbituric acid (TBA) reactive substances - chất phản ứng thiobarbituric acid)
Nguyên lý: MDA (Malondialdehyd) là sản phẩm sinh ra do quá trình peroxy hóa lipid mà thành MDA có thể phản ứng với TBA để tạo thành phức màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm được mô phỏng ở hình 2.6 Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng
532 nm cho phép tính được nồng độ của MDA trong mẫu
Hình 2 6 Phản ứng giữa MDA và TBA
Phương pháp định lượng MDA theo mô tả bởiRambhadur P Subedi (2017) [48]
- Chuẩn bị dung dịch TBA 0,37% (trong 10 mL HCl 0,24N chứa 0,037 g TBA và TCA 15%)
+ Giếng phản ứng chứa: 90 àL dung dịch TBA 0,37% và 10 àL dịch đồng thể đầu ruồi
+ Giếng trắng chứa: 90 àL dung dịch TBA 0,37% và 10 àL dung dịch PBS 1X
Mỗi lô lặp lại 2 lần Đĩa phản ứng được đạy nắp kín, ủ trong tủ sấy ở 100⁰C trong 15 phút cho phản ứng Đem đo quang ở bước sóng 532 nm
Nồng độ của MDA trong các lô được tính theo phương trình đường chuẩn Chất chuẩn MDA: 1,1,3,3-tetraethoxypropane.
Đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction - NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang
- NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang
Nghiên cứu được tiến hành đánh giá diện tích của các nút thần kinh (bouton) ở nhóm cơ số 4 (nhóm cơ có kích thước lớn nhất) ở ấu trùng ruồi giấm bậc 3 bằng kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang sử dụng các kháng thể đặc hiệu cho từng loại tế bào
Đối tượng thí nghiệm: ấu trùng ruồi đực bậc 3 được lấy ngẫu nhiên ở thành ống Số lượng ruồi trong một lần thí nghiệm: 4 lô ấu trùng, mỗi lô 6 con
Giải phẫu ấu trùng ruồi giấm bậc 3:
- Chuẩn bị các dụng cụ giải phẫu (kéo, kim, kìm, đĩa)
- Thả ấu trùng bậc 3 vào chính giữa đĩa có chứa vài giọt dung dịch HL3, để ấu trùng sao cho mặt lưng hướng lên trên (quan sát thấy 2 ống khí quản màu trắng chạy dọc sống lưng)
- Đâm kim số 1 vào phần đỉnh, gần lỗ miệng của ấu trùng, đâm kim số 2 vào phần đuôi, giữa 2 ống khí quản sao cho thân ấu trùng căng giãn vừa phải
- Dùng kéo cắt 4 đường trên da: đường thứ nhất dưới kim số 1, ngang qua phần đầu, đường thứ hai bắt đầu từ vết cắt số 1 dọc theo thân đến gần kim thứ hai, đường số ba và bốn cắt vát về 2 bên thân bắt đầu từ điểm cuối đường số 2 Bộc lộ nội quan
- Hút bỏ nội quan và giữ mẫu trong dung dịch HL3 khoảng 1h (Hình 2.7)
Hình 2 7 Giải phẫu ấu trùng ruồi giấm bậc 3[21]
Thành phần HL3 (Hemolymph- like 3 saline) :
- Hút bỏ dung dịch HL3, thêm dung dịch trong dung dịch paraformaldehyd 4% (PFA) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Gỡ bỏ toàn bộ kim giải phẫu, chuyển lớp da vào ống eppendorf 1,5ml có chứa sẵn dung dịch Triton/PBS 0,3% (PBST)
- Rửa mẫu hai lần trong 15 phút bằng dung dịch đệm PBS-T 0,3% trên máy lắc đảo
- Hỗn hợp ủ bao gồm: khỏng thể anti-Dlg (1 àl) (đặc hiệu cho vựng sau synap), trong dung dịch chứa BSA 2àg/àl (1àl) và PBS-T 0,15% (198àl)
- Bọc giấy bạc, ủ hỗn hợp qua dêm ở 4 0 C
- Rửa lại mẫu 5 lần bằng PBST 0,3%, mỗi lần 10 phút
- Ủ khỏng thể bậc 2 trong hỗn hợp bao gồm: Khỏng thể anti-HRP (0,2 àl) cú gắn huỳnh quang FICT (đặc hiệu cho vựng trước synap), BSA 2àg/àl (20àl), PBS-T 0,15% (180 àl), Alexa 594/ 546 (0,5 àl)
- Để ở nhiệt độ phòng trong 2-3h rồi rửa lại mẫu 5 lần với dung dịch PBST 0,3%, mỗi lần 10 phút
Gắn lam và đọc kết quả:
- Gắn mẫu lên lam kính (lật mặt trong lên trên) Dùng dao cắt phần đầu, đuôi
- Cố định mẫu bằng Mountin Quan sát và chụp lại mẫu mô dưới kính hiển vi soi huỳnh quang.
Phân tích kết quả
Kết quả của thí nghiệm tương tác cộng đồng của ruồi giấm, thí nghiệm đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm được xử lý bằng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ sau đó phân tích thống kê bằng phần mềm SPSSv20 Kết quả của thí nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn, đánh giá tác dụng chống oxy hóa, đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ của ấu trùng ruồi giấm được tổng hợp bằng Microsoft Excel và phân tích bằng SPSSv20 Với số liệu thuộc phân phối chuẩn, kết quả biểu diễn bởi giá trị trung bình và sai số chuẩn So sánh kết quả giữa các lô bằng kiểm định One – way ANOVA Với số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả biểu diễn bởi giá trị trung vị và các tứ phân vị So sánh kết quả giữa các lô bằng kiểm định Kruskal Wallis
Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05