Đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm của cao chiết cây xấu hổ ( mimosa pudica l , fabaceae)

Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao toàn phần và các phân đoạn của cây Xấu hổ theo phương pháp dung nạp glucose đường uống OGTT trên chuột bình thường.... Kết quả đánh g

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

MÃ SỐ: 8720205

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Bùi Thanh Tùng

2 PGS.TS Đào Thị Vui

HÀ NỘI 2022

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thanh Tùng, PGS.TS Đào

Thị Vui đã trao cho tôi cơ hội làm nghiên cứu thực nghiệm, đã tạo điều kiện, hỗ trợ,

động viên cũng như đưa ra những nhận xét nghiêm khắc, hữu ích trong suốt quá trình nghiên cứu, đã hướng dẫn nhiệt tình giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Thị Lan đã tạo điều kiện, chỉ dẫn tận tình

và ủng hộ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực nghiệm.

Đề tài là kết quả quá trình tôi tham gia nghiên cứu cùng đề tài : “Nghiên cứu khả

năng cải thiện và cơ chế tác dụng của cao chiết lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.)

trên mô hình bệnh đái tháo đường do Streptozotocin gây ra ở chuột” của Nghiên cứu sinh : ThS Phạm Thị Lan Tôi cam kết không có xung đột lợi ích về bản quyền với nhóm nghiên cứu

Cảm ơn các cán bộ của bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng- Trường đại học dược

Y Dược – Đại học quốc gia Hà Nội đã luôn đồng hành, hỗ trợ, chia sẻ công việc giúp tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu Những sự giúp đỡ của mọi người là động lực lớn giúp tôi hoàn thành nghiên cứu trong những ngày tháng nghiên cứu tại bộ môn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn dược lực, dược lâm sàng nơi tôi

đã theo học chuyên ngành dược lý - dược lâm sàng cũng như các thầy giáo, cô giáo tại trường đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã tận tụy truyền tải tri thức trên giảng đường trong gần suốt gần hai năm học tập tại đây Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn

bè luôn động viên tinh thần và ủng hộ để tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Trần Thị Huyền Trang

MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Bệnh đái tháo đường 3

1.1.1 Định nghĩa, phân loại, tiêu chẩn đoán ĐTĐ 3

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh bệnh ĐTĐ 4

1.1.3 Biến chứng do Đái tháo đường 6

1.1.4 Các thuốc sử dụng trong điều trị ĐTĐ 8

1.1.5.Các mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm trên động vật 13

1.2 Tổng quan về cây Xấu hổ 15

1.2.1.Đặc điểm hình thái 15

1.2.2.Thành phần hóa học 15

1.3 Các nghiên cứu liên quan đến tác dụng hạ glucose máu của cây Xấu hổ 16

1.3.1.Nghiên cứu trên thế giới liên quan đến tác dụng hạ glucose máu của cây Xấu hổ 16

1.3.2.Nghiên cứu trong nước liên quan đến tác dụng hạ glucose máu của cây Xấu hổ 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Động vật thí nghiệm 20

2.1.3 Hóa chất và thuốc thử 21

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao toàn phần và các phân đoạn của cây Xấu hổ theo phương pháp dung nạp glucose đường uống (OGTT) trên chuột bình thường 22

2.2.2 Phương pháp đánh giá các tác dụng của phân đoạn có tác dụng tốt nhất trên mô hình chuột bị gây ĐTĐ kiểu typ 2 do streptozotocin 24

2.2.3 Phương pháp xác định các thông số đánh giá trong thí nghiệm 26

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao toàn phần và các phân đoạn của cây Xấu hổ theo phương pháp dung nạp glucose đường uống (OGTT) trên chuột bình thường 33

3.1.1 Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống với cao toàn phần và phân đoạn của cây Xấu hổ 33

3.1.2 Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống với phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ 34

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ trên mô hình chuột bị gây ĐTĐ typ 2 do chế độ ăn giàu chất béo và streptozotocin 34

3.2.1 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cây Xấu hổ lên glucose huyết tương 34

3.2.2 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cây Xấu hổ lên nồng độ lipid máu 36

3.2.3 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cây Xấu hổ lên microalbumin niệu 37

3.2.4 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên nồng độ creatinin máu 38

3.2.5 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên nồng độ creatinin nước tiểu……… 39

3.2.6 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên hệ số thanh thải creatinin 40

3.2.7 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên tình trạng viêm ở mô thận chuột 41

3.2.8 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên quá trình stress oxy hóa ở chuột ………43

3.2.9 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cây Xấu hổ lên mô bệnh học thận của chuột 47

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 49

4.1 Về tác dụng hạ glucose máu của cao toàn phần và các phân đoạn của cây Xấu hổ theo phương pháp dung nạp glucose đường uống (OGTT) trên chuột bình thường 49

4.1.1 Về việc lựa chọn thử nghiệm OGTT 49

4.1.2 Về việc lựa chọn liều thử nghiệm 49

4.1.3 Về kết quả thử nghiệm OGTT 49

4.2 Về tác dụng của phân đoạn ethylacetat trên mô hình chuột bị gây ĐTĐ kiểu typ 2 do chế độ ăn giàu chất béo và streptozotocin 50

4.2.1 Về việc lựa chọn mô hình nghiên cứu 50

4.2.2 Về ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cây Xấu hổ lên mô hình chuột bị gây ĐTĐ typ 2 do STZ 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADA American Diabetes Association Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kì AMPK Adenosine 5 protein monophosphate

protein kinase

Protein kinase phụ thuộc AMP

DPP-4i Dipeptidyl peptidase -4 inhibitors Thuốc ức chế Dipeptidyl

peptidase - 4

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Acid Ethylenediaminetetraacetic

GHSR Growth hormone secretagogue

GLUT-1 Glucose transporter type 1 Chất vận chuyển glucose typ 1

HDL High Density Lipoprotein

HPLC High-performance liquid

chromatography

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

IDF International Diabetes Federation Liên đoàn đái tháo đường thế giới

IRS Insulin receptor substrates Chất nền thụ thể insulin

LDL Low Density Lipoprotein Cholesterol Lipoprotein trọng lượng phân tử

thấp

MHC Major Histocompatibility Complex Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu NDAPH Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate OGTT Oral glucose tolerance test Nghiệm pháp dung nạp glucose

đường uống

PIP3 Phosphatidylinositol triphosphate Phosphatidylinositol triphosphate PKB,

PKC

PNP-G p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

PPARγ Peroxysome proliferator-activated

receptor γ

Thụ thể hoạt hóa peroxysome γ

PTP1B Protein Tyrosine Phosphatase 1B Protein Tyrosine Phosphatase 1B

oxy SGLT-2 Sodium glucose transporter -2 Hệ thống đồng vận Na, glucose -2

SU Sulfonylureas Các Sulfonylurea

TGF-β Transforming Growth Factor β Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β

TNF-α Tumor Necrosis Factors– α Factors Yếu tố hoại tử khối u – α

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự tiết insulin và 1 số thuốc sử dụng trong ĐTĐ 8

Hình 1 2 Cây Xấu hổ 15

Hình 2 1 Hình ảnh mẫu cây Xấu hổ thu hái 19

Hình 2 2 Sơ đồ chiết phân đoạn 20

Hình 2 3 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm 22

Hình 2 4 Sơ đồ thí nghiệm dung nạp glucose đường uống 23

Hình 2 5 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng của mẫu nghiên cứu trên chuột 26

Hình 3 1 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên nồng độ glucose máu …… 35

Hình 3 2 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cây Xấu hổ lên microalbulin niệu 37

Hình 3 3 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc lên nồng độ creatinin máu 38

Hình 3 4 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc lên nồng độ creatinin niệu 39

Hình 3 5 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc lên hệ số thanh thải creatinin 40

Hình 3 6 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc lên nồng độ TNF –α trên mô thận chuột41 Hình 3 7 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc lên nồng độ IL-1β trên mô thận chuột 42 Hình 3 8 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên quá trình peroxy hóa lipid 43

Hình 3 9 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên nồng độ SOD 44

Hình 3 10 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên nồng độ CAT 45

Hình 3 11 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cây Xấu hổ lên nồng độ GPx 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Một số loại insulin 9 Bảng 3 1 Kết thử nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống với cao toàn phần và

các phân đoạn của cây Xấu hổ 33

Bảng 3 2 Kết quả thử nghiệm dung nạp glucose đường uống đối với phân đoạn

EtOAc của cây Xấu hổ 34

Bảng 3 3 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cây Xấu hổ lên nồng độ lipid máu 36 Bảng 3 4 Hình ảnh vi thể thận của chuột thí nghiệm 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh mạn tính khá phổ biến hiện nay, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân cũng như để lại rất nhiều biến chứng nguy hiểm Theo số liệu thống kê của Liên đoàn đái tháo đường thể giới (IDF) vào năm 2021, trên thế giới có khoảng 537 triệu người trong độ tuổi từ 20-79 mắc ĐTĐ, ước tính con số này có thể lên đến 643 triệu vào năm 2030 và 783 triệu vào năm 2045 [39] Tại Việt Nam, theo ước tính của Bộ y tế, đối với độ tuổi từ 20-

79, bệnh ĐTĐ sẽ tăng khoảng 78.5% trong giai đoạn 2017-2045 (từ 3,53 triệu người mắc năm 2017 lên 6,3 triệu người mắc năm 2045) [4].Cũng theo một nghiên cứu trong năm 2019, tổng chi tiêu cho y tế liên quan đến ĐTĐ trên toàn thế giới ước tính là 760 tỷ USD ở người trong độ tuổi từ 20-79, với phần lớn từ số đó là chi tiêu dành cho người từ độ tuổi 50-79, dự kiến đến năm 2030 con số này sẽ là 825 tỷ USD và có thể lên đến 845 tỷ USD vào năm 2045 [135] Bệnh ĐTĐ đã và đang trở thành gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân, gia đình bệnh nhân cũng như cho xã hội Bên cạnh gánh nặng kinh tế, ĐTĐ còn để lại nhiều biến chứng nguy hiểm cho người bệnh Trong đó biến chứng trên mạch máu nhỏ như bệnh thận do ĐTĐ, các biến chứng về mắt như: đục thủy tinh thể, glaucom…rất phổ biến Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các biến chứng mạch máu nhỏ ở bệnh nhân ĐTĐ không chỉ dẫn đến mù lòa, cắt cụt chi mà còn có thể làm tăng nguy cơ của các biến chứng tim mạch và suy thận [19]

Bệnh thận do ĐTĐ xảy ra ở khoảng 40% tổng số bệnh nhân bị ĐTĐ và là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến suy thận mạn trên toàn thế giới Mặc dù bệnh thận mạn giai đoạn cuối (ESRD) là hậu quả dễ dàng nhận ra nhất của bệnh thận do ĐTĐ nhưng bệnh nhân chủ yếu lại tử vong do các bệnh tim mạch hoặc nhiễm trùng trước khi khi cần đến liệu pháp thay thế thận [16] Trong một nghiên cứu được tiến hành năm 2021 tại Anh cho thấy nguy cơ tử vong ở bệnh nhân mắc ĐTĐ typ 2 và bệnh thận do ĐTĐ rất cao: cứ 20 bệnh nhân có bệnh thận do ĐTĐ thì có một người tử vong mỗi năm, tỉ lệ này cao hơn 50% so với những bệnh nhân không có bệnh thận

do ĐTĐ [46]

Hiện nay, bên cạnh các loại thuốc kinh điển đã được sử dụng thì các thuốc có

nguồn gốc tự nhiên cũng đã và đang được nghiên cứu để tìm ra những thành phần hoạt chất góp phần trong điều trị ĐTĐ Các cây thảo dược đã được chứng minh có các tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, điều hòa lipid máu, giảm glucose máu… dẫn đến ức chế quá trình chết theo chu trình (apotosis) của tế bào β đảo tụy và giảm

sự đề kháng của insulin từ đó làm hạ đường huyết Một số cây thảo dược đã được

nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết như: cây Gỗ lim (Memecylon umbellatum Burm), lá cây Dâu tằm trắng (Morus alba L ), Hoàng kì (astragalus membranaceus

Bunge)….[79]

Cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn) là một cây thân thảo, phân bố ở nhiều nơi

trên thế giới cũng như ở Việt Nam Tất cả các bộ phận của cây: lá, hoa, thân, rễ, quả đều được sử dụng để làm thuốc trong y học cổ truyền [23] Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy cây Xấu hổ có tác dụng hạ đường huyết, giảm lipid máu [34], [83] và ức chế α-glucosidase [131]

Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam các nghiên cứu về tác dụng của dịch chiết cây Xấu hổ trên điều trị ĐTĐ còn rất ít Do đó, để cung cấp thêm minh chứng khoa học cho việc sử dụng cây Xấu hổ trong hỗ trợ điều trị ĐTĐ, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm của cao chiết cây Xấu hổ (

Mimosa Pudica L., Fabaceae)” với hai mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao toàn phần và các phân đoạn của cây Xấu hổ theo phương pháp dung nạp glucose đường uống (OGTT) trên chuột bình thường

2 Đánh giá tác dụng của phân đoạn có tác dụng tốt nhất trên mô hình chuột bị gây ĐTĐ typ 2 do chế độ ăn giàu chất béo kết hợp streptozotocin

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường

1.1.1 Định nghĩa, phân loại, tiêu chẩn đoán ĐTĐ

Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa, có đặc điểm tăng glucose huyết mạn tính do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai Tăng glucose máu mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim

và mạch máu, thận, mắt, thần kinh [1], [111]

Theo hiệp hội ĐTĐ Hoa Kì (2021), ĐTĐ được chia làm bốn loại:

Bệnh ĐTĐ typ 1 : Do sự phá hủy tế bào β, thường dẫn đến thiếu hụt insulin tuyệt đối bao gồm cả ĐTĐ tự miễn tiềm ẩn ở người trưởng thành

Bệnh ĐTĐ typ 2: Do mất dần việc tiết insulin thường xuyên từ tế bào β trên nền đề kháng insulin

Các bệnh ĐTĐ cụ thể do các nguyên nhân khác, ví dụ: hội chứng ĐTĐ đơn gen (chẳng hạn như bệnh ĐTĐ ở trẻ sơ sinh và bệnh ĐTĐ khởi phát ở tuổi trưởng thành), các bệnh về tuyến tụy ngoại tiết (xơ nang, viêm tụy), bệnh ĐTĐ do thuốc hoặc hóa chất (sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau ghép tạng)

ĐTĐ thai kì: bệnh ĐTĐ được chẩn đoán ở ba tháng giữa hoặc ba tháng cuối thai kì mà không phải ĐTĐ rõ trước khi mang thai

Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ dựa vào 1 trong 4 tiêu chí sau:

1 Glucose huyết tương lúc đói ≥ 126 mg/dL (hay 7 mmol/L) hoặc:

2 Glucose huyết tương ở thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạp với 75g glucose bằng đường uống ≥ 200 mg/dL (hay 11,1 mmol/L)

3 HbA1c ≥ 6,5% (48 mmol/mol) Xét nghiệm HbA1c phải được thực hiện bằng phương pháp đã chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế

4 Bệnh nhân có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết hoặc của cơn tăng glucose huyết cấp kèm mức glucose huyết tương bất kỳ ≥ 200 mg/dL (hay 11,1 mmol/L) [1]

Chẩn đoán xác định nếu có 2 kết quả trên ngưỡng chẩn đoán trong cùng 1 mẫu

máu xét nghiệm hoặc ở 2 thời điểm khác nhau đối với tiêu chí 1, 2, hoặc 3; riêng tiêu chí 4: chỉ cần một lần xét nghiệm duy nhất

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh bệnh ĐTĐ

1.1.2.1 Cơ chế bệnh sinh đối với bệnh đái tháo đường typ 1

ĐTĐ typ 1 là kết quả của quá trình tự miễn phá hủy tế bào β của tuyến tụy, dẫn đến thiếu hụt insulin Quá trình tự miễn dịch diễn ra ở những người nhạy cảm

về mặt di truyền dưới tác động kích hoạt của một hoặc nhiều yếu tố môi trường, và thường tiến triển trong thời gian nhiều tháng hoặc nhiều năm

Yếu tố đầu tiên cần phải nói tới trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là di truyền Các gen chính có khuynh hướng đối với ĐTĐ typ 1 nằm trong vùng phức hợp tương hợp mô chính (MHC), thường được gọi là HLA (kháng nguyên bạch cầu

ở người) và nằm trên nhiễm sắc thể số 6 Các alen đa hình phức hợp HLA chịu trách nhiệm cho 40–50% nguy cơ di truyền phát triển ĐTĐ typ 1 Tiếp đó là gen insulin (Ins-VNTR, IDDM 2) trên nhiễm sắc thể 11 và gen gây độc tế bào liên kết với tế bào lympho T (CTLA-4) trên nhiễm sắc thể 2, vì chúng là nguyên nhân của 15% khuynh hướng di truyền [93] Có ba loại gen HLA, trong đó các gen loại II có mối

liên hệ mạnh nhất với ĐTĐ typ 1 [65] Các alen ở các locus HLA DR và HLA

DQ lớp II là những yếu tố quyết định nhất đối với nguy cơ di truyền [17]

Yếu tố thứ hai trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là yếu tố môi trường Các yếu tố môi trường liên quan bao gồm vi rút (rubella, coxsackievirus B hoặc enterovirus), độc tố và chất dinh dưỡng (sữa bò, ngũ cốc) Ảnh hưởng chính xác của các yếu tố này vẫn chưa rõ ràng, nhưng cần phải được xác định, vì các yếu tố này có thể được sửa đổi và có thể dẫn đến các can thiệp trong phòng ngừa hoặc điều trị bệnh [94]

Sự phá hủy các tế bào β của tuyến tụy trong ĐTĐ typ 1 xảy ra nhiều nhất là thông qua quá trình apoptosis còn được gọi là chết theo chương trình tế bào, bao gồm một loạt các hoạt động cysteine-asparaginase, được gọi là caspase Phản ứng viêm với nồng độ cao của các cytokine tiền viêm IL-1, TNF-α (yếu tố hoại tử khối u-α) và INF-γ (interferon-γ) được gây ra bởi các tế bào lympho T tự hoạt động trong

vi môi trường đảo nhỏ Các cytokin này kích hoạt dòng thác caspase [93] Đáp ứng

miễn dịch bị rối loạn bao gồm cả nhánh miễn dịch dịch thể, sản sinh ra các tự kháng thể có thể trước khi bắt đầu biểu hiện lâm sàng của ĐTĐ typ 1 trong nhiều năm Các tự kháng thể chính được phát hiện ở bệnh nhân ĐTĐ typ 1 là các kháng thể chống lại GAD65, tyrosin phosphatase (IA-2), insulin (IAA) và chất vận chuyển kẽm (ZnT8) [94], [80]

1.1.2.2 Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường typ 2

Đái tháo đường typ 2 xảy ra khi có sự thiếu hụt insulin hoặc hoạt động của insulin trong việc duy trì nồng độ glucose máu ở mức bình thường [45], [25] Trong hầu hết các trường hợp, kháng insulin được cho là biểu hiện ở cấp độ tế bào thông qua các khiếm khuyết sau thụ thể trong việc truyền tín hiệu insulin Các cơ chế có thể xảy ra bao gồm giảm điều hòa, thiếu hụt hoặc đa hình di truyền của quá trình phosphoryl hóa tyrosin của thụ thể insulin, các protein IRS hoặc PIP-3 kinase, hoặc có thể liên quan đến các bất thường chức năng của GLUT4 [134]

ĐTĐ typ 2 liên quan nhiều đến di truyền hơn so với ĐTĐ typ 1[118],[75] Khả năng bị ĐTĐ typ 2 ở những người có bố mẹ hoặc anh chị em bị ĐTĐ typ 2 cao gấp

4 lần so với bình thường và có thể lên đến 6 lần nếu cả bố và mẹ đều mắc bệnh, trường hợp sinh đôi cùng trứng có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn 2 đến 3 lần so với sinh đôi khác trứng Có hơn 20 gen được xác định là có liên quan đến bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 như TCF7L2, PPARG, NCNJ11,WFS1, HNF1B [118],[87], trong đó đóng vai trò lớn nhất là yếu tố phiên mã TCF7L2 [45] Người mang một alen TCF7L2 có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường typ 2 cao hơn xấp xỉ 40% so với người mang alen đồng hợp tử của alen bảo vệ [38]

Có mối quan hệ giữa béo phì (chỉ số MBI) và số tuổi mà tại đó bệnh nhân được chẩn đoán ĐTĐ typ 2 [82], [45] Các mô đáp ứng của insulin là tế bào cơ, mô

mỡ và tế bào gan Sự đề kháng insulin ở tế bào cơ và mỡ thường dẫn đến giảm vận chuyển glucose từ máu vào trong tế bào Đề kháng insulin ở gan liên quan đến sự giảm khả năng ức chế tổng hợp glucose ở gan của insulin Sự đề kháng insulin ở mô

mỡ làm tăng ly giải lipid và giải phóng acid béo vào vòng tuần hoàn, điều này lại góp phần vào việc đề kháng insulin ở các mô [45] Do đó, béo phì không chỉ là yếu

tố nguy cơ của ĐTĐ typ 2 mà nó còn có tác động lên sự phát triển và tiến triển của

1.1.3 Biến chứng do ĐTĐ

1.1.3.1 Biến chứng thận do đái tháo đường

Bệnh thận do đái tháo đường xuất hiện ở 20-40% bệnh nhân bị đái tháo đường [100] Bệnh thận do ĐTĐ thường xuất hiện sau khoảng 10 năm ở bệnh nhân ĐTĐ typ 1 nhưng có thể xảy ra ở ngay thời điểm chẩn đoán ĐTĐ typ 2 [10]

Bệnh thận do đái tháo đường là một hội chứng lâm sàng đặc trưng bởi sự xuất hiện của albumin niệu vi lượng dai dẳng đồng thời với đái tháo đường phụ thuộc hoặc không phụ thuộc insulin Ban đầu, bệnh nhân có biểu hiện tăng tốc độ lọc cầu thận (GFR) gần gấp đôi giá trị bình thường và thỉnh thoảng xuất hiện albumin niệu

vi lượng Những dấu hiệu này có thể xuất hiện trong vòng 5 năm Sau đó trong vòng 20 năm, GFR giảm xuống và albumin niệu xuất hiện trước khi có sự biểu hiện của tăng protein niệu vừa và nhẹ Bước cuối cùng trong diễn tiến tự nhiên của bệnh được đặc trưng bởi tăng protein niệu nặng có hoặc không mắc kèm hội chứng thận

hư và suy thận nhẹ đến bệnh thận giai đoạn cuối (ESRD) Nguyên nhân của những

sự suy giảm trên là do sự thay đổi trong cấu trúc của tế bào thận, bắt đầu bằng sự tích lũy chất nền ngoại bào ở trung bì và màng đáy cầu thận, sau đó hình thành các nốt trung bì thể hiện các đặc điểm tổn thương của bệnh thận đái tháo đường cùng với những tổn thương kẽ ống thận [129] Đặc điểm hình thái của bệnh thận do đái tháo đường bao gồm phì đại cầu thận, dày màng đáy, giãn nở trung bì, teo ống thận,

xơ hóa mô kẽ và dày tiểu động mạch [57]

Tăng đường huyết, tăng huyết áp và khuynh hướng di truyền là những yếu tố nguy cơ chính phát triển bệnh thận do đái tháo đường Ngoài ra, tăng lipid huyết, thói quen hút thuốc, số lượng và nguồn gốc của protein trong chế độ ăn uống cũng đóng một vai trò như các yếu tố nguy cơ [119]

Có nhiều dữ liệu gợi ý về cơ chế bệnh sinh của bệnh thận do đái tháo đường

Cơ chế theo con đường huyết động học liên quan đến hệ renin – angiotensin – aldosterol và hệ urotensin Các cytokin viêm và profibrotic bao gồm yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β (TGF-β), yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) các kinase như protein kinase C (PKC) và Janus kinase cũng có vai trò trong tiến triển của bệnh thận đái tháo đường Và đóng vai trò quan trọng nhất là các chất trung gian gây stress oxy hóa như NADPH oxydase [18]

1.1.3.2 Các biến chứng khác của đái tháo đường

Bệnh võng mạc do ĐTĐ

Tăng đường huyết có thể gây tổn thương tiến triển cho các mạch máu trong võng mạc, có thể dẫn đến xuất huyết, bong võng mạc và mù lòa [113] Đây là biến chứng phổ biến nhất của ĐTĐ với tỉ lệ mắc ở bệnh nhân là khoảng 35% [106] Bệnh võng mạc do ĐTĐ được đặc trưng bởi các tổn thương như: thay đổi tính thấm thành mạch, vi mạch mao mạch, thoái hóa mao mạch và sự hình thành quá mức của mạch máu mới Bệnh võng mạc do ĐTĐ được chia thành hai loại là bệnh không

tăng sinh (NPDR) và bệnh có tăng sinh (PDR) [32] Đây là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến mù lòa ở người trưởng thành trong độ tuổi từ 20-74 [52]

Biến chứng thần kinh do ĐTĐ

Tương tự như các biến chứng ĐTĐ khác, bệnh thần kinh do ĐTĐ là một tình trạng đa yếu tố liên quan tới một số yếu tố nguy cơ như mức HbA1c, tăng huyết áp, tình trạng hút thuốc và BMI [97] Hơn một nửa bệnh nhân tiểu đường sẽ gặp phải biến chứng thần kinh với nguy cơ là một hoặc nhiều chi dưới bị cắt cụt, tỉ lệ này lên đến 15% [8]

Biến chứng tim mạch do ĐTĐ

Rối loạn tim mạch trong bệnh tiểu đường bao gồm xơ vữa động mạch sớm, biểu hiện như nhồi máu cơ tim và đột quỵ cũng như suy giảm chức năng tim, chủ yếu rối loạn chức năng tâm trương Biến chứng tim mạch chiếm hơn một nửa tỉ lệ

tử vong ở bệnh nhân ĐTĐ và bệnh nhân ĐTĐ cũng có nguy cơ nhồi máu cơ tim cao gấp ba lần so với người bình thường [41] Các yếu tố nguy cơ của biến chứng tim mạch do ĐTĐ bao gồm: có sự hiện diện của các biến chứng vi mạch khác, tuổi tác, giới tính, BMI, kiểm soát đường huyết và HbA1c, huyết áp và tình trạng hút thuốc [113]

1.1.4 Các thuốc sử dụng trong điều trị ĐTĐ

Hình 1 1 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự tiết insulin và 1 số thuốc sử dụng trong ĐTĐ [51]

1.1.4.1 Insulin

Insulin là một protein nhỏ với phân tử lượng là 5808 Da, bao gồm 51 acid amin xếp thành 2 chuỗi A và B, nối với nhau bằng cầu nối disulfit Proinsulin là 1 protein đơn chuỗi dài, được xử lý tại bộ máy Golgi của tế bào β đảo tụy, nó sẽ được thủy phân thành insulin và peptid C bằng cách loại bỏ 4 acid amin [51], [25] Insulin sau khi đi vào tuần hoàn, sẽ khuếch tán vào các mô và gắn lên 1 receptor đặc hiệu ở các mô đích ở gan, cơ và mô mỡ [25]

Receptor của insulin được cấu thành từ 4 tiểu đơn vị, 2 tiểu đơn vị α và 2 tiểu đơn vị β là sản phẩm của 2 gen đơn Khi insulin gắn vào tiểu đơn vị α, việc kích hoạt thụ thể sẽ bắt đầu thông qua việc phosphoryl hóa tập hợp các protein nội bào bao gồm các IRS và Shc protein Hoạt động vận chuyển glucose của insulin phụ thuộc vào sự hoạt hóa của PI3K PI3K được hoạt hóa bằng tương tác giữa các IRS protein và tạo ra PIP3, từ đó điều hòa hoạt động của nhiều kinase xuôi dòng bao gồm PKB (Akt), các đồng dạng không điển hình của PKC và mTOR Đồng dạng Akt2 có vai trò quan trọng trong bước cuối cùng của quá trình hấp thu glucose vào

mô cơ và mô mỡ cũng như điều hòa sản xuất glucose ở gan Chất nền của Akt2 cũng điều phối sự chuyển vị của chất vận chuyển glucose GLUT4 [45] Khi đến màng sinh chất, GLUT4 hợp nhất với màng và vận chuyển glucose vào trong tế bào [30], [25], tăng quá trình tổng hợp glycogen và đường phân [51], [25]

Bảng 1 1 Một số loại insulin [25]

Insulin tác dụng ngắn Insulin lispro

Insulin aspart Insulin glulisine Regular insulin Regular insulin inhaled

Insulin tác dụng kéo dài NPH insulin

Insulin glargine Insulin detemir Insulin degludec

Insulin hỗn hợp 70 NPH/30 regular

75/25 NPL, Lispro 50/50 NPL, Lispro 70/30 NPA, Aspart 70/30 Degludec/Aspart

1.1.4.2 Các thuốc làm tăng tiết insulin

Sulfunylurease ( SU): thuốc gắn lên vị trí đặc hiệu trên phức hợp kênh KATP

của tế bào β (SUR) và ức chế hoạt động của nó, dẫn đến làm thay đổi điện thế màng

tế bào [51], [45], Ca2+ đi vào màng tế bào, kích thích tế bào β đảo tụy tiết insulin [51], [25] Trong điều trị lâu dài, nồng độ insulin trong tuần hoàn có thể giảm xuống

do sự giảm các thụ thể bề mặt của SU trên bề mặt tế bào β nhưng sự giảm nồng độ glucose máu vẫn được duy trì [45] Một số hoạt chất thuộc nhóm sulfonylurea: glimepirid, glipizid, gliclazid…

Các Meglinide (nateglinid, repaglinid): nhóm thuốc này cũng kích thích tế

bào β đảo tụy tiết insulin thông qua việc điều biến hoạt động của kênh K+ phụ thuộc ATP như SU Tuy nhiên khác với SU, các thuốc này gắn lên kênh K+

ở 2 vị trí: một

vị trí giống với SU và một vị trí khác [84],[25] Các thuốc này hấp thu nhanh, kích thích tiết insulin trong vòng vài phút [84] và đạt đỉnh tác dụng sau khoảng 1 giờ [45], [25] Do đó, nồng độ insulin cần thiết đạt được trong máu ngay sau bữa ăn, giúp giảm đường huyết sau ăn mà không có nguy cơ hạ đường huyết giữa các bữa

ăn [84], điều này khác với SU

Thuốc đồng vận GLP-1 receptor (GLP-1GAs) và các chất ức chế DPP-4 (DPP-4is)

Incretin là một nhóm hormon được tiết ra từ tế bào L ruột non, gồm 2 loại chính là GIP và GLP-1 [51], [45], [25] GLP-1 tác động vào tế bào β đảo tụy làm tăng tiết insulin phụ thuộc vào nồng độ glucose máu, ức chế tế bào α tiết glucagon, làm chậm thời gian rỗng dạ dày từ đó giúp hạ glucose máu [60], [51], nhưng GLP-1

sẽ bị phân hủy rất nhanh sau 2-3 phút trong máu [68] bởi một enzym có tên DPP-4 [85], [51] Do đó, nhằm kéo dài tác dụng của GLP-1, các thuốc mới đã được phát

triển theo 2 cơ chế:

+ Các thuốc đồng vận receptor GLP-1: Các thuốc này có các tác dụng dược lý tương tự GLP-1 và không bị phân hủy bởi DPP-4 nên có tác dụng kéo dài hơn khi dùng đường tiêm Cơ chế hoạt động của chúng là kích hoạt thụ thể GLP-1 (một receptor thuộc họ receptor glucagon nhóm B) Các thụ thể này có mặt ở các vị trí: tế bào β đảo tụy, hệ thần kinh trung ương, hệ tim mạch, phổi, thận Khi thuốc gắn vào thụ thể sẽ kích hoạt con đường cAMP- PKA và một số GEF Hoạt hóa receptor này cũng dẫn tới truyền tín hiệu qua PKC và PI3K và thay đổi hoạt động của một số kênh ion Tại tế bào β kết quả cuối cùng là làm tăng sinh tổng hợp và bài tiết insulin phụ thuộc glucose Ở trên TKTW, kích thích trên receptor có tác dụng trên sự hấp thu thức ăn và sự rỗng dạ dày, ngoài ra cũng có thể gây ra tác dụng phụ như buồn nôn [45] Các hoạt chất thuộc nhóm này: albiglutid, exenatid, liraglutid, lixisenatid…

+ Các thuốc ức chế enzym DPP-4: Alogliptin, linagliptin và sitagliptin là những chất ức chế cạnh tranh DPP-4; vildagliptin và saxagliptin liên kết cộng hóa trị với enzym này Ức chế DPP-4 làm tăng nồng độ GIP và GLP-1 lên gấp 2 lần từ

đó làm tăng tiết insulin và giảm tiết glucagon, cải thiện tốt cả đường huyết sau ăn và đường huyết lúc đói [45] Một số nghiên cứu đã đi đến hình thành giả thuyết rằng một số thuốc ức chế DPP-4 có tiềm năng trong việc làm chậm hoặc ngăn chặn sự tiến triển của ĐTĐ type 2 cũng như cải thiện khối lượng và chức năng của tế bào β đảo tụy [81], [21]

1.1.4.3 Các thuốc làm tăng nhạy cảm của insulin với receptor

Biguanid

Metformin là thuốc duy nhất trong nhóm biguanid còn được sử dụng đến ngày hôm nay để điều trị ĐTĐ [45] Metformin được vận chuyển vào bên trong tế bào nhờ các chất vận chuyển, trong đó đóng vai trò quan trọng nhất là SLC22A1, chất này có nồng độ cao tại gan, làm cho nồng độ metformin tập trung cao ở đây [126] Hầu hết các tác dụng dược lý của metformin đều qua trung gian ở gan mà ít ảnh hưởng đến chuyển hóa glucose hoặc nhạy cảm với insulin ở cơ xương [45] Metformin làm tăng sự nhạy cảm của insulin với thụ thể và cơ chất thụ thể insulin 2

(IRS-2) bằng cách làm tăng hoạt động tyrosin kinase của insulin receptor, tăng sự biểu hiện của insulin receptor, tăng cường chuyển vị các chất vận chuyển glucose GLUT1 (ở gan) [49] và GLUT4 (ở cơ) [40] đến màng tế bào Metformin có tác dụng đối với hô hấp của ti thể làm giảm ATP nội bào và tăng AMP Việc kích hoạt protein kinase phụ thuộc AMP (AMPK) bởi metformin dẫn đến kích thích quá trình oxy hóa acidbéo ở gan, hấp thu glucose, chuyển hóa glucose và giảm quá trình tân tạo đường và lipid [45]

Thiazolidinedion

Thiazolidinedion kích hoạt thụ thể PPARγ, được biểu hiện chủ yếu ở mô mỡ, ngoài ra còn ở tế bào tim, cơ xương và cơ trơn, tế bào β đảo tụy, đại thực bào, và tế bào nội mô mạch máu Liên kết phối tử với PPARγ gây ra sự hình thành dimer với thụ thể retinoid X và tương tác với các yếu tố đáp ứng PPAR trên các gen cụ thể Phản ứng chính khi kích hoạt PPARγ là biệt hóa tế bào mỡ Hoạt động của PPARγ cũng thúc đẩy sự hấp thu các acidbéo tuần hoàn vào các tế bào mỡ và chuyển dịch

dự trữ lipid từ các vị trí ngoài mỡ sang mô mỡ Một hậu quả của các phản ứng tế bào đối với sự hoạt hóa PPARγ là tăng độ nhạy của mô với insulin [45] Thiazolidinedion cũng đã được chứng minh là làm giảm mức độ của chất ức chế hoạt hóa plasminogen loại 1, chất nền metalloproteinase 9, protein phản ứng C và interleukin 6 [25] Các hoạt chất thuộc nhóm này: pioglitazon và rosiglitazon [45], [25]

1.1.4.4 Thuốc ức chế SGLT2: canagliflozin, dapagliflozin, empagliflozin

Glucose được lọc tự do ở cầu thận và tái hấp thu ở ống lượn gần bởi chất vận chuyển sodium- glucose transporter-2 (SGLT-2) SGLT-2 tham gia vào 90% sự tái hấp thu glucose ở ống thận [25], 10% còn lại do SGLT-1 đảm nhiệm ở các đoạn xa hơn của ống thận [45] Các thuốc ức chế SGLT-2 làm giảm glucose bằng cách tăng đào thải glucose cùng với nước tiểu ở thận [45], [25] Bên cạnh hạ nồng độ glucose máu, các thuốc này còn có tác dụng giảm cân, hạ huyết áp, và nhiều tác dụng có lợi trên tim mạch [24]

1.1.4.5 Thuốc ức chế α- glucosidase: acarbose, miglitol, volglibose [25]

Carbonhydrat trong thức ăn phải được biến đổi thành các phân tử nhỏ hơn nhờ

α –glucosidase ở diềm bàn chải của ruột để hấp thu Ức chế α –glucosidase làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thu carbonhydrat vào máu do đó các thuốc này làm giảm nồng độ glucose máu sau ăn [13] Ngoài ra, các thuốc này còn tăng tiết GLP-1 vào tuần hoàn nên góp phần tăng tác dụng hạ glucose máu [45]

1.1.4.6 Các thuốc khác sử dụng trong điều trị ĐTĐ

Pramlintid

Pramlintid là một chất tương tự amylin ở đảo tụy (chất này được tiết ra cùng insulin) với sự thay đổi ở 3 vị trí 25;28;29 [25] Chất này có khả năng hoạt động thông qua thụ thể amylin ở các vùng cụ thể của não sau Kích hoạt thụ thể amylin làm giảm bài tiết glucagon, trì hoãn quá trình làm rỗng dạ dày và tăng cảm giác no [45] Pramlintid được chấp thuận để sử dụng cho bệnh nhân ĐTĐ typ 1 và typ 2 được điều trị bằng insulin, những người không thể đạt được mức đường huyết mục tiêu sau ăn, thuốc được sử dụng đường tiêm dưới da [25]

Ngoài ra còn có một số thuốc khác được sử dụng trong điều trị ĐTĐ typ 2 như: Colesevelam hydrochloride – một nhựa gắn acid mật được sử dụng trong điều trị ĐTĐ typ 2 và Bromocriptin – một chất đồng vận Dopamin, có khả năng giảm HbA1c ở các thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng [45], [25]

1.1.5 Các mô hình gây ĐTĐ typ 2 thực nghiệm trên động vật

1.1.5.1 Mô hình streptozotocin/ alloxan

Streptozotocin hay 2-deoxy-2 (3-metyl-3-nitrosoureido) -D-glucopyranose (STZ) là một chất tương tự nitrosourea được sử dụng rộng rãi trong các mô hình gây ĐTĐ ở chuột Tế bào β đảo tụy tương đối nhạy cảm với STZ STZ được hấp thu vào bên trong tế bào β nhờ các chất vận chuyển GLUT-2 ở trên màng tế bào [91] STZ phá hủy tế bào β đảo tụy thông qua cơ chế chính là alkyl hóa ADN do chuyển nhóm methyl từ STZ vào phân tử ADN gây ra một chuỗi các phản ứng sau

đó và cuối cùng dẫn đến phân mảnh ADN Ngoài ra, sự tạo thành các gốc oxy hóa

có nguồn gốc oxy ROS (reactive oxygen spieces) cũng góp phần trong tác dụng của STZ lên phá hủy tế bào β [122] Việc sử dụng STZ và nicotinamid trong mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm đã được khuyến cáo vì nicotinamid có tác dụng bảo vệ những tế bào tiết insulin chống lại độc tính của STZ [96] Liều cao STZ gây giảm

bài tiết insulin gây ra ĐTĐ typ 1 trong khi liều thấp STZ gây ra sự suy giảm nhẹ trong việc tiết insulin, gần giống với các đặc tính của giai đoạn muộn ĐTĐ typ 2 [66],[56]

Năm 1943, Dunn và McLetchie báo cáo cáo rằng alloxan có khả năng gây ra ĐTĐ ở động vật [37] Alloxan gây ĐTĐ bằng cơ chế dựa trên sự phá hủy tế bào β đảo tụy dẫn đến làm suy giảm số lượng cũng như chất lượng insulin được tiết ra sau

đó Điều này được gây ra bởi 2 tác dụng riêng biệt của alloxan: 1: ức chế có chọn lọc sự bài tiết insulin gây ra bởi sự tăng glucose máu thông qua ức chế thụ thể glucokinase, 2: gây ra sự hình thành ROS dẫn đến hoại tử có chọn lọc các tế bào β [6],[122] Alloxan có thể gây độc tính ở trên thận vì phạm vi liều hiệu quả của nó rất hẹp nên ít được sử dụng [116]

1.1.5.2 Mô hình ăn chế độ ăn giàu chất béo

Béo phì sẽ phát triển ở các loài gặm nhấm khi chúng được ăn một chế độ ăn nhiều chất béo (40-60% tổng lượng calo) Các mô hình này sẽ có đặc điểm là gây thừa cân, béo phì, rối loạn dung nạp glucose và kháng insulin Độ tuổi thích hợp nhất của các loài gặm nhấm để gây ĐTĐ bằng mô hình này là 6-8 tuần tuổi Sau khoảng 4 tuần, các biểu hiện đặc trưng của ĐTĐ đã xuất hiện tuy nhiên thời gian cho ăn càng lâu thì các đặc trưng của kháng insulin càng tăng lên Mức độ tăng đường huyết phụ thuộc vào khối lượng và loại chất béo cũng như thời gian cho ăn chất béo cao [101]

1.1.5.3 Mô hình kết hợp chế độ ăn giàu chất béo và STZ

Với mô hình này, chuột được cho ăn chế độ ăn giàu chất béo để tạo ra đề kháng insulin sau đó sẽ tiêm STZ để gây ra rối loạn chức năng tế bào β đảo tụy Mô hình này sao chép cơ chế bệnh sinh tương tự như cơ chế bệnh sinh ở người bị ĐTĐ typ 2 [31] Mặc dù thời gian để phát triển ĐTĐ tương đối dài (8 tuần), và có nhiều cách tiếp cạnh phương pháp này bằng cách sử dụng các loại chất béo khác nhau kết hợp với các mức liều STZ từ thấp đến trung bình nhưng tỉ lệ thành công của mô hình này cao hơn so với các mô hình khác Do đó, mô hình kết hợp chế độ ăn giàu chất béo và STZ có thể là một phương pháp thay thế để gây ĐTĐ typ 2 ở chuột [54]

Ngoài ra, còn có nhiều mô hình gây đái tháo đường ở trên động vật thực nghiệm khác như: mô hình dinh dưỡng bằng fructose, mô hình cảm ứng bởi monosodium gutamate (MSG), mô hình kết hợp STZ và nicotinamid [54], mô hình gây ĐTĐ typ 2 bằng phương pháp di truyền [14]

1.2 Tổng quan về cây Xấu hổ

Cây Xấu hổ hay còn có tên gọi là cây mắc cỡ, cây thẹn, cây trinh nữ, hàm tu

thảo; có tên khoa học là Mimosa pudica L, họ Đậu – Fabaceae [23]

Hoa: mọc ở nách lá, có màu hồng và thường hình cầu

Quả: hình trám, có gai trên các vết khâu [23]

Hạt: gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1,5mm [2]

1.2.2 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Dịch chiết lá chứa hàm lượng flavonoid toàn phần và phenolic toàn phần cao

nhất và cao hơn đáng kể so với các dịch chiết từ các phần khác của cây Có sự khác biệt giữa flavonoid toàn phần và phenolic toàn phần giữa các bộ phận của cây, flavonoid cao hơn đáng kể so với phenolic toàn phần trong các dịch chiết [55] Dịch chiết toàn cây cho thấy có sự có mặt của 2'-hydroxy flavanon, 6-hydroxy flavon, ethyl gallat, catechin and gallic acid [73]

Trong dịch chiết của lá có sự hiện diện của một số thành phần có hoạt tính như: mimosin, terpenoid, flavonoid, glycoside, alkaloid, quinin, phenol, tannin, saponin, and coumarin [44]

Rễ có chứa flavonoid, phytosterol, alkaloid, amino acid, tannin, glycosid, and acid béo [78]

Dịch chiết hạt chứa phenol và flavonoid [92], d-xylose and d-glucuronic acid [61]

Cây Xấu hổ có chứa 1 loại alkaloid độc có tên là mimosin và một lượng đáng

kể selen [2]

Trên thế giới, cây Xấu hổ đã được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều công dụng khác nhau như điều trị tiêu chảy, bệnh lỵ amip, nhiễm trung tiết niệu, cẩm máu, các bệnh phụ khoa cũng như thần kinh Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã chỉ ra cây Xấu hổ có nhiều tác dụng dược lý bao gồm: tác dụng làm lành vết thương của dịch chiết methanol chồi và rễ; tác dụng kháng khuẩn; giảm đau và chống viêm, chống độc gan và hạ glucose máu của dịch chiết ethanol của lá; dịch chiết từ rễ cây Xấu hổ có tác dụng chống vô sinh và dịch chiết hạt của cây Xấu hổ có tác dụng điều trị giun sán [23]

1.3 Các nghiên cứu liên quan đến tác dụng hạ glucose máu của cây Xấu hổ

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới liên quan đến tác dụng hạ glucose máu của cây Xấu hổ

Nghiên cứu của Piyapong Yupparach, Ampa Konsue đã tiến hành đánh giá tác dụng hạ đường huyết và lipid máu của dịch chiết ethanol của cây Xấu hổ trên chuột bình thường và chuột được gây ĐTĐ bằng streptozotocin Kết quả đã cho thấy dịch chiết ethanol của cây Xấu hổ ở liều 500mg/kg có tác dụng hạ đường huyết cũng như giảm nồng độ cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-C và tăng HDL-C ở trên

chuột [83]

S T Tasnuva và các cộng sự (2019) trong nghiên cứu của mình đã cho thấy cây Xấu hổ có tác dụng ức chế enzym α- glucosidase, ngăn cản sự hấp thu glucose vào ruột, có tác dụng điều trị đái tháo đường typ 2 một cách an toàn với các thành phần có hoạt tính như stigmasterol, quercetin and avicularin Giá trị IC50 của stigmasterol trong nghiên cứu này là 91,08 μg mL-1 so với acarbose là 351,02 μg

mL-1, do đó cho thấy hiệu lực gấp 3,8 lần so với acarbose Nghiên cứu cũng chỉ ra quercetin mạnh hơn acarbose 4,6 lần, ngoài ra quercetin còn có nhiều tác dụng như

hạ glucose máu, bảo vệ tuyến tụy khỏi stress oxy hóa trong khi acarbose chỉ có tác dụng hạ glucose máu bằng cách ức chế hấp thu carbonhydrat Tác dụng ức chế của avicularin lên α - glucosidase khá tốt (IC50 481,7 ± 0,7 μg mL-1) mặc dù không cao hơn các hợp chất kia (có thể do số lượng và vị trí nhóm hydroxyl không thuận lợi như quercetin), tuy nhiên, nó cũng cho thấy tiềm năng trong việc kiểm soát đường huyết sau ăn ở bệnh nhân đái tháo đường [131]

Nghiên cứu của Subramani Parasuraman và các cộng sự (2019) đã cho thấy tác dụng hạ đường huyết và lipid máu đáng kể của dịch chiết methanol của lá cây Xấu hổ với các liều 125mg/kg, 250mg/kg và 500mg/kg trên chuột bị gây đái tháo đường bằng streptozotocin khi so sánh với nhóm đối chứng sau 1 tuần Dịch chiết lá cây Xấu hổ cũng có tác dụng ức chế các thay đổi sinh hóa do STZ gây ra trên chuột, cải thiện những tổn thương trên mô ở tụy tương tự như tác dụng của glybenclamid Tác dụng này có thể là do thành phần flavonoid, các phenolic, alkaloid cũng như saponin có trong dịch chiết methanol [95]

Một nghiên cứu khác của Deepa Rajendiran và các cộng sự (2017) đã cho thấy dịch chiết ethanol của cây Xấu hổ có khả năng hồi phục các hoạt động của các enzym liên quan đến việc chuyển hóa glucose và glycogen Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết là thông qua việc tăng cường sản xuất insulin làm tăng enzym phân hủy và giảm enzym tổng hợp glucose Cụ thể, hoạt động của các enzym hexokinase, phosphofructokinase và pyruvate kinase giảm đáng kể ở chuột bị đái tháo đường khi so sánh với nhóm đối chứng Tuy nhiên sau khi được điều trị bằng dịch chiết ethanol của lá cây Xấu hổ và metformin thì hoạt động của các enzym này

được đảo ngược về mức bình thường Enzym glucose-6-phosphatase và fructose 1,6–bisphosphatase, hai enzym quan trọng trong quá trình tân tạo đường, được báo cáo tăng đáng kể ở chuột bị bệnh khi so sánh với chuột bình thường Khi chuột được cho uống dịch chiết ethanol của lá cây Xấu hổ liều 300mg/kg và metformin, hoạt động của hai enzym này được giảm xuống gần với mức bình thường [34] Myoinositol – một chất được phân lập từ dịch chiết methanol của thân của

Mimosa pudica L đã được tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ đường huyết

trên chuột Các kết quả nghiên cứu cho thấy, ở chuột bị gây rối loạn lipid máu bằng Triton WR-1339, myoinositol (25 và 50 mg/kg) có tác dụng hạ cholesterol máu, trilgycerid và LDL-C máu; myoinositol còn giảm đáng kể mức glucose máu lúc đói (FPG) ở chuột được gây ĐTĐ bằng mô hình kết hợp chế độ ăn giàu chất béo và STZ và giúp bình thường hóa mức tăng đường huyết gây ra bởi các bất thường sinh hóa ở chuột được gây ĐTĐ do đề kháng insulin Nghiên cứu cũng đã tiến hành đánh giá mô bệnh học và kết quả thu được chỉ ra rằng dùng myoinositol (25 và 50 mg/kg) cho chuột bị ĐTĐ cho thấy các mô có phân phối bình thường với cấu trúc gần như đều đặn trong khi chuột không điều trị cho thấy có nhiều tổn thương ở mô tim, gan, thận [112]

1.3.2 Nghiên cứu trong nước liên quan đến tác dụng hạ glucose máu của cây Xấu hổ

Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu trên cây Xấu hổ về những tác dụng như

an thần, giải lo âu; điều trị hen hay thử hoạt tính kháng khuẩn Tuy nhiên các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây Xấu hổ vẫn còn rất ít

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Huyền và cộng sự đã cho thấy dịch chiết nước của lá cây Xấu hổ có tác dụng ức chế α-glucosidase và chống oxy hóa tốt Bên cạnh

đó dịch chiết nước lá cây Xấu hổ cũng có khả năng giảm đáng kể nồng độ glucose máu và cân nặng ở chuột bị đái tháo đường khi so sánh với nhóm đối chứng [74]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Mẫu dược liệu là lá và cành mang lá của cây Xấu hổ được thu hái tại Nam Định và định danh dưới sự giúp đỡ của bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN Tiêu bản mẫu thu hái được lưu giữ tại trường đại học Y Dược, ĐHQGHN Cao toàn phần và các phân đoạn của cây Xấu hổ được điều chế tại Viện dược liệu

Hình 2 1 Hình ảnh mẫu cây Xấu hổ thu hái

Điều chế cao toàn phần

20kg dược liệu là lá và cành mang lá cây Xấu hổ được ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi ethanol 80% ở nhiệt độ phòng, 3 lần x 3 ngày với tỉ lệ dược liệu/ dung môi 1:10 (kg/l) Lọc loại bã dược liệu gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 1785g cao ethanol 80%

Điều chế cao phân đoạn

Phân tán trong nước nóng sau đó chiết lỏng –lỏng, tỉ lệ 1:2, mỗi lần 2 lít x 3 lần với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, ethylacetat (EtOAc), butanol (BuOH) Gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn (Hình 2.2)

Hình 2 2 Sơ đồ chiết phân đoạn

Thiết kế liều thử cho mẫu nghiên cứu

Dựa trên những nghiên cứu trước đây về tác dụng hạ đường huyết của cây Xấu

hổ [104], [89], liều thử nghiệm trên chuột được lựa chọn như sau:

- Trên mô hình thử nghiệm dung nạp glucose máu đường uống

Thử nghiệm OGTT lần 1: liều 100mg/kg với tất cả các phân đoạn và cao toàn phần Thử nghiệm OGTT lần 2 với phân đoạn tốt nhất: 50mg/kg, 100mg/kg

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Đối tượng nghiên cứu là chuột nhắt trắng chủng Swiss, trưởng thành, khỏe

mạnh, khối lượng 20 ± 2g do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cấp Chuột được nuôi

20 kg

ổn định 7 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh

dịch tế trung ương cấp, uống nước tự do

2.1.3 Hóa chất và thuốc thử

- Streptozotocin (STZ) lọ 1g (S0130-1G, Sigma aldrich, Singapore)

- Dung dịch citrat pH 4,5 (pha từ acid citric monohydrat và nitri citrat dihydrat)

- Dung dịch đệm PBS lọ 500ml (Fisher Bioreagents, USA)

- 1,1,3,3-tetramethoxypropane (108383-100ML, Sigma aldrich, Singapore)

- Gliclazid (biệt dược Diamicron 60mg) của Les Laboratoires Servier Industrie – Pháp, lô SX: VN 20549 - 17

- ELISA Nephrat kit (Thermo Fisher Scientific, USA)

- Dung dịch đệm natri photphat (pH 7,0) dung dịch GSH 10 mmol/L, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), natri azide, glutathione reductase

- 1-methyl-2-phenylindole 10,3 mmol/l, butylated hydroxytoluene 2μg/mL

- Dung dịch đệm (100 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8,2)

- Các dụng cụ và hóa chất đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm

- Máy đo glucose huyết Acon On Call Plus (Acon Biotech-USA)

- Máy ly tâm lạnh Heraeus Sepatech - Đức

- Máy đo quang phổ UV-VIS U1800 Hitachi - Nhật Bản

- Máy sinh hóa TC 3300 plus (ERBA Diagnostics Mannheim- USA)

- Cân phân tích Mettler moledo Thụy Sĩ độ chính xác 0,1mg

- Máy đo quang phổ (EVO 210, Thermo-Fisher, USA)

- Máy cắt tiêu bản microtome (Leica RM2125, Leica Biosystems - Đức.)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Theo mục tiêu của đề tài nghiên cứu được thiết kế như sau:

Hình 2 3 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm

2.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao toàn phần và các phân đoạn của cây Xấu hổ theo phương pháp dung nạp glucose đường uống (OGTT) trên chuột bình thường

Nguyên tắc

Nghiệm pháp dung nạp glucose (OGTT) được tiến hành theo phương pháp được trình bày trong nghiên cứu của Du Vigneaud và Karr [105] Thử nghiệm OGTT trên chuột được tiến hành với cao ethanol toàn phần và các phân đoạn n - hexan, ethylacetat (EtOAc) và butanol (BuOH) của cao Xấu hổ ở liều 100mg/kg Sau đó phân đoạn có tác dụng tốt nhất sẽ được tiến hành thử nghiệm OGTT lặp lại một lần nữa với liều 50mg/kg và 100mg/kg

Cách tiến hành

- Thử nghiệm OGTT với cao toàn phần và các phân đoạn với liều 100mg/kg Chuột được nuôi ổn định trong vòng 7 ngày bằng thức ăn chuẩn từ viện vệ sinh dịch tễ trung ương, sau đó tiến hành đánh dấu, chia làm 6 nhóm, mỗi nhóm 8

chuột và để nhịn đói qua đêm (chỉ sử dụng nước uống trong suốt quá trình đánh giá)

Lô 1: (Chứng trắng): được cho uống nước

Lô 2: (Chứng dương): uống gliclazid 5mg/kg

Lô 3: uống cao toàn phần ethanol liều 100mg/kg

Lô 4: uống cao phân đoạn n-hexan liều 100mg/kg

Lô 5: uống cao phân đoạn ethylacetat liều 100mg/kg

Lô 6: uống cao phân đoạn butanol liều 100mg/kg

Sau 30 phút cho chuột uống glucose với liều là 2g/kg Kiểm tra và ghi lại mức đường huyết tại các thời điểm 0, 60, 120 phút kể từ lúc chuột được uống glucose Trả lại thức ăn vào lồng sau khi hoàn thiện đánh giá

- Thử nghiệm OGTT trên phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu tốt nhất

Sau khi tiến hành thử nghiệm OGTT với cao toàn phần và các phân đoạn, chọn ra phân đoạn có tác dụng tốt nhất trên glucose máu chuột, sau đó tiến hành thử nghiệm OGTT với phân đoạn tốt nhất đó trên các mức liều 50, 100mg/kg

Chuột được nuôi ổn định trong vòng 7 ngày bằng thức ăn chuẩn từ Viện vệ sinh dịch tễ trung ương, sau đó tiến hành đánh dấu, chia làm 4 nhóm, mỗi nhóm 8 chuột và để nhịn đói qua đêm (chỉ sử dụng nước uống trong suốt quá trình đánh giá)

Nuôi ổn định

Chia lô

uống nước, gliclazid, cao toàn phần và các phân đoạn

Uống glucose 2g/kg

Hình 2 4 Sơ đồ thí nghiệm dung nạp glucose đường uống với cao tổng và các phân

đoạn của cây Xấu hổ

Lô 1: (Chứng sinh lý): được cho uống nước

Lô 2: (Chứng dương): uống gliclazid 5mg/kg

Lô 3: uống cao phân đoạn tác dụng tốt nhất liều 50mg/kg

Lô 4: uống cao phân đoạn tác dụng tốt nhất liều 100mg/kg

Sau 30 phút, chuột được cho uống glucose với liều là 2g/kg Kiểm tra và ghi lại mức đường huyết tại các thời điểm 0, 60, 120 phút kể từ khi cho uống glucose Trả lại thức ăn vào lồng sau khi hoàn thiện đánh giá

Nhóm II: Chuột nhắt trắng được cung cấp một chế độ ăn giàu chất béo với 40% calo trong vòng 8 tuần để gây béo phì Sau đó, những chuột này được tiêm streptozotocin (STZ) để gây ĐTĐ typ 2 STZ được pha loãng trong dung dịch đệm citrat (10 mM, pH 4,5) với liều 50 mg/kg, có nhắc lại liều hằng ngày Bảy ngày sau khi tiêm STZ, đo đường huyết chuột sau 8h khi chuột bị bỏ đói qua đêm Những chuột có đường huyết cao hơn hoặc bằng 10mmol/L [74] sẽ đạt tiêu chuẩn để tiếp tục tham gia nghiên cứu

- Phân lô nghiên cứu

Chuột bị ĐTĐ typ 2 được tiến hành phân nhóm để đánh giá tác dụng hạ đường

huyết, mỗi nhóm gồm 10 con được phân phối ngẫu nhiên

Nhóm 1: Chứng sinh lý: Chuột nhóm I được cho uống nước

Nhóm 2: Chứng bệnh lý: Nhóm chuột bị ĐTĐ được cho uống nước

Nhóm 3: Nhóm chứng dương: chuột bị ĐTĐ và được cho uống gliclazid liều 5mg/kg/ngày hòa tan trong nước

Nhóm 4: Cao Xấu hổ (CXH) 50mg/kg: Chuột bị ĐTĐ và được cho uống cao chiết phân đoạn cây Xấu hổ có tác dụng tốt nhất với liều 1: 50mg/kg/ngày

Nhóm 5: CXH 100mg/kg: Chuột bị ĐTĐ và được cho uống cao chiết phân đoạn cây Xấu hổ có tác dụng tốt nhất với liều 2: 100mg/kg/ngày

Đường huyết của tất cả các động vật được đánh giá mỗi 10 ngày một lần trong vòng 60 ngày Vào ngày 60 của quá trình thí nghiệm, động vật được nhốt trong các lồng trao đổi chất riêng lẻ và mẫu nước tiểu 24 giờ được thu thập (V nước tiểu) để phân tích các thông số nước tiểu (albumin niệu, creatinin niệu, độ thanh thải creatinin) Máu từ động mạch chủ bụng được thu thập trước khi chuột bị giết và được đem đi phân tích các chỉ số sinh hóa máu ( cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-C, HDL-C và creatinin huyết thanh) Giết chuột, mổ lấy thận, đem rửa bằng nước muối đẳng trương lạnh và ngay lập tức đông lạnh trong nitơ lỏng cho đến khi mang đi phân tích (định lượng TNF-α, IL-1β; định lượng MDA, đo hoạt độ enzym chống oxi hóa, mô bệnh học thận)

Hình 2 5 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng của mẫu nghiên cứu có tác dụng

tốt nhất trên chuột bị gây ĐTĐ typ 2 bởi STZ

2.2.3 Phương pháp xác định các thông số đánh giá trong thí nghiệm

2.2.3.1 Định lượng glucose huyết tương

Nguyên tắc

Glucose huyết tương được định lượng bằng phương pháp Trinder [99] Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phản ứng:

Glucose + các chất oxy hóa glucose + O2 → acidgluconic + H2O2

H2O2 + 4-aminoantipyrine + peroxydase → phức có màu quinoneimin

Cường độ màu của mẫu tỉ lệ thuận với nồng độ glucose của mẫu

Cách tiến hành

Sát trùng, tạo vết cắt trên đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2

để đo glucose máu bằng máy Acon On Call Plus Sát trùng và cầm máu

Thông số đánh giá

Giá trị glucose máu đơn vị là mmol/l được đo bằng máy Acon On Call Plus Mẫu nghiên cứu được coi là có tác dụng hạ glucose máu nếu giá trị glucose máu thấp hơn so với lô chứng bệnh lý đạt mức ý nghĩa thống kê (p< 0,05)

2.2.3.2 Định lượng triglycerid máu, cholesterol toàn phần, LDL, HDL và creatin huyết thanh

Trong bệnh ĐTĐ, rối loạn lipid máu rất phổ biến và là yếu tố quan trọng có liên quan đến sự phát triển các biến chứng của bệnh tiểu đường Để đánh giá tác dụng cải thiện lipid huyết của cao chiết phân đoạn cây Xấu hổ, chúng tôi tiến hành định lượng triglycerid máu, cholesterol toàn phần, LDL-C, HDL-C Định lượng creatin huyết thanh để phục vụ cho việc tính toán độ thanh thải creatinin

Nồng độ TC, TG, HDL-C, LDL-C đơn vị tính là mmol/L, creatinin máu đơn

vị μmol/L được đo bằng máy sinh hóa TC 3300 plus (ERBA Diagnostics Mannheim- USA)

Mẫu nghiên cứu được coi là có hiệu quả cải thiện các chỉ số lipid máu và creatinin huyết thanh nếu triglycerid máu, cholesterol toàn phần, LDL-C, creatin huyết thanh thấp hơn và/ hoặc HDL-C cao hơn so với lô chứng bệnh lý đạt mức ý nghĩa thống kê (p< 0,05)

2.2.3.3 Đánh giá tác dụng cải thiện biến chứng thận trên chuột bị ĐTĐ typ 2

Để đánh giá tác dụng cải thiện chức năng thận của cao chiết phân đoạn cây Xấu hổ, nước tiểu 24h của chuột được thu thập để phân tích các thông số nước tiểu,

hệ số thanh thải creatinin, các cytokin viêm, quá trình stress oxy hóa và vip phẫu

mô bệnh học thận

Định lƣợng creatinin niệu, microalbumin niệu, hệ số thanh thải creatinin

Tiến hành

Các mẫu nước tiểu 24 giờ được thu thập từ mỗi con chuột bị bệnh đái tháo đường được ly tâm ở mức 2000 vòng trong 10 phút Nồng độ microalbumin, creatinin trong nước tiểu được đo bằng bộ kit ELISA Nephrat Tất cả các phân tích được thực hiện theo các hướng dẫn của nhà sản xuất

UCr: nồng độ creatinin trong nước tiểu (μmol/L)

Vnước tiểu: thể tích nước tiểu thu thập (mL)

SCr: nồng độ creatinin trong huyết thanh thu thập tại thời điểm chính giữa khoảng thời gian thu thập nước tiểu (μmol/L)

T: thời gian thu thập nước tiểu (phút)

Mẫu nghiên cứu được coi là có tác cải thiện các thông số nước tiểu trên chuột khi nồng độ microalbumin niệu thấp hơn và hoặc creatinin / độ thanh thải creatinin cao hơn so với lô chứng bệnh lý đạt mức ý nghĩa thống kê (p< 0,05)

Định lƣợng TNF-α và IL-1β

Nguyên tắc

Các dấu ấn sinh học của quá trình viêm như TNF-α, và IL-1β liên quan đến sự tiến triển của biến chứng thận ở bệnh đái tháo đường thông qua sự thay đổi tính thấm thành mạch, cơ chế giãn mạch và co mạch, chất nền ngoại bào, sự gia tăng của trung mô, nội mô và tế bào cơ trơn mạch máu, cũng như cảm ứng và gây độc tế bào, quá trình apoptosis và hoại tử trong cơ chế bệnh sinh và sự tiến triển của biến chứng thận ở bệnh ĐTĐ [133] Do đó, định lượng TNF-α, và IL-1β có thể cho thấy mức

độ cải thiện biến chứng thận ở chuột bị ĐTĐ typ 2 do STZ

Mô thận được nghiền đồng nhất trong dung dịch đệm HCl 10 mmol/L (pH 7.4) chứa 2 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 0,01% Tween 80, 1 mmol/L PMSF và ly tâm ở mức 9000 vòng trong 30 phút ở 4oC Dịch nổi thu được sử dụng để xác định nồng độ các cytokin Các cytokin: yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), và IL-1β được đo dựa vào các kit ELISA Các mẫu được phân tích thành hai lần theo hướng dẫn của nhà sản xuất [132]

Tiến hành

96 đĩa được ủ qua đêm ở 4oC với 100μg kháng thể đơn dòng TNF-α hoặc 1β (1μg/ml) trong dung dịch đệm phosphat ( PBS, pH= 7,2) Tiến hành rửa đĩa 4 lần bằng đệm rửa ( PBS 1+ 0,05% Tween 20), thấm khô, ủ với dung dịch khóa bao gồm PBS và 1% albumin huyết thanh bò trong 1 giờ Sau đó rửa đĩa và thêm 100μl mỗi mẫu hoặc chất chuẩn đồng nhất Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2h Rửa đĩa, bổ sung 100μL kháng thể phát hiện TNF-α hoặc IL-1β (0,25μg/mL), kháng thể được ủ ở nhiệt độ phòng trong 2h Thêm 100μL avidin kết hợp với peroxydase cải ngựa (1:2000) và ủ trong 30 phút Phát hiện màu bằng 2,2’ – Acinobis [3-ethylbenzothiazone 6 –sulfonic acid], để ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự thay đổi màu Màu sắc được theo dõi bằng đầu lọc vi tấm ở bước sóng 405nm Đường chuẩn Elisa được thành lập bằng cách sử dụng TNF- α và IL-1β của chuột được pha trong dung dịch đệm PBS

IL-Thông số đánh giá

Các giá trị TNF-α, và IL-1β đơn vị ng cytokin/mg protein được đo bằng bộ kit ELISA (Thermo Fisher Scientific, USA )

Mẫu nghiên cứu được coi là có tác dụng chống viêm nếu hàm lượng TNF-α,

và IL-1β thấp hơn so với lô chứng bệnh lý đạt mức ý nghĩa thống kê (p< 0,05)

Xác định hoạt độ ức chế peroxy hóa lipid

Nguyên tắc

Trong bệnh tiểu đường, stress oxy hóa là một trong những nguyên nhân dẫn đến các biến chứng trong đó có biến chứng thận Malonyldialdehyde (MDA) - sản phẩm của quá trình peroxy hóa màng tế bào, là một trong những marker của quá trình stress oxy hóa Định lượng MDA có thể xác định được mức độ tổn thương