NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) NUÔI CẤY IN VITRO. LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Ý ngh a khoa học Kết quả của luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về ảnh hưởng của elicitor lên khả năng t ch lũy oleanolic acid trong tế

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ Á KIM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG

VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO ĐINH

LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) NUÔI CẤY

IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HUẾ - NĂM 2022

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ Á KIM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG

VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO

ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS)

NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số: 9 42.02.01

HUẾ - NĂM 2022

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Phòng đào tạo sau đại học, các Thầy Cô giáo Khoa Sinh, Bộ môn Công nghệ sinh học - Trường đại học Khoa học Huế, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Quảng Nam Em xin chân thành cảm ơn sự giúp

đỡ quý giá đó

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Văn Tường Huân, PGS TS Võ Thị Mai Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập; xin cảm ơn các anh chị công tác tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học Huế; Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc đến GS TS Nguyễn Hoàng Lộc – Người Thầy giáo mẫu mực, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện luận án này

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cho đến khi hoàn thành luận án này

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!

Thừa Thiên Huế, tháng 4 năm 2022

Phan Thị Á Kim

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và nghiêm túc, tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng

Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả luận án

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC i

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3

4 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 3

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 4

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ 5

1.1.1 Đặc điểm thực vật 5

1.1.2 Thành phần hóa học của cây đinh lăng lá nhỏ 7

1.1.3 Giá trị dược lý của cây đinh lăng lá nhỏ 8

1.2 ELICITOR 10

1.2.1 Khái niệm 10

1.2.2 Phân loại 10

1.2.3 Cơ chế tác dụng của elicitor 12

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình k ch kháng 14

1.2.5 Nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp 17

1.2.6 Một số thành tựu trong sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật được xử lý elicitor 19

1.3 TỔNG QUAN VỀ OLEANOLIC ACID 25

1.3.1 Vai trò và phân bố 25

1.3.2 Một số công dụng của oleanolic acid 25

1.3.3 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý 28

1.3.4 Sinh tổng hợp oleanolic acid 29

1.3.5 Các nghiên cứu sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật 31

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐINH LĂNG 36

1.4.1 Nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ 36

1.4.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ 39

1.4.3 Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ 40

1.4.4 Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ 41

Chương 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 43

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 43

2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 43

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.2.1 Hóa chất và môi trường nuôi cấy 45

2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của callus 46

2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của tế bào 47

2.2.4 Xử lý elicitor 48

2.2.5 Định lượng oleanolic acid 49

2.2.6 Xử lý thống kê 50

Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52

3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA CALLUS 52

3.1.1 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên sinh trưởng của callus 52

3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của callus thân 57

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO 60

3.2.1 Nuôi cấy tế bào 60

3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon 62

3.2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 63

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ 66

3.3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men 66

3.3.2 Ảnh hưởng của methyl jasmonate 71

Chương 4.BÀN LUẬN 76

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA CALLUS 76

4.1.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 76

4.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 77

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO VÀ HÀM LƯỢNG OLEANOLIC ACID 78

4.2.1 Nuôi cấy tế bào huyền phù 78

4.2.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon 79

4.2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 80

4.2.4 T ch lũy oleanolic acid trong tế bào 81

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ 83

4.3.1 Đặc điểm của elicitor 83

4.3.2 Ảnh hưởng của một số elicitor lên sinh trưởng tế bào 85

4.3.3 Ảnh hưởng của một số elicitor lên t ch lũy oleanolic acid 86

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92

KẾT LUẬN 92

KIẾN NGHỊ 92

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

PHỤ LỤC 110

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

BAP 6-benzyl aminopurine

DW Dry weight (khối lượng khô)

FW Fresh weight (khối lượng tươi)

HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao) IBA

IC50

3-indolebutyric acid Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối đa một nữa)

MS Murashige and Skoog (1962)

SA

SOD

Salicylic acid Superoxide dismutase

TPA

TRYP

12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate Tryptone

YE Yeast extract (dịch chiết nấm men)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp 11 Bảng 2.1 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 45 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng sinh trưởng

của callus lá sau 5 tuần nuôi cấy 53

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus

thân sau 5 tuần nuôi cấy 54

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus

rễ sau 5 tuần nuôi cấy 56

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của TRYP lên khả năng sinh trưởng của callus thân sau

5 tuần nuôi cấy 58

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của CAS lên khả năng sinh trưởng của callus thân sau 5

tuần nuôi cấy 59

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng của tế bào đinh

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của oleanolic acid 28

Hình 1.2 Sinh tổng hợp cation dammarenyl (I), oleanyl, lupenyl và lupeol từ squalene 29

Hình 1.3 Sinh tổng hợp UA (4) và OA (5) từ cation oleanyl 30

Hình 1.4 Chu trình tổng hợp oleanolic acid ở thực vật 30

Hình 2.1 Cây đinh lăng lá nhỏ tự nhiên 43

Hình 2.2 Callus có nguồn gốc từ lá sau 5 tuần nuôi cấy 44

Hình 2.3 Callus có nguồn gốc từ thân sau 5 tuần nuôi cấy 44

Hình 2.4 Callus có nguồn gốc từ rễ sau 5 tuần nuôi cấy 44

Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm 51

Hình 3.1 Callus lá sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy 53

Hình 3.2 Callus thân sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy 55

Hình 3.3 Callus rễ sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 2 mg/L NAA và 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy 56

Hình 3.4 Callus thân sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 0,8 g/L TRYP sau 5 tuần nuôi cấy 58

Hình 3.5 Callus thân sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 0,4 g/L CAS sau 5 tuần nuôi cấy 60

Hình 3.6 Đường cong sinh trưởng của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS chứa 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN 61

Hình 3.7 Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào đinh lăng lá nhỏ 61

Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC phân t ch hàm lượng oleanolic acid A Chất

chuẩn oleanolic acid, B Mẫu lá, C Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L 2,4-D, D Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa 1,25 mg/L KIN và 1 mg/L 2,4-D 66

Hình 3.9 Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C)

của tế bào đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 3 g/L lúc bắt đầu nuôi cấy 70

Hình 3.10 Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô

(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 1 g/L sau 6 ngày nuôi cấy 70

Hình 3.11 Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô

(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 10 µM lúc bắt đầu nuôi cấy 74

Hình 3.12 Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô

(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 100 µM sau 3 ngày nuôi cấy 74

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cùng với sự phát triển của nền y học, việc nghiên cứu chiết xuất các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để tạo ra những loại thuốc mới phục vụ sức khỏe con người ngày càng được quan tâm Nhiều dược liệu có nguồn gốc thực vật đã và đang được sử dụng rộng rãi như là nguồn cung cấp các loại thuốc chữa bệnh hoặc thực phẩm chức năng cho đại đa số người dân trên thế giới Đinh lăng còn gọi là cây gỏi cá, nam dương sâm, có tên khoa học là

Polyscias spp., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), là một loài cây thuốc đã

được đưa vào dược điển Việt Nam Trong số các loài đinh lăng thuộc chi

Polyscias, đinh lăng lá nhỏ (P fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử

dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu [4] Trong đinh lăng có các loại alkaloid, glycoside, saponin, flavonoid, tannin, vitamin B1, và amino acid như methionine, lycine, cysteine và các amino acid thiết yếu khác Đinh lăng chứa các hợp chất saponin tương tự như

ở nhân sâm Trong một số trường hợp, rễ củ đinh lăng được thay thế cho nhân sâm như một nguyên liệu dễ tìm ở Việt Nam [11]

Đặc biệt, trong thành phần của đinh lăng, oleanolic acid là một triterpene thuộc nhóm saponin có hoạt tính sinh học cao, phổ biến trong nhiều loài thực vật Oleanolic acid không chỉ tồn tại như một phân tử tự do ở thực vật, mà còn là tiền chất aglycone của các saponin triterpenoid Những tiềm năng to lớn của oleanolic acid trong y học như khả năng kháng viêm, bảo vệ gan, chống khối u, điều trị tiểu đường, chống cao huyết áp, [64, 108] đòi hỏi phải

có những hướng sản xuất phù hợp để thương mại hóa sản phẩm đáp ứng nhu cầu sử dụng

Hiện nay, nhu cầu về oleanolic acid trong dược phẩm đang tăng cao, trong khi đó, nguồn nguyên liệu tự nhiên không ổn định do việc nhân trồng cây đinh lăng, chủ yếu theo phương pháp truyền thống (giâm hom), thời gian thu hoạch khá lâu, t nhất từ 3-5 năm trở lên, năng suất thường thấp, phụ thuộc rất lớn vào điều kiện thời tiết, mùa vụ, đất đai, diện t ch canh tác, nên trữ lượng của chúng ngày càng giảm, không đáp ứng đủ nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược Vì vậy, những nghiên cứu thu nhận oleanolic acid bằng phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là một hướng rất được quan tâm, hứa hẹn tiềm năng to lớn

Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt

t nh sinh học t ch lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro thường là tương

đương hoặc cao hơn nhiều lần so với bộ phận t ch lũy chúng ở cây ngoài tự nhiên [118] Thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, các tiền chất hoặc các elicitor (chất k ch kháng) trong môi trường nuôi cấy tế bào có ảnh hưởng đến việc tăng hiệu suất tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp, rút ngắn thời gian và giảm chi ph sản xuất

Hiện nay, các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ [5,

101], nuôi cấy tế bào huyền phù [8] và nuôi cấy rễ tơ [3] để sản xuất saponin

từ cây đinh lăng lá nhỏ cũng đang được quan tâm Tuy nhiên, các nghiên cứu

về sử dụng elicitor trong quá trình nuôi cấy tế bào cây đinh lăng lá nhỏ lại

chưa được thực hiện nhiều Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng

(Polyscias fruticosa (L.) Harms) nuôi cấy in vitro” được thực hiện nhằm

làm cơ sở cho việc sản xuất một số hợp chất có giá trị dược liệu sau này

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định môi trường nuôi cấy và elicitor thích hợp để tăng khả năng tích lũy oleanolic acid của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ

3 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của callus đinh lăng lá nhỏ

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và t ch lũy oleanolic acid của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ, bao gồm:

+ Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, chất điều hòa sinh trưởng)

+ Ảnh hưởng của các elicitor (dịch chiết nấm men và methyl jasmonate)

Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây đinh lăng lá nhỏ được thực hiện

tại Phòng th nghiệm của Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

- Phân t ch hàm lượng oleanolic acid được thực hiện tại Phòng th nghiệm của Trường Đại học Y dược, Đại học Huế và Công ty CP Dược TW Huế

4 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đây là công trình đầu tiên sử dụng các elicitor (YE và MeJA) để nghiên cứu cải thiện khả năng t ch lũy oleanolic acid của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ Nghiên cứu đã xác định được YE ở nồng độ 1 g/L bổ sung sau 6 ngày nuôi cấy cho hiệu quả t ch lũy oleanolic acid cao nhất (164,34 mg/g khối lượng khô), gấp 6,47 lần so với đối chứng không xử lý elicitor (25,40 mg/g)

Xử lý bằng MeJA cũng cho hiệu quả cao nhưng thấp hơn YE, MeJA ở nồng

độ 100 µM bổ sung sau 3 ngày nuôi cấy cho hiệu quả t ch lũy oleanolic acid cao gấp gần 5,2 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (131,83 mg/g khối lượng khô)

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

Ý ngh a khoa học

Kết quả của luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về ảnh hưởng của elicitor lên khả năng t ch lũy oleanolic acid trong tế bào cây đinh lăng lá nhỏ; đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật

Ý ngh a th c tiễn

Đây là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ

1.1.1 Đặc điểm th c vật

Cây đinh lăng lá nhỏ có tên khoa học là P fruticosa (L.) Harms thuộc họ

Nhân sâm (Araliaceae) Ở Việt Nam, loài này còn có các tên khác như đinh lăng hương, đinh lăng lá xẻ, cây gỏi cá, và nam dương sâm [11, 12]

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây đinh lăng lá nhỏ thuộc cây thân bụi có khả năng mọc xanh tốt quanh năm, chiều cao của cây từ 0,5-2 m Thân cây có hình tròn, vỏ cây sần sùi nhưng không có gai Trên thân cây thường có những vết sẹo lồi to do lá rụng, thân cây thường có màu nâu xám Cây đinh lăng lá nhỏ sử dụng làm thuốc chủ yếu là những cây đinh lăng nhỏ hay còn gọi là đinh lăng nếp, có thân gỗ nhỏ, chiều cao cây thường từ 0,8-1,5 m, thân cây cũng không có gai

Cây đinh lăng lá nhỏ thuộc họ lá mọc cách, kép lông chim 2-3 lần Chiều dài lá thường từ 20-40 cm Những lá chét thường chia thùy nhọn không đều, mặt trên của lá có màu xanh, phần mặt dưới của lá thường bóng hơn Phần gốc lá và phiến lá có hình dáng thuôn nhọn, dài từ 3-5 cm, rộng từ 0,5-1,5 cm Gân lá thường có hình lông chim, phần gân ch nh thường nổi rõ và có thêm 3 đến 4 cặp gân phụ chia theo từng đường lá Cuống lá đinh lăng lá nhỏ thường dài, có hình tròn hoặc màu xanh đậm, đôi khi có xuất hiện những đốm lá hình nhạt ở trên cuống Đáy cuống phình to ra thành bẹ lá

Hoa của cây đinh lăng lá nhỏ thường mọc thành cụm hoa và tụ lại ở phía đầu của ngọn cành Hoa đinh lăng lá nhỏ thường là hoa lưỡng tính, mẫu 5

K ch thước hoa khá nhỏ, cuống hoa có hình trụ màu xanh khoảng 0,3-0,4 cm

Lá bắc thường mọc ở gốc cuống của hoa và có hình tam giác nhọn

Bao hoa: đài hoa chỉ có 5 răng và chia đều ra các ph a, thường có màu xanh và có hình bầu dục, phần đỉnh thường thuôn nhọn Cánh hoa thường dài từ 0,25-0,3 cm, chiều rộng khoảng 0,1-0,15 cm, ở giữa cánh hoa thường

có gân

Bộ nhị: có 5 nhị rời và đều, xếp xen kẽ giữa các cánh hoa Chỉ nhị có dạng sợi mảnh, thường có màu trắng và chiều dài khoảng 0,1-0,15 cm Bao phấn bên ngoài là 2 ô thuôn dài màu vàng nứt dọc theo chiều dài và hướng vào bên trong, phần bao phấn đ nh với gốc hoa Hạt phấn tách rời và thường

có hình cầu 3 lỗ, hạt phấn có màu vàng nhạt và có đường kính từ 30-35 cm

Bộ nhụy: có từ 2-3 lá noãn Phần bầu dưới có 2-3 ô, mỗi ô chứa một noãn Đỉnh noãn trung trụ, có tới 2-3 vòi nằm úp sát vào nhau và thẳng đứng, noãn thường có màu xanh đậm, dài khoảng 1 cm Phần đầu nhiều hình điểm Quả đinh lăng lá nhỏ thuộc dạng quả hạch, có hình bầu dục với chiều dài khoảng 4-6 mm, chiều rộng khoảng 3-4 mm Trên đỉnh quả thường vẫn còn lại vòi nhụy mọc choãi ra, đài vẫn còn Quả đinh lăng lá nhỏ thường có màu xanh đậm, trên vỏ quả xuất hiện những nốt tròn có màu xanh nhạt [11, 12]

1.1.1.2 Đặc điểm phân bố và sinh thái

Chi Polyscias có gần 100 loài trên thế giới, phân bố rải rác ở các vùng

cận nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương Ở Việt Nam, đinh lăng cũng có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá… để làm cảnh, làm thuốc và gia vị

Đinh lăng lá nhỏ là loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, trồng được trên nhiều loại đất; thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn

có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai Trồng bằng cành sau 2-3 năm có

hoa quả Đinh lăng lá nhỏ có khả năng tái sinh vô t nh khỏe, thường được trồng bằng phương pháp giâm cành hay trồng trực tiếp từ đoạn thân hay cành Đinh lăng có nhiều loài khác nhau, tuy nhiên, đinh lăng lá nhỏ là quan trọng nhất, được sử dụng làm thuốc, làm gia vị và làm cây cảnh [30]

1.1.2 Thành phần hóa học của cây đinh lăng lá nhỏ

Chi Polyscias là chi lớn thứ hai trong họ Nhân sâm, cho đến nay trên thế giới chỉ có một số loài của chi Polyscias được nghiên cứu thành phần hóa học như P filicifolia Bail., P scutellaria (Burm f) Merr., P amflifolia (Baker) Harms., P dichroostachya Baker., P fulva, P murayi Harms và Polyscias sp Nov Trong số này, loài P fructicosa (L.) Harms được quan tâm và nghiên

cứu nhiều nhất [94]

Năm 1998, Huan và cs đã phân lập được 11 saponin triterpen bao gồm ladyginoside A, zingibroside R1, polysicoside A, polysicoside B, polysicoside

C, 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D-glucuronopyranosyl

oleanolic-28-O--D-glucopyranosyl ester, polysicoside D, polysicoside E, polysicoside F, polysicoside G, và polysicoside H [49]

Thai và cs (2016) đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất, trong

đó có 1 hợp chất mới từ lá cây đinh lăng lá nhỏ Các hợp chất này gồm 3 saponin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1->4)-β-D-glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester, polyscioside D, polyscioside I (chất mới); và 3 flavonoid glycoside afzelin, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1->6)-β-D-glucopyranosidevà quercitrin [112]

Lá cây đinh lăng lá nhỏ trồng tại An Giang được thu mẫu, chiết và tách phân đoạn bằng kỹ thuật chiết ngấm kiệt và chiết lỏng-lỏng Kết quả phân lập được 3 hợp chất saponin triterpen bao gồm: Ladyginosid A, acid 3-O-[β-D-

glucopyranosyl-(1β4)]- β-D-(6-O-methyl) glucurono-pyranosyloleanolic, O- β -D-glucuronopyranosy-loleanolic 28-O-β-D-glucopyra-nosyl ester [14]

3-1.1.3 Giá trị dƣợc lý của cây đinh lăng lá nhỏ

Tăng lực-chống nhược sức

Cao đinh lăng có tác dụng tăng lực ở khoảng liều <180 mg/kg đƣợc xác định bằng hai nghiệm thức thực hiện trên chuột nhắt: chuột bơi kiệt sức của Brekhman và chuột leo dây của Cabured [12]

Chống xơ vữa động mạch

Cao đinh lăng (90-180 mg/kg thể trọng) làm giảm sự gia tăng cholesterol máu và lipid toàn phần trong huyết thanh của động vật bị gây xơ vữa động mạch thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu cholesterol (gây tăng cholesterol ngoại sinh) và bằng Tween 80 (gây tăng cholesterol nội sinh) [12]

Kháng khuẩn

Tác dụng kháng khuẩn của cao đinh lăng trên các chủng Staphylococus

mạnh hơn trên các chủng vi khuẩn và nấm mốc khác [12]

lý nhƣ: thời gian ngủ bị rút ngắn (giảm 30% thời gian ngủ so với nhóm bình

thường), có hành vi tấn công khi tiếp xúc với chuột lạ, trạng thái thụ động [12]

Chống oxy hóa

Cao lá và saponin lá thể hiện tác dụng ức chế peroxide hóa lipid màng tế bào não, trong khi cao rễ và saponin rễ thì không có tác dụng này Cao rễ chỉ thể hiện tác dụng ức chế peroxide hóa lipid trong trường hợp có xúc tác của

hệ Fenton [12]

Kích thích miễn dịch

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng của đinh lăng trên chức năng miễn dịch tương tự như bột chiết sâm Việt Nam, thể hiện cả trên cơ địa động vật bình thường và trên cơ địa động vật bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid, một chất kìm tế bào thuộc nhóm oxazaphosphorin thường được sử dụng trong liệu pháp chống ung thư [12]

Hạ đường huyết

Luyen và cs (2018) đã đánh giá hiệu quả ức chế amylase và glucosidase của 3-O- [β-d-glucopyranosyl- (1 → 4) -β-d-glucuronopyranosyl] oleanolic acid 28-O-β-d-glucopyranosyl este (PFS), một saponin được phân

α-lập từ lá cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) và tiềm năng hạ đường huyết sau

bữa ăn trên chuột nhắt trắng Các tác giả đã nhận thấy, lá đinh lăng và saponin chính PFS có thể được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị bệnh đái tháo đường

và các biến chứng [70]

Các tác dụng phụ của cây đinh lăng

Ngoài các tác dụng kể trên, việc sử dụng đinh lăng không đúng cách cũng có thể gây ra các tác dụng phụ như: hồi hộp, bồn chồn, nôn nao, tim đập nhanh, hơi đau nhói Một số trường hợp không nên sử dụng loại cây này như phụ nữ đang mang thai hay người bị bệnh gan

1.2 ELICITOR

1.2.1 Khái niệm

Elicitor có thể được định nghĩa là một chất hoặc một hỗn hợp các chất

mà khi đưa một nồng độ phù hợp vào hệ thống tế bào sống sẽ khởi đầu hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất đặc trưng

Sự kích kháng (elicitation) là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng hợp các chất trao đổi do sự thêm vào một lượng nhỏ elicitor [97]

1.2.2 Phân loại

Elicitor được phân loại hoặc dựa trên bản chất tự nhiên của chúng là elicitor phi sinh học và elicitor sinh học, hoặc dựa trên nguồn gốc của chúng

là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh (Bảng 1.1)

Elicitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật, bao gồm các polysaccharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các vi sinh vật (chitin hoặc glucans) và các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào có chức năng gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa hoặc bất hoạt một số các enzyme hoặc các kênh ion Elicitor phi sinh học

là các chất không có nguồn gốc từ sinh vật, chủ yếu là các muối vô cơ và các tác nhân vật lý như ion Cu2+

và Cd2+, Ca2+ và pH cao Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các polysaccharide, polyamine và các acid béo Ngược lại, elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào như là galacturonide hoặc hepta-β-glucoside, [82]

Bảng 1.1 Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp [43]

Phân loại d a tính chất t nhiên của elicitor

có thành phần đã biết nhƣ polysaccharides, glycoproteins, glucans, chitin, chitosan, pectin, alginate, xanthan, elicitin, enzyme bất hoạt,

Dạng chua xác định

có thành phần chƣa đƣợc xác định nhƣ dịch chiết thô nấm men, dịch chiết vi khuẩn, dịch nấm,…

Mannitol, sorbitol, sodium chloride, potassium chloride, cadmium chloride, polyvinyl pyrrolidone,

Elicitor nội

sinh

Có nguồn gốc ở bên trong tế bào nhƣ Jasmonic acid, methyl jasmonate, salicylic acid, acetyl salicylic acid, systemin, …

1.2.3 Cơ chế tác dụng của elicitor

Khi thực vật bị nhiễm bởi các vi sinh vật gây bệnh, sự đáp ứng được kích hoạt nhanh với các phản ứng phòng thủ được điều hòa cả về không gian

và thời gian Các đáp ứng này bao gồm oxy hóa liên kết chéo của các protein thành tế bào, sản xuất phytoalexin, các enzyme thủy phân, phenol hóa các protein thành tế bào và cuối cùng tế bào thực vật chết do mẫn cảm Vi sinh vật xâm nhiễm vào thực vật cảm ứng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt t nh kháng sinh theo cách tương tự các nhân tố stress như chiếu tia UV, sốc thẩm thấu, acid béo, muối vô cơ và ion kim loại nặng Các phân tử kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp được gọi là elicitor Cả elicitor sinh học

và phi sinh học cảm ứng t ch lũy sản phẩm không chỉ ở cây nguyên vẹn mà cả

ở tế bào nuôi cấy như là kết quả của các phản ứng phòng thủ, bảo vệ hay tấn công [82] Một lượng lớn các hợp chất thứ cấp được sản xuất ở thực vật cùng khi có sự xuất hiện của các tác nhân tự nhiên như các vi sinh vật gây bệnh, động vật ăn cỏ và các thực vật cạnh tranh khác Các hợp chất đó được biết như là phytoanticipin, bao gồm saponin, các triterpenoid glycoalkaloid với hoạt tính kháng khuẩn được t ch lũy trong các mô thực vật khác nhau (ví dụ, α-tomatine trong lá cây cà chua, avenacine A-1 trong rễ yến mạch) [116] Một số nghiên cứu chứng minh rằng sự nhận biết đặc hiệu giữa elicitor

là vi sinh vật với các thụ thể thực vật tương ứng gây ra các tín hiệu đặc trưng làm kích hoạt các phản ứng phòng thủ Thụ thể của elicitor thực vật được xác

định đặc t nh đầu tiên là Arabidopsis FLS2, thụ thể này có thể nhận biết tiên

mao của vi khuẩn FLS2 được cho là kích hoạt sự đáp ứng phòng thủ khi xử

lý tế bào nuôi cấy cây Arabidopsis với tiên mao hoặc flg22 (một peptide gồm

22 amino acid) Sau đó nhiều thụ thể của các elicitor khác cũng đã được nghiên cứu [38] Sự nhận biết các elicitor bởi các thụ thể thường gây ra các

phản ứng tiếp theo như sự phosphoryl hóa và dephosphoryl hóa ở màng sinh chất và các protein tế bào chất, các dòng chảy ion, đảo cực ở màng sinh chất, kiềm hóa môi trường ngoại bào và acid hóa môi trường nội bào Các phản ứng này xảy ra trong vòng vài phút đến vài giờ sau khi nhận biết các elicitor

và ngay sau đó k ch hoạt các đáp ứng tiếp theo Sự hoạt hóa các NADPH oxidase (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen) và peroxidase gian bào một cách ồ ạt khi tiếp nhận kích thích cùng với sự tích lũy ROS (Reactive oxygen species) tạm thời có thể tham gia cảm ứng các đáp ứng phòng thủ “trễ”, trong đó có sản xuất các hợp chất thứ cấp [38]

Các dòng trao đổi ion nhanh như dòng K+/H+, dòng Cl- đi ra, và dòng ion

loài thực vật, như lúa hoặc Cupressus lusitanica Tăng nồng độ Ca2+ trong tế bào chất làm hoạt hóa các phản ứng phòng thủ tiếp theo một cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các cảm biến Ca2+, như calmodulin và Ca2+

dependent protein kinase (CDPK) [38]

-Sự phosphoryl hóa protein có thể hoạt hóa trực tiếp các enzyme sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp bằng cách biến đổi hậu dịch mã, hoặc tham gia vào các đợt tín hiệu làm tăng sự biểu hiện của các gen tương ứng Đặc biệt, các protein kinase được hoạt hóa bởi ty thể ở thực vật (MAPK-Mitogen-Activated Protein Kinase) là trung gian hoạt hóa các đáp ứng nói chung sau khi nhận biết mầm bệnh và các elicitor có nguồn gốc từ mầm bênh Một số MAPKs được nghiên cứu trong sự phòng thủ của thực vật là protein kinase

được cảm ứng bởi SA (SIPK: SA-Induced Protein Kinase) hay cảm ứng bởi vết thương (WIPK: Wound-Induced Protein Kinase) ở thuốc lá; MAPK được cảm ứng bởi stress (SAMK: Stress-Activated MAPK) và stress muối (SIMK: Salt-Induced MAPK) ở cỏ linh lăng…Với sự hoạt hóa qua thụ thể trung gian, MAPK được chuyển vị đến nhân để chúng có thể tương tác với các yếu tố phiên mã và cảm ứng sự biểu hiện các gene phòng thủ [38]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá tr nh kích kháng

Một số thông số như nồng độ, loại elicitor, thời gian tiếp xúc với elicitor, độ tuổi nuôi cấy, dòng tế bào, chất điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng và chất lượng của thành tế bào là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản xuất các hợp chất chuyển hóa thứ cấp [81]

Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đóng một vai trò rất quan trọng

trong quá trình kích kháng Các công bố cho thấy xử lý elicitor ở nồng độ cao

đã gây ra phản ứng quá mẫn cảm dẫn đến chết tế bào, chỉ khi nồng độ ở mức tối ưu mới gây ra cảm ứng cần thiết cho quá trình kích kháng

Trên cây nhân sâm, sử dụng 0,1% (w/v) natri clorua giúp hàm lượng saponin và năng suất tăng lên lần lượt khoảng 1,15 và 1,13 lần so với đối

chứng Trong nuôi cấy tế bào cây S miltiorrhiza, xử lý SA ở các nồng độ

khác nhau đã ảnh hưởng đến sự t ch lũy của salvianolic B và caffeic acid Sự

t ch lũy salvianolic B và caffeic acid đã tăng lên khi sử dụng 3,125-25,0 mg/L

SA ở 8 và 96 giờ so với khi xử lý SA ở nồng độ 32,0-50,0 mg/L Sau 96 giờ

xử lý với 3,125-25,0 mg/L SA thì nồng độ của phenolic acid giảm mạnh so với mức sau 8 giờ xử lý nhưng nồng độ t ch lũy vẫn ở mức cao hơn đối

chứng Trong nuôi cấy huyền phù tế bào của cây Gymnema sylvestre, các

nồng độ khác nhau (50, 100, 150, 200 và 250 μM) của MeJA và SA đã được

sử dụng, kết quả hàm lượng gymnemic acid tăng lên khi xử lý với MeJA ở

150 μM và SA ở nồng độ 200 μM Trong nuôi cấy tế bào rễ tơ loài W somnifera, sử dụng MeJA (15 μM) và SA (150 μM) tăng cường sản xuất hàm

lượng withanolide A, withanone và withaferin A [81]

Thời gian tiếp xúc với elicitor: Nuôi cấy tế bào huyền phù loài G

sylvestre xử lý với MeJA nồng độ 150 μM sau 72 giờ cho kết quả hàm lượng

gymnemic acid đạt giá trị cực đại, tăng gấp 15,4 lần so với các mẫu đối chứng không xử lý elicitor Khi xử lý bằng MeJA với nồng độ vượt quá 150 μM, thì

sự t ch lũy gymnemic acid đã giảm mạnh (36,3%) Xử lý bằng SA ở nồng độ cao 200 μM SA sau 48 giờ xử lý tạo ra một lượng lớn gymnemic acid (43,27

± 0,80 mg/g DCW) Nhìn chung khi nuôi cấy mô loài G sylvestre xử lý với

SA làm cho sự t ch lũy gymnemic acid tăng 4,9 lần so với đối chứng Khi xử

lý với các elicitor có nguồn gốc sinh học như các loài vi khuẩn và nấm như A rhizogenes, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Aspergillus niger và Saccharomyces cerevisiae yêu cầu khoảng thời gian tối thích khác nhau

(tương ứng với 24, 48, 48, 72, và 72 giờ) để kích thích sản xuất gymnimic acid hiệu quả nhất [81]

Độ tuổi nuôi cấy: Độ tuổi nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sản

xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học đươcj xử lý với các elilcitor

Xử lý với MeJA và SA trong nuôi cấy tế bào rễ tơ loài W somnifera sau 40

ngày cho t ch lũy hàm lượng withanolide A, withanone và withaferin A cao

nhất Nuôi cấy mô loài dừa cạn (C roseus) 20 ngày tuổi có xử lý các elicitor khác nhau (Trichoderma viride, A niger và F moniliforme) cho sản lượng

ajmalicine cao hơn so với đối chứng không sử dụng elicitor Khi xử lý bằng MeJA ở nồng độ 10 μM và 100 μM vào ngày thứ 6 của sự sinh trưởng tế bào, hàm lượng ajmalicine và serpentine đều tăng [81]

Thành phần dinh dưỡng: Thành phần của môi trường cũng đóng một

vai trò quan trọng trong quá trình kích kháng Trong nuôi cấy callus cây

Erythroxylum coca, hàm lượng cocaine, cinnamoylcocaine, chlorogenic acid

(CGA) và 4-coumaroyl quinate (CQA) bị ảnh hưởng đáng kể bởi môi trường nuôi cấy Quá trình sản xuất cocaine tăng mạnh khi nuôi cấy ở các môi trường Anderson rhododendron (ARM), Gamborg B5 (GB5) và môi trường Murashige-Tucker (MMT) Quá trình tổng hợp cinnamoylcocaine cũng chịu ảnh hưởng theo cách tương tự [81]

Tổng nồng độ ion thấp hơn trong ARM có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều khiển cơ chế tổng hợp các hợp chất thứ cấp Có nhiều công bố chỉ ra mối quan hệ tỷ lệ nghịch giữa nồng độ nitrate trong môi trường nuôi cấy và quá trình t ch lũy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp ở nhiều loài

thực vật bao gồm Arabidopsis thaliana, đại mạch (Hordeum vulgare) và thuốc lá (Nicotiana tabacum) Tương tự, giảm nồng độ nitrate trong môi trường nuôi cấy rễ tơ cây Atropa belladonna làm tăng hàm lượng alkaloid

Các môi trường nuôi cấy khác nhau cho kết quả tạo ra hàm lượng chất CGA khác nhau, thấp nhất trên môi trường ARM và cao nhất trên môi trường MMT Hàm lượng CQA được tạo ra trên môi trường ARM t hơn so với hai môi trường MMT và GB5 [81]

Ngoài ra, nhiều công bố cũng cho thấy có nhiều chiến lược để tăng sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật thông qua các cảm ứng sinh lý được tạo ra

bằng cách thay đổi môi trường nuôi cấy in vitro, tăng hoặc giảm các thành

phần dinh dưỡng của môi trường so với mức tối ưu cũng anh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp [53]

Hiệu quả của quá trình kích kháng còn phụ thuộc vào t nh đặc trưng của các loại elicitor khác nhau, các dòng tế bào khác nhau hoặc các loài vi sinh vật được sử dụng cùng với sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng,

thành phần dinh dưỡng của môi trường và điều kiện nuôi cấy

1.2.5 Nuôi cấy tế bào th c vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu dài trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, đặc biệt là các chất có hoạt t nh sinh học Hướng nghiên cứu này giúp ổn định chất lượng và hàm lượng sản phẩm, t phụ thuộc vào tự nhiên Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những

th nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp khác nhau [10]

Nhiều nghiên cứu cho thấy, một số hợp chất thứ cấp ở tế bào thực vật

nuôi cấy in vitro được t ch lũy cao hơn so với cây bố mẹ, chẳng hạn như sự

t ch lũy anthocyanin trong tế bào Vitis sp., Euphorbia milli và Perilla frutescens lần lượt cao gấp 1,6; 13,3 và 16 lần; anthraquinone trong tế bào Morinda citrifolia cao gấp 8 lần; berberin trong tế bào Coptis japonica và Thalictrum minor lần lượt cao gấp 3,3 và 1000 lần; rosmarinic acid trong tế bào Coleus blumei cao gấp 9,3 lần; shikonin trong tế bào Lithospermum erythrorhizon cao gấp 9,3 lần so với cây ngoài tự nhiên Điều này cho thấy ưu

điểm của việc sản xuất các hợp chất trao đổi thứ cấp đặc trưng của thực vật thông qua phương thức nuôi cấy tế bào [104]

Mặc dù hướng nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật đã được triển khai khá lâu, ngày nay, các nghiên cứu theo hướng này trên cây dược liệu vẫn tiếp tục được nghiên cứu và công bố Chẳng hạn, Nhan

và cs (2017) đã sản xuất thành công eurycomanone từ nuôi cấy tế bào bách

bệnh (Eurycoma longifolia) [85] Tung và cs (2022) đã nuôi cấy thành công tế

bào huyền phù cây giảo cổ lam để sản xuất gypenoside, hàm lượng gypenoside ở tế bào huyền phù cao hơn mẫu tự nhiên khoảng 1,3 lần [115]

Bảng 1.2 Các hợp chất thứ cấp đã đƣợc sản xuất từ nuôi cấy mô thực vật [31]

1 Acridines Artemisinin Brassinolide Aloe-emodin Anthocyanins

2 Betalaines Cucurbitacins Bufadienolides Anthraquinones Caffeic acid

3 Furoquinolines Diterpenes Catasterone Benzoquinones Coumarins

4 Galanthamine Ginsenosides Digoxin Chrysophanol Eugenol

5 Harringtonines

Isoquinolines

Meroterpenes Digitoxin Emodin Ferulic acid

6 Lobeline Monoterpenes Digitoxigenin β-Lapachol Flavonoids

7 Quinolizidines Paclitaxel Ecdysteroids Naphthoquinones Hydroxycinnamoyl

Sesterpenes Physodine Plumbagin Lignans

11 Thebaine Triterpenes Scillaridine Shikonin Proanthocyanidins

12 Trigonelline Ursane triterpenoid Steroidal glycosides Thymoquinone Stilbenes

13 Tropane alkaloids Withanolides Steroidal lactones Uglone Tannins

1.2.6 Một số thành t u trong sản xuất hợp chất thứ cấp ở th c vật được

xử lý elicitor

1.2.6.1 Sản xuất hợp chất nhóm Alkaloid

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,

có phản ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi cả ở động vật, thường có dược t nh mạnh và cho những phản ứng hoá học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid Trong sinh khối thực vật, alkaloid thường được tổng hợp với hàm lượng thấp, nuôi cấy tế bào có sử dụng elicitor để sản xuất các loại alkaloid khác nhau đã được nhiều tác giả công bố

Hyoscyamine và scopolamine là hai loại alkaloid tropane có giá trị, thường được sử dụng để làm chất chống đông, chống co thắt, chống dị ứng, giảm đau và làm thuốc an thần, Các hợp chất này được phát hiện có nhiều

trong các loài Hyoscyamus như H reticulatus Để tìm được phương pháp sản

xuất hyoscyamine và scopolamine tốt nhất, Moharrami và cs (2017) đã thử

nghiệm nuôi cấy rễ tơ của cây gieo từ hạt biến nạp với chủng Agrobacterium rhizogenes A7 có sử dụng elicitor sinh học ở các nồng độ và thời điểm xử lý

khác nhau Kết quả thu được cho thấy, nấm men ở nồng độ 500 mg/L và 250 mg/L sau 48 giờ xử lý cho kết quả tốt nhất với hàm lượng hyoscyamine và scopolamine t ch lũy tăng gấp 2 và 2,5 lần tương ứng so với đối chứng [78] Dừa cạn là một loài cây thuốc quan trọng chứa nhiều hợp chất chống ung thư như các alkaloid vinblastine và vincristine Các hợp chất này t ch lũy trong cây với một lượng rất thấp Maqsood và cs (2017) đã nghiên cứu phương pháp nhằm làm tăng sản lượng vinblastine và vincristine lên nhiều lần

bằng cách sử dụng YE làm elicitor trong quá trình nuôi cấy in vitro cây dừa

cạn Phôi hình thành từ protoplast khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung YE

ở nồng độ 1,5 mg/L đã t ch lũy lượng vinblastine và vincristine tăng nhiều nhất so với đối chứng, trong đó vinblastine tăng 22,8% và vincristine tăng 48,49% Hàm lượng vinblastine và vincristine cao nhất được tìm thấy ở mô lá

với giá trị tương ứng là 15,47 μg/g và 4,14 μg/g khô khi được xử lý với 1,5 mg/L YE [73]

Huang và cộng sự (2021) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor MeJA, SA và gây thương tổn lên quá trình tổng hợp benzophenanthridine alkaloids (BIAs) bao gồm sanguinarine (SAN), chelerythrine (CHE),

protopine (PRO), và allocryptopine (ALL) lên loài Macleaya cordata Hàm

lượng SAN và CHE tăng đáng kể sau khi được xử lý bởi MeJA so với các elicitor khác (P < 0,05) tại thời điểm 120 giờ Hàm lượng SAN và CHE tăng lên 10 và 14 lần so với đối chứng [50]

1.2.6.2 Sản xuất hợp chất phenol

Các hợp chất phenol tự nhiên đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng và điều trị ung thư Các hợp chất phenol từ thảo dược và thực phẩm bao gồm phenolic acid, flavonoid, tannin, stilbenes, curcuminoid, coumarin, lignan, quinone và các chất khác Hoạt t nh sinh học khác nhau của các hợp chất phenol liên quan đến các đặc t nh chống lại sự oxy hóa của chúng (v dụ như chất chống oxy hóa, chống ung thư, chống đột biến và chống viêm); gây chết tế bào (apoptosis); điều hòa sự biểu hiện và trao đổi các tác nhân gây ung thư; sự bám d nh, di chuyển và biệt hóa tế bào; chặn các con đường truyền t n hiệu [51]

Từ các nghiên cứu đã được công bố có thể thấy, sử dụng elicitor để tăng khả năng t ch lũy các hợp chất phenol là khá phổ biến, hàm lượng các hợp chất này thường tăng lên 2-3 lần so với đối chứng không xử lý Khả năng làm tăng t ch lũy các hợp chất hóa sinh có giá trị và sinh khối khi nuôi cấy huyền

phù tế bào Momordica dioica có sử dụng elicitor đã được Chung và cs (2017)

chứng minh Kết quả nghiên cứu cho thấy, so với khi nuôi cấy tế bào không

bổ sung elicitor, sự có mặt của JA và SA đã làm tăng đáng kể các hợp chất phenol, flavonoid và carotenoid cũng như các hoạt tính chống oxy hóa, chống

vi sinh vật và chống lây nhiễm Hơn nữa, quá trình nuôi cấy có bổ sung

elicitor đã tạo ra 22 hợp chất phenol như flavonol, hydroxycinnamic acid và hydroxybenzoic acid Trong đó, khả năng k ch thích của JA tốt hơn so với

SA Đây là nghiên cứu đầu tiên thành công trong việc nuôi cấy huyền phù tế

bào M dioica để sản xuất các hợp chất phenol và carotenoid cũng như sản

xuất sinh khối tế bào [34]

Để tăng cường sản xuất các hợp chất phenol và flavonoid từ cây chà là

(Phoenix dactylifera L.), Al-Khayri và cs (2020) tiến hành nghiên cứu xử lý

elicitor trong quá trình nuôi cấy Khi xử lý tế bào nuôi cấy bằng dịch chiết nấm men, kết quả cho thấy tổng số hợp chất phenolic tăng lên khi tăng nồng

độ dịch chiết nấm men Với nồng độ dịch chiết nấm men là 200 mg/L, thu được 234,696 ± 36,761 mg/100 g khối lượng khô Hàm lượng hợp chất phenolic tổng số tăng đáng kể 317,986 ± 28,743 mg/100 g khối lượng khô và hàm lượng flavonoid tổng số thu được là 157,286 ± 20,775 mg/100 g khối lượng khô thu được khi xử lý ở nồng độ elicitor thấp hơn là 50 mg/L SA và

50 mg/L CdCl2 Xử lý ở nồng độ 100 mg/L CdCl2 cho kết quả t ch lũy flavonoid tổng số là thấp nhất khi so sánh với tất cả các phương án xử lý elicitor khác Khi xử lý tế bào nuôi cấy bằng AgNO3, cho thấy nồng độ cao gây ra sự ức chế t ch lũy hợp chất phenolic và flavonoid tổng số [22]

1.2.6.3 Sản xuất saponin

Saponin là một nhóm hợp chất thứ cấp phổ biến trong thế giới thực vật Các hợp chất saponin có hoạt tính sinh học cao nên rất có giá trị trong lĩnh vực y dược Theo nhiều nghiên cứu đã được công bố, saponin có tác dụng kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ gan, điều hòa miễn dịch, Hiện nay, việc tách chiết và sản xuất các hợp chất saponin bằng phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật có bổ sung elicitor đã và đang được nghiên cứu nhiều nhằm tối đa hóa lượng saponin

Saponin của rau má (Centella asiatica) được biết đến với tên gọi là

centelloside, có hoạt tính sinh học giúp điều trị nhiều chứng bệnh khác nhau

như da khô, phong, loét varicose, eczema và bệnh vẩy nến Hidalgo và cs (2017) đã xây dựng hệ thống tối ưu cho việc sản xuất centelloside trên cơ sở

sử dụng elicitor và các cải biến sinh học trong nuôi cấy tế bào Kết quả cho thấy, việc sử dụng coronatine kết hợp với các resin giàu amyrin làm tăng khả năng sản xuất centelloside một cách mạnh mẽ Quá trình nuôi cấy này có thể được mở rộng sản xuất ở quy mô lớn nhằm giúp tăng sản lượng sinh khối và centelloside [45]

Ginsenoside là các hợp chất saponin thuộc nhóm triterpene, được xem là

thành phần có hoạt tính sinh học quan trọng nhất trong nhân sâm (Panax ginseng) Khả năng tổng hợp ginsenoside từ nuôi cấy rễ đã được gây đột biến

của nhân sâm có sử dụng elicitor sinh học đã được Le và cs (2018) nghiên cứu Tất cả 5 chủng vi khuẩn cố định đạm và 4 chủng vi khuẩn lên men được

sử dụng đều có ảnh hưởng đến khả năng t ch lũy sinh khối và ginsenoside

Hàm lượng saponin cao nhất thu được trong nuôi cấy rễ với Mesorhizobium amorphae (GS3037) sau 5 ngày là 105,58 mg/g khối lượng khô so với 74,48

mg/g ở thí nghiệm đối chứng không bổ sung elicitor Sự tích lũy của ginsenosides Rb2 và Rb3 tăng đáng kể, tương ứng là 19,4 và 4,4 lần; 18,8 và

4,8 lần sau 5 ngày xử lý với M amorphae (GS3037) và M amorphae

(GS336) [60]

Ursolic acid là một hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong nhiều loại thực vật Martínez và cs (2017) nghiên cứu khả năng của MeJA và

SA trong nuôi cấy callus loài Leptochinia caulescens để sản xuất ursolic acid

và oleanolic acid Mẫu lá được nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có bổ sung 3 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L BAP để tạo callus Quá trình nuôi cấy callus được bổ sung thêm MeJA và SA để k ch th ch tăng sản xuất ursolic acid và oleanolic acid Kết quả cho thấy, cả hai loại elicitor trên đều có ảnh hưởng đến quá trình sản xuất ursolic acid và oleanolic acid trong đó, bổ sung MeJA sau 8 giờ giúp tăng sản xuất các chất trên lên gấp 5 lần so với đối chứng [75]

Alsoufi và cs (2019) đã nghiên cứu khả năng của các elicitor phi sinh học lên quá trình tổng hợp triterpenoid và tiết saponin trong nuôi cấy tế bào rễ tơ loài

cúc kim tiền (Calendula officinalis L.) Thí nghiệm được thực hiện trên hai

dòng tế bào rễ tơ là dòng CC16 và CH2 Đối với elicitor là ion bạc và ion cadimi, quá trình t ch lũy oleanolic acid glycosides ở tế bào rễ tơ của cả hai dòng tế bào đều giảm, trong khi đó quá trình tiết oleanolic acid lại tăng đến 12 lần Đối với ảnh hưởng của sóng siêu âm (tần số 50 kHz), xử lý 20 phút gây

ra sự tiết oleanolic acid saponin tăng 4 lần đối với dòng CC16 và 11 lần ở dòng CH2 Đối với elicitor là tia tử ngoại UV-C, khi xử lý trên dòng CC16, lượng oleanolic acid t ch lũy tăng lần lượt là 2,4 và 1,6 lần sau khi xử lý 30 và

60 phút, trong khi đó hàm lượng saponin được tổng hợp tăng 38% sau 60 phút

xử lý ở dòng CH2 [23]

Nhiều loại saponin khác cũng đã được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật có xử lý elicitor Lee và cs (2018) đã nghiên cứu phương

thức tăng tổng hợp saponin trong nuôi cấy tế bào Kalopanax septemlobus

bằng cách sử dụng elicitor Khi nuôi cấy tế bào không bổ sung elicitor, hàm lượng saponin tổng số thu được là 1,56 mg/60 mL sau 15 ngày nuôi cấy Khi

bổ sung coronatine 1 μM, lượng saponin t ch lũy tăng lên 160% Ngoài ra, các tác giả nhận thấy, coronatine làm tăng biểu hiện sinh tổng hợp beta-amyrin từ

đó dẫn đến t ch lũy oleanolic acid [61] Nhan và cs (2018) nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor lên quá trình tổng hợp eurycomanone ở loài mật nhân

(Eurycoma longifolia) Eurycomanone là một hợp chất thứ cấp có giá trị,

thuộc nhóm hợp chất quassinoid, biểu hiện hoạt tính chống sốt rét và tăng cường sản xuất testosterone ở chuột, ức chế tế bào ung thư phổi Các nồng độ khác nhau của dịch chiết nấm men (YE) (20-250 mg/L), MeJA (20-500 µM)

và SA (20-500 µM) đã được sử dụng để phân tích ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào và t ch lũy eurycomanone sau 14 ngày nuôi cấy Kết quả cho thấy hàm lượng eurycomanone trong tế bào được xử lý với 20 µM MeJA sau 4

ngày nuôi cấy đạt giá trị cực đại là 17,36 mg/g trọng lượng khô và tăng từ

8-10 lần so với nhóm không xử lý elicitor [86] Kwan và cs (2021) nghiên cứu ảnh hưởng của 3 elicitor sinh học (YE, pectin và valine) lên khả năng sản xuất các hợp chất sinh học có hoạt t nh chống lại các dòng tế bào ung thư trong nuôi cấy tế bào huyền phù cây Bách bệnh Kết quả cho thấy cả 3 elicitor này đều làm tăng hoạt t nh gây độc đối với dòng tế bào ung thư ở người, HTC116, tương tự như dịch chiết từ rễ của cây trưởng thành, mà không ảnh đến sự sinh trưởng của

tế bào cây Bách bệnh [59]

1.2.6.4 Sản xuất các hợp chất thứ cấp khác

Bên cạnh các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp ch nh như saponin, alkaloid, hợp chất phenol,… nhiều hợp chất khác cũng đã được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào thực vật có bổ sung elicitor Ho và cs (2017) đã nghiên cứu cải thiện sinh tổng hợp và t ch lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng

cách sử dụng elicitor trong nuôi cấy rễ tơ của loài Polygonum multiflorum

MeJA và SA (50 μM) và YE (50 mg/L) đã tăng khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp, trong khi chitosan lại có hiệu suất kém hơn đối chứng Các tác giả cũng nghiên cứu tính khả thi của việc nhân rộng mô hình sản xuất bằng cách so sánh hiệu suất khi nuôi cấy lắc và nuôi cấy trong các bioreactor 3 lít,

5 lít cùng sử dụng MeJA 50 μM làm elicitor Kết quả cho thấy, không có sự khác biệt nhiều trong sản xuất sinh khối nhưng khả năng t ch lũy các hợp chất thứ cấp lại giảm khi thể t ch tăng [46]

Để nghiên cứu khả năng tăng tổng hợp sắc tố betalain trong nuôi cấy

huyền phù tế bào Celosia cristata, Warhade và cs (2018) đã thử nghiệm bổ sung các elicitor cả sinh học và phi sinh học bao gồm nấm F oxysporum, YE,

CuSO4 và CoCl2 Kết quả nghiên cứu cho thấy, chỉ có nấm F oxysporum giúp

tăng hàm lượng betalain trong quá trình nuôi cấy Các chất còn lại làm giảm sinh khối tế bào, khả năng sống của tế bào và tỉ lệ tế bào mang sắc tố [119]

Từ các tài liệu đã được tổng hợp có thể thấy việc sử dụng elicitor để tăng

cường sản xuất các hợp chất thứ cấp thông qua nuôi cấy tế bào thực vật là hướng nghiên cứu khá phổ biến trong khoảng 20 năm trở lại đây, tuy nhiên vẫn còn khá nhiều đối tượng chưa được chú ý và đây cũng là hướng nghiên cứu còn rất nhiều tiềm năng

1.3 TỔNG QUAN VỀ OLEANOLIC ACID

1.3.1 Vai trò và phân bố

Oleanolic acid là một hợp chất thứ cấp được tổng hợp trong nhiều loại thực vật khác nhau Chúng đóng vai trò như các chất phòng vệ chống lại các loài động vật ăn cỏ hoặc mầm bệnh, có liên quan đến sự hình thành các rào cản chống mất nước, hay có đặc t nh allelopathic T nh đến 9/2007, oleanolic acid đã được phát hiện có mặt trong 146 họ, 698 chi và 1620 loài thực vật, đặc biệt là họ Oleaceae [122] Các pentacyclic triterpene bao gồm oleanolic acid được phổ biến rộng rãi trong các loại quả, lá và vỏ của các loại cây ăn

được và cây dược liệu khác nhau Loài Lantana camara và Ligustrum lucidum là những nguồn giàu oleanolic acid và chúng được sử dụng trong y

học truyền thống để điều trị các bệnh khác nhau Oleanolic acid cũng có thể

dễ dàng thu được với năng suất cao từ cây ô liu Guinda và cs (2010) đã thông báo rằng thành phần triterpene trong lá của cây ô liu rất đa dạng, trong đó oleanolic acid là triterpenoid phong phú nhất trong các giống được khảo sát Các loại gia vị ẩm thực phổ biến như cỏ xạ hương và cây đinh hương cũng là nguồn cung cấp oleanolic acid Táo, nho, cây sơn trà, cây xô thơm là một số cây ăn quả, trong đó oleanolic acid cũng đã được phát hiện và phân lập [26]

1.3.2 Một số công dụng của oleanolic acid

Oleanolic acid và đồng phân của nó đã được chứng minh có các hoạt tính sinh học như khả năng chống viêm, bảo vệ gan, kháng khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus, Một số có tác dụng trong điều trị viêm loét

dạ dày, viêm da Hiện nay, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, oleanolic acid và urnolic acid có tác dụng trong điều trị tiểu đường, chống cao huyết áp [64,

108]

1.3.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Khả năng kháng khuẩn của oleanolic acid và ursolic acid đã được khảo sát với nhiều chủng vi khuẩn khác nhau Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, oleanolic acid và ursolic acid có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, trong đó chủ yếu là các vi khuẩn Gram âm, do đó hai hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong nhiều loại thuốc kháng sinh Oleanolic và ursolic acid đã được chứng minh có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh ở người

khác như S pneumonia (MIC 16 𝜇g/mL), các chủng Staphylococcus aureus

nhạy và kháng methicillin (tương ứng với giá trị MIC ở 8 𝜇g/mL và 64

𝜇g/mL) [121], Bacillus subtilis (MIC 8 𝜇g/mL), B cereus, Enterococcus faecalis (MIC 6,25-8,00 𝜇g/mL), E faecium (MIC 8 𝜇g/mL), và Pseudomonas aeruginosa (MIC 256 𝜇g/mL) [39, 48]

1.3.2.2 Tác dụng bảo vệ gan

Tác dụng bảo vệ gan của oleanolic acid được công bố lần đầu tiên vào

năm 1975 trong nghiên cứu của He và Shi trên cây Swertia mileensis, một

loại dược liệu truyền thống được sử dụng trong điều trị viêm gan Ba hoạt chất được phân lập từ loài dược liệu này, trong đó có oleanolic acid cho hiệu quả tốt nhất trong bảo vệ chống lại tổn thương gan gây ra bởi tác nhân CCl4 Các nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh thêm oleanolic acid có khả năng làm suy giảm CCl4 - chất gây ra hoại tử mô gan cũng như xơ và thoái hóa gan [71]

oleanolic acid [105, 110]

1.3.2.4 Hoạt tính kháng khối u

Nhiều nghiên cứu cho thấy, quá trình hình thành và phát triển của khối u

bị ngăn chặn bởi oleanolic acid và ursolic acid với nhiều mức độ khác nhau Trong đó, tác động đáng chú ý nhất của 2 loại triterpenoid nói trên là tác động kìm hãm sự sinh trưởng của khối u Oleanolic acid và ursolic acid được xác

định là các hoạt chất ch nh được tìm thấy trong cây Ligustrum lucidum Hai

hoạt chất này giúp ngăn chặn quá trình đột biến hình thành bởi sự benzo[a]pyrene (B[a]P) của vi khuẩn [87]

1.3.2.5 Hoạt tính chống bệnh tiểu đường

Tiểu đường là một căn bệnh tiến triển phức tạp, kết quả của sự bài tiết hay khả năng cảm ứng tổng hợp insulin bị suy giảm Oleanolic acid đã được

sử dụng làm tác nhân trị liệu trong các mô hình bệnh tiểu đường để cải thiện hoạt động của insulin, ức chế sự tổng hợp glucose và thúc đẩy sử dụng glucose Oleanolic acid không gây t ch lũy mỡ (adipogenic), không giống như các liệu pháp điều trị tiểu đường thường được sử dụng như insulin hoặc thiazolidinediones điều hòa vận chuyển glucose ở ngoại biên và thường dẫn đến tăng cân Vì vậy, oleanolic acid có thể là một phương thức điều trị đầy hứa hẹn và tốt hơn so với các tác nhân trị liệu chống tiểu đường khác [26]

1.3.2.6 Hoạt tính chống oxy hóa

Stress oxy hóa được biết đến có liên quan đến các yếu tố gây bệnh của các bệnh mãn t nh khác nhau và do đó liệu pháp chống oxy hóa là một chiến lược đầy hứa hẹn cho việc quản lý và điều trị các bệnh này (Bajpai, 2016) Các báo cáo về hoạt tính sinh học của oleanolic acid đôi khi được cho là do

tác dụng chống oxy hóa của nó Ví dụ, oleanolic acid từ L lucidum đã được

chứng minh là làm giảm mức độ malonaldehyde (MDA) và tăng hoạt tính superoxide dismutase (SOD) và gluthatione peroxidase (GSH-px) trên chuột

bị bệnh tiểu đường do alloxan gây ra Mức độ MDA (dựa theo sản phẩm của