Nghiên cứu định hướng khả năng ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm của cây hoàn ngọc

Hoạt tính kháng lại một số vì sinh vật gây hư hỏng trong thực phẩm của dịch 3.2.2.. Mục u nghiên cứu Đánh giá khả năng ức chế các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm của dịch chiết từ câ

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH - Đại học Mở Hà Nội

'TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CUA CAY HOAN NGOC

GIÁO VIÊN HUGNG DAN : PGS.TS Nguyễn La Anh SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lộc Tú Anh

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

1.3.1 Tác dụng dược lý của cây Hoàn ngọc

1.3.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học của cây Hoàn ngọc

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

2.2 Phương pháp vì sinh

2.2.1 Phương pháp đếm số lượng tế bảo bằng buồng đếm hồng cầu

2.2.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng trang cấy

2.4 Phương pháp kiểm tra khả năng ức chế VSV gây hư hỏng thực phẩm:

2.5 Phương pháp xác định nông độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá Hoàn ngoc28

2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol „28

2.7 Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid sec 29 2.8 Thử nghiệm dịch chiết lá Hoàn ngọc trên thực phẩm - 2

CHUONG III: KET QUA

3.1 Hoạt tính kháng lại một số vì sinh vật gây hư hỏng trong thực phẩm của dịch

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tách chiết

3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệ

DANH MUC CHU VIET TAT

3 | CFU Colony Forming Unit — don vj hinh thanh ii

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

Hình 2: Escherichia coli trên kính hiển vi điện tử

Hinh 3: Bacillus cereus trên kính hiên vi điện tử

Hinh 4: Aspergillus niger trén kính hiển vi điện tử

Hình 5: Cấu trúc hóa học của một số nhóm chat thudc polyphenol

Hình 6: Cấu trúc hóa học của Resveratrol

Hình 7: Cấu trúc hóa học của một số flavones và flavonoids

Hình §: Cấu trúc hóa học của một số quinones đại dign 1a quinone va hypericin 11 Hình 9; Cấu trúc hóa học của một số alkaloids

Hình 10: Cyanidin O-galactoside và flavone C-glycoside 13

Hinh 11: Sarsapogenins trong Yucca

Hình 12: Cấu trúc đại diện của tannin

Hình 13: Cơ chế kháng khuẩn của tỉnh dầu

Hình 14: Ảnh hưởng của tỉnh dầu cây Metha piperita tới thành tế bào sợi nắm và sự hình thành bào tử của Aspergillus niger (a,b) and Penicillium hirsutum (c,d) khi nuôi cấy trên đĩa Petri chứa 20 nl tỉnh dầu

Hình 15: Cấu trúc thứ cấp của AMP: A) xoắn ơ, B) vòng x‹

Hình 18: Dịch chiết bằng phương pháp trích ly hồi lưu

Hình 19: Hoạt tính kháng lại ching Staphylococcus aureus CNTP 6077 cita dich

chiết lá Hoàn ngọc tách chiết ở các nhiệt độ khác nhau

Hình 20: Hoạt tính khang lai ching Staphylococcus aureus CNTP 6077 ciia dich chiết lá Hoàn ngọc từ các nguồn khác nhau

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Cơ chế của các hợp chất kháng khuẩn từ thực vậ

Bảng 3 I Hoạt tính kháng tại một số chủng VSV gây hư hỏng thực phẩm

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả tách chiết lá Hoàn ngọc 3l

Bảng 3 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả tách chiết lá Hoàn ngo\ 2 Bảng 3 4 Đặc điểm của dịch chiết lá Hoàn ngọc thu nhận từ các vùng nguyên liệu

Bảng 3 5 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô trong dịch chiết lá Hoàn ngọc đối với

Bang 3 6 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Hoàn ngọc tới mật độ tế bào VSV ở mẫu tương ớt Mường Khương trong thời gian lưu trữ -ecesereevŸ7

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐÀU Trong ngành công nghiệp thực phẩm, nguyên nhân chủ yếu dẫn tới các hư hỏng, ngộ độc ở sản phẩm là do nhiễm các vỉ khuẩn như Salmonella typhi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus; nam men Candida albican hoặc nắm mốc Aspergillus niger, Fusarium oxysporum Do đó, việc ngăn ngừa các mầm bệnh này là yếu tô được ưu tiên hang

đầu của các nhà sản xuất

Một trong những phương pháp truyền thông là sử dụng nhiệt độ cao (UHT) hoặc nhiệt độ ở áp suất cao để tiệt trùng sản phẩm, chỉ phù hợp với một số sản phẩm đóng hộp Phương pháp phổ biến hiện nay là sử dụng các hóa chất (Sodium Benzoate, Potassium Sorbate ) để ức chế các vi sinh vật có mặt trong sản phẩm Hiện nay, xu hướng sản xuất các loại thực phâm chất lượng cao, an toàn, có nguồn gốc tự nhiên, không sử dụng các chất bảo quản hóa học (dù được cho phép) Các công ty chế biến thực phẩm lớn ở Việt Nam cũng quan tâm đến hướng nghiên cứu

phát triển này nhằm tăng giá trị và độ an toàn cho sản phẩm của mình Nhiều sản phẩm thực phẩm nếu được bảo quản bằng chất bảo quản tự nhiên như các loại bánh truyền thống (bánh dẻo, bánh cốm, bánh đậu xanh ), các loại sản phẩm gia vị (tương ớt, nước sốt ) thì sẽ có giá trị gia tăng cao hơn

Do đó, nhu cầu tìm kiếm các chất bảo quản thay thế, an toàn đối với con người

ngày càng tăng Trong đó, thực vật được coi là nguồn tự nhiên phong phú chứa các

hợp chất kháng khuẩn Hơn nữa, các hợp chất này còn được cho là dễ phân giải, tránh được sự tích tụ trong chuỗi thức ăn

Hoàn Ngọc là loài cây phổ biển ở nước ta, được ứng dụng rộng rãi trong y học

cổ truyền đề chữa các bệnh liên quan tới đường tiêu hóa, làm lành các vết thương Một số nghiên cứu gần dây cho thấy lá cây Hoàn Ngọc có tiềm năng ức chế sự phát triển của một số vi khuân gây bệnh, khối u Xuất phát từ lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu định hướng khả năng ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm

của cây hoàn ngọc”

Mục

u nghiên cứu Đánh giá khả năng ức chế các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm của dịch chiết từ cây Hoàn ngọc và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Nội dung nghiên cứu

Khảo sát phương pháp tách chiết các hợp chất tự nhiên từ lá hoàn ngọc

Đánh giá khả năng kháng nắm và kháng khuẩn của dịch chiết từ lá hoàn ngọc Thử nghiệm dịch chiết lá hoàn ngọc ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

CHƯƠNG I TỎNG QUAN 1.1 Các vi sinh vật gây hư hồng ở thực phẩm

Các quá trình hư hỏng của thực phẩm do vi sinh vật gây nên và trong nhiều trường hợp chúng còn tạo ra các độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe con người Khi có mặt trong thực phẩm, các VSV này có thể gây bệnh trực tiếp bằng cách tiết ra độc

LLL Vi khudn [1][2]13]

1.1.1.1 Clostridium perfringens

Clostridium perfringens (C perfringens) là một loại vi khuẩn Gram (+), di

động và hình thành bào tử, được tìm thấy trong nhiều nguồn môi trường cũng như:

Trong sé 5 typ C perfringens, cdc ching thuge typ A tham gia gây các bệnh nhiễm trùng, gây độc phát sinh từ thực phẩm Các thực phẩm có thể nhiém khuan này thường là thịt gia cằm, thực phẩm khô Các triệu chứng do vi sinh vật này gây

ra là đau thắt vùng bụng, bệnh về đường tiêu hóa và xuất hiện từ 8 - 24 giờ sau khi

ăn một lượng lớn tế bào sống (từ 5 — 10° CFU/g) qua đường thực phẩm

1.1.1.2 Sfaphyllcoccus arews

Sfaphyllococcus aureus là một khuẩn cau Gram (+), các tế bào liên kết thành chùm, không di động, không tạo bảo tử Chúng có khả năng chịu được sự khô hạn, nông d6 mudi cao (9 — 10%) Staphyllococcus aureus c6 thé san sinh ra cdc loai độc tố gây dung huyết, diệt bạch cầu, hoại tử da, gây chết, độc tố đường ruột và các yếu tố độc lực ngoại bào Ngoài ra chúng còn hình thành những nhân tố gây bệnh như: chất làm tan tơ huyết, men làm đông huyết tương, nhân tố khuếch tán (Trần Thị Phận, 2004)

Staphyllococcus aureus khi nhiém vào thực phẩm sẽ phát triển rất nhanh, sinh

hiện các triệu chứng về đường tiêu hóa Các thực phẩm có chứa hàm lượng muối cao

có nguy cơ nhiễm như jambon, kem tông hợp, nước soup, vì các loại thực phẩm này ít được xử lý ở nhiệt độ cao

Sự kháng thuốc ở S/aphylococeus aureus là đặc điểm rất đáng lưu ý Đa số

Staphylococcus aureus khang lại các nhóm kháng sinh nhóm ƒ-lactams nhờ men j- lactamase (Nguyễn Thanh Bảo, 2003) Một số còn kháng được methicillin, do nó

tạo được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh Hiện nay một số các tụ

ngoài da, tụ cầu khuẩn xâm nhập vào máu gây chứng huyết nhiễm mủ và theo máu

di tới các cơ quan gây nên các ổ áp se Tụ cầu khuẩn là nguyên nhân gây viêm xoang, viêm amidan, viêm vú ở người (Trần Thị Phận, 2004)

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

E.coli là vi sinh vật hiểu khí phổ biến trong đường tiêu hĩa người, các lồi động vật máu nĩng Hầu hết các dịng Z.cọi tồn tại khơng gây hại trong đường tiêu hĩa, ngược lại chúng cịn đĩng vai trị quan trọng trong việc ơn định sinh ý đường tiêu hĩa Tuy nhiên cĩ 4 dong sau đây cĩ thể gây bệnh cho người và một số lồi động vật Enteropathogenic E.coli (EPEC) Emerorocienic E.coli (ETEC) Enteroinvasive E.coli (EIEC) Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli 0157: H7

Dịng vi khuẩn E.coli 0157: H7 1a một lồi vi khuẩn gây hại nhất cĩ trong thực phâm và thường cĩ mặt trong các sản phâm: bánh mì, thịt bị chưa được nấu chín, sữa tươi, nước táo chưa thanh trùng £ coli O157:H7 với kháng nguyên đặc hiệu thân (O) và kháng nguyên lơng (H) đã nhận các gene độc và sinh ra chất

độc Shiga gây ra bệnh tiêu chảy ở người

thời gian nhân bản thường dài hơn đáng kẻ Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi,

Một số chủng Aspergillus flavus, A parasiticus, A niger sinh ra déc t6 aflatoxin, loai chat déc gây ung thư, đột biến Các nắm mộc này phát triển ở nhiệt

độ từ 7 ~ 40C và tối ưu ở 24 - 28C, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa, đậu phộng, ) Một só chủng enicillium (đặc biệt

PP verrucosum) và Aspergillus sinh độc tố ochratoxin gây ức chế sự vận chuyền của

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

axit ribonucleie, các axit amin và làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể; đây là độc tố gây ung thư và nhiễm độc thận Những nắm mốc này rất phổ biến, gây hỏng thực phẩm Aspergillus niger xuat hién trén một số loài trái cây và rau quả như nho, mơ, hành tây và đậu phộng và gây ra bệnh nấm meo Penicillium phát triển tốt ở môi trường axit 0,5% gây nên mốc xanh trên quả có múi và thối móc trên

cà chua Từ các nguyên liệu này, nắm mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm

Saccharomyees cerevisiae là mội loai nam tai (Ascomycetes), có dạng hình cầu, sinh sản bằng cách tạo chdi va tao bao ttt Candida tropicalis sng ky sinh & vo của dứa, sản xuất ra protease aspartyl va enzyme phospholipase pha hoại cấu trúc

thành tế bào của vật chủ

1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật

Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, tách chiết từ thực vật đã được ứng dụng

trong các lĩnh vực được phẩm, mỹ phẩm Trong ngành thực phẩm, các hợp chất có

hoạt tính kháng khuẩn được sử dụng để kiểm soát sự hư hỏng và sự phát triển của vi

thực vật, điều kiện môi trường, khí hậu, phương thức thu hoạch và công nghệ tách

Polyphenol là chất chuyền hóa thứ cấp phô biến ở tất cả các loài thực vật bậc

cao và có vai trò chống lại vỉ sinh vật gây hại cho thực vật, chống oxi hiệu quả

stilbens và các polyphenol khác [4]

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

Hình 5: Cấu trúc hóa học của một số nhóm chất thuộc polyphenol

Axit phenolic là những hợp chất có đặc điểm của nhóm chức caboxylie, có thé được chia làm hai nhóm: nhóm các dẫn xuất của axit benzoic như axit gallie và nhóm các dẫn xuất của axit cinnamic như axit coumaric, axit caffeic va axit ferulic

Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến nhất, chứa trong nhiều loại trái cây và rau

quả, thường được este hóa với axit quinic trong axit chlorogenic, là một hợp chất

phenolic chủ yếu trong cà phê Một axit phenolic phổ biến khác là axit ferulic, đó là chất có trong ngũ cốc và được este hóa tạo thành các hemicelluose có trong tế bảo Các hợp chất phenolie có chuỗi C3 ở mức độ thấp hơn mức độ oxy hóa được gọi là tỉnh dầu

1.2.1.2 Resveratrol

Resveratrol (3,5.4'-trihydroxystilbene) là một stilbenoid (dẫn xuất stilbenoid hydroxyl héa), lan dau duge phan lap trong ré cay Hellebore tring [25] Resveratrol

được cây sản xuất ra khi có sự kích thích từ mầm bệnh, tia cực tím hoặc ozone,

được gọi là phytoalexin [24] Hợp chất-này có tác dụng kháng khuẩn trên £ cøli O157:H7, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, S aureus, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa Resveratrol có khả năng ức chế hơn là diệt vi khuẩn [25]

bao vi sinh vat [14,18]

Hinh 7: Cau tric héa hoc ctia m6t sé flavones va flavonoids

Catechin được chiết xuất từ trà xanh, có thể tạo liên kết trực tiếp với protein gây ra hiện tượng ngưng kết, đây là tính chất đặc trưng cho hoạt tính kháng khuẩn Catechin có tác dụng gây ức ché enzyme glucosyltransferase cula Streptococcus

‘mutans (28), ức chế hoạt động của Shigella [7]

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

protein của vi khuẩn Habbal và cộng sự, 2011, đã báo cáo quinine từ dịch chiết cây

quinones dai diện là quinone va hypericin

it hữu cơ có chứa nitơ, đa số nhân dị vòng Một số

nicotine, tropane, atropine, cocaine, quinine, papaverine, morphine, codeine, strychnine, caffeine [4]

Dich chiét 14 Tamarindus indica (Fabaceae) cé tac dung kháng khuẩn đối với

vi khuẩn Gram durong nhu S aureus, E coli va Gram âm P aeruginosa nhưng khéng chéng lai Salmonella typhi [21] Dich chiét berberin cita cay hong lién có tác dụng với vi trùng bệnh sốt rét, kháng vi khuân Shigella, tụ cầu khuẩn

mù tạt và có khả năng kháng nắm, kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa và chống viêm

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

là trong y học cô truyền và công

nghiệp thuộc da Chúng được tổng hợp ở tắt cả các bộ phận của cây và tìm được số lượng lớn trong vỏ và lá sồi, vân sam, óc chó, việt quất và trong quả một số loài như

Hình 12: Cấu trúc dai dién ctia tannin

1.2.1.9 Terpenes va tinh dầu

Tỉnh dầu là hợp chất thơm dễ bay hơi, không tan trong nước nhưng tan trong dung mỗi hữu cơ được tìm thấy trong các bộ phân cây như hoa, quả, lá, và được chiết xuất bằng phương pháp chung cat hoi nước hoặc chiết xuất qua dung môi hữu

cơ Trong tỉnh dầu có 90-95% là monoterpen, sesquiterpene và các dẫn xuất oxy hóa, andehit, rượu, este [4] Trong đó, các hợp chất có khả năng kháng khuẩn và

kháng nắm là terpens (p- cymene, limonene), terpenoids (thymol, carvacrol), phenylpropenes (eugenol, vanilin) và các hợp chất khác như allicin hoặc

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

Hình 13: Cơ chế kháng khuẩn của tỉnh dầu

Cineol trong tỉnh dầu từ cây bạch đàn có tác dung khang Bacillus subtilis va

Staphyllococcus aureus nhung kém tác dụng với E coli Tình dầu từ các loài cây xả

có tác dụng kháng khuẩn chủ yếu đối với vi khuẩn Gram âm Theo Gislene và cs.,

eugenol có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn và nắm men, bao

gdm: Staphylococcus aureus; Salmonella choleraesuis, Bacillus subtilis va Candida

Hình 14: Anh hưởng của tỉnh dâu cây Metha piperita tới thành tế bào sợi nắm và

sự hình thanh bao tir cia Aspergillus niger (a,b) and Penicillium hirsutum (c,d) khi

nuôi cấy trên đĩa Petri chứa 20 ul tinh dau

1.2.1.10 Peptides

Để bảo vệ chống lại mầm bệnh, thực vật tổng hợp protein là các enzyme

(glucanases, proteinases, amylases, oxydases) có vai trò như là chất chuyển hóa

chính, nhưng cũng có các peptit có trọng lượng phân tử lượng thấp khoảng I0kDa,

được gọi là peptit kháng khuân (AMPs) AMPs được phân lập từ một lượng lớn

thực vật và được phân loại theo cấu trúc thứ cấp và cấu trúc ba chiều gồm peptit mạch thăng; peptit mạch vòng với cấu trúc B và liên kết disulfide; chuỗi xoăn ơ kết hợp với B, liên kết qua liên kết disulfide; các peptit mạch thăng có chứa gốc axit amin; các peptit nhỏ có cấu trúc dạng vòng hoặc cấu trúc không xác định [10]

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

trong tế bào chất; ức chế quá trình tong hop enzyme

Bang 2 1 Co chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

(Nhóm Phan nhóm | Hợp chât Co chi

Phenolics Phenols Catechol Gây mắt chất nền

—— Epicatechin | Tạo ra sự gián đoạn màng tế bào —_ Quinones | Hypericin Tạo phức với thành tế bào, bắt hoạt

ic enzyme Flavonoids | Chrysin Liên kết với chất kết dính Flavones | Abyssinin Tạo phức với thành tế bào, vô hiệu

ha enzyme Tannins Ellagitannin | Liên kết với protein, liên kết với

chất kết dính, ức chế enzyme, sự mắt chất nền, tạo phức với thành tế bào, gián đoạn màng, sự tạo phức

ion kim loại

Coumarins | Warfarin Tương tác với DNA [Terpenoids, Capsaicin Tao ra sự gián đoạn mảng tế bào

Các hợp chất kháng khuẩn tác động tới các vị trí đích của tế bào vi khuẩn, bao

gồm: màng tế ác protein (protein thụ thể, protein vận chuyển ion, các enzyme, protein điều hòa, protein cấu trúc) và axit nucleic

Cấu trúc màng tế bào bị suy giảm do đặc tính ưa béo của các terpenoit Các hợp chất ky nước này làm thay đôi phospholipid kép-của màng, tạo thành ra các lỗ

rỗng-cho phép khuếch tán hoặc vận chuyển các hợp chất có hại Các chất chuyền

hóa thứ cắp khác có thể tương tác với các protein ngoại bảo, protein vận chuyển, ngăn chặn chức năng truyền tín hiệu và vận chuyển của các protein này Các tác động này dẫn sự chết của các tế bảo

Các chất kháng khuẩn thực vật có thể tương tác với protein tế bào, do đó làm thay đôi cấu trúc bậc hai và bậc ba của những phân tử quan trọng này Khi cấu trúc

ba chiều của protein bị thay đôi, cấu trúc và chức năng trao đồi chất của chúng cũng

bị ảnh hưởng và gây ra những hậu quả đối với tế bào sống Những thay đổi về cầu trúc có thể kích hoạt hoặc bất hoạt một protein Các chất chuyển hóa thứ cấp cũng

có thê thay đổi cấu trúc trung tâm xúc tác của các enzyme gây mắt chức năng xúc

tác

Các chất chuyển hóa thứ cấp có chứa các nhóm alkyl hoặc các phân tử tương

tự như các bazơ nitơ trong ADN hoặc ARN có thể sửa đôi các axit nucleic bằng

cách alkyl hóa và sự thêm vào chuỗi ADN Những thay đổi này có thê dẫn đến đột biến điểm và cuối cùng trình tự các axit amin trong protein bị sửa đổi Trên thực tế, các chất chuyển hóa của chất kháng khuẩn có thể ảnh hưởng đến toàn bộ hệ thống sao chép, phiên mã và dịch mã [20]

1.3 Cây Hoàn ngọc

Cây hoàn ngọc trắng, có tên khoa học là Pseuderanthemum palatiferum

(Nees) Radlk, là một loại dược liệu, thuộc dạng cây bụi sống lâu năm, có chiều cao