Ứng dụng chỉ thị DNA trong phân tích đa dạng di truyền loài lan Kim Tuyến tại vùng miền núi phía bắc Việt Nam LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyen Thi Hong Ngoc include include include Bc1 Khai báo bien tep tin FILE fp Bc2 Mo tep tin de ghi hoac doc fopen(Ten tep, mode); Bc3 Ghi hoac doc tep tin (x.Nguyen Thi Hong Ngoc include include include Bc1 Khai báo bien tep tin FILE fp Bc2 Mo tep tin de ghi hoac doc fopen(Ten tep, mode); Bc3 Ghi hoac doc tep tin (x.

Trang 1

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);

printf("\nDa ghi xong!\n");

//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

fclose(fp);

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ DNA TRONG PHÂN TÍCH

ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI LAN KIM TUYẾN

TẠI VÙNG MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên -2022

Trang 2

/*

fclose(fp);

Trang 3

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ DNA TRONG PHÂN TÍCH

ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI LAN KIM TUYẾN

TẠI VÙNG MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS NGUYỄN XUÂN VŨ

2 PGS TS NGUYỄN TIẾN DŨNG

Thái Nguyên -2022

Trang 4

/*

fclose(fp);

Trang 5

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng:

Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng hoặc công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

Trang 6

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Vũ và PGS TS Nguyễn Tiến Dũng đã dành nhều thời gian, tâm huyết, trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài và hoàn thiện luận văn Thạc sĩ

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, khích

lệ, chia sẻ, giúp đỡ, đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

Trong quá trình học tập và nghiên cứu khó tránh khỏi những thiếu sót

Do đó, tôi mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô để luận văn được hoàn thiện hơn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 05 tháng 01 năm 2022

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

Trang 7

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

*/

int main(int argc, char *argv[])

{

int n;

//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

FILE *fp;

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

if(fp==NULL)

{

printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");

exit(0);

}

srand(time(NULL));

for(int i=1;i<=5;i++)

{

n=rand()%100;

fprintf(fp,"%d\t",n);

}

fclose(fp);

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về lan Kim Tuyến 3

1.2 DNA barcode 4

1.3 Một số DNA barcode thường được sử dụng ở thực vật 5

1.3.1 DNA barcode ở thực vật 5

1.3.2 Gen ITS 5

1.3.3 Gen rbcL 6

1.3.4 Gen matK 7

1.4 Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật 7

1.5 Ứng dụng DNA barcode ở loài lan 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.2 Vật liệu nghiên cứu 10

Trang 8

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

*/

{

int n;

FILE *fp;

if(fp==NULL)

{

exit(0);

}

srand(time(NULL));

{

n=rand()%100;

}

fclose(fp);

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 12

2.4 Nội dung nghiên cứu 12

2.5 Phương pháp nghiên cứu 12

2.5.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 12

2.5.2 Phương pháp kiểm tra nồng độ DNA 13

2.5.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 15

2.5.4 Phương pháp phân tích trình tự gen và mối quan hệ di truyền 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Kết quả đánh giá hình thái 17

3.2 Kết quả tách chiết DNA 23

3.3 Kết quả khuếch đại DNA và giải trình tự 24

3.3.1 Kết quả khuếch đại vùng gen ITS1 và giải trình tự 24

3.3.2 Kết quả khuếch đại vùng gen matK và giải trình tự 27

3.3.3 Kết quả khuếch đại vùng gen rbcL và giải trình tự 30

Phần 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

4.1 Kết luận 34

4.2 Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

Trang 9

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi

polymerase

Trang 10

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

*/

{

int n;

FILE *fp;

if(fp==NULL)

{

exit(0);

}

srand(time(NULL));

{

n=rand()%100;

}

fclose(fp);

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 8 mẫu lan Kim Tuyến thu thập được ở một số tỉnh thành phía Bắc 10

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 10

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu 11

Bảng 2.4 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 11

Bảng 2.5 Quy trình tách chiết DNA 13

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR sử dụng INtRON PCR master mix 14

Bảng 3.1 So sánh một số đặc điểm hình thái giữa các mẫu lan Kim Tuyến 17

Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ DNA 23

Bảng 3.3 Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen ITS1 25

Bảng 3.4 Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen matK 28

Bảng 3.5 Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen rbcL 31

Trang 11

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

*/

{

int n;

FILE *fp;

if(fp==NULL)

{

exit(0);

}

srand(time(NULL));

{

n=rand()%100;

}

fclose(fp);

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Một số hình ảnh về loài lan Kim Tuyến 4

Hình 1.2 Hình ảnh miêu tả vị trí của vùng gen ITS 6

Hình 1.3 Hình ảnh miêu tả vị trí gen rbcL trên cây Arabidopsis thaliana 7

Hình 1.4 Hình ảnh miêu tả vị trí của gen matK [14] 7

Hình 2.1 Chu trình nhiệt chạy PCR khuếch đại DNA 15

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu HG1 18

Hình 3.3 hình ảnh mẫu HG3 19

Hình 3.5 Hình ảnh mẫu BK 20

Hình 3.6 Hình ảnh mẫu LS 47

Hình 3.7 Hình ảnh mẫu LC 21

Hình 3.8 Hình ảnh mẫu TN 21

Hình 3.9 Hình ảnh 8 mẫu lan Kim Tuyến thu thập được 22

Hình 3.10 Hình ảnh mặt trước và sau lá của các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được 23

Hình 3.11 Kết quả PCR khuếch đại gen ITS1 24

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS1 của các mẫu nghiên cứu 26

Hình 3.13 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen ITS1 giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu 27

Hình 3.15 Kết quả PCR khuếch đại gen matK 27

Hình 3.16 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen matK của các mẫu nghiên cứu 29

Hình 3.17 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen matK giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu 30

Hình 3.18 Kết quả PCR khuếch đại gen rbcL 30

Hình 3.19 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen rbcL của các mẫu nghiên cứu 32

Hình 3.20 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen rbcL giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu 33

Trang 12

/*

fclose(fp);

Trang 13

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Họ Lan là một họ thực vật rất đa dạng ở Việt Nam, với gần 900 loài thuộc

154 chi Thông thường Lan được sử dụng để làm cảnh, bên cạnh đó còn có 1

số loài Lan được sử dụng để làm thuốc Chi lan Kim Tuyến (Anoectochilus) ở

Việt Nam hiện nay đã thống kê được khoảng 15 loài, trong đó có những loài có giá trị làm cảnh và những loài có giá trị làm thuốc, có công dụng bổ máu, giải nhiệt, chữa được các bệnh như tiểu đường, viêm dạ dày, viêm gan,… đặc biệt

có những loài đã được xếp vào danh mục cấm mua bán và có tên trong sách đỏ Việt Nam như lan Kim Tuyến Sapa

Lan Kim Tuyến thường cao từ 10 – 20cm, thân cây tròn, mọng nước, thường có màu xanh hoặc tím, lá hình trái xoan hay hình trứng, tròn ở gốc và nhọn dần về phía đầu, trên lá có lông nhung bao phủ, vân lá thường có màu vàng kim rất đẹp Chúng thường mọc trên những triền núi, những khe suối, nơi

ẩm ướt, tránh ánh nắng trực tiếp của mặt trời Chúng có thể sinh sản vô tính từ thân, rễ, hay sinh sản hữu tính bằng hạt nhưng tốc độ sinh trưởng và phát triển chậm, lại bị con người khai thác quá mức trong tự nhiên nên số lượng còn lại rất ít và thuộc nhóm thực vật đang nguy cấp

Trong các công tác bảo tồn, bảo vệ và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền của thực vật, việc đánh giá nguồn gen là một quá trình vô cùng quan trọng không những phục vụ cho việc phân biệt các loài khác nhau

mà còn tìm hiểu sự liên hệ về di truyền giữa các loài để bảo tồn nguồn đa dạng gen Trong thời đại mà công nghệ ngày càng phát triển, công nghệ sinh học mà đặc biệt là sinh học phân tử đã tạo ra các phương pháp đánh giá được sự đa dạng ở mức độ gen, tạo cơ sở để đánh giá tính đa dạng di truyền về bộ gen của loài Trong đó, DNA barcode là phương pháp phổ biến để xác định loài có thể

sử dụng những vùng DNA đáng tin cậy và đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới nhằm phục vụ công tác phân loại, đánh giá đa dạng sinh học và bảo tồn

Trang 14

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

nguồn gen Nhận thức được vấn đề này, tôi lựa chọn đề tài “Ứng dụng chỉ thị DNA trong phân tích đa dạng di truyền loài lan Kim Tuyến tại vùng miền núi phía bắc Việt Nam” để xác định đa dạng di truyền của loài lan Kim Tuyến, phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen của loài cây này

2 Mục tiêu của đề tài

Ứng dụng chỉ thị DNA barcode trong đánh giá đa đạng di truyền loài lan Kim Tuyến

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức

độ phân tử của loài lan Kim Tuyến

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Góp phần thu thập và lưu giữ nguồn gen của loài lan Kim Tuyến tại Việt Nam

- Góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen của loài lan Kim Tuyến

- Làm cơ sở cho việc nhận dạng, lai tạo và nhân giống, nâng cao chất lượng của các sản phẩm sử dụng nguyên liệu là lan Kim Tuyến

Trang 15

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về lan Kim Tuyến

Chi lan Kim Tuyến (Anoectochilus) là một chi thực vật có hoa thuộc họ Lan (Orchidacea) Tên lan Kim Tuyến bắt nguồn từ những đường gân lá ánh

kim rất đẹp trên lá các loài lan thuộc chi này

Ở Việt Nam hiện nay, lan Kim Tuyến được tìm thấy có tổng cộng 15 loài [3], phân bố tại các tỉnh như Lào Cai, Hà Tĩnh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Hà Giang, Lâm Đồng,… Ngoài ra, lan Kim Tuyến còn phân bố ở nhiều nơi trên thế giới như Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ, …

Lan Kim Tuyến là cây thân thảo, phần lớn sống trên mặt đất, sinh trưởng chậm, có một số loài sống trên các vách đá, có kích thước nhỏ, từ 10-20 cm, lá thường có màu xanh, xanh đậm, tím nâu hoặc màu sắc khác tuỳ thuộc vào loài, gân lá màu xanh, màu đỏ, vàng, có ánh kim cũng tuỳ theo loài, trên bề mặt lá

có lông mềm, mịn Hoa thường có màu trắng, các đài hoa và cánh hoa xếp chồng lên nhau, cùng với 2 nhuỵ và 2 nhị hoa, mọc chúc xuống

Lan Kim Tuyến được biết đến do có nhiều công dụng trong y học, là một thành phần quan trọng có trong nhiều bài thuốc cổ truyền của dân tộc Lan Kim Tuyến chứa nhiều loại hợp chất có tác dụng tốt đối với cơ thể, có thể bảo vệ gan, thận, chống ung thư [7], giảm lượng đường huyết trong máu, bảo vệ tim mạch [17],… Bên cạnh giá trị làm dược liệu, lan Kim Tuyến còn có giá trị kinh

tế cao, có giá trị làm cảnh nên đang bị khai thác quá mức, dẫn đến có nguy cơ

bị tuyệt chủng Hiện nay ở Việt Nam, nhiều loài lan Kim Tuyến đã được đưa vào danh sách các loài nguy cấp [1], có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu như không có một phương pháp bảo tồn hiệu quả

Trang 16

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

Anoectochilus regalischapaensis Anoectochilus formosanus Hayata

Ed Merkle 2007 London Orchid show 2017

Hình 1.1 Một số hình ảnh về loài lan Kim Tuyến 1.2 DNA barcode

Phương pháp phân loại hình thái là một phương pháp đã được sử dụng lâu dài và có một hệ thống phân loại riêng Phương pháp này dựa trên sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trên cơ thể thực vật, tuy nhiên sẽ gặp nhiều khó khăn khi cần xác định các mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển, các mẫu vật có nhiều đặc điểm tương đồng do thích nghi hay ở các bậc phân loại thấp như loài hoặc dưới loài Phương pháp này cũng thường chỉ được sử dụng bởi các chuyên gia về hình thái học, khiến việc phân loại tốn rất nhiều thời gian và công sức

Khái niệm về DNA barcode (mã vạch DNA) đã được đưa ra bởi Paul Heber vào năm 2003, nhằm giúp nhận diện loài, bằng cách sử dụng các trình

tự DNA như một “mã vạch” để phân loại [15] DNA barcode là một phương pháp định danh loài bằng cách sử dụng một đoạn trình tự DNA ngắn, thường

từ 400 – 800 bp, trong đó có vùng ít bị thay đổi và có vùng dễ thay đổi trong quá trình tiến hoá nằm trong hệ gen của mẫu vật đang nghiên cứu nhằm xác định xem mẫu vật đó thuộc về loài nào Ngoài ra, đoạn DNA barcode cần phải

Trang 17

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

đáp ứng được một số nhu cầu như có tính phổ biến để có thể sử dụng trên nhiều loài thực vật và có khả năng phân biệt đồng thời nhiều loài Tuỳ vào mục đích khác nhau và đối tượng nghiên cứu, người ta có thể sử dụng các gen khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen Bên cạnh việc sử dụng để nhận dạng mẫu vật, kỹ thuật này còn được kỳ vọng trong nghiên cứu và ứng dụng ở các lĩnh vực khác nhau như pháp y, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm, bảo hộ sản phẩm, nghiên cứu sản xuất y dược,…

1.3 Một số DNA barcode thường được sử dụng ở thực vật

1.3.1 DNA barcode ở thực vật

Không như ở động vật, ngoài bộ gen ở nhân và ty thể, ở thực vật còn có 1 bộ gen ở lục lạp Ở thực vật, DNA nhân, ty thể và lục lạp đều có thể sử dụng để phân loại loài

Các gen ở ty thể như COI, cytochrome b được sử dụng rộng rãi cho động vật, nhưng đối với thực vật lại thể hiện tính bảo thủ cao nên không phù hợp với việc nhận dạng bằng DNA barcode Vì vậy các vùng gen khác đã được nghiên

cứu để sử dụng trong việc nhận dạng loài như vùng exon của các gen rbcL, matK,… hay các vùng intron của các gen trnL, trnL – F,… Bên cạnh đó, một số gen thuộc nhóm DNA nhân thường sử dụng là 18S, 26S, ITS [9], [11],…

Tuy vậy, hệ gen lục lạp thường được dùng để thực hiện DNA barcode vì DNA trong lục lạp có mối liên hệ với hệ thống di truyền ngoài nhân của thực vật và hệ thống tổng hợp protein của lục lạp Bên cạnh đó chúng có số lượng khá lớn từ 1000 đến 10000 bản sao gen lục lạp trên mỗi tế bào thực vật Vì vậy chúng rất phù hợp cho việc nhận dạng loài, đặc biệt là các loài có mối quan hệ

họ hàng, gần gũi với nhau hay đặc điểm hình thái tương đồng

1.3.2 Gen ITS

Vùng gen ITS chứa các vùng ít bị thay đổi nên rất nhiều mồi đã được

thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự Bên cạnh đó, vùng gen ITS có ở

Trang 18

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

nhiều loài thực vật, và có mặt rộng rãi dưới kích thước 700bp ở các loài thực

vật có hoa [8] Các trình tự ITS đa dạng hơn trình tự của các gen DNA ribosome

và hiệu quả cả ở các loài có quan hệ họ hàng gần Vùng ITS cũng được di truyền

từ cả thế hệ bố và mẹ, khiến cho chúng cũng có thể được sử dụng để kiểm tra

sự lai chéo Tuy nhiên các trình tự như ITS1 và ITS2 có hàm lượng GC cao,

khiến cho việc giải trình tự có thể gặp khó khăn

Hình 1.2 Hình ảnh miêu tả vị trí của vùng gen ITS 1.3.3 Gen rbcL

Gen rbcL là một trình tự gen rất đặc trưng, mã hoá cho các tiểu đơn vị

lớn của Rubilose- 1,5- biphosphate cacboxylase/oxygenase (RUBISCO),

rbcL là gen đầu tiên được sử dụng một cách rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài ở thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn trong ngân hàng gen

Ưu điểm của rbcL là sự dễ khuếch đại, tuy nhiên khả năng phân biệt loài của rbcL lại thấp nên được các nhà nghiên cứu cho rằng nên kết hợp cùng với các chỉ thị khác

IG S

5,8s

Trang 19

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

Hình 1.3 Hình ảnh miêu tả vị trí gen rbcL trên cây Arabidopsis thaliana 1.3.4 Gen matK

Trong số các gen lục lạp, gen matK được biết đến như là một trong những

gen có tốc độ tiến hoá nhanh nhất, là một khung đọc mở (ORF) có kích thước khoảng 1500 bp, tương ứng với khoảng 500 amino acid cho sản phẩm được dịch mã và mã hoá cho protein maturase K tham gia vào quá trình sau phiên

mã của quá trình sinh tổng hợp RNA vận chuyển amino acid Lysin Gen matK

cho thấy khả năng cao giúp phân biệt các loài thực vật hạt kín [18]

Hình 1.4 Hình ảnh miêu tả vị trí của gen matK [14]

1.4 Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật

Hiện nay, việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các mẫu vật, các loài trên thế giới có ý nghĩa ngày càng lớn Cho đến tháng 6 năm 2021, Barcode of Life Data System đã ghi nhận 12.884.744 mẫu vật, 9.549.858 mẫu vật được nhận diện đại diện cho 324.144 loài trên toàn thế giới Đối với thực vật đã có 537.297 mẫu vật được ghi nhận, 292.724 mẫu được nhận diện mã vạch cùng

Trang 20

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

với 78.771 loài được nhận diện mã vạch Để hoàn thiện việc nhận dạng các loài trên thế giới bằng việc sử dụng DNA barcode, rất nhiều nhà khoa học cũng như các viện nghiên cứu đã hợp tác phát triển cũng như nghiên cứu để cho ra được kết quả này

Ở Việt Nam cũng như trên toàn thế giới, việc nghiên cứu và nhận dạng các loài và mẫu vật bằng việc sử dụng DNA barcode ngày càng trở nên phổ biến và đạt được nhiều thành tựu lớn

Nghiên cứu của Shiou Yih Lee và các công sự (2016) đã cung cấp phương pháp xác định các mẫu vật trầm hương trên thị trường một cách hiệu quả, cũng như cung cấp các thông tin để bảo tồn các loài trầm hương đang nguy cấp do bị khai thác quá mức [19].

Lê Thanh Hương cùng các cộng sự (2016) đã công bố nghiên cứu “Ứng dụng mã vạch DNA hỗ trợ định loại loài một số mẫu sâm thuộc chi nhân sâm

(Panax L.)” bằng việc sử dụng 5 loại DNA barcode khác nhau là 18S, ITS, matK, psbA-trnH và rbcL để nhận diện 11 mẫu nghiên cứu, giúp nhận diện ra

một số loài quý hiếm có nhiều công dụng và cần được bảo tồn nhưng khó nhận dạng do hình dáng tương đồng như Sâm Ngọc Linh, và loài dễ nhầm lẫn với Tam thất hoang là Sâm Vũ Diệp [4]

T.Gunnels và các cộng sự (2020) đã sử dụng các đoạn mồi đặc trưng cho

vùng ITS ở nấm linh chi để thực hiện nghiên cứu đã chỉ ra rằng nghiên cứu mã vạch DNA sử dụng vùng trình tự ITS đạt được hiệu quả cao với các sản phẩm

thảo dược có nguồn gốc từ linh chi, giúp xác định chất lượng sản phẩm, ngăn chặn việc trộn lẫn các chất, các loài khác trong các sản phẩm có nguồn gốc từ linh chi [20]

Nghiên cứu của A.Naeem và cộng sự (2014) đã đánh giá 2 vùng mã vạch

là matK và rbcL, để so sánh các loài thuộc họ cau, từ đó chỉ ra rằng vùng rbcL

có khả năng phân biệt các loài thuộc họ cau hơn matK, lên đến 90%, từ đó giúp

lập hệ thống mã vạch để phân biệt các loài thực vật thuộc họ cau [7]

Trang 21

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

1.5 Ứng dụng DNA barcode ở loài lan

Hiện nay, ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về loài lan ứng dụng kỹ thuật DNA barcode Các nghiên cứu này giúp phát triển thêm những nghiên cứu ứng dụng các loại chỉ thị phân tử, đặc biệt là DNA barcode vào việc nhận diện, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn,… các loài thực vật nói chung và loài lan nói riêng

Năm 2014, Hye Min Kim và cộng sự đã sử dụng 647 vùng trình tự gen

lục lạp là rbcL, matK, atpF-atpH IGS, psbK-psbI IGS và trnH-psbA IGS từ 89 loài Phong lan, đã tìm ra được sự kết hợp giữa các vùng atpF-atpH IGS, psbK- psbI IGS và trnH-psbA IGS là sự lựa chọn tốt nhất để định danh loài lan bằng

cách sử dụng kỹ thuật DNA barcode tại Hàn Quốc [12]

Tại Việt Nam, Vũ Thị Huyền Trang và cộng sự đã công bố nghiên cứu

“Đặc điểm di truyền trình tự loài lan Hài hồng Paphiopedilum delenatii đặc hữu Việt Nam” Nghiên cứu đã giải trình tự, phân tích đặc điểm di truyền sử dụng

6 vùng trình tự rpoB, rpoC1, trnH-psbA, ITS, matK và trnL, từ đó nhận dạng

loài, giúp hạn chế việc mua bán trái phép các loài lan quý hiếm do nhận dạng sai với cái loài lan thương mại [6]

Huỳnh Hữu Đức và cộng sự năm 2019 đã công bố nghiên cứu “Nghiên cứu sử dụng một số DNA barcode trong phân tích di truyền và nhận diện một

số loài lan Kim Tuyến (Anoectochilus spp.)” Bằng việc phân tích di truyền của

6 mẫu giống lan, dựa trên 9 vùng gen rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2, ITS1, ITS2, ITS, nhóm nghiên cứu đã nhận diện và phân biệt 6 mẫu nhóm lan,

từ đó mở ra cơ hội đê bảo tồn và khai thác nguồn gen của các loài lan Kim Tuyến này một cách hợp lý [2]

Trang 22

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu lan được thu thập tại một số tỉnh thành như Hà Giang, Bắc Kạn, Lào Cai, Thái Nguyên, Lạng Sơn

Bảng 2.1 Mẫu lan Kim Tuyến thu thập được ở một số tỉnh thành phía

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Trong nghiên cứu có sử dụng một số hóa chất, dụng cụ và các trang thiết

bị, được liệt kê trong các bảng dưới đây:

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

Trang 23

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

13 Máy đo nồng độ DNA Nano Drop One Thermo Scientific

Trang 24

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Phòng sinh học phân tử khoa CNSH-CNTP Đại học Nông

lâm Thái Nguyên, Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2020 đến tháng 11/2021 2.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Đánh giá hình thái loài lan Kim Tuyến từ 8 mẫu lan Kim Tuyến thu thập được từ các vùng khác nhau

Nội dung 2: Phân tích trình tự các vùng gen tương ứng với các mồi sử

dụng DNA barcode

Nội dung 3: Xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài lan Kim Tuyến

từ các mẫu đã thu thập được và giải trình tự

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách chiết DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, quyết định tới sự thành công cho các bước thí nghiệm tiếp theo Để tách chiết DNA một cách hiệu quả cần lựa chọn một phương pháp phù hợp với đối tượng nghiên cứu DNA tổng số từ mẫu lá được tách chiết dựa theo phương pháp CTAB của Doyle

[22] có cải biến theo quy trình dưới đây:

Trang 25

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

Bảng 2.5 Quy trình tách chiết DNA Bước 1 Cắt khoảng 0,2g mẫu mô lá cho vào ống eppendorf 2ml

Bước 2 Nghiền mẫu bằng máy nghiền MM400

Bước 3 Bổ sung 800µl đệm CTAB, đảo đều

Bước 6 Ly tâm 13000 vòng trên phút trong 10 phút

Bước 7 Hút dịch bề mặt bằng pipette sang ống eppendorf 1,5 ml

Bước 8 Bổ sung 600µl isopropanol và đảo nhẹ ống

2.5.2 Phương pháp kiểm tra nồng độ DNA

DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng máy đo quang phổ hấp phụ NanodropOne Các bước tiến hành như sau:

- Sử dụng giấy thấm để lau sạch 2 đầu của máy đo

- Sử dụng pipette hút 2µl nước cất khử ion nhỏ lên dụng cụ đo để cài đặt giá trị 0

Trang 26

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

- Sử dụng giấy thấm lau sạch 2 đầu của máy đo, sử dụng pipette hút 2µl dung dịch DNA cần đo nhỏ lên dụng cụ đo để đo nồng độ và ghi lại giá trị đã đo được

- Sau mỗi lần đo cần sử dụng giấy thấm vệ sinh máy đo

Từ các mẫu DNA đã tách được, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để tiến

hành khuếch đại số lượng DNA Tiến hành nhân 3 đoạn gen ITS1, matK và rbcL từ DNA tổng số đã tách chiết bằng phản ứng PCR với các cặp mồi: ITS1-

L1F và ITS1-R: matK-1F và matK-1R; rbcL-1F và rbcL-1R Thí nghiệm được

Trang 27

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

Hình 2.1 Chu trình nhiệt chạy PCR khuếch đại DNA

Sau khi chạy xong phản ứng PCR, kiểm tra sản phẩm bằng cách chạy điện di trên gel Agarose

2.5.3 Phương pháp điện di trên gel agarose

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel Agarose

theo các bước sau:

- Đun gel agarose 1%, để cho gel nguội đến khoảng 50-60oC

- Bổ sung 3µl Ethidium Bromide

- Lắc đều, đổ gel vào khuôn có cài sẵn răng lược cho đến khi gel đông lại

- Trộn đều mẫu cần điện di với đệm tra mẫu (loading dye) với tỷ lệ mẫu

và đệm là 10µl:2µl

- Nhấc lược ra khỏi bản gel

- Tra dung dịch mẫu đã trộn đều với loading dye vào giếng Dung dịch đệm mẫu có tác dụng làm tăng trọng lượng riêng của acid nucleic, vì vậy nó sẽ kéo phân tử acid nucleic lắng xuống đáy giếng, sau đó đặt bản gel vào bể điện

di đã được đổ đầy bởi dung dịch TAE 1X (ngập bản gel)

Trang 28

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

- Tiến hành chạy điện di ở 100V Quan sát khi mẫu chạy được 2/3 bản gel (khoảng 25 phút) thì tắt máy, nhấc bản gel ra và đặt vào máy soi gel để quan sát các băng DNA và chụp ảnh

2.5.4 Phương pháp phân tích trình tự gen và mối quan hệ di truyền

Sản phẩm PCR vùng gen kiểm tra được giải trình tự bởi 1st BASE tại Singapore

Kết quả giải trình tự được xử lý thô để loại bỏ các vùng có tín hiệu nhiễu, không rõ ràng nhằm chỉnh sửa các vị trí lỗi do giải trình tự Trình tự sau khi được xử lí sẽ được sử dụng để so sánh với các trình tự tương ứng đã được công

bố và các loài có trên GenBank Việc phân tích trình tự được hỗ trợ bởi các phần mềm như SnapGene Viewer 5.2.4; BioEdit 7.2 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng cách sử dụng phần mềm MEGA X theo phương pháp Maximum – Likelihood với giá trị bootstrap là 1000

Trang 29

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả đánh giá hình thái

Kết quả đánh giá một số đặc điểm hình thái các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được tóm tắt ở bảng dưới đây:

Bảng 3.1 So sánh một số đặc điểm hình thái giữa các mẫu lan Kim Tuyến Mẫu Hình dạng lá Màu sắc lá Màu sắc thân Màu sắc gân lá HG1 Lá hình trứng

Mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới có màu xanh tím

Thân màu xanh đậm

Gân lá màu vàng, có ánh kim

HG2 Lá hình trứng

Mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới có màu tím hồng

Thân cây màu xanh nhạt

Gân lá màu hồng, có ánh kim

Gân lá màu bạc, có ánh kim

HG4 Lá hình trứng

Mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới màu xanh tím

Thân cây màu xanh đậm hơi ngả tím

BK Lá hình trứng

Mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới có màu tím hồng

Thân cây màu xanh đậm

LS Lá hình trứng

Thân cây màu xanh

LC Lá hình trứng

Mặt trên màu xanh, mặt dưới có màu xanh nhạt

Thân cây có màu xanh nhạt

Gân lá màu bạc, có ánh kim

TN Lá hình trứng

Thân cây màu xanh nhạt

Gân lá màu hồng, có ánh kim Phân tích các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được cho thấy có sự đa dạng

về hình thái giữa các cá thể chủ yếu ở đặc điểm các bộ phận như màu sắc lá, màu sắc thân, màu sắc gân lá, cụ thể như sau:

- HG1: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu

Trang 30

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu vàng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá có màu trắng xanh, hơi ngả hồng ở gần cuống lá Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu HG1

- HG2: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu tím hồng, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá và cuống lá có màu hồng nhạt Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, phần gần các đốt, gốc cây sẫm màu hơn và hơi ngả hồng

Trang 31

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

- HG3: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh nhạt, gân lá có màu bạc, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá có màu xanh nhạt Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn

- HG4: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá có màu hồng nhạt, cuống lá có màu xanh Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn

Trang 32

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

- BK: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu tím hồng, những đường gân phụ trên lá mọc dày, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá có màu hồng nhạt, cuống lá có màu xanh Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn

Hình 3.5 Hình ảnh mẫu BK

- LS: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá có màu hồng, ngả xanh ở phần cuống lá Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn

Hình 3.6 Hình ảnh mẫu LS

Trang 33

#include <stdio.h>

#include <stdlib.h>

#include <time.h>

/*

fclose(fp);

- LC: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu Mặt trên lá có màu xanh, mặt dưới lá có màu xanh nhạt, gân lá có màu bạc, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá có màu trắng hồng nhạt, phần cuống lá có màu xanh nhạt Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt

Hình 3.7 Hình ảnh mẫu LC

- TN: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, những đường gân phụ của lá mọc dày, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm Phần bẹ lá có màu hồng, ngả xanh ở gần cuống lá Thân cây mọng nước

có màu xanh nhạt, sẫm màu hơn ở phần gốc

Hình 3.8 Hình ảnh mẫu TN

Tiêu đề	Application of DNA primers in genetic diversity analysis of Dendrobium species in Northern mountainous regions of Vietnam
Tác giả	Nguyễn Thị Hồng Ngọc
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Xuân Vũ, PGS. TS. Nguyễn Tấn Dũng
Trường học	Thái Nguyên University
Chuyên ngành	Biotechnology
Thể loại	Thesis
Năm xuất bản	2022
Thành phố	Thái Nguyên

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	2,32 MB