NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ cố ĐỊNH tế bào TRONG lên MEN rượu từ tỏi ĐEN

TÓM TẮT Tên đề tài : NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG LÊN MEN RƯỢU TỪ TỎI ĐEN Họ và tên sinh viên : Nguyễn Ngọc Vương Khóa : 2018 - 2022 Ngành : Kỹ thuật thực phẩm Nội dung nghi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC – MÔI TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG LÊN MEN RƯỢU

TỪ TỎI ĐEN

Đà Nẵng, 06/2022

Giáo viên hướng dẫn : TS Ngô Thị Minh Phương

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Ngọc Vương

Mã sinh viên

Lớp

: :

1811507310152 18HTP1

TÓM TẮT

Tên đề tài : NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG

LÊN MEN RƯỢU TỪ TỎI ĐEN

Họ và tên sinh viên : Nguyễn Ngọc Vương

Khóa : 2018 - 2022

Ngành : Kỹ thuật thực phẩm

Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện nhằm mục đích tìm ra các thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu tỏi đen ứng dụng công nghệ cố định tế bào Nội dung nghiên cứu chính bao gồm: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất mang trong lên men rượu từ tỏi đen, khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men cố định trong lên men rượu từ tỏi đen và khảo sát số lần tái sử dụng hạt nấm men trong lên men rượu tỏi đen Ngoài ra nội dung nghiên cứu còn bao gồm việc xác định các hoạt chất trong tỏi đen và đề xuất quy trình lên men rượu tỏi đen ứng dụng công nghệ cố định tế bào

Kết quả đạt được

- Đề xuất quy trình sản xuất rượu tỏi đen ứng dụng công nghệ cố định tế bào

- Xác định hoạt chất trong tỏi đen và rượu tỏi đen là flavonoid và phenolic acid

- Xác định hàm lượng chất mang trong cố định tế bào là 20%, tỷ lệ nấm men cố

định trong lên men rượu tỏi đen là 0,6%, và khảo sát được hạt nấm men sẽ được sử dụng

và tái sử dụng 4 lần mà vẫn giữ được hoạt lực lên men, không ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

KHOA CN HÓA HỌC – MÔI TRƯỜNG

CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Giảng viên hướng dẫn: TS Ngô Thị Minh Phương

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngọc Vương Mã SV: 1811507310152

1 Tên đề tài:

Ứng dụng công nghệ cố định tế bào trong lên men rượu từ tỏi đen

2 Các số liệu, tài liệu ban đầu:

3 Nội dung chính của đồ án:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan lý thuyết

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

4 Các sản phẩm dự kiến

- Bài tổng hợp đồ án chi tiết

- Sản phẩm rượu tỏi đen

LỜI NÓI ĐẦU

Tỏi là một loại nông sản phổ biến ở nước ta hiện nay, là đặc sản ở một số vùng miền trên cả nước Tuy vậy, các sản phẩm về tỏi chưa được đa dạng và phổ biến trên thị trường, người tiêu dùng chủ yếu sử dụng tỏi tươi, các sản phẩm bột tỏi hay gần đây là sản phẩm tỏi đen Tỏi đen là sản phẩm lên men từ tỏi, có hàm lượng dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao hơn rất nhiều lần so với tỏi tươi Vì thế, với mục đích đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao giá trị của nguyên liệu tỏi nói chung và tỏi đen nói riêng mặc khác ứng dụng công nghệ mới trong lên men rượu là cố định tế bào nên tôi đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu ứng dụng công nghệ cố định tế bào trong lên men rượu từ tỏi đen”

Sau thời gian thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ cố định tế bào

trong lên men rượu từ tỏi đen”, dưới sự hướng dẫn tận tình của TS Ngô Thị Minh

Phương cùng với đó là sự giúp đỡ, nhận xét góp ý của các Thầy Cô giáo bộ môn và

Thầy Cô giáo phòng thí nghiệm, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình

Em xin chân thành cảm ơn và gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến quý Thầy Cô giáo trong khoa Công nghệ Hóa học-Môi trường nói chung cũng như quý Thầy Cô giáo bộ

môn Kỹ thuật Thực phẩm nói riêng và TS Ngô Thị Minh Phương đã tận tình hướng

dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em từ khi nhận đề tài đến lúc hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình Cảm ơn cô đã luôn định hướng, chỉ dẫn và dành thời gian, tâm huyết

để truyền đạt kiến thức giúp em hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Hoàng Phúc Sơn đã tận tình

giúp đỡ, hỗ trợ và giải quyết những khó khăn về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất và nhiều vấn đề trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Em cũng chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trong Hội đồng Bảo vệ Tốt nghiệp đã dành thời gian để đọc, nhận xét và đưa ra lời góp ý để em hoàn thiện đồ án tốt nghiệp một cách tốt nhất

CAM ĐOAN

Kính gửi: Hội đồng bảo vệ đồ án tốt nghiệp Khoa Công nghệ Hóa học-Môi trường

Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật-Đại học Đà Nẵng Tôi tên: Nguyễn Ngọc Vương, Lớp 18HTP1-Khoa Công nghệ Hóa học-Môi trường, ngành Kỹ thuật thực phẩm, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật-Đại học Đà Nẵng

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ cố định tế bào trong

lên men rượu từ tỏi đen” dưới sự hướng dẫn của TS Ngô Thị Minh Phương là công

trình nghiên cứu độc lập được thực hiện bởi bản thân tôi Các nội dung, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được thu nhập

từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung

đồ án của mình

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Vương

MỤC LỤC

Nhận xét của người hướng dẫn

Nhận xét của người phản biện

Tóm tắt

Nhiệm vụ đồ án

Lời nói đầu i

Cam đoan ii

Mục lục iii

Danh sách các bảng, hình vẽ vii

Danh sách các ký hiệu, chữ viết tắt x

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 4

1.1 Tổng quan về nguyên liệu tỏi đen 4

Tổng quan về tỏi 4

Tổng quan về tỏi đen 8

Thành phần hóa học của tỏi đen 9

Quá trình sản xuất tỏi đen 10

Công dụng 12

1.2 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae 13

Đặc điểm của nấm men 13

Cấu tạo nấm men Saccharomyces cerevisiae 14

Thành phần hóa học 15

Hình thức sinh sản của nấm men 16

Sự sinh trưởng của nấm men 16

Dinh dưỡng nấm men 17

1.3 Tổng quan về quá trình lên men rượu 18

Khái niệm 18

Vi sinh vật chủ yếu 19

Cơ chế quá trình lên men rượu 19

Các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men rượu 20

1.4 Công nghệ cố định tế bào trong lên men 21

Ưu và nhược điểm của nấm men cố định 22

Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào 22

Kỹ thuật cố định tế bào 23

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong và ngoài nước 26

Tình hình trong nước 26

Tình hình ngoài nước 27

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Đối tượng nghiên cứu 29

2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng 29

Hóa chất 29

Dụng cụ 29

Thiết bị 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 30

Phương pháp vi sinh 30

Phương pháp hóa học 30

Bảo quản nấm men và hoạt hóa nấm men 32

Phương pháp vật lý 34

Cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae 34

Quy trình chế biến rượu lên men tỏi đen dự kiến 36

Thuyết minh quy trình 37

2.5 Bố trí thí nghiệm 39

Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng chất mang trong lên men rượu tỏi đen 39 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men trong lên men rượu từ tỏi đen 40

Khảo sát số lần tái sử dụng hạt nấm men cố định trong lên men rượu tỏi đen

40

2.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm 41

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Xác định một số thành phần hóa học của tỏi đen 42

3.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng chất mang trong lên men rượu tỏi đen 43

Ảnh hưởng của hàm lượng chất mang đến hàm lượng chất khô trong quá trình lên men rượu tỏi đen 44

Ảnh hưởng của hàm lượng chất mang đến độ pH của quá trình lên men rượu tỏi đen 46

Ảnh hưởng của hàm lượng chất mang đến nồng độ rượu sau quá trình lên men rượu tỏi đen 47

Kết luận 48

3.3 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men cố định trong lên men rượu tỏi đen 51

Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men cố định đến hàm lượng chất khô trong quá trình lên men rượu tỏi đen 51

Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men cố định đến độ pH trong quá trình lên men rượu tỏi đen 52

Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men cố định đến nồng độ rượu trong quá trình lên men rượu tỏi đen 54

Kết luận 55

3.4 Kết quả khảo sát số lần tái sử dụng hạt nấm men cố định trong lên men rượu tỏi đen 56

3.5 Xác định hàm lượng các chất trong rượu tỏi đen 57

3.6 Xác định các chỉ tiêu cảm quan của rượu tỏi đen 58

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

Tài liệu tham khảo 60Phục lục

DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ

BẢNG 1.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TỎI 7BẢNG 1.2 BẢNG SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC GIỮA TỎI ĐEN VÀ TỎI TƯƠI 10BẢNG 1.3 THÀNH PHẦN SINH KHỐI CỦA NẤM MEN 15BẢNG 1.4 PHÂN LOẠI CÁC LOẠI CHẤT MANG 23BẢNG 1.5 ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 26BẢNG 3.1 MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TỎI ĐEN 42BẢNG 3.2 SỰ KHÁC NHAU CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT KHÔ GIỮA LÊN MEN RƯỢU TỎI ĐEN BẰNG NẤM MEN TỰ DO VÀ NẤM MEN CỐ ĐỊNH 45BẢNG 3.3 SỰ KHÁC NHAU CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT KHÔ TRONG LÊN MEN RƯỢU TỪ TỎI ĐEN VÀ LÊN MEN RƯỢU MÃNG CẦU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 46BẢNG 3.4 KẾT QUẢ ĐO SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT MANG ĐẾN NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ, PH VÀ ĐỘ RƯỢU TRONG LẦN THỨ NHẤT SỬ DỤNG HẠT NẤM MEN 48BẢNG 3.5 KẾT QUẢ ĐO SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT MANG ĐẾN NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ, PH VÀ ĐỘ RƯỢU TRONG LẦN THỨ HAI SỬ DỤNG HẠT NẤM MEN 48BẢNG 3.6 KẾT QUẢ ĐO SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT MANG ĐẾN NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ, PH VÀ ĐỘ RƯỢU TRONG LẦN THỨ BA SỬ

DỤNG HẠT NẤM MEN 49BẢNG 3.7 KẾT QUẢ ĐO SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT MANG ĐẾN NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ, PH VÀ ĐỘ RƯỢU TRONG LẦN THỨ BA SỬ

DỤNG HẠT NẤM MEN 49BẢNG 3.8 BẢNG ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ƯU THÍCH SẢN PHẨM RƯỢU VỚI HÀM LƯỢNG CHẤT MANG 5%, 10%, 20% 50BẢNG 3.9 BẢNG SO SÁNH SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LÊN NẤM MEN ĐẾN NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ TRONG TRƯỜNG HỢP SỬ DỤNG NẤM MEN TỰ DO

VÀ NẤM MEN CỐ ĐỊNH 52

BẢNG 3.10 BẢNG SO SÁNH SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LÊN NẤM MEN ĐẾN

ĐỘ PH TRONG TRƯỜNG HỢP SỬ DỤNG NẤM MEN TỰ DO VÀ NẤM MEN CỐ

ĐỊNH 53

BẢNG 3.11 BẢNG SO SÁNH SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LÊN NẤM MEN ĐẾN NỒNG ĐỘ RƯỢU TRONG TRƯỜNG HỢP SỬ DỤNG NẤM MEN TỰ DO VÀ NẤM MEN CỐ ĐỊNH 54

BẢNG 3.12 BẢNG ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ƯU THÍCH SẢN PHẨM RƯỢU VỚI TỶ LỆ NẤM MEN 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% 55

BẢNG 3.13 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ, PH, ĐỘ RƯỢU QUA 4 LẦN TÁI SỬ DỤNG 56

BẢNG 3.14 BẢNG TÍNH CHẤT CẢM QUAN CỦA SẢN PHẨM RƯỢU TỎI ĐEN 58

HÌNH 1.1 CÂY TỎI 4

HÌNH 1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CÂY TỎI 5

HÌNH 1.3 ẢNH MINH HỌA HỢP CHẤT ALLICIN TRONG TỎI 6

HÌNH 1.4 TỎI ĐEN 9

HÌNH 1.5 NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE 13

HÌNH 1.6 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH LÊN MEN RƯỢU 18

HÌNH 1.7 ẢNH MINH HỌA CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 21

HÌNH 2.1 NẤM MEN SAU NHÂN GIỐNG VÀ LY TÂM 34

HÌNH 2.2 CÁCH TẠO HẠT NẤM MEN CỐ ĐỊNH 35

HÌNH 2.3 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH TẠO HẠT NẤM MEN CỐ ĐỊNH 35

HÌNH 2.4 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CHẾ BIẾN RƯỢU LÊN MEN TỪ TỎI ĐEN DỰ KIẾN 36

HÌNH 2.5 NGÂM TỎI VỚI BIA 37

HÌNH 2.6 TỎI ĐEN SAU KHI Ủ 37

HÌNH 2.7 SẢN PHẨM RƯỢU TỎI ĐEN 39

HÌNH 3.1 DỊCH TỎI ĐEN ĐANG LÊN MEN BẰNG CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 43

HÌNH 3.2 HẠT NẤM MEN CỐ ĐỊNH 44

HÌNH 3.3 ĐỒ THỊ THỂ HIỆN SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT

MANG 44HÌNH 3.4 SỐ LƯỢNG HẠT NẤM MEN Ở HÀM LƯỢNG CHẤT MANG 5%, 10%, 20% 45HÌNH 3.5 ĐỒ THỊ THỂ HIỆN SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT

MANG ĐẾN ĐỘ PH 46HÌNH 3.6 ĐỒ THỊ THỂ HIỆN SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG CHẤT

MANG ĐẾN NỒNG ĐỘ RƯỢU 47HÌNH 3.7 ĐỒ THỊ THỂ HIỆN SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NẤM MEN ĐẾN NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ 51HÌNH 3.8 ĐỒ THỊ THỂ HIỆN SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NẤM MEN ĐẾN ĐỘ

PH 53HÌNH 3.9 ĐỒ THỊ THỂ HIỆN SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NẤM MEN ĐẾN NỒNG ĐỘ RƯỢU 54HÌNH 3.11 HẠT NẤM MEN CỐ ĐỊNH SAU 4 LẦN TÁI SỬ DỤNG 57HÌNH 3.12 ĐỒ THỊ SO SÁNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG TỎI ĐEN VÀ RƯỢU TỎI ĐEN 58HÌNH 3.13 SẢN PHẨM RƯỢU TỎI ĐEN 58

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT:

5-HMF : 5- hydroxymethylfurfural

LDL : low density lipoprotein cholesterol-lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp HDL : high density lipoprotein cholesterol-lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao AST : Aspartate transaminase là một enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa amin trong cơ thể

ALT : Alanine transaminase

Kda : kilodalton

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay, với sự phát triển của xã hội, các sản phẩm đồ uống chứa cồn đã và đang được sử dụng một cách phổ biến bởi người tiêu dùng Mặc khác, với sự phát triển thông tin trên toàn thế giới dẫn đến người tiêu dùng có kiến thức và hiểu biết hơn về sản phẩm mình lựa chọn Vì thế các sản phẩm đem lại lợi ích về sức khỏe, ứng dụng những phương pháp tiên tiến, có lợi đang là sự lựa chọn hàng đầu Trong quá trình sản xuất rượu hiện nay, phương pháp lên men phổ biến là sử dụng nấm men tự do Nấm men sẽ được loại

bỏ sau khi kết thúc quá trình lên men gây lãng phí Hơn thế nữa, nấm men trong dịch lên men có thể không được lọc triệt để, trong quá trình bảo quản, phần nấm men còn sót lại có thể bị lắng xuống đáy ảnh hưởng đến chất lượng cũng như tính chất cảm quan của sản phẩm Vì thế hiện nay phương pháp cố định tế bào trong lên men đang là một lựa chọn tối ưu vì có nhiều lợi ích hơn so với phương pháp lên men bằng nấm men tự do như lợi ích về mặt kinh tế, cải thiện mùi vị sản phẩm, tăng tính chất cảm quan cho sản phẩm

Theo Phòng Kinh tế và hạ tầng nông thôn huyện Lý Sơn (Quảng Ngãi), vụ Đông Xuân năm 2021-2022, sản lượng tỏi huyện Lý Sơn ước khoảng 1,225 tấn, năng suất bình quân là 37,69 tạ/ha, chỉ đạt khoảng 30,1% so với năm trước.Trong khi đó, giá tỏi Lý Sơn giảm sâu, chỉ còn từ 40.000-50.000 đồng/kg Tỏi là loại nông sản phổ biến khắp cả nước, nhưng các sản phẩm từ nguyên liệu tỏi lại xuất hiện rất ít trên thị trường, trong đó có tỏi đen Tỏi đen là một sản phẩm có chức năng tuyệt vời đối với sức khỏe người tiêu dùng như: khả năng chống oxy hóa, giảm viêm, giảm mỡ trong máu Với các chức năng trên cộng thêm việc đa dạng hóa sản phẩm, đưa các sản phẩm liên quan đến tỏi đen gần hơn với người tiêu dùng thì chế biến đồ uống có cồn là một giải pháp tốt giúp tăng giá trị sử dụng và kinh tế của tỏi đen

Bên cạnh đó, kỹ thuật cố định các xúc tác sinh học nói chung và kỹ thuật cố định

tế bào nói riêng đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời sống Các loại hình kĩ thuật này đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế thiết thực và nhanh chóng đi vào thực tế [1] Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ các tế bào trong một

không gian phản ứng và vẫn giữ được tính chất xúc tác và có thể được tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục để sản xuất những sản phẩm theo mong muốn [1] Với tiềm năng to lớn

về nguồn nguyên liệu cũng như nhằm đa dạng hóa các sản phẩm rượu trên thị trường, tạo ra loại rượu đặc trưng mang thương hiệu Việt Nam Để giải quyết những vấn đề trên,

chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ cố định tế bào trong lên men

rượu từ tỏi đen” Hiện nay một số sản phẩm sử dụng phương pháp cố định đã được áp

dụng

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tổng quan về phương pháp cố định tế bào trong lên men rượu

- Khảo sát các yếu tố trong lên men rượu từ tỏi đen ứng dụng công nghệ cố định

4 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu xuyên suốt quá trình là tỏi Hà Nội sau khi được ủ lên men

tạo thành tỏi đen Cùng với đó là giống nấm men Saccharomyces cerevisiae được cố

định trong hạt Natri alginate Sau đó tiến hành lên men rượu tỏi đen bằng phương pháp

cố định tế bào

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vật lý, hóa học, sinh học, phương pháp xử lý số liệu như excel…

6 Bố cục đồ án tốt nghiệp

Bố cục đồ án tốt nghiệp bao gồm các phần sau:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan lý thuyết

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.1 Tổng quan về nguyên liệu tỏi đen

Tổng quan về tỏi

Tỏi (danh pháp hai phần: Allium sativum) hay còn gọi là tỏi ta là một loài thực

vật thuộc họ Hành, nghĩa là có họ hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây, v.v và cũng được con người sử dụng làm gia vị, thuốc, rau [2]

Hình 1.1 Cây tỏi Tên khoa học : Allium sativum

Giới (regnum) : Plantae

Bộ (ordo) : Asparagales

Họ (family) : Hành (Alliaceae)

Phân họ (subfamily) : Hành (Allioideae)

Tông (tribus) : Hành (Allieae)

Chi (genus) : Hành tây (Allium)

Loài (Species) : Allium sativum

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái cây tỏi Tỏi thuộc nhóm thực vật thân thảo Thân thực hình trụ, phía dưới mang nhiều rễ phụ, phía trên mang nhiều lá Lá cứng, rộng 1–2,5 cm, hình dải có rãnh khía, mép lá hơi ráp

Thân cây có màu xanh lục, có hoa mọc ở đỉnh thân Thân mọc trực tiếp từ dưới

củ, vươn thẳng lên hay còn được gọi là cán hoa, có chiều cao 15-55 cm Rễ chùm, củ tỏi mọc trên nền đất, có nhiều tép tỏi nhỏ, phần hay được sử dụng nhất của cả cây tỏi là củ tỏi

Ở mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép tỏi; các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ tỏi Củ tỏi nằm phía dưới mặt đất Là bộ phận quan trọng nhất của cây tỏi

Hoa tỏi: Hoa xếp thành tán ở ngọn thân trên một cán hoa dài 55cm hay hơn Cán hoa mọc trực tiếp từ củ tỏi, bao hoa màu trắng hay hồng bao bởi một cái mo dễ rụng tận cùng thành mũi nhọn dài Hoa ra vào tháng 5-7, quả tháng 9-10 [3]

1.1.1.2 Điều kiện sinh thái

Tỏi rất dễ trồng nên phân bố rất rộng rãi Ở Việt Nam có nhiều vùng đất trồng tỏi nổi tiếng như đảo Lý Sơn, Phan Rang, Bắc Giang Trong đó Huyện đảo Lý Sơn là vùng đất nổi tiếng nhất về việc trồng tỏi Tỏi là cây chịu lạnh tốt, cây có thể sinh trưởng

và phát triển ở nhiệt độ 18-20°C, còn để tạo củ thì cần từ 20-22°C Tỏi ưa ánh sáng dài ngày, nếu có đủ nắng trong 12 giờ/ngày thì cây sẽ ra củ nhanh

Tỏi cũng là loại cây ưa nước nhưng ở mức độ vừa phải Nếu thiếu nước cây sẽ đanh lại, củ nhỏ còn nếu thừa nước thì sẽ gây ra hiện tượng úng củ, thối củ làm cho củ không giữ được lâu Tỏi được chia làm 2 loại bào gồm tỏi trắng có lá xanh đậm, to bản,

củ to, đường kính khoảng 4cm Củ tỏi vỏ màu trắng nên gọi là tỏi trắng, loại tỏi này bảo quản kém Và tỏi tía có lá dày, cứng màu xanh nhạt, củ chắc và cay, dọc thân gần củ có màu tía Củ tỏi tía nhỏ hơn củ tỏi trắng (đường kính 3,5-4 cm) Tỏi tía cỏ hương vị đặc biệt nên được trồng nhiều

1.1.1.3 Phân loại

Cây tỏi có nguồn gốc từ vùng Trung châu Á và từ những năm 3000 trước công nguyên, tỏi được biết đến ở Hy lạp, Ấn Độ, Trung Quốc và được biết đến từ thời kỳ cổ đại

Ở Việt Nam có rất nhiều loại tỏi khác nhau, được trồng ở các tỉnh khác nhau: Tỏi tím (Tỏi Bắc): Quả vừa, vỏ có màu tím, các tép tỏi không đều nhau, nhiều tinh dầu, vị cay, thơm, được trồng ở các tỉnh phía Bắc vào khoảng tháng 1-2, thu hoạch vào tháng 5-6

Tỏi trắng: Củ to, màu trắng, cứng chắc chắn, có mùi thơm đặc trưng Được trồng nhiều ở các tỉnh phía Nam, nhất là ven biển miền Trung, đảo Lý Sơn-Quảng Ngãi, Bình Thuận và Ninh Thuận [3]

1.1.1.4 Thành phần hóa học của tỏi

Tỏi chứa nhiều chất như: khoáng chất, protein, đường, các vitamin A, B1, B2 và các chất kháng khuẩn khác, Các hợp chất có mùi như allylmetyl sunfua, disunfua, diallyl sunfua, 2-propen thiol [4]

Hình 1.3 Ảnh minh họa hợp chất Allicin trong tỏi

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tỏi

nguyên liệu tỏi

b Cải thiện quá trình oxy hóa

Tỏi có thể cải thiện quá trình oxy hóa trong động mạch và các triệu chứng ở bệnh nhân có hội chứng gan phổi Bốn thành phần S-allylcysteine, S-allyl-mercaptocystein, alliin và allicin có tác dụng ức chế sự biến đổi oxy-hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp in vitro

Ngoài ra, trong tỏi còn có chứa alliin, chất chống oxy và một số thành phần như selenium, vitamin C, vitamin E…có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các khối ung bướu

d Giảm cholesterol và mỡ trong máu

Allicin làm giảm nồng độ của lipid toàn phần, phospholipid, triglyceride và cholesterol toàn phần trong huyết thanh và gan

Cùng với allicin và allyl mercaptan và diallyl disulfide làm tăng sự ức chế sinh tổng hợp cholesterol

e Chống tăng huyết áp

Tỏi có thể làm tăng sản sinh oxit nitric dẫn đến làm giảm huyết áp Adenosin có tác dụng hạ áp, làm giãn các mạch máu ngoài biên, làm giảm huyết áp và tham gia điều hòa tuần hoàn trong động mạch vành

f Giảm đường huyết

Allicin làm giảm đường máu và tăng hoạt tính của insulin phụ thuộc vào liều lượng Tác dụng hạ đường máu của cao tỏi có thể do sản sinh insulin

Tổng quan về tỏi đen

Tỏi đen (Black garlic) là sản phẩm lên men tự nhiên từ tỏi tươi trong thời gian 30-60 ngày dưới tác động của nhiệt độ và độ ẩm thích hợp (60-90oC, 80-90%) Quá trình

này làm cho tỏi đen có vỏ màu trắng xám đến nâu nhạt, ruột màu đen, vị ngọt, mùi thơm, mềm dẻo như thạch và không cay nồng như tỏi tươi [6]

Hình 1.4 Tỏi đen Tỏi tươi đã được con người sử dụng làm thức ăn từ rất lâu cũng như được dùng làm thuốc trong điều trị nhiều bệnh cấp tính và mãn tính Lịch sử sử dụng tỏi cũng như các nghiên cứu khoa học về tỏi đều cho thấy không có tác dụng phụ đáng kể Nguồn gốc chính xác của tỏi đen cũng không được biết rõ và còn nhiều tranh cãi Tuy nhiên, tỏi đen cũng đã được sử dụng ở Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan từ nhiều thế kỷ trước và hiện nay việc sử dụng đã lan rộng ra nhiều nước châu Á, dưới dạng gia vị cho nhiều món ăn hoặc thực phẩm hỗ trợ sức khỏe [7] So với tỏi tươi, tỏi đen không còn mùi hăng và vị cay nồng Đó là do quá trình lên men đã làm giảm hàm lượng allicin trong tỏi tươi, giúp chuyển allicin thành các hợp chất alkaloid và flavonoid mang nhiều hoạt tính sinh học hơn allicin Nhiều hoạt tính sinh học quý đã được nghiên cứu, chứng minh như: chống oxy hóa, chống dị ứng, chống đái tháo đường, chống viêm, chống ung thư,…[8]

Thành phần hóa học của tỏi đen

Tỏi đen trải qua quá trình bị tác động bởi nhiệt, một số chất trong tỏi tươi được chuyển hóa thành các hợp chất Amadori/Heyns thông qua phản ứng Maillard [6]

Thành phần hóa học của các hợp chất trong tỏi đen khá phức tạp, phụ thuộc vào quá trình sản xuất tỏi đen Tuy nhiên, tỏi đen chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hơn tỏi tươi, như (S-allyl cysteine), đặc biệt là chứa nhiều polyphenol, flavonoid, và một vài sản phẩm của phản ứng Maillard có hoạt tính chống oxy hóa [9][10] Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tỏi đen có hoạt tính sinh học mạnh hơn, chẳng hạn có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn tỏi tươi

Một vài nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng các đường tan trong nước, các amino acid, các polyphenol và các flavonoid toàn phần tăng hoặc giảm trong quá trình tác động bởi nhiệt [9] Cụ thể, 3 hợp chất Amadori và 3 hợp chất Heyns trong tỏi đen có hàm lượng cao gấp 40-100 lần so với tỏi tươi Ngược lại, trải qua quá trình lên men bởi nhiệt, hàm lượng các fructan trong tỏi đen giảm đáng kể so với tỏi tươi, do fructose, glucose và một số amino acid đã tham gia phản ứng Maillard trong quá trình lên men tỏi

Bảng 1.2 Bảng so sánh thành phần hóa học giữa tỏi đen và tỏi tươi

(Tăng/giảm so với tỏi tươi)

Hàm lượng trong tỏi tươi

1 Đường tan trong nước Tăng 1,88-7,91 lần 450 mg/g

2 Polyphenol toàn phần Tăng 4,19 lần 13,91 mg/g (tính

Quá trình sản xuất tỏi đen

Quá trình tạo tỏi đen từ tỏi tươi thực chất là quá trình lên men, dựa vào tác động của nhiệt, ẩm và men Trong quá trình này sự biến đổi và tạo thành các chất mới trong tỏi phụ thuộc vào thời gian và chịu ảnh hưởng của cả 3 yếu tố trên

1.1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến chất lượng tỏi đen

Thời gian lên men tỏi được rút ngắn nếu tăng nhiệt độ Thời gian lên men ở 70oC giảm còn một nửa so với khi ủ tỏi ở 60oC Theo đánh giá cảm quan, ủ tỏi ở nhiệt độ 70-

80oC cho chất lượng tốt hơn và tỏi có màu đen đều hơn Nếu ủ ở 90oC, tỏi sẽ có mùi

khét, vị đắng và chua Nếu ủ ở 60oC, tỏi sẽ có màu đen không đều, vì ở nhiệt độ này quá trình lão hóa không xảy ra hoàn toàn

Khi độ ẩm của tỏi đạt 400-500 g/kg, tỏi đen có thể chất mềm dẻo, rất thích hợp cho việc sử dụng bằng cách ăn trực tiếp Tỏi sẽ khô và cứng hơn nếu độ ẩm 350-400 g/kg, sẽ rất cứng nếu độ ẩm dưới 350 g/kg, và khó dùng để ăn trực tiếp Hơn nữa, tốc độ lên men tỏi rất chậm ở 60oC Quá trình lên men ở 80-90oC diễn ra tốt nhưng lại cho sản phẩm có hàm lượng phenol và hàm lượng đường khử dao động [11]

Hàm lượng đường khử được coi là yếu tố quan trọng trong quá trình lên men, bởi quá trình tạo đường khử và một số acid amin cần phản ứng Maillard Khi ủ ở 60-

70oC, hàm lượng đường khử tăng dần trong quá trình ủ, chứng tỏ ở nhiệt độ này, quá trình tạo ra đường khử có tốc độ nhanh hơn quá trình phân hủy đường Mặc dù khi tăng nhiệt lên 80-90oC, lượng đường khử tăng lên, nhưng đây cũng không phải là nhiệt độ thích hợp, bởi tốc độ phá hủy đường cũng tăng lên tạo ra các hợp chất làm cho tỏi đen

có mùi khét, vị đắng và chua gắt Ngoài ra, sự khử các amino acid cũng được thực hiện bởi phản ứng Maillard [11]

Một trong những thành phần có hoạt tính chống oxy hóa có trong tỏi đen là 5- hydroxymethylfurfural (5-HMF), cũng là một sản phẩm quan trọng được tạo ra bởi phản ứng Maillard Hàm lượng 5-HMF tăng dần trong quá trình ủ tỏi, tuy nhiên tốc độ tăng rất chậm nếu ủ tỏi ở 60oC [11]

1.1.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến chất lượng tỏi đen

Như đã đề cập ở phần trên, nhiệt độ lên men tỏi có ảnh hưởng đến thành phần và hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen Tuy nhiên, theo những phát hiện của Jung và cộng sự [12], tỏi đen sản xuất theo phương pháp lên men chứa nhiều chất

có hoạt tính sinh học hơn tỏi đen sản xuất theo phương pháp lên men bởi nhiệt Cụ thể,

so với tỏi đen dùng nhiệt, tỏi đen lên men có hoạt tính tốt hơn trong các chứng béo phì, tăng lipid máu, bệnh lý về thận và gan Tuy nhiên, sự khác biệt về thành phần của tỏi đen khi sản xuất theo hai phương pháp dùng nhiệt hoặc lên men vẫn chưa được biết rõ Theo những kết quả nghiên cứu đã trình bày ở trên, 70oC là nhiệt độ thích hợp nhất để sản xuất tỏi đen Tuy nhiên, chất lượng của tỏi đen còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nữa, như độ ẩm và điều kiện lên men, cần có thêm đánh giá và báo cáo về ảnh hưởng của những yếu tố này [12]

Công dụng

1.1.5.1 Chống oxy hóa

Alliin là một hợp chất không ổn định trong tỏi tươi, được chuyển đổi thành một hợp chất ổn định trong tỏi đen Ngoài ra, còn chứa lượng lớn flavonoid, polyphenol Có khả năng làm giảm gốc tự do

Chiết xuất ethanol của tỏi đen gây ra độc tính tế bào trong ung thư biểu mô, ung thư biểu mô tuyến vú, tuyến dạ dày, mô gan [12]

1.1.5.2 Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư

Cơ chế tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư của tỏi đen chưa được biết rõ Tuy nhiên các nghiên cứu cho thấy dịch chiết tỏi đen có tác dụng ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm: ung thư máu, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư ruột kết [13][14]

1.1.5.3 Chức năng bảo vệ gan

Một nghiên cứu khác cho thấy tỏi đen 200 mg/kg làm giảm nồng độ alanine transaminase và aspartate transaminase trong gan trong các mô hình tổn thương gan do carbon tetrachloride và d-galactosamine gây ra của chuột Sprague-Dawley Nó cũng làm giảm nồng độ alanine transaminase và aspartate transaminase trong gan nhiễm mỡ do

hế độ ăn nhiều chất béo gây ra và mô hình tổn thương gan [15]

1.1.5.4 Chống viêm, tác động lên hệ miễn dịch

Một số nhóm nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng chống viêm và tác động lên hệ miễn dịch của tỏi thông qua các cơ chế: Giảm sự hình thành các yếu tố gây viêm, giảm phân bào [16]

1.1.5.5 Giảm lipid trong máu

Trong nhiều báo cáo, các thí nghiệm trên chuột cho thấy tỏi đen có tác dụng cải thiện cholesterol toàn phần, triglyceride, LDL và HDL [24] Theo một nghiên cứu khác trên 60 bệnh nhân tình nguyện có cholesterol máu cao được sử dụng 6g tỏi đen, 2 lần mỗi ngày trong 12 tuần Kết quả là sau 12 tuần, nhóm sử dụng tỏi đen có nồng độ HDL cao hơn và nồng độ cholesterol thấp hơn so với nhóm dùng giả dược Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng cho thấy tỏi đen có thể tác động lên trí nhớ và hệ thần kinh, cải thiện tình trạng mệt mỏi thể chất, giảm đường huyết [17]

1.1.5.6 Chống béo phì

Béo phì là một trong các tác nhân góp phần làm trầm trọng các bệnh lý đái tháo đường, bệnh tim, tăng mỡ máu, hay các bệnh về gan Những nghiên cứu trên chuột cho thấy tỏi đen có tác dụng chống béo phì thông qua các hiệu quả làm giảm cân, giảm béo, giảm triglyceride, LDL, tăng HDL, giảm các men gan AST và ALT [12]

1.2 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae

Đặc điểm của nấm men

Nấm men thường được sử dụng trong sản xuất rượu là chủng thuộc giống

Saccharomyces cerevisiae, phân bố rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, trên bề

mặt nhiều loại trái cây và các loại cây lương thực, thực phẩm khác Loài này có thể xem

là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay

Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu, và bia

Hình 1.5 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Chi (genus) : Saccharomyces

Loài (Species) : S.cerevisiae

Giống Saccharomyces có hình dáng tế bào hình cầu, hình ovan hay elip

Thường có 1-4 bào tử trong nang, ít khi có 8 bào tử Thế hệ sinh dưỡng của các giống này trong điều kiện bình thường là các thể lưỡng bội Khi già chúng thường kết thành vòng và mọc trên dịch lên men sợi giả, có thể kết màng nổi Lên men thường tốt, nhưng nồng độ đường không quá 30% và tạo thành tới 18% cồn etylic

Nhiệt độ tối đa thích hợp đối với sinh trưởng của nấm men trong khoảng 25-30℃, còn nhiệt độ tối thiểu khoảng 2-3℃ Ở 40℃, sinh trưởng ngừng lại và men bị chết Trong môi trường có nồng độ đường cao nấm men ngừng các quá trình sống

Tế bào nấm men có dạng hình cầu, hình ovan, elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi là hình sợi Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh, tế bào có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1 µm, Trọng lượng riêng của nấm men (1,055-1,060 (Da) không khác mấy so với vi khuẩn (1,050-1,142 KDa) [18]

Cấu tạo nấm men Saccharomyces cerevisiae

Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào cơ bản giống thực vật So với vi khuẩn tế bào nấm men tiến hóa hơn về mặt cấu trúc

- Vỏ tế bào:

Bao quanh nấm men Cấu tạo bởi protein, polysaccharide, phosphate và lipid Trong thành phần polysaccharide có chứa glucan (chủ yếu) và manan (chiếm 90% chất khô của vỏ)

Glucan là thành phần chính của vỏ, là một polymer của glucose Nằm phía trong tiếp giáp màng tế bào chất Nếu lớp glucan bị phá hỏng thì toàn bộ tế bào bị phá hủy Manan có thể kết hợp với protein tạo thành lớp mannoprotein rất khó phá hủy

Màng tế bào chất: Là lớp màng mỏng, dày 0,1 nm dính chặt với tế bào chất Chức năng của màng tế bào chất:

+ Bảo vệ, hàng rào thẩm thấu

+ Điều chỉnh chất dinh dưỡng từ ngoài vào trong và ngược lại

+ Thực hiện tổng hợp thành phần của vỏ tế bào

+ Nơi khu trú của một số enzym và bào quan (ribosome)

Vận chuyển vật chất qua màng liên quan đến tính thẩm thấu chọn lọc màng tế bào Đặc tính này phụ thuộc enzyme phospholipase và lipase

Bảng 1.3 Thành phần sinh khối của nấm men

Thành phần Hàm lượng (%) Chất vô cơ 5-10

Thành phần hóa học của tế bào nấm men có thể thay đổi phụ thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng, mức độ tăng trưởng của giống nấm men và điều kiện nuôi cấy

Protein: Nấm men có hàm lượng protein trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô) và khoảng 45% protein hoàn chỉnh Các dẫn xuất của acid nucleic như bazơ purin

và pyrimidine, các acid amin tự do đều được coi là protein nguyên liệu

Lipit: Chất béo trong tế bào nấm men có các acid oleic, linoleic, palmitic Trong chất béo có tới 30-40% phosphatid

Các nguyên tố vi lượng: Các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng đối với sinh sản và hoạt động sống của nấm men

Vitamin và nhân tố sinh trưởng: Để cho nấm men được phát triển bình thường và lên men được bình thường cần phải có các vitamin làm cofactor trong nhiều enzyme của

tế bào nấm men [18]

Hình thức sinh sản của nấm men

Sinh sản vô tính bằng nảy chồi, các tế bào mẹ không chuyển trực tiếp các vật liệu sang tế bào con mà ở chỗ các mấu chồi sẽ tổng hợp các vật liệu vỏ tế bào và tích tụ ở đây để chuyển sang tế bào con Chỗ mấu chồi là các sẹo thường ở đầu cong nhất của tế bào (ở đó có thể tròn hoặc xoắn)

Ngoài ra, đôi khi giống Saccharomyces cũng có thể sinh sản hữu tính, với các

pha đơn bội, nhị bội Tế bào nhị bội có thể sinh sản vô tính lâu dài không hạn chế, khi gặp điều kiện không thuận lợi sẽ chuyển sang sinh bào tử nang chứa các bào tử đơn bội Mỗi bào tử thuộc về một trong hai típ tiếp hợp [18]

Sự sinh trưởng của nấm men

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong lên men, gồm 4 pha: pha thích nghi, pha tăng trưởng, pha cân bằng, pha suy vong

Pha thích nghi: (pha lag) nấm men mới cấy vào môi trường, đang thích nghi với

môi trường mới Vận tốc sinh trưởng coi như bằng không, nồng độ chất dinh dưỡng còn rất nhiều Đây là thời kỳ tiềm phát của nấm men, trong đó một số tế bào bị ức chế, thậm chí có thể chết Số lượng tế bào nấm men trong giai đoạn này không tăng hoặc tăng không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ Kích thước tế bào tăng, hàm

lượng protein, acid nucleic tăng lên Trong môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng, nấm men cấy vào càng trẻ khỏe và pha lag càng ngắn

Pha tăng trưởng: (pha log) tăng sinh khối, tế bào phát triển ồ ạt theo cấp số nhân:

20 + 21 + 22 + 23 + 24 + +2n với tốc độ tăng trưởng là cực đại Kích thước tế bào nấm men ở pha này nhìn chung là nhỏ nhất, vì chúng còn phải sinh sản Đối với tế bào trong pha này chúng có hoạt tính sinh lý, sinh hóa rất đặc trưng và rất nhạy cảm với những nhân tố bất lợi của môi trường

Trong pha này, chất dinh dưỡng giảm mạnh và bắt đầu xuất hiện sản phẩm trao đổi chất không cần thiết đối với giống và quá trình chuyển sang pha ổn định Nếu là quá trình thu sinh khối ta nên thu vào cuối giai đoạn này

Pha cân bằng: quần thể tế bào ổn định, tỉ lệ sinh ra bằng tỷ lệ mất đi Sản phẩm

trao đổi chất tích tụ nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt Thu sản phẩm trao đổi chất trong pha này

Pha suy vong: tế bào chết, dinh dưỡng cạn kiệt và tế bào chất tăng dần Tế bào

nấm men có khả năng tự phân do enzyme protease nội bào Các tế bào sống trở nên già

đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt Tế bào chất bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn lại những hạt cầu béo nhỏ [18]

Dinh dưỡng nấm men

- Cacbon:

Nấm men có thể sử dụng đường làm nguồn cacbon, không sử dụng trực tiếp tinh

bột, cellulose, hemicellulose Nấm men Saccharomyces sử dụng glucose, fructose,

maltose, saccharose, galactose, không sử dụng được pentose, lactose, melibiose

Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose được sử dụng trước, kế tiếp là acid béo tùy thuộc vào thành phần của các acid này Trong đó acid acetid và glucose được sử dụng đồng thời Nấm men sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng có lợi trước

Ngày nay người ta đang nghiên cứu vai trò của CO2 trong trao đổi chất của nấm men, vì CO, là chất hoạt động sinh học Những dạng liên kết với CO, đều cần thiết cho nấm men, như acid pyruvic, acid cacbonic, và hàng loạt acid hữu cơ khác

- Nitơ: Nguồn nitơ cần thiết cho việc tổng hợp các cấu tử trong tế bào, là những

hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ

Tuy nhiên nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nitơ chính là muối amoni: amoni sulfate, phosphate, muối acetate, lactate, malate, Trong môi trường chứa muối amoni, đặc biệt là sulfate thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid sử dụng sau hoặc làm acid hóa môi trường Môi trường lỏng amoniac (NH3), là môi trường lý tưởng cho nấm men chỉ sau acid amin Nấm men sử dụng cả ure và pepton Nấm men tiêu hóa tốt acid amin tự nhiên, các nucleotide purine, pyrimidin, protein, một số amin, còn pepton kém hơn và không sử dụng protein Các acid amin đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng nitơ và cacbon Nấm men chỉ sử dụng acid amin dạng tự nhiên Hàm lượng nitơ phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện hiếu khí, chủng loại nấm men

Lưu huỳnh có trong protein và coenzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ phá hỏng sự trao đổi chất và tổng hợp enzyme, protein Trong điều kiện kỵ khí, S bị khử thành H2S Nguyên tố vi lượng cũng cần thiết cho quá trình sinh lý tế bào như: mangan, đồng, sắt, kẽm, [18]

1.3 Tổng quan về quá trình lên men rượu

Khái niệm

Lên men rượu là quá trình lên men được thực hiện nhờ nấm men trong điều kiện yếm khí, cơ chất chủ yếu là đường được chuyển thành rượu etylic và CO2, đồng thời giải phóng năng lượng [19]

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình lên men rượu

Phương trình tổng quát:

C6H12O6 + 2(P) + 2ADP → 2C2H5OH + 2CO2↑ + 2ATP

Vi sinh vật chủ yếu

Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men có tính kỵ khí không bắt buộc, chúng

có khả năng hô hấp và lên men Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men, S.cerevisiae cần

có oxy để hô hấp và tổng hợp sterol cần cho việc cấu trúc màng tế bào Giai đoạn sau thì ở điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt

Cơ chế quá trình lên men rượu

Đường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấp thụ và khuếch tán vào trong tế bào nấm men qua màng tế bào Trong khi nước ra vào tự do qua màng

tế bào nấm men, thì đường và các chất dinh dưỡng khác được màng tế bào chỉ cho đi vào mà không cho quay ra Trong tế bào nấm men, nhờ hoạt động sống của tế bào, nhờ hoạt động xúc tác của hàng loạt men mà những phản ứng sinh hóa phức tạp xảy ra và dẫn đến tổng hợp chất này, phân hủy chất kia Rượu etylic và CO2 tạo thành liền thoát

ra khỏi tế bào Rượu etylic tan tốt trong nước, do vậy nó khuếch tán rất nhanh vào môi trường xung quanh [20]

Ngoài sản phẩm chính là ethanol thì quá trình lên men rượu còn ra nhiều sản phẩm phụ khác nhau như: glycerin, aldehyde acetic, các acid succinic, acetic, lactic và citric, các este rượu bậc cao

Trong quá trình này xảy ra 2 giai đoạn

- Thời kỳ cảm ứng:

Lượng acetaldehyde (CH3CH=O) tạo thành còn ít

Ion H+ được chuyển từ NADH2 đến glyceraldehyde-3-phosphate để tạo thành glycerin-3-phosphate

Sau đó glycerin-3-phosphate bị khử gốc phosphate để tạo thành glyxerin

Phương trình tổng quát:

Glyceracetaldehyde-3-phosphate Glyceryl-3-phosphate Glyceryl

- Thời kỳ tỉnh:

- P NADH2 NAD+

Khi lượng acetaldehyde (CH3CH=O) tạo thành đạt được một lượng nhất định, acetaldehyde bị khử tạo thành rượu etylic

Glycerin chỉ được tạo thành từ thời kỳ cảm ứng do nó chỉ là sản phẩm phụ trong khi lên men trong môi trường acid

Phương trình tổng quát quá trình này như sau:

C6H12O6 + 2(P) + 2ADP → 2C2H5OH + 2CO2↑ + 2ATP

Các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men rượu

1.3.4.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản và phát triển của nấm men và

chất lượng của sản phẩm Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong

giới hạn 28-32℃ Nhiệt độ càng thấp khả năng lên men cao, thời gian lên men bị kéo dài hơn, tuy nhiên lại hạn chế được sự nhiễm khuẩn Nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men

sẽ giảm nhanh và dễ nhiễm nấm men dại

Mặt khác nhiệt độ còn ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của sản phẩm; Khi lên men ở điều kiện nhiệt độ lạnh thì hương, vị của rượu sẽ có mùi vị của trái cây và tươi hơn, hàm lượng acid bay hơi thấp hơn, hàm lượng glycerin sẽ tăng hơn [19]

1.3.4.2 pH môi trường

Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men Có khả năng tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng của nấm men Độ pH tối ưu của môi trường là 4,5-5,5 [19]

1.3.4.3 Nồng độ đường của dịch lên men

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy: hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men là 12-20%, còn ở hàm lượng đường 25% sẽ ức chế quá trình lên men

Mặt khác tỉ lệ các loại đường có trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy: glucose

là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của nấm men cũng như quá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructose và saccarose vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men và chất lượng của sản phẩm [19]

1.3.4.4 Nồng độ oxy của môi trường

Sự cung cấp oxy cần thiết cho giai đoạn đầu sinh khối nấm men vào dịch lên men

Độ thoáng khí gây bất lợi cho quá trình lên men rượu khi bắt đầu sang giai đoạn lên men, sự lên men xảy ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn [19]

CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường Tuy nhiên, nó cũng

có thể ức chế hoạt động nấm men, làm giảm khả năng sinh sản nhưng không làm yếu khả năng lên men [19]

1.3.4.6 Nồng độ cồn etylic

Nấm men thuộc giống Saccharomyces lại có thể chịu được 9-12% thể tích cồn và

lên men đạt tới 14-16% thể tích Trong quá trình lên men rượu, nồng độ rượu tăng dần

sẽ gây ức chế không chỉ cho các hoạt động sống của nấm men mà còn kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzym chuyển hóa đường thành rượu, khả năng sống sót của nấm men phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ rượu có trong dịch lên men [19]

1.4 Công nghệ cố định tế bào trong lên men

Kỹ thuật cố định các xúc tác sinh học nói chung và kỹ thuật cố định tế bào nói riêng đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời sống Các loại hình kĩ thuật này đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế thiết thực và nhanh chóng đi vào thực tế

Hình 1.7 Ảnh minh họa cố định tế bào

Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ các tế bào trong một không gian phản ứng và vẫn giữ được tính chất xúc tác và có thể được tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục

để sản xuất những sản phẩm theo mong muốn Nói cách khác cố định tế bào nhằm hạn chế mọi sự vận động vật lý của các tế bào bằng cách cố định chúng trên các vật thể gọi

là chất mang bằng nhiều phương pháp như hấp thụ, liên kết ion, liên kết nguyên tử, bọc trong gel mà không ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của chúng

Ưu và nhược điểm của nấm men cố định

1.4.1.1 Ưu điểm

- Có thể tái sử dụng nhiều lần

- Sản phẩm sạch và giảm chi phí tinh sạch

- Bền với môi trường nhờ sự bảo vệ của chất mang

- Điều chỉnh hình dạng, kích thước phù hợp với thiết bị

- Hạn chế được sự rửa trôi của tế bào trong quá trình sản xuất liên tục

1.4.1.2 Nhược điểm

- Hoạt lực tế bào thấp hơn so với lên men tự do vì tế bào tiếp xúc qua cơ chất phải

thông qua chất mang nên việc trao đổi chất diễn ra khó khăn hơn so với lên men tự do

- Cơ chất và sản phẩm phải thông qua chất mang để trao đổi nên vận tốc phản ứng

chậm dẫn đến quá trình lên men có thể chậm hơn so với lên men tự do

- Lựa chọn kỹ cơ chất phù hợp để tránh hiện tượng cạnh tranh giữa chất mang với

cơ chất

Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào

1.4.2.1 Yêu cầu của chất mang

Chất mang trong phương pháp cố định tế bào cần phải đảm bảo được các yếu tố sau:

- Có tính trơ cao (bền hóa học), không bị hòa tan, không tác dụng với những sản

phẩm thức cấp sinh ra trong quá trình lên men có trong dịch lên men

- Có tình bền sinh học (không bị phá hủy bởi vi sinh vật)

- Có tính chất cơ lý bền vững, ổn định để chịu được tác động của môi trường

- Không gây ức chế hay làm mất đi hoạt tính enzyme của vi sinh vật

- Có độ xốp để quá trình trao đổi chất qua chất mang của vi sinh vật được thực hiện

dễ dàng

- An toàn với môi trường và có khả năng bám dính tốt để dễ gắn vi sinh vật vào

- Không cạnh tranh với cơ chất và phù hợp với hình dạng thiết bị

- Rẻ tiền và dễ tìm kiếm [21][22]

1.4.2.2 Phân loại chất mang

Có hai loại chất mang đó là: chất mang tự nhiên bao gồm tinh bột, cellulose, agar, alginate, BC (bacterial cellulose),… và chất mang nhân tạo bao gồm polyme từ mủ cao

su, poly triren, poly acetate,…

Các chất mang hay sử dụng hiện nay gồm có:

- Cellulose: giá rẻ, tính cơ lý khá tốt nhưng không đồng nhất và ổn định nên chỉ sử

dụng ở dạng sợi và vi hạt

- Agarose: ổn định, đồng nhất, dễ tạo hạt, tuy nhiên giá cao nên thường không được

sử dụng trong sản xuất mà chỉ dùng trong nghiên cứu, y học

- Alginate: tạo gel trong môi trường có CaCl2, để nhốt enzyme và tế bào, nhưng tính chất không ổn định trong môi trường có phosphate Dù vậy, đây là vật liệu dễ tìm,

rẻ (acid alginic có trong rong biển), có khả năng tạo gel, tạo hạt Nên ứng dụng nhiều trong công nghiệp, cố định tế bào và enzyme

- Poly acrylamide: có nhiều đặc tính quý như: bền, tính trơ cao, độ trương tốt, độ

đồng nhất cao, kích thước lỗ gel có khả năng điều chỉnh, diện tích tiếp xúc lớn Tuy nhiên giá thành khá cao

- Seolite: Men/2O.Al2O3.xSiO2.yH2O là các tinh thể aluminosilicate, có cấu trúc không gian ba chiều, mang các lỗ xốp có kích thước cỡ phân tử Được dùng nhiều trong

cố định nấm men [21][22]

Bảng 1.4 Phân loại các loại chất mang [22]

Phân loại Tên chất mang

Hữu cơ Tự nhiên Agar, cellulose, alginate, BC (bacterial cellulose),…

Nhân tạo Poly acrylamide, poly styrene, poly vinyl

Vô cơ Tự nhiên Seolit, silicate,…

Nhân tạo Alumium oxide (Al2O)

Kỹ thuật cố định tế bào

1.4.3.1 Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang

a Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang

Vật liệu: Thủy tinh xốp, cellulose, than, các oxit kim loại, đất hiếm, cao lanh,… Nguyên tắc thực hiện: thông qua các liên kết cộng hóa trị (giữa nhóm amin và nhóm cacboxyl), liên kết tĩnh điện giữa những bề mặt mang điện tích, lực Vandewalls Các phương pháp gắn này cụ thể dựa trên những nguyên tắc sau:

- Gắn tế bào bằng liên kết ion: dựa vào sự tích điện trái dấu giữa tế bào và chất

mang

- Gắn tế bào bằng liên kết cộng hóa trị: có thể xảy ra 2 trường hợp:

+ Trường hợp 1: Chất mang có chứa các nhóm có thể tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein vi sinh vật

+ Trường hợp 2: Phải hoạt hóa chất mang bằng cách gắn lên chất mang với tế bào

vi sinh vật

Ưu, nhược điểm của phương pháp: Phương pháp này có thể tạo ra được những liên kết hóa học mạnh giữa tế bào và chất mang Tuy nhiên, để tạo ra các mối nối đồng hóa trị này thường tốn công và mắc tiền [21][22]

+ Trường hợp 2: Đối với chất mang không có lỗ xốp (thủy tinh) tế bào sẽ bám trên bề mặt chất mang

+ Trường hợp 3: Khi chất mang tích điện (nhựa trao đổi ion) chúng sẽ tạo liên kết ion

Phương pháp thực hiện: tế bào vi sinh vật được phối trộn với chất mang trong môi trường lỏng, khuấy trộn trong điều kiện thích hợp, sau đó rửa bã để loại bỏ phần tế bào vi sinh vật dư

Ưu và nhược điểm: Ưu điểm của phương pháp là dễ thực hiện, đơn giản Tuy nhiên, có nhược điểm là liên kết vật lý này rất yếu nên vi sinh vật dễ tuột khỏi chất mang [21][22]

1.4.3.2 Phương pháp nhốt tế bào vào hệ gel

Đối với phương pháp bao trong gel thì tế bào được bao bọc trong các chất polyme

tự nhiên hay tổng hợp có khả năng gel hóa Hình dáng bề ngoài của các chất xúc tác sinh học đã được cố định theo phương pháp bọc gel có thể thay đổi theo yêu cầu ví dụ hình cầu, hình trụ, sợi mảnh hay màng mỏng, nhưng dạng hình cầu là thông dụng nhất

Vật liệu: Có thể sử dụng các loại vật liệu sau để cố định tế bào vi sinh vật:

- Ion gel: Các polymer mà tế bào gắn kết với nhau tạo thành mạng lưới bằng liên

kết ion

- Covalent gel: Polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, tạo thành một

mạng lưới

- Cryogel: Là cấu trúc gel polymer mới được tạo bởi phương pháp lạnh đông các

tiểu phần polymer có phân tử lượng cao hay thấp

- Alginate: Là vật liệu lấy từ rong biển, có khả năng tạo gel tốt, rất tốt để bao gói

enzyme hay tế bào vi sinh vật

Nguyên tắc thực hiện: Trong hệ gel các polymer sẽ tạo thành mạng lưới bao bọc

tế bào Mạng lưới có lỗ nhỏ đến mức tế bào không thể ra ngoài, nhưng đủ lớn để cơ chất

và sản phẩm chui vào Đối với chất mang tạo liên kết ion, ta trộn chung huyền phù tế bào và hỗn hợp chất mang đa diện tích và dung dịch đa diện tích trái dấu

Với chất mang polymer như covalent: trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với các monomer rồi đem trùng hợp, hoặc trộn chung với polymer tạo liên kết giữa các sợi polymer

Đối với gel alginate ta tiến hành như sau: Đầu tiên gel alginate được đun sôi để nguội đến 30oC Sau đó khuấy trộn alginate và huyền phù tế bào tỷ lệ 1:1, khuấy nhẹ 30 vòng/phút, trong 5-10 phút Tạo hình, cố định hình trong dung dịch CaCl2 Tiếp theo rửa nước vô trùng và bảo quản lạnh

Ưu và nhược điểm: Phương pháp này có ưu điểm là hiệu suất cao, tế bào ít bị rửa trôi Tuy nhiên, vì nằm trong khuôn gel nên không chịu được khuấy trộn Các tế bào

trong khuôn gel phân bổ không đồng đều, các tế bào nằm trên bề mặt sẽ tham gia lên men Đồng thời sản phẩm trao đổi chất làm trương nở hạt gel, gây dễ vỡ [21][22]

Bảng 1.5 Ưu và nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào

Hấp phụ lên bề

mặt rắn

Phương pháp đơn giản, điều kiện nhẹ nhàng, đảm bảo sự sống tốt cho tế bào

Lực liên kết yếu, tế bào dễ bị tách khỏi nếu có lực cơ học, số lượng tế bào bị hấp phụ thấp

Tạo liên kết cộng

hóa trị

Độ bền giữa các liên kết tốt, khả năng trao đổi chất cao

Tế bào gắn vào khả năng sống thấp, hoạt lực thấp Do đó, đòi hỏi tế bào phải

có khả năng tạo liên kết với chất mang

Nhốt vào hệ gel Hiệu suất nhốt cao, độ

bền cao, có khả năng ứng dụng với nhiều loại tế bào

Hoạt tính tế bào thấp hơn tế bào tự do,

bì vị chất mang cản trở Có thể xảy ra

sự cạnh tranh giữa chất mang và cơ chất Những sản phẩm bậc hai tích tụ có khả năng làm hư hỏng chất mang

Một trong các chiến lược cải tiến quá trình lên men etanol là áp dụng kĩ thuật cố định tế bào để thu được quá trình lên men có năng suất và hiệu suất cao Trong số các chất mang trong kĩ thuật cố định tế bào ứng dụng trong lên men cồn thì natri-alginate được sử dụng rộng rãi nhất do gel có độ xốp cao cho phép cơ chất và sản phẩm lên men

đi vào, đi ra được dễ dàng tạo thuận lợi cho việc trao đổi chất Sự khuếch tán của glucose

và etanol vào và ra khỏi mạng lưới gel rất cao khoảng 90% so với trong nước và do tính tương thích sinh học rất tốt cho phép các tế bào sống duy trì hoạt động sống của mình khi cố định trên mạng lưới gel, không độc, không gây ức chế hoạt động sống của tế bào

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong và ngoài nước

Tình hình trong nước

Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể liên quan đến đề tài lên men rượu tỏi đen bằng bằng phương pháp cố định tế bào Nhưng đã có nhiều báo cáo nghiên cứu liên quan đến phương pháp cố định tế bào trong lên men rượu, cụ thể như:

- Ngày 25/12/2012, Nguyễn Thị Hương và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Cố định

tế bào nấm men ứng dụng trong lên men cồn từ rỉ đường” Với các mục đích: lựa chọn nồng độ chất mang Na-Alginate phù hợp cho quá trình cố định tế bào, lựa chọn nồng độ dung dịch gel CaCl2 phù hợp cho quá trình cố định tế bào, lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp trong dung dịch chất mang cho khả năng giam giữ và độ bền của hạt tế bào cố định tốt nhất, lựa chọn tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định, cuối cùng là đánh giá hoạt lực lên men của tế bào cố định theo thời gian lên men [1]

- Năm 2014, Ngô Thị Minh Phương, thực hiện đề tài “Nghiên cứu cố định vi khuẩn

Lactobacillus plantarum trên natri alginate và ứng dụng lên men tạo nước cà chua bổ

sung Probiotic” với mục tiêu chính là khảo sát nồng độ natri alginate và CaCl2 trong quá

trình tạo hạt, tạo hạt vi gói cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum, khảo sát khả năng sống sót của Lactobacillus plantarum trên natri alginate trong thời gian bảo quản, khảo sát khả năng sống sót của Lactobacillus plantarum trên natri alginate trong thời gian bảo

quản và ứng dụng sản xuất nước cà chua lên men tạo sản phẩm probiotic [23]

Tình hình ngoài nước

Hiện nay trên thế giới các đề tài liên quan đến lên men tỏi đen còn rất hạn chế Nhưng giống với trong nước, các đề tài liên quan đến cố định tế bào trong lên men rượu xuất hiện khá nhiều, cụ thể như:

- Năm 1991, Francesc Gòdia và cộng sự thực hiện đề tài ”Application of

Immobilized Yeast Cells to Sparkling Wine Fermentation” Với mục đích chính khảo sát quá trình lên men bằng phương pháp cố định tế bào bằng cách sử dụng hai kỹ thuật tạo hạt khác nhau: hạt gel đơn giản và hạt gel có lớp phủ bên ngoài không có tế bào xung quanh Trong kỹ thuật tạo hạt đầu tiên, hạt alginate canxi 2% với 109 tế bào/g hạt và hàm lượng hạt là 12g/lọ ở trong điều kiện tối ưu Đối với hạt gel có lớp phủ bên ngoài, liều lượng có thể giảm xuống 6g/lọ Trong cả hai trường hợp, các đặc tính cảm quan của rượu vang sủi bọt đã được cải thiện so với quá trình lên men rượu thông thường [24]

- Năm 2013, Anna Puig-Pujol và cộng sự thực hiện đề tài “Application of a New

Organic Yeast Immobilization Method for Sparkling Wine Production” Với mục đích

áp dụng phương pháp cố định nấm men trong lên men rượu vang Dữ liệu thu được sau nghiên cứu cho thấy hiệu quả lên men bằng phương pháp cố định tế bào và kết quả của