TIỂU LUẬN: CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO doc

8 Chính vì vậy mà Tổ chức Y tế Thế giới xếp bệnh lở mồm long móng đứng đầu các bệnh truyền nhiễm của động vật trong danh mục kiểm dịch quốc tế.. Vì hiện nay những nước đã khống chế được

Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Bộ môn Công nghệ sinh học

Lớp DH06SH

Bài tiểu luận:

CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT

NUÔI CẤY TẾ BÀO

Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Duy Lan

_Tháng 10/2009

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành chăn nuôi được coi là một trong những ngành hàng quan trọng để chuyển đổi cơ cấu

và thúc đẩy tăng trưởng nông nghiệp Tuy nhiên, điều quan trọng hàng đầu là trong quá trình chọn giống và nuôi dưỡng chăm sóc, đàn gia súc phải luôn luôn khỏe mạnh, sức đề kháng cao và thành phần các chất dinh dưỡng tích lũy vào thịt có chất lượng tốt và có giá trị sinh học

Bệnh lở mồm long móng (tiếng Anh: Foot-and-mouth disease, viết tắt FMD; tiếng Latin:

Aphtae epizooticae), là một loại bệnh rất nguy hiểm do virus gây ra trên động vật móng

guốc chẵn như heo, bò, trâu, hươu, dê Bệnh này rất nguy hiểm vì bệnh lây lan rất nhanh trên diện rộng qua nhiều con đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, truyền qua không khí Mặc dù tỷ lệ gây chết chỉ cao trên heo con, bê nghé; còn trên các gia súc lứa và trưởng thành nếu được điều trị tốt thú có thể phục hồi sau 1-2 tuần, song thiệt hại về kinh tế rất lớn, do tính lây lan quá mạnh (8)

Chính vì vậy mà Tổ chức Y tế Thế giới xếp bệnh lở mồm long móng đứng đầu các bệnh truyền nhiễm của động vật trong danh mục kiểm dịch quốc tế

Vì hiện nay những nước đã khống chế được bệnh rất hạn chế nhập khẩu gia súc, hoặc các sản phẩm động vật từ các nước chưa khống chế được bệnh LMLM, đây chính là mối nguy hại cho đầu ra của ngành chăn nuôi, cũng như sự phát triển của nó

Hình: Friedrich Loeffler Đây là minh chứng đầu tiên cho thấy một bệnh trên động vật do tác nhân qua lọc gọi là virus gây ra, mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành virus học (Virology)

1929: Những trường hợp cuối cùng ở Mỹ

1953: Những trường hợp cuối cùng ở Canada và Mexico

1993: Italy

1997: Đài Loan (Taiwan)

2001: Anh (United Kingdom)

Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 and 1981 Dịch bệnh lở mồm long móng đã xảy ra ở nhiều châu lục như châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ (7)

Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001 Hàng triệu gia súc

bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế các quốc gia này nói chung

Cùng năm đó, dịch cũng đã xảy ra tại Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan

Đến cuối năm 2003, dịch xảy ra ở vùng Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia,

Malaysia, Myanma, Philippines và Việt Nam Một năm sau, dịch lan tới Trung Quốc, Nga, Mông Cổ và tiếp tục ở Myanma

Hình: Các đợt dịch FMD năm 2003 Trong 2 năm 2005 và 2006, dịch tràn tới Nam Mỹ ở các quốc gia như Brasil, Argentina và Paraquay cũng như ở châu Phi (Nam Phi) (1)

Việt Nam

Năm 2006 là năm bệnh dịch lở mồm long móng xảy ra rất mạnh ở hầu hết các tỉnh thành của Việt Nam với hàng chục nghìn gia sục bị nhiễm bệnh Tuy nhiên, do điều kiện cũng như ý thức của người dân, trình độ và sự thiếu trách nhiệm của cán bộ thú y và chính quyền địa phương mà dịch bệnh không thể khống chế dễ dàng Một số nơi, còn sử dụng các con vật đã chết làm thức ăn

2.1.2 Phân bố bệnh trên thế giới

Các type huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới Type huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới Trái lại các type huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi Typ huyết thanh Asia 1 được tìm thấy

ở nhiều nước thuộc châu Á Riêng type huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như Philippines

Theo tài liệu của Cục Thú y, dòng virus gây bệnh LMLM trên gia súc ở Việt Nam thuộc type O, gần đây có xuất hiện virus type A ở miền Trung và virus type Asia 1 ở các tỉnh miền núi phía bắc (5)

Hình: FMD type O virus từ phía Bắc Việt Nam

Tính tới ngày 1/11/2009:

Ở Tuyên Quang: Ngày 25/10/2009, dịch Lở mồm đã xảy ra trên địa bàn xã Công Đa của huyện

Yên Sơn làm 17 con trâu mắc bệnh Kết quả xét nghiệm bệnh phẩm dương tính với chủng vi rút Lở mồm long móng type O Hiện tại, địa phương đang tiến hành các biện pháp phòng, chống dịch theo quy định

Hiện nay, cả nước còn 10 tỉnh là: Quảng Nam, Đăk Lăk, Yên Bái, Sơn La, Hà Giang, Quảng Ninh,

Gia Lai, Hòa Bình, Lai Châu và Tuyên Quang có dịch LMLM chưa qua 21 ngày

2.2 Giới thiệu về virus lở mồm long móng

2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, hình thái

Virus lở mồm long móng ( Foot and Mouth Desease Virus) được phát hiện bao gồm một sợi đơn RNA, kích thước khoảng 8500 base, được bao bọc bởi bốn protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4) tạo thành lớp vỏ capsid có 20 mặt (icosahedral) (1)

VP1, VP2, VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt đối xứng (phân tử 12S) còn VP4 là protein bên trong capside, kết dính ARN virus với mặt trong của capside

Hình: Cấu trúc FMD Virus FMD Virus thuộc họ Picorna Viridae có 7 type (O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1, mỗi type còn có nhiều phụ type, thí dụ như các tiểu type O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1, C2, C3 … căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên) Các type virus phân

bố không đều nhau trên thế giới, type O là type phổ biến trên thế giới hơn cả Các type khi giám định huyết thanh đều không có miễn dịch chéo, và trong các ổ dịch, động vật có thể mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều type huyết thanh Vì thế, nếu có sự biến đổi về mặt di truyền dẩn đến biến đổi về mặt kháng nguyên virus ở các ổ dịch thì việc kiểm soát bệnh bằng vaccine cũ sẽ không có hiệu quả

Virus type A là nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất Type A có đến 32 type phụ

Và hiện nay người ta vẫn chưa thống nhất được với nhau về số lượng kiểu di truyền của virus type A khi giải trình tự gen VP1 Với virus type C việc giải trình tự gen VP1 cho phép phân chúng thành 8 nhóm di truyền Virus type Asia 1 có sự đa dạng di truyền ít nhất, chỉ có 1 nhóm di truyền Giải trình tự gen VP1, type SAT1 có 3 nhóm, SAT2 có 2 nhóm và SAT3 có 3 nhóm di truyền phân bố theo khu vực địa lý rõ ràng

Sự biến đổi của các type huyết thanh cũng khá phức tạp, đôi khi còn những điều chưa được hiểu biết rõ Do đó ngành thú y phải chọn vaccine đúng với type đang gây bệnh để tiêm phòng

+ Trong phân ủ thành đống virus tồn tại 7 ngày

+ Nước tiểu virus tồn tại 39 ngày

+ Virus FMDV không có vỏ bọc, nên chúng có sức đề kháng cao đối với các dung môi

hữu cơ ( cồn, ete…)

+ Mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol, …

+ Virus bền vững trong khoảng pH = 7 – 7,7 Nhanh chóng bị vô hoạt ở độ pH cao hoặc

thấp (pH <2 và pH>11) Ở pH = 6, virus mất khả năng gây nhiễm

2.2.2 Yếu tố độc tính (1)

Function Viral factors Host factors

Adsorption and

penetration Capsid proteins (VP1 to 3)

Integrins, other receptors (?), entry factors (?)

RNA replication S region, poly(C), cre, 2B, 2C, 3A, 3B, 3Cpro, 3Dpol Cellular membranes, PCBP, PABP Assembly and

maturation

Capsid proteins (VP0, VP1, and VP3), 3Cpro, 2A, viral RNA Cellular membranes (?) Bảng: Các yếu tố của virus và tế bào chủ có thể quyết định độc lực

Các nghiên cứu cho thấy virus có trình tự RGD của VP1 G-H loop thì hoặc sẽ đột biến

hoặc không thể nhân lên trong nuôi cấy hoặc không thể gây bệnh ở gia súc được (11)

Các biến thể virus type O rất thích hợp với các thụ thể HS in vitro, cho thấy tầm quan trọng của sự tương tác virus-intergrin in vivo (Integrin là họ các protein xuyên màng có trong

màng của tế bào động vật Chức năng chính của nó là tạo liên kết với extracellular matrix (ECM) và truyền tín hiệu giữa ECM với tế bào)

Lpro đượccho thấy là một yếu tố quyết định độc lực virus, dựa trên cơ sở thí nghiệm trên

động vật với các kỹ thuật di truyền, virus type A12 được xoá bỏ Lpro Độc lực của virus yếu hơn so với virus hoang dại (wild virus) vì thiếu Lpro dẫn đến mất khả năng ngừng tổng hợp protein tế bào (cellular protein)

Vai trò của protein 3A trong độc lực virus được chứng minh qua các nghiên cứu phân lập

virus FMDV đáp ứng với dịch ở Đài Loan năm 1997 (designated O/Taw/97) Đó là đợt

dịch chỉ có heo bị bệnh, gây nên tỷ lệ chết cao, ngoài ra các gia súc khác không bị ảnh

hưởng Nghiên cứu ở mức độ phân tử đã phát hiện được virus chứa codon 10 delection codon deletion) ở nửa cuối đầu C của protein 3A Vị trí đó tương tự với codon 19-20

(10-delection (19- to 20-codon deletion) tìm thấy trên FMDV chuyển trong phôi gà (FMDV

2.3 Đặc điểm dịch tễ học

2.3.1 Động vật cảm nhiễm (5)

Trong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, rồi mới đến heo, dê, cừu, các loài dã thú như hươu, nai, heo rừng…Loài ăn thịt và người ít nhạy cảm với bệnh, loài một móng như ngựa, gia cầm, chim không mắc bệnh

Ở người, theo tài liệu của Chung Văn Lẫm, 1997 Học viện kỹ thuật quốc gia Bình Đông Đài Loan, thì người ăn thịt bò mắc bệnh đã nấu chín, công nhân giết mổ gia súc mắc bệnh

lở mồm long móng đều không mắc bệnh Tuy nhiên, theo tài liệu của BS Nguyễn Vĩnh Phước, người chăm sóc gia súc bệnh lở mồm long móng có thể mắc bệnh do virus xâm nhập qua vết thương ở da, đường tiêu hoá, hoặc hô hấp, thời gian nung bệnh khoảng 4-8 ngày, sau đó xuất hiện các triệu chứng: sốt, mụn nước mọc ở đầu ngón tay, bàn chân, cánh tay và các nơi khác Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng gãi nhiều, đôi khi mụn

có thể mọc ở lợi răng, gây viêm miệng Bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày, sau đó sẽ hết bệnh

sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò)

- Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng Lượng virus trong bắp cơ cao hơn trong máu và có mặt đến ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh

2.3.2 Đường xâm nhập và cách truyền bệnh (5)

Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ thể Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ

Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:

+ Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn thả chung

+ Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép của người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh

+ Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km

2.3.3 Cơ chế gây bệnh (5)

- Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đôi khi kéo dài đến 7 ngày

- Đầu tiên virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua thức ăn, nước uống… hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể Virus sẽ nhân lên tại các vị trí xâm nhập ở lớp thượng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, da, tạo nên mụn nước sơ cấp, thường các mụn nước này ít và ở giai đoạn đó thú vẫn sinh hoạt bình thường, do đó

dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện được Sau 1-2 ngày virus từ mụn nước sơ phát xâm nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt cao Tuy nhiên, máu và phủ tạng

không phải là nơi thích hợp cho sự phát triển, do đó virus quay ngược trở về các vị trí trên cơ thể có vùng thượng bì non như môi, nướu răng, lưỡi, gờ móng, đầu vú để phát triển, tạo các mụn nước thứ cấp Đặc điểm mụn nước

chỉ mọc ở phần thượng bì, không ăn sâu vào lớp

trung bì và hạ bì, do đó sau khi mụn nước vở sẽ rất

mau lành lại, và ít gây nhiễm trùng thành mụn mủ

nếu được chăm sóc tốt

- Mụn mọc ở miệng, lưỡi gây cảm giác đau nhức làm

thú không nuốt được, nước bọt bị kích thích chảy ra

đầy ở miệng Heo con, bê nghé bỏ bú do đó sẽ chết

sau vài ngày mắc bệnh

- Mụn nước ở móng chân thường bị nhiễm trùng do

thú đi đứng trong phân, đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ

tấn công sâu vào các lớp bên dưới gây hư hại nặng tổ

chức da ở gờ móng, làm móng dễ bị bong tróc

Móng bị bong tróc ra

- Virus có thể tạo các mụn nước ở khí quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ tim kéo theo

sự phụ nhiễm của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ tim, thoái hoá cơ tim làm gia súc chết ngộp

Chảy nước bọt ở góc miệng Thương tổn lưỡi bò

Hình thành mụn nước quanh đầu vú, đầu vú bị thương tổn

- Ở miệng: lưỡi có mụn to ở đầu lưỡi gốc lưỡi ở hai bên lưỡi, xoang trong miệng trong

má, lỗ chân răng, môi có mụn lấm tấm bằng hạt ké, hạt bắp Sau đó mụn vỡ và tạo thành các vết loét đáy nhỏ và phủ màu xám Nước dãi chảy nhiều như bọt xà phòng

Virus LMLM gây thương tổn vùng miệng và lưỡi

- Ở mũi: niêm mạc có mụn nước, đặt biệt là vành mũi có mụn loét, nước mũi lúc đầu

- Ở chân, kẽ móng có mụn nước từ trước ra sau, mụn vỡ làm long móng

- Ngoài da: xuất hiện các mụn loét ở vùng da mỏng như bụng, bẹn, vú, ở đầu núm vú …

- Sau khi hàng loạt mụn nước vỡ dần sẽ dẫn đến nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da, thú sốt cao, suy nhược dần rồi chết

Thể biến chứng

- Những biến chứng xảy ra khi điều kiện vệ sinh, chăm sóc kém làm mụn vỡ dẫn đến nhiễm trùng, chân bị long móng, thối móng, thối xương làm thú què Vú thì bị viêm tắt sữa Các mụn khác vỡ sẽ gây nhiễm vi khuẩn kế phát, bại huyết rồi chết

Viêm loét gây thối Mụn vỡ gây viêm loét giữa các kẽ móng chân

Viêm loét gây thối móng và sứt móng

- Bệnh lở mồm long móng ghép với các bệnh ký sinh trùng hay vi khuẩn khác có sẵn trong máu có thể làm con vật mau chóng chết

- Đối với heo con: sốt cao 40-41,5oC, trong những ngày đầu thấy toàn thân đỏ ửng cả da

và niêm mạc Chảy nước mắt và nước dãi, sau 3-4 ngày thấy da nhăn nheo nứt thành từng vết từ trên xuống và có nước chảy ra Nhiều con miệng viêm loét không bú được và nhiễm trùng máu rồi chết Tốc độ lây nhiễm trong đàn heo con là rất nhanh Bệnh tích thường gặp

ở bốn chân, mụn loét ở miệng và gây hiện tượng long móng, sau 7-10 ngày thì lây lan sang toàn đàn

- Đối với heo nái: bệnh biểu hiện nhẹ hơn, thấy mụn nước ở vú, kẽ móng chân, có con nhiễm trùng thì sưng móng viêm có mủ, đi cà nhắc, có con long móng

2.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng

2.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

a Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào là là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và các chức năng chuyên biệt của tế bào Nuôi cấy tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu vào năm 1907 bởi Harrison với những tế bào thần kinh ếch

Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy tế bào được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thú y, nhân

y, sinh học trong mục đích nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào (dược học, độc tố học), chẩn đoán và điều trị ung thư (ung thư học), chẩn đoán các tác nhân gây bệnh, sản xuất kháng thể đơn dòng, sản xuất vaccine (miễn dịch học, virus học, vi khuẩn học), chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học như hormone, enzyme trị liệu (công nghệ gen, công nghệ sinh học) Việc nuôi cấy tế bào động vật đòi hỏi các điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt và môi trường nuôi cấy phức tạp, giàu chất dinh dưỡng

Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai trường hợp: tế bào bậc một hay tế bào sơ cấp và tế bào bậc hai hay tế bào thứ cấp

- Tế bào bậc một (Primary cells) là những tế bào thu được trực tiếp từ các cơ quan hay

mô động vật

- Khi nuôi cấy chuyển tiếp các tế bào này trong điều kiện phòng thí nghiệm sẽ thu được

tế bào bậc hai (Secondary cells), những tế bào này có thể được nuôi chuyển tiếp nhiều lần, một số trong đó có khả năng duy trì sự phát triển trong vài tuần hoặc vài tháng, nhưng một số có thể duy trì sự phát triển không hạn định Những tế bào này sẽ được giữ lại làm những dòng tế bào giống phục vụ cho các nghiên cứu trên tế bào

Các loại tế bào nuôi cấy

- Tế bào biểu mô (Epithelial cells)

- Nguyên sợi bào (Firoblast cells)

- Tế bào cơ (Muscle cells)

- Tế bào thần kinh (Nerve cells)

- Tế bào lympho bào

Tế bào động vật có thể được bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196oC, ở nhiệt độ này, tế bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và phát triển trở lại trên môi trường nuôi cấy tế bào khi được rã đông (3)

Các loại tế bào khác nhau có khả năng phát triển khác nhau

Dòng tế bào Nguồn gốc Loại tế bào nuôi cấy

CHO Buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc Tế bào biểu mô

(Dòng tế bào: quần thể tế bào giống hệt nhau, bắt nguồn từ một tế bào ban đầu)

Một số phương tiện cần thiết

- Phòng thí nghiệm: sạch, chiếu sáng tốt, ít người qua lại

- Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào (hệ thống vô trùng)

- Tủ ấm thường và tủ ấm CO2

- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu