Phân tích vai trò của các yếu tố điều hòa hoạt động (CRE) trên vùng promoter chuyên biệt hạt phấn lúa LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRIỆU BÍCH HUỆ PHÂN TÍCH VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG (CRE) TRÊN VÙNG PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN LÚA Ngành Công nghệ Sinh học Mã số ngành 8.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRI ỆU BÍCH HUỆ

Ngành: Công ngh ệ Sinh học

Mã s ố ngành: 8 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng

PHÂẦN TÍCH VAI TRÒ CỦA CÁC YÊU TÓ ĐIÊU HÒA

HOẠT ĐỘNG (CRE) TRÊN VÙNG PROMOTER

CHUYÊN BIỆT HẠT PHẦN LÚA

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng

Thái Nguyên — 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi và nhóm nghiên cứu được sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong luận văn này là trung thực

và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình

Thái Nguyên, ngày 08 tháng 1 năm 2022

Học viên

Triệu Bích Huệ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng

tôi và nhóm nghiên cứu được sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn

Tiến Dũng Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong luận văn này là trung thực

và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Tôi xin hoàn toàn chịu

trách nhiệm về nội dung luận văn của mình

Thái Nguyên, ngày 08 tháng I năm 2022

Học viên

Triệu Bích Huệ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên

và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập

và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã truyền dạy kiến thức và

kỹ năng cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường, tạo điều kiện thuận lợi

để tôi có thể thực hiện tốt luận văn của mình

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cùng tập thể lớp Công nghệ sinh học K27, nhóm sinh viên trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, những người đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm — Đại học Thái Nguyên

và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập

và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thây cô giáo khoa Công nghệ sinh học

— Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã truyền dạy kiến thức và

kỹ năng cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường, tạo điều kiện thuận lợi

đề tôi có thê thực hiện tốt luận văn của mình

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cùng tập thể lớp Công nghệ sinh học K27, nhóm sinh viên trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, những người đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 08 tháng Ì năm 2022

Học viên

Triệu Bích Huệ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa của luận văn……… 2

3.1 Ý nghĩa khoa học……… 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn……….……… 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Hoa lúa 4

1.2 Gen kiểm soát quá trình phát triển của hạt phấn 4

1.3 Gen và promoter 5

1.3.1 Gen 5

1.3.2 Promoter 6

1.4 Vai trò của yếu tố điều hòa CRE 9

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 11

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 11

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 11

2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 11

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 11

2.3.2 Hóa chất 12

MỤC LỤC 0909 ))629900 ẽ l LỜI CẢM ƠN 5252521 E1EE121121121121121111111111111111 2111111111111 1111 xe ii MỤC LLỤC 52-521 222121 32321121212112111211111 1111111111 11111111 1111011111 c0 li DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTT - 2 s+s+E+E+EeEezezEzzsss V DANH MỤC BẢNH - 52 SE22E2EE2E121211212127111112112112111111111111 1.1 rre vi MỞ ĐẦU - S1 21 21 21215212127121121121111211 2111111111111 111 1121111011011 ca l 1 Đặt vấn đề ch HH1 11111111111 1111111111 1111111111111 1111111111111 1 TT nrrếy l P0 1ii19i8i1340)1i 0u - , 2

3 Ý nghĩa của luận văn ‹- ‹ cc 2c 1221211121112 111 11112111 111 xxx sêg 2 3.1 Ý nghĩa khoa hỌc - c- c0 1211111012111 1 1111111111 1112k nrxkg 2 3.2 Ý nghĩa thực tiễn -‹- -c c2 1111201121112 111 11112111 21k nh cớ 3 CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU - 5-52 + k#E£EEEE+E+E+EvEeEE+Eexerererecxee 4 In; 4 1.2 Gen kiêm soát quá trình phát triển của hạt phấn - 22 2 2 s+£+s+zszse2 4 IS ¡0/0001 ố 5

In c.ỶễŸễŸễŸiẻốổaa 5

1.3.2 Prormof€r C22121 6666111111111111111 1111111111111 1 1111111111111 E ng net 6 1.4 Vai trò của yêu tố điều hòa CRE -¿- c5 E‡EE+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrkrkrkrree 9 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 11 2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu . - 2 2 +s+St+£EE+EEEE£EE+EEEEEEEEEEEEEEerkerees II

2.1.1 Đối tượng nghiên CỨu - SE SSE+E£EEEEEEEEESEEEEEEEEEEEEEEEE11 1111.111 gre 11

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu - 2s 2++EE+E+E+EE+EeEE+Erkerxrrerkrrees 11 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu ¿- - 2 SSx+SE+EEEEEEEEEEEE21E112111111111111111 11111116 11

2.2.2 Thời gian nghiÊn CỨU c6 2 3321331183511 111 E111 kg vn II

2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu . -¿- 2 Sx+E£tk£E+EeEEEErkerkrkerkee 11

2.3.1 Vật liệu nghiÊn CỨU - - ¿+ 3313321133118 1119111111 111 1 1H vn vn rrệp II

2.3.3 Thiết bị thí nghiệm 12

2.4 Nội dung nghiên cứu 13

2.4.1 Nội dung 1: Phân tích trình tự promoter để xác định các yếu tố CRE 13

2.4.2 Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen 13

2.4.3 Nội dung 3: Chuyển gen vào cây Arabidopsis 13

2.5 Phương pháp nghiên cứu 13

2.5.1 Nghiên cứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt phấn 13

2.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 13

2.5.3 Phương pháp khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR 14

2.5.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 15

2.5.5 Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter 15

2.5.6 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 16

2.5.7 Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp 16

2.5.8 Phương pháp tách chiết plasmid 17

2.5.9 Phương pháp định lượng DNA 18

2.5.10 Phương pháp xác định trình tự 19

2.5.11 Thiết kế vector biểu hiện GUS 19

2.5.12 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 21

2.5.13 Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis 21

2.5.14 Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE 24

3.2 Biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn 29

3.3 CRE phổ biến trên vùng promoter RMP1 30

3.4 Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen RMP1del ::GFP/GUS 33

3.5 Vai trò của CRE với khả năng biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn 34

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

4.1 Kết luận 37

4.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

2.3.3 Thiết bị thí nghiệm . 2 + ©sSE+S+SE+EEEESEE2EEEEEEE2EE11211211111111 11111 xe, 12 2.4 Nội dung nghiÊn CỨU - G1 131211833 11111 1131191111 0111118 11 1g vn vn 13 2.4.1 Nội dung 1: Phân tích trình tự promoter để xác định các yếu tố CRE 13

2.4.2 Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen - - 2 2 s+Sk+eEE+EeEEeEE+Eerxerees 13 2.4.3 Nội dung 3: Chuyên gen vào cây ArabidopSis - 2-5 s+se+xex+xerxerees 13 2.5 Phương pháp nghiÊn CỨU - - c E13 11183111 889 11185 111 8 111 9 vn vn rưy 13 2.5.1 Nghiên cứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt phắn - 2 2 sex: 13 2.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tông sỐ 2 52 2 +E+EE+ESEE2EEEeEEzEerxee 13 2.5.3 Phương pháp khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR -. 14

2.5.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR .-2- 5-52 2 +E+EE+E£EE2E£EeEEzEerxee 15 2.5.5 Phương pháp thiết kế vector tách dòng promofer - 2 - 5c s+s+se£++szx+¿ 15 2.5.6 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 16

2.5.7 Phương pháp sảng lọc dòng tế bảo tái tổ hợp - 2 2 2+s+cs+z+zscceei 16 2.5.8 Phương pháp tách chiết plasmiid - ¿2 2 +SE+E+E£EE+E£EE+ErEeEErEerkerees 17 2.5.9 Phương pháp định lượng DNA -c S5 +2 * + siserersrrrereereree 18 2.5.10 Phương pháp xác định trình tỰ - - c6 3311132 1E EEsrrkrrrree 19 2.5.11 Thiết kế vector biểu hiện GUS -55cccvtccrtrrrkrrrtrrrrrrrrrrrierrrkeg 19 2.5.12 Phương pháp biến nạp vảo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 21

2.5.13 Phương pháp chuyên gene trên cây Arabidopsis - 2-5-2 se: 21 2.5.14 Phương pháp đánh giá hoạt động của promO€T -««++s+>+s+2 22 CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN - - s-s+s+ 24 3.1 Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tổ CRE 2- 2 s+s+s+ 24 3.2 Biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn ¿2 2 +s+SE+E£EE+EEEESEE+EeEEeErkerkrree 29 3.3 CRE phổ biến trên vùng promoter RÌMP - ¿2 5+ k+E£EE+E£E+EeEeEzxerred 30 3.4 Tách dòng và thiết kế vector chuyên gen RMPIdel ::GFP/GUS - 33

3.5 Vai trò của CRE với khả năng biểu hiện của gen RMPI ở hạt phấn 34

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ .- 5¿552c 2+2 vsExvrrrrsrrrrree 37 ằnc ẽ 37 4.2 Kiến nghị, ¿5c St T21 1511211111111111111 1111111111111 1111111111111 1 g0 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 5: Sc Set St SE SE S88 S858 EESESESESESESESEEEEEEEEEEEEEEErErrrrrrrrrer 38

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CaMV Cauliflower mosaIc virus

RMP Rice Microspore pollen Promoter

RMPdel Rice Microspore pollen Promoter Deletion

TSS Transcription sftart site

DANH MỤC BẢNH

Bảng 1.1 Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi 10

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 12

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR 14

Bảng 2.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 17

Bảng 3.1 Các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP 26

Bảng 3.2 Các yếu tố CRE chuyên biệt mô trên promoter RMP 27

Bảng 3.3 Danh sách các CRE phổ biến trên promoter RMP1 31

Bảng l.] Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 3.l Bảng 3.2 Bảng 3.3 DANH MỤC BẢNH Một số yếu tô điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi 10 Trình tự môi sử dụng trong nghiên cứu - 2 2+s+x+Eezx+x+xerxexez 12 Thành phần của phản ứng PC .- 2-2 2 +s+S£2E£EE+EE+E£EE+EerEerzxered 14 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid - 2: 2-5 + x+£+Ez£x+Se£ 17 Các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP - ¿2 2+scs+s+¿ 26 Các yếu tố CRE chuyên biệt mô trên promoter RMP 5- 27 Danh sách các CRE phô biến trên promoter RMPI . 5: 3l

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc mô phỏng hoa lúa 4

Hình 1.2 Cấu trúc gen 6

Hình 2.1 Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng 16

Hình 2.2 Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR 20

Hình 2.3 Phương pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE 21

Hình 3.1 Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP 28

Hình 3.2 Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến 28

Hình 3.3 Biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản bằng phần mềm

RiceEXPro 29

Hình 3.4 Mô phỏng biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản bằng phần mềm eFP 29

Hình 3.5 Tần số xuất hiện các CRE phổ biến (A) và vị trí phân bố của Pollen1LETAT52 và (B) trên promoter RMP1 32

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR-RMP1del ::GFP/GUS (A)

và vector chuyển gen pKG7-RMP1del ::GFP/GUS (B) 34

Hình 3.7 Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR với cặp mồi GUS-F/GUS-R 35

Hình 3.8 Biểu hiện của gen GUS ở cụm hoa cây chuyển gen 36

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Câu trúc mô phỏng hoa lÚa - - 2 2S E2 E£EE+EE+E£EE+EEEEEEE+EEEEEEEEEEEErEerkerees 4 Hình 1.2 Cấu trúc gen - - 2-5221 E211 EEE12152111211111111121111111111 151111110 6 Hình 2.1 Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng 16

Hình 2.2 Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR - 20

Hình 2.3 Phương pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE .-. - 21

Hình 3.1 Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMEP 28

Hình 3.2 Tần số xuất hiện của các yêu tố CRE phổ biến . 2- 2 25s 2£s£z+52 28 Hình 3.3 Biểu hiện của gen RMPI ở cơ quan sinh sản băng phần mềm š502599660011077 29

Hình 3.4 Mô phỏng biêu hiện của gen RMPI1 ở cơ quan sinh sản băng phần mềm eFP - 2 SE +E9SE+EÊEE+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEE2111151111111111 111111 cyeE 29 Hình 3.5 Tần số xuất hiện các CRE phổ biến (A) và vị trí phân bố của PollenILETATS52 và (B) trên promoter RMP Ï -.- << s3 + E£++eeeEseeeeereeeeers 32 Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR-RMPIdel ::GFP/GUS (A) và vector chuyên gen pKG7-RMPI1del ::GFP/GUS (B) . - 2 2+s+cz+szzszse2 34 Hình 3.7 Kết quả phân tích cây chuyên gen bằng PCR với cặp mỗi GUS-F/GUS-R 35 Hình 3.8 Biểu hiện của gen GUS ở cụm hoa cây chuyên gen -5- 2s s+s2 36

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Promoter là trình tự nucleotide nằm trước gen phía đầu 5’ tính từ điểm khởi đầu phiên mã (TSS), đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển hoạt động phiên mã vì v ậy nó được xem như một trong những yếu tố chủ đạo trong nghiên

c ứu biểu hiện gen Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter theo các hướng điều khiển khác nhau theo mục đích nghiên cứu, bao gồm: (i) promoter cảm ứng (inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong điều

ki ện nhất định; (ii) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiển gen hoạt động liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) promoter chuyên biệt (specific promoter) điều kiển gen hoạt động ở mẫu mô nhất định Trong số các nhóm trên, promoter

cơ định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến nhất [6], [10], [43].Tuy nhiên, nh ững promoter này thường tạo ra các kiểu hình không mong

mu ốn do hoạt động không định hướng của gen gây ra Vì thế, để khắc phục điều này các nhà khoa h ọc có xu hướng sử dụng các promoter chuyên biệt để điều khi ển các gen ở các mô, bộ phận theo chủ đích [33]

H ạt phấn là cơ quan sinh sản quan trọng của cây trồng, liên quan trực tiếp đến năng suất Đến nay đã có nhiều gen liên quan đến quá trình phát triển của

h ạt phấn được xác định và đánh giá ở lúa như OsSCP, OsCP1, OSIPA [41], [60]

Promoter chuyên bi ệt hạt phấn có tính ứng dụng cao như: (i) tạo các dòng bất dục đực phục vụ cho sản xuất hạt lai khi promoter này kết hợp với một gen gây

b ất dục như barnase hoặc bất hoạt gen liên quan quá trình trao đổi chất bằng

công ngh ệ RNAi (RNA interference) [5], [40] (ii) ứng dụng để kiểm soát các gen liên quan đến quá trình tổng hợp đường, tinh bột, hóc môn sinh trưởng nhằm tăng cường sức chống chịu của hạt phấn trong điều kiện bất lợi như hạn hán, nóng, l ạnh, hay các stress môi trường khác [28]; (iii) ngoài ra promoter này cũng

MỞ ĐÀU

1 Đặt vấn đề

Promoter là trình tự nueleotide nằm trước gen phía đầu 5' tính từ điểm khởi đầu phiên mã (TSS), đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiến hoạt động phiên mã vì vậy nó được xem như một trong những yếu tố chủ đạo trong nghiên cứu biểu hiện gen Đề nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter theo các hướng điều khiển khác nhau theo mục đích nghiên cứu, bao gồm: (¡) promoter cảm ứng (indueible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong điều kiện nhất định; (ï¡) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiến gen hoạt động liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) promoter chuyên biệt (specific promoter) điều kiên gen hoạt động ở mẫu mô nhất định Trong số các nhóm trên, promoter

cơ định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến nhất [6] [10], [43].Tuy nhiên, những promoter nảy thường tạo ra các kiểu hình không mong

muốn đo hoạt động không định hướng của gen gây ra Vì thế, để khắc phục điều này các nhà khoa học có xu hướng sử dụng các promoter chuyên biệt để điều

khiển các gen ở các mô, bộ phận theo chủ đích [33]

Hạt phấn là cơ quan sinh sản quan trọng của cây trồng, liên quan trực tiếp đến năng suất Đến nay đã có nhiều gen liên quan đến quá trình phát triển của

hạt phần được xác định và đánh giá ở lúa như ÓsSŒ?P, ÓsCP!, OSIP4 [41], [60]

Promoter chuyên biệt hạt phấn có tính ứng dụng cao như: (ï) tạo các dòng bất dục đực phục vụ cho sản xuất hạt lai khi promoter này kết hợp với một gen gây bất dục như Đzrzase hoặc bất hoạt gen liên quan quá trình trao đổi chất bằng công nghệ RNAi (RNA interference) [5], [40] (1) ứng dụng để kiểm soát các gen liên quan đến quá trình tổng hợp đường, tỉnh bột, hóc môn sinh trưởng nhằm tăng cường sức chống chịu của hạt phấn trong điều kiện bất lợi như hạn hán, nóng, lạnh, hay các stress môi trường khác [28]; (11) ngoài ra promoter này cũng

là công c ụ lý tưởng để nghiên cứu chức năng gen, protein liên quan đến quá trình phát tri ển hạt phấn ở thực vật [18]

Nhìn chung, các promoter chuyên bi ệt thường có mặt của các yếu tố điều khiển hoạt động Cis (Cis Regulatory Elements-CRE) chuyên biệt cho mô hay tế bào Ví d ụ, khi phân tích trình tự promoter chuyên biệt hạt phấn của gen ở cây

cà chua nhóm nghiên c ứu của Twell đã tìm thấy một số yếu tố có vai trò chính đến hoạt động của promoter như GTGANTG10, POLLEN1LeLAT52 [46] Các

y ếu tố này cũng được tìm thấy ở một số promoter chuyên biệt hạt phấn khác như

t ố này, một số nghiên cứu cho thấy các motif mới hay trình tự bảo thủ cũng chi

ph ối hoạt động chuyên biệt của promoter

Nh ằm cung cấp nguồn vật liệu (promoter) tốt cho các nghiên cứu liên quan đến hạt phấn, gần đây chúng tôi đã phân lập và đánh giá 20 promoter chuyên biệt

h ạt phấn ở giai đoạn sớm (RMP1 đến RMP9) và muộn (OsLPS1 đến OsLPS11)

ở cây lúa Mặc dù các promoter này đã được đánh giá ở cây lúa và Arabidopsis

nhưng cần phải được phân tích chi tiết hơn nữa để xác định vai trò của các yếu

t ố CRE, các motif mới hay trình tự bảo thủ chi phối hoạt động chuyên biệt hạt

ph ấn Dựa trên phương pháp phân tích đột biến mất đoạn kết hợp với chuyển gen chúng tôi s ẽ tiến hành “Phân tích vai trò c ủa các yếu tố điều hòa hoạt động (CRE) trên vùng promoter chuyên bi ệt hạt phấn lúa” Kết quả nghiên cứu

không ch ỉ xác định được vai trò của các yếu tố CRE mà còn là cơ sở để tối ưu hóa kích thước promoter, tạo nguồn vật liệu tốt cho các nghiên cứu chọn tạo

gi ống đáp ứng biến đổi khí hậu ở Việt Nam

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá vai trò của CRE trên promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa

(Oryza sativa L.) nh ằm cung cấp các thông tin về promoter chuyên biệt hạt phấn

để phục vụ cho công tác nghiên cứu

là công cụ lý tưởng để nghiên cứu chức năng gen, protein liên quan đến quá trình

phát triển hạt phấn ở thực vật [18]

Nhìn chung, các promoter chuyên biệt thường có mặt của các yếu tố điều khiển hoạt động C¡s (C¡s Regulatory Elements-CRE) chuyên biệt cho mô hay tế bào Ví dụ, khi phân tích trình tự promoter chuyên biệt hạt phấn của gen ở cây

cà chua nhóm nghiên cứu của Twell đã tìm thấy một số yếu tô có vai trò chính

đến hoạt động của promoter như TGANTGI10, POLLENILeLAT52 [46] Các

yếu tố này cũng được tìm thấy ở một số promoter chuyên biệt hạt phân khác như

OsSCP, OSIPA, OsLPS10 và OsLPSTT [I], [20] [26] Ngoài vai trò của các yếu

tố này, một số nghiên cứu cho thấy các motif mới hay trình tự bảo thủ cũng chỉ phối hoạt động chuyên biệt của promoter

Nhằm cung cấp nguồn vật liệu (promoter) tốt cho các nghiên cứu liên quan đến hạt phấn, gần đây chúng tôi đã phân lập và đánh giá 20 promoter chuyên biệt hạt phấn ở giai đoạn sớm (#Ä⁄P¡ đến RMP9) và muộn (OsLPS¡ đến OsLPS11)

ở cây lúa Mặc dù các promoter này đã được đánh giá ở cây lúa và 4rabidopsis nhưng cần phải được phân tích chỉ tiết hơn nữa đề xác định vai trò của các yếu

tố CRE, các motif mới hay trình tự bảo thủ chi phối hoạt động chuyên biệt hạt

phần Dựa trên phương pháp phân tích đột biến mất đoạn kết hợp với chuyền gen

chúng tôi sẽ tiến hành “Phân tích vai trò của các yếu tố điều hòa hoạt động

(CRE) trên vùng promoter chuyên biệt hạt phấn lúa” Kết quả nghiên cứu

không chỉ xác định được vai trò của các yếu tổ CRE mà còn là cơ sở để tối ưu

hóa kích thước promoter, tạo nguồn vật liệu tốt cho các nghiên cứu chọn tạo

giống đáp ứng biến đổi khí hậu ở Việt Nam

3 Ý nghĩa của luận văn

kh ả năng thích ứng với stress của môi trường, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng khô h ạn và cơ cấu sản xuất lúa chịu stress như nắng nóng, nhiệt độ cao ở

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Phân tích vai trò của các yếu tố điều hòa hoạt động (CRE) trên vùng promoter chuyên biệt hạt phần lúa (Oryza sativa L) góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, có khả năng thích ứng với stress của môi trường, phủ hợp với điều kiện canh tác lúa

vùng khô hạn và cơ cầu sản xuất lúa chịu stress như nắng nóng, nhiệt độ cao ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hoa lúa

Lúa là cây tự thụ phấn, hoa được cấu tạo gồm hai bộ phận chính: cơ quan sinh s ản đực (nhị) và cơ quan sinh sản cái (nhụy) Nhụy hoa bao gồm có đầu

nh ụy, chỉ nhụy và noãn Đầu nhụy làm nhiệm vụ tiếp nhận hạt phấn và kết nối

v ới noãn thông qua ống nhụy Noãn nằm ở đế hoa sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành h ạt

Cơ quan sinh sản đực bao gồm 6 chỉ (tua nhị) mang 6 bao phấn Mỗi nhị

g ồm 2 phần là chỉ nhị và bao phấn Ở giai đoạn trưởng thành, hạt phấn được giải phóng kh ỏi bao phấn và tiếp xúc với nhụy Bao phấn gồm 2 phần chứa hạt phấn được liên kết với nhau bởi vách ngăn Trước khi hoa nở, nhị và nhụy được bao

b ọc bởi vỏ hạt

Hình 1.1 C ấu trúc mô phỏng hoa lúa

1.2 Gen kiểm soát quá trình phát triển của hạt phấn

Nghiên c ứu đầu tiên về biểu hiện gen ở hạt phấn lúa được Parnell (1921) quan sát khi nhu ộm với iod [27] Tiếp đến là Brink và MacGillivray (1924) cũng

ti ến hành thí nghiệm tương tự ở hạt phấn ngô [8] Quá trình phát triển của hạt

CHƯƠNG 1

TÓNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hoa lúa

Lúa là cây tự thụ phấn, hoa được cấu tạo gồm hai bộ phận chính: cơ quan

sinh sản đực (nhị) và cơ quan sinh sản cái (nhụy) Nhụy hoa bao gồm có đầu

nhụy, chỉ nhụy và noãn Đầu nhụy làm nhiệm vụ tiếp nhận hạt phấn và kết nối

với noãn thông qua ống nhụy Noãn năm ở đề hoa sau khi thụ tinh sẽ phát triển

thành hạt

Cơ quan sinh sản đực bao gồm 6 chỉ (tua nhị) mang 6 bao phấn Mỗi nhị gồm 2 phần là chỉ nhị và bao phẫn Ở giai đoạn trưởng thành, hạt phân được giải phóng khỏi bao phần và tiếp xúc với nhụy Bao phân gồm 2 phần chứa hạt phấn

được liên kết với nhau bởi vách ngăn Trước khi hoa nở, nhị và nhụy được bao bọc bởi vỏ hạt

Bao phân Chỉ nhị

Đình hạt Râu (đuôn)

1.2 Gen kiểm soát quá trình phát triển của hạt phấn

Nghiên cứu đầu tiên về biểu hiện gen ở hạt phấn lúa được Parnell (1921) quan sát khi nhuộm với iod [27] Tiếp đến là Brink và MacGillivray (1924) cũng tiến hành thí nghiệm tương tự ở hạt phẫn ngô [8] Quá trình phát triển của hạt

ph ấn gồm 2 giai đoạn: tiểu bào tử (microspore) và giai đoạn hạt phấn trưởng thành (pollen) H ầu hết các nghiên cứu sàng lọc gen liên quan cũng được tập trung ở hai giai đoạn này[33].Cho tới nay có rất nhiều gen liên quan đến quá trình phát triển của hạt phấn được sàng lọc Honys và cộng sự (2006) đã xác định

được 3.500 gen biểu hiện ở hạt phấn của cây Arabidopsis Một số gen đã được đánh giá như MORI/GEMI, TIO, MSP1, MSP2 và MSP3 [32] Theo dự đoán

có kho ảng 13.977 gen biểu hiện ở hạt phấn cây Arabidopsis [4], [7], [43]

Trong đó, 11,565 gen biểu hiện ở giai đoạn tiểu bào tử, 7.235 gen biểu hiện ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành Tỷ lệ gen đặc hiệu ở các giai đoạn này lần lượt là 6,9 và 8,6% [4]

Ở lúa, Endo và cộng sự (2004) xác định được 259 gen chuyên biệt cho bao

ph ấn Mức độ biểu hiện của các gen thay đổi theo từng giai đoạn phát triển của

h ạt phấn [13] Lu và cộng sự (2006) một số nghiên cứu trước đây cho rằng có 26 gen tăng mức độ biểu hiện ở giai đoạn hình thành nhị hoa [23] Wei và cộng sự (2010) chia làm 5 giai đoạn: tiều bào tử đơn nhân, hai nhân, ba nhân chưa hoàn

ch ỉnh, hoàn chỉnh và giai đoạn hạt phấn nảy mầm [68] Phân tích microarray cho

th ấy có khoảng 22.000 đến 25.062 nhân tố phiên mã được phát hiện trong quá trình hình thành và phát tri ển hạt phấn [68] Trong đó có khoảng 1.000 gên chuyên bi ệt hạt phấn được tìm thấy, bao gồm 453 gen ở giai đoạn ba nhân, 184 gene ở giai đoạn đơn nhân, 78 gene ở giai đoạn phân bào giảm phân và 291 gene

ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành [33]

1.3 Gen và promoter

1.3.1 Gen

Mendel (1865) là người đầu tiên đưa ra khái niệm nhân tố di truyền Johansen (1909) đã đề xuất thuật ngữ gen để chỉ nhân tố di truyền xác định một tính trạng nào đó Sau đó, Morgan trong những năm 1920 đã cụ thể hóa khái niệm về gen, khẳng định nó nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một locus nhất định, gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng

phấn gồm 2 giai đoạn: tiêu bào tử (microspore) và giai đoạn hạt phấn trưởng thành (pollen) Hầu hết các nghiên cứu sảng lọc gen liên quan cũng được tập trung ở hai giai đoạn này[33].Cho tới nay có rất nhiều gen liên quan đến quá trình phát triển của hạt phấn được sàng lọc Honys và cộng sự (2006) đã xác định được 3.500 gen biểu hiện ở hạt phân của cây Arabidopsis Một số gen đã được

đánh giá như MORIGEMI, T1O, MSPI, MSP2 và MSP3 [32] Theo dự đoán

có khoảng 13.977 gen biểu hiện ở hạt phấn cây Arabidopsis [4], [7] [43] Trong đó, 11,565 gen biểu hiện ở giai đoạn tiểu bào tử, 7.235 gen biêu hiện ở

giai đoạn hạt phấn trưởng thảnh Tỷ lệ gen đặc hiệu ở các giai đoạn này lần lượt là 6,9 và 8,6% [4]

Ở lúa, Endo và cộng sự (2004) xác định được 259 gen chuyên biệt cho bao phấn Mức độ biểu hiện của các gen thay đổi theo từng giai đoạn phát triển của hạt phấn [13] Lu và cộng sự (2006) một số nghiên cứu trước đây cho răng có 26

gen tăng mức độ biểu hiện ở giai đoạn hình thành nhị hoa [23] Wei và cộng sự

(2010) chia làm 5 giai đoạn: tiều bào tử đơn nhân, hai nhân, ba nhân chưa hoàn chỉnh, hoàn chỉnh vả giai đoạn hạt phấn nảy mầm [68] Phân tích microarray cho thấy có khoảng 22.000 đến 25.062 nhân tô phiên mã được phát hiện trong quá trình hình thành và phát triển hạt phấn [68] Trong đó có khoảng 1.000 gên

chuyên biệt hạt phần được tìm thấy, bao gồm 453 gen ở giai đoạn ba nhân, 184

gene ở giai đoạn đơn nhân, 78 gene ở giai đoạn phân bào giảm phân và 29] gene

ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành [33]

1.3 Gen và promofter

1.3.1 Gen

Mendel (1865) là người đầu tiên đưa ra khái niệm nhân tố di truyền Johansen (1909) đã đề xuất thuật ngữ gen đề chỉ nhân tổ di truyền xác định một tính trạng nào đó Sau đó, Morgan trong những năm 1920 đã cụ thê hóa khái

niệm về gen, khẳng định nó nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một locus nhất định, gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng

Vào những năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) được chứng minh là vật chất di truyền Mô hình cấu trúc DNA của Watson và Crick được đưa ra và

lý thuyết trung tâm (central dogma) ra đời Gen được xem là một đoạn DNA trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA

Cuối những năm 1970, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở sinh vật eukaryote cho thấy có những đoạn DNA không mã hóa cho các amino acid trên phân tử protein Vì thế, khái niệm về gen một lần nữa được điều chỉnh như sau: Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả phần phía trước là vùng 5’ không dịch mã (5’ untranslation) hay còn gọi là vùng ngược hướng (upstream) và phía sau là vùng 3’ không dịch mã (3’ untranslation) hay còn gọi là vùng cùng hướng (downstream) của vùng mã hóa cho protein, và bao gồm cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa (exon) Vùng mã hoá

Hình 1.2 C ấu trúc gen 1.3.2 Promoter

Promoter là trình t ự nucleotide cần thiết để ARN pol bám vào khởi động quá trình phiên mã Trình t ự này nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã ở các

h ệ gen của sinh vật nhân sơ Trong khi đó promoter ở hệ gen của sinh vật nhân chuẩn thường gồm vị trí nhận biết bởi ARN pol và các trình tự đặc biệt nhận biết

b ởi yếu tố phiên mã [2]

Trình t ự cơ bản của promoter (code promoter) thường gồm các nucleotide

ở vị trí -10 đến vài nucleotide sau vị trí khởi đầu phiên mã đối với gen ở sinh vật nhân sơ hoặc gồm các nucleotide ở vị trí - 40 đến + 20 đối với gen của sinh vật nhân chu ẩn Hầu hết các trình tự gen sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đều có chứa

m ột đoạn ngắn giàu A- T gọi là hộp TATA Hộp TATA thường ở vị trí - 10 ở promoter sinh v ật nhân sơ nhưng phân bố ở vị trí - 25 ở promoter sinh vật nhân

Vào những năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) được chứng minh là

vật chất di truyền Mô hình cấu trúc DNA của Watson và Crick được đưa ra và

lý thuyết trung tâm (central dogma) ra đời Gen được xem là một đoạn DNA trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA

Cuối những năm 1970, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở sinh vật eukaryote cho thấy có những đoạn DNA không mã hóa cho các amino acid trên

phân tử protein Vì thế, khái niệm về gen một lần nữa được điều chỉnh như sau: Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả

phân phía trước là vùng 5” không dịch mã (5° untranslation) hay còn gọi là vùng ngược hướng (upstream) và phía sau là vùng 3° không dịch mã (3° untranslation) hay còn gọi là vùng cùng hướng (downstream) của vùng mã hóa cho protein, vả bao gồm cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa (exon)

Promoter là trình tự nucleotide cần thiết để ARN pol bám vào khởi động quá trình phiên mã Trình tự này năm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã ở các

hệ gen của sinh vật nhân sơ Trong khi đó promoter ở hệ gen của sinh vật nhân

chuẩn thường gồm vị trí nhận biết bởi ARN pol và các trình tự đặc biệt nhận biết

bởi yếu tố phiên mã [2]

Trình tự cơ bản của promoter (code promoter) thường gồm các nucleotide

ở vị trí -10 đến vài nucleotide sau vị trí khởi đầu phiên mã đối với gen ở sinh vật nhân sơ hoặc gồm các nucleotide ở vị trí - 40 đến + 20 đối với gen của sinh vật nhân chuẩn Hầu hết các trình tự gen sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đều có chứa

một đoạn ngắn giàu A- T gọi là hộp TATA Hộp TATA thường ở vị trí - 10 ở promoter sinh vật nhân sơ nhưng phân bồ ở vị trí - 25 ở promoter sinh vật nhân

chu ẩn Khi promoter chỉ có trình tự cơ bản thì mức độ phiên mã xảy ra rất thấp, tuy nhiên s ẽ tăng lên rất nhiều khi có thêm trình tự nằm phía trước trình tự cơ

b ản Trình tự thứ hai này thường nằm ở vị trí - 35 đối với gen sinh vật nhân sơ,

ho ặc vị trí - 70 đến - 90 ở gen sinh vật nhân chuẩn [2]

Promoter c ủa gen ở sinh vật nhân chuẩn mã hóa cho protein được nhận biết

b ởi ARN pol II khi mà hầu hết các yếu tố phiên mã đã có mặt ở promoter Phiên

mã ở sinh vật nhân chuẩn cũng đòi hỏi các trình tự tăng cường enhancer đặc thù cho t ừng gen hoặc nhóm gen, có thể nằm phía trước, sau hoặc ngay trong gen để tăng cường mức độ phiên mã trên promoter [2]

a Promoter không đặc hiệu

Promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định (constitutive promoter) tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở tất cả hoặc hầu như tất

c ả các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển của sinh vật CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện ARN 35S được phân lập

t ừ virut khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển hình

c ủa nhóm promoter này CaMV là một virus dạng sợi đôi ở thực vật thuộc họ cải

H ệ gen của virus này là một phân tử DNA vòng sợi kép có kích thước 8kb với

ba quãng ng ắt là sợi đơn, hai bản phiên mã mARN chính (19S và 35S) và sáu khu ng đọc mở được mã hóa bởi DNA Sự phiên mã xảy ra từ tiểu nhiễm sắc thể vòng và không tiếp hợp trong nhân của tế bào thực vật và DNA virion được tổng

h ợp trong tế bào chất thông qua sự phiên mã ngược của mARN 35S CaMV35S promoter là trình t ự có kích thước vào khoảng 350 bp nằm ở phía đầu của mARN 35S ( - 343 đến +8, với vị trí Cap ở +1), trong đó khoảng 250 bp gối lên 3% đoạn

k ết thúc của gen V1, khung đọc mở cuối cùng trong 6 khung đọc mở lớn Có 3 vùng trên promoter, promoter trung tâm ch ứa hộp TATA (vị trí từ - 46 đến +8)

và hai vùng chính khác có ch ức năng tăng cường Vùng A (- 90 đến – 46) chủ

y ếu cần cho biểu hiện ở rễ và vùng B (- 343 đến – 90) cần cho biểu hiện ở lá [12]

Ti ểu vùng của vùng B (B1 đến B5) có thể được nhận dạng dựa trên những tương tác khác bi ệt với những nhân tố phiên mã khác nhau Tuy nhiên, vùng B hoàn

chuẩn Khi promoter chỉ có trình tự cơ bản thì mức độ phiên mã xảy ra rất thấp,

tuy nhiên sẽ tăng lên rất nhiều khi có thêm trình tự nằm phía trước trình tự cơ

bản Trình tự thứ hai này thường nằm ở vị trí - 35 đối với gen sinh vật nhân sơ,

hoặc vị trí - 70 đến - 90 ở gen sinh vật nhân chuẩn [2I

Promoter của gen ở sinh vật nhân chuẩn mã hóa cho protein được nhận biết

bởi ARN pol II khi mà hầu hết các yếu tố phiên mã đã có mặt ở promoter Phiên

mã ở sinh vật nhân chuẩn cũng đòi hỏi các trình tự tăng cường enhancer đặc thù cho từng gen hoặc nhóm gen, có thể năm phía trước, sau hoặc ngay trong gen để tăng cường mức độ phiên mã trên promoter [2|

a Promoter không đặc hiệu

Promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định (consftitufive

promoter) tham gia điều khiến quá trình biểu hiện gen ở tất cả hoặc hầu như tất

cả các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển của

sinh vật CaMV35S promoter điều khiến sự biểu hiện ARN 35S được phân lập

từ virut khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus — CaMV) là một ví dụ điển hình

của nhóm promoter này CaMV là một virus dạng sợi đôi ở thực vật thuộc họ cải

Hệ gen của virus này là một phân tử DNA vòng sợi kép có kích thước S§kb với

ba quãng ngắt là sợi đơn, hai bản phiên mã mARN chính (19S và 35S) và sáu khung đọc mở được mã hóa bởi DNA Sự phiên mã xảy ra từ tiểu nhiễm sắc thể vòng và không tiếp hợp trong nhân của tế bào thực vật và DNA virion được tổng hợp trong tế bào chất thông qua sự phiên mã ngược của mARN 35S CaMV35S promoter là trình tự có kích thước vào khoảng 350 bp năm ở phía đầu của mARN 35S ( -343 đến +8, với vị trí Cap ở +1), trong đó khoảng 250 bp gối lên 3% đoạn kết thúc của gen VI, khung đọc mở cuối cùng trong 6 khung đọc mở lớn Có 3 vùng trên promoter, promoter trung tâm chứa hộp TATA (vị trí từ - 46 đến +8)

và hai vùng chính khác có chức năng tăng cường Vùng A (- 90 đến — 46) chủ

yếu cần cho biểu hiện ở rễ và vùng B (- 343 đến — 90) cần cho biểu hiện ở lá [12]

Tiểu vùng của vùng B (BI đến B5) có thê được nhận dạng dựa trên những tương

tác khác biệt với những nhân tô phiên mã khác nhau Tuy nhiên, vùng B hoản

ch ỉnh cho phép biểu hiện đa dạng hơn so với trường hợp kết hợp các tiểu vùng Vai trò c ủa các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh

c ủa CaMV mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây [12] Các nghiên cứu cho th ấy việc loại bỏ hộp TATA làm mất khả năng gây nhiễm Hai vùng tăng cường tách biệt liên quan đến khả năng gây nhiễm đã được xác định là (- 207 đến – 150) và (- 95 đến – 56) Vùng tăng cường thậm chí có thể hoạt động theo hướng ngược chiều [24]

b Promoter đặc hiệu

Promoter đặc hiệu chuyên biệt (specific promoter) với các yếu tố Cis

chuyên bi ệt điều khiển gen hoạt động ở mẫu mô nhất định Sự biểu hiện đặc hiệu

là s ự biểu hiện các sản phẩm của gene giới hạn ở một hoặc một vài mô (hạn chế

v ề không gian – spatial limitation) hoặc ở một vài giai đoạn phát triển (đặc hiệu

th ời gian – temporal limitation) Cần nhấn mạnh rằng không có một promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter dường như hoạt động ở một số mô, trong khi

ở một số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu Hiện tượng này được biết đến

là s ự biểu hiện yếu Promoter đặc hiệu mô (tissue specific promoter): Các loại promoter đặc hiệu mô chỉ điều khiển biểu hiện gen ở những mô nhất định, ví dụ promoter đặc hiệu rễ [22], promoter đặc hiệu bó mạch thực vật, promoter đặc

hi ệu hoa [9], [31], [42], [50] Thuộc nhóm promoter này có promoter điều khiển biểu hiện gen mã hóa sucrose synthase Sucrose synthase là một trong những enzyme quan tr ọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bào Ở lúa, người ta

đã phát hiện được ba gen cùng mã hóa cho sucrose synthase (Rsuc1, Rsuc2,

Gene Rsuc2 không có tính đặc hiệu mô cao Gen Rsuc3 đặc hiệu cao ở hạt [34]

Ch ỉ có gen Rsuc1 biểu hiện đặc hiệu ở bó mạch, rễ, mầm Kích thước của gen

3 kb Promoter c ủa Rsuc1 chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, h ộp CCAAT…và các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gen đặc

hi ệu bó mạch như hộp ASL, hộp GAGA.… [34]

chỉnh cho phép biểu hiện đa dạng hơn so với trường hợp kết hợp các tiểu vùng Vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh của CaMV mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây [12] Các nghiên cứu cho thấy việc loại bỏ hộp TATA làm mắt khả năng gây nhiễm Hai vùng tăng cường tách biệt liên quan đến khả năng gây nhiễm đã được xác định là (- 207 đến — 150) và (- 95 đến — 56) Vùng tăng cường thậm chí có thể hoạt động theo hướng ngược chiều [24]

b Promoter đặc hiệu

Promoter đặc hiệu chuyên biệt (specific promoter) với các yếu tố C¡s

chuyên biệt điều khiển gen hoạt động ở mẫu mô nhất định Sự biêu hiện đặc hiệu

là sự biểu hiện các sản phâm của gene giới hạn ở một hoặc một vài mô (hạn chế

về không gian — spatial limitation) hoặc ở một vài giai đoạn phát triển (đặc hiệu

thời gian — temporal limitation) Cần nhân mạnh rằng không có một promoter

hoàn toàn đặc hiệu: các promoter dường như hoạt động ở một số mô, trong khi

ở một số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu Hiện tượng này được biết đến

là sự biểu hiện yếu Promoter đặc hiệu mô (tissue specific promoter): Các loại promoter đặc hiệu mô chỉ điều khiển biểu hiện gen ở những mô nhất định, ví dụ promoter đặc hiệu rễ [22], promoter đặc hiệu bó mạch thực vật, promoter đặc hiệu hoa [9], [31], [42] [50] Thuộc nhóm promoter này có promoter điều khiển

biểu hiện gen mã hóa sucrose synthase Sucrose synthase là một trong những

enzyme quan trọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bảo Ở lúa, người ta

đã phát hiện được ba gen cùng mã hóa cho sucrose synthase (Rsucl, Rsuc2, Rsue3) [34] Tuy nhiên mức độ biểu hiện của các gen này ở các mô là khác nhau

Gene Rsc2 không có tính đặc hiệu mô cao Gen Rsuc3 đặc hiệu cao ở hạt [34| Chỉ có gen Rsucl biểu hiện đặc hiệu ở bó mạch, rễ, mầm Kích thước của gen

Rsue1 là 8167 bp, trong đó kích thước của vùng 5` tương đối lớn, chiếm khoảng

3 kb Promoter của Rsucl chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp

TATA, hộp CCAAT và các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gen đặc

hiệu bó mạch như hộp ASL, hộp GAGA [34]

c Promoter c ảm ứng

Là promoter c ảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong các điều kiện nhất định Chẳng hạn trong các điều kiện cực đoan (stress) như hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, oxy hóa cao,

n ồng độ muối quá cao…các gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ rất nhanh

Vì vậy vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và các protein tham gia vào vi ệc điều khiển biểu hiện gen thông qua việc nhận biết

và ho ạt hóa quá trình khởi động phiên mã được đặc biệt quan tâm [3]

Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter theo các hướng điều khiển khác nhau tùy mục đích nghiên cứu, bao gồm: (i) promoter

c ảm ứng(inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong điều kiện nhất định; (ii) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiển gene hoạt động liên t ục ở tất cả các mẫu mô; (iii) promoter chuyên biệt (specific promoter) điều khi ển gen hoạt động ở mẫu mô nhất định Trong số các nhóm trên, promoter cơ định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến nhất [6], [10], [44] Tuy nhiên nh ững promoter này thường tạo ra kiểu hình không mong muốn do hoạt động không định hướng của gen gây ra Vì thế để khắc phục điều này các nhà khoa h ọc có xu hướng sử dụng các promoter chuyên biệt để điều khiển các gen

ở các mô, bộ phận theo chủ đích [3]

1.4 Vai trò của yếu tố điều hòa CRE

Y ếu tố điều hòa cis định vị trên vùng điều hòa của promoter, là vị trí nhận

biết của yếu tố phiên mã, tham gia điều hòa biểu hiện của gen đáp ứng với các

điều kiện bất lợi [1] Việc phát hiện ra yếu tố điều hòa cis (cis regulatory element,

CRE) n ằm trong trình tự của promoter của gen được coi là một thành công trong

vi ệc giải mã toàn bộ cơ chế điều hòa phiên mã của gen Rất nhiều kết quả thu được gần đây đã khẳng định sự tham gia của CRE trong con đường dẫn truyền tín hi ệu điều khiển các quá trình sinh học diễn ra trong tế bào Nhiều nghiên cứu liên quan đến CRE đã cung cấp những dẫn liệu khá đầy đủ về chức năng của chúng vào s ự phát triển của cây trồng Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đã

c Promofter cảm ứng

Là promoter cảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong các điều kiện nhất định Chẳng hạn trong các

điều kiện cực đoan (stress) như hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, oxy hóa cao,

nồng độ muối quá cao các gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ rất nhanh

Vì vậy vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và các protein tham gia vào việc điều khiên biểu hiện gen thông qua việc nhận biết

và hoạt hóa quá trình khởi động phiên mã được đặc biệt quan tâm [3]

Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sảng lọc promoter theo các hướng điều khiến khác nhau tùy mục đích nghiên cứu, bao gồm: (¡) promoter cảm ứng(inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong điều kiện nhất định; (1i) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiển gene hoạt động liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) promoter chuyên biệt (specific promoter) điều khiển gen hoạt động ở mẫu mô nhất định Trong số các nhóm trên, promoter cơ

định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phô biến nhất [6], [10], [44] Tuy

nhiên những promoter này thường tạo ra kiểu hình không mong muốn do hoạt

động không định hướng của gen gây ra Vì thế để khắc phục điều này các nhà

khoa học có xu hướng sử dụng các promoter chuyên biệt để điều khiển các gen

ở các mô, bộ phận theo chủ đích [5|]

1.4 Vai trò của yếu tố điều hòa CRE

Yếu tổ điều hòa c¡s định vị trên vùng điều hòa của promoter, là vị trí nhận

biết của yếu tố phiên mã, tham gia điều hòa biểu hiện của gen đáp ứng với các điều kiện bất lợi [1] Việc phát hiện ra yếu tô điều hòa c¡s (cis regulafory element, CRE) năm trong trình tự của promoter của gen được coi là một thành công trong việc giải mã toàn bộ cơ chế điều hòa phiên mã của gen Rất nhiều kết quả thu được gần đây đã khăng định sự tham gia của CRE trong con đường dẫn truyền tín hiệu điều khiển các quá trình sinh học diễn ra trong tế bảo Nhiều nghiên cứu liên quan đến CRE đã cung cấp những dẫn liệu khá đầy đủ về chức năng của chúng vào sự phát triên của cây trông Một sô yêu tô điêu hòa c¡s quan trọng đã

được tìm ra như ABRE cảm ứng với ABA, MYBRS và MYCRS đáp ứng hạn, DRE và LTRE c ảm ứng với nhiệt độ… (Bảng 1.1)

B ảng 1.1 Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi

Yếu tố điều

MYBRS (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C Tham gia vào quá trình đáp ứng hạn

điều kiện hạn và cảm ứng với ABA

Đặc trưng của các promoter hoạt động cảm ứng stress là có mang các yếu

t ố hoạt hóa cis (cis-acting element) đóng vai trò là vị trí liên kết với nhân tố phiên

mã (được kích hoạt bởi các tín hiệu stress) để điều hòa biểu hiện của các gen liên quan Các yếu tố hoạt hóa Cis đáp ứng điều kiện stress được chia thành 3 nhóm, bao g ồm (1)nhóm liên quan tới con đường điều hòa phụ thuộc hormone ABA

như yếu tố cis ABRE (chứa motif –T/CACGTGG với trình tự lõi ACGT),

MYCRS (trình t ự nhận biết MYC - CANNTG), MYBRS (trình tự nhận biết MYB – A/TAACCA và C/TAACG/TG)…, (2) nhóm không phụ thuộc ABA như

y ếu tố cis DRE (có trình tự lõi A/GCCGAC)… và (3) liên quan đến cả hai con đường trên như yếu tố cis NAC (có chứa trình tự lõi CATGTG), ZFHDRS (chứa

m ột motif bảo thủ TT/AAATT) [1]

được tìm ra như ABRE cảm ứng với ABA, MYBRS và MYCRS đáp ứng hạn,

DRE và LUTRE cảm ứng với nhiệt độ (Bảng I.])

Bảng 1.1 Một số yếu tố điều hòa c¡s quan trọng đáp ứng điều kiện bắt lợi

Yêu tô điều

Trình tự bảo thủ Chức năng hòa c¡s

ABRE CCACGTGG Tham gia vào quá trình đáp ứng với ABA MYBRS (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C Tham gia vào quá trình đáp ứng hạn

Tham gia vào quá trình đáp ứng sớm với

điêu kiện hạn và cảm ứng với ABA

Liên quan đến sự đáp ứng với điều

kiện mặn, hạn và nhiệt độ thâp

LTRE ACCGACA;CCGAAA; Yếu tố đáp ứng nhiệt độ thấp, điều hòa

GTCGAC đáp ứng điều kiện lạnh

Đặc trưng của các promoter hoạt động cảm ứng stress là có mang các yêu

tố hoạt hóa c¡s (cis-acting element) đóng vai trò là vị trí liên kết với nhân tố phiên

mã (được kích hoạt bởi các tín hiệu stress) để điều hòa biểu hiện của các gen liên

quan Các yếu tô hoạt hóa C¡s đáp ứng điều kiện stress được chia thành 3 nhóm, bao gồm (I)nhóm liên quan tới con đường điều hòa phụ thuộc hormone ABA

như yếu tố cis ABRE (chứa motif —T/CACGTGG với trình tự lõi ACGT), MYCRS (trình tự nhận biết MYC - CANNTG), MYBRS (trình tự nhận biết

MYB-— A/TAACCA và C/TAACG/TG) , (2) nhóm không phụ thuộc ABA như

yếu tô cis DRE (có trình tự lõi A/GCCGAC) và (3) liên quan đến cả hai con

đường trên như yếu tố c¡s NAC (có chứa trình tự lõi CATGTG), ZFHDRS (chứa

một motIf bảo thủ TI/AAATTT) [1]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây lúa Oryza sativa L và cây Arabidopsis thaliana

2.1.2 Ph ạm vi nghiên cứu

Đánh giá vai trò của các yếu tố CRE trên promoter chuyên biệt hạt phấn từ

cây lúa Oryza sativa L

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghi ệm Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên

2.2.2 Th ời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2020 đến tháng 6/2021

2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.3.1 V ật liệu nghiên cứu

- V ật liệu thực vật: Giống lúa Oryza sativa L do Phòng thí nghiệm Sinh

h ọc phân tử - Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại

h ọc Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên cung cấp

- Các v ật liệu khác:

 Cấu trúc vector tách dòng pDONR201

 Hệ thống vector chuyển gen pKGWFS7 mang gen chọn lọc kanamycin

 Mồi sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.1)

 Chủng vi khuẩn chuyển gen E.coliDH5α của hãng Invitrogen và vi

khu ẩn Agrobacterium do phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công nghệ

Sinh h ọc và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung c ấp

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vỉ nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây lúa Øryza safiva L và cây Arabidopsis thaliana

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Đánh giá vai trò của các yếu tô CRE trên promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa Óryza safiva L

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm S¡nh học phân tử - Khoa Công nghệ sinh học và Công

nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2020 đến tháng 6/2021

2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

- Vật liệu thực vật: Giống lúa Óryza safiva L do Phòng thí nghiệm Sinh

học phân tử - Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại

học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên cung cấp

- Các vật liệu khác:

Câu trúc vector tách dòng pDONR201

Hệ thống vector chuyển gen pKGWFS7 mang gen chọn lọc kanamycin

Môi sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.1)

* Chủng vi khuẩn chuyên gen E.coiiDH5ø của hãng Invitrogen và vi khuẩn Agrobacterium do phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công nghệ

Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

cung câp

B ảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu

Gene Primer Sequence (5'-3') thước Kích

RMP1del-R AGAAAGCTGGGT GTTAATTAGCTAGGCTACAGGGGAGG

2.3.2 Hóa ch ất

Các hóa ch ất được sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ các hãng có

uy tín như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Invitrogen (Mỹ)

Các mu ối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần nền khoáng B5, MS Chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bổ sung: Yeast extract, L-Cysteine, trypton, sucrose, agarose… và các thành phần hóa chất trong phân tích sinh học phân t ử của các hãng sản xuất như Duchafe, sigma,…:

2.3.3 Thi ết bị thí nghiệm

Các thi ết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm:

- Buồng cấy vô trùng

GTTAATTAGCTAGGCTACAGGGGAGG RMPIdel-F AAAAAGCAGGCT TGAAGAGACGAGGGGCATTATCATC | 623

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ các hãng có

uy tín như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Invitrogen (Mỹ)

Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần nên khoáng BS, MS

Chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bố sung: Yeast extract, L-Cysteine,

trypton, sucrose, agarose và các thành phần hóa chất trong phân tích sinh học phân tử của các hãng sản xuât như Duchafe, sigma, :

2.3.3 Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm:

- Buông cây vô trùng

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 N ội dung 1: Phân tích trình tự promoter để xác định các yếu tố CRE

D ựa trên kết quả phân tích dữ liệu công bố về các gen biểu hiện trên cây lúa,

ti ến hành lựa chọn các gen biểu hiện ở hạt phấn cho nghiên cứu

2.4.2 N ội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen

2.4.3 N ội dung 3: Chuyển gen vào cây Arabidopsis

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Nghiên c ứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt phấn

D ựa trên kết quả phân tích dữ liệu microarray database (http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)

Sử dụng mẫu hạt phấn lúa để tiến hành phân tích lựa chọn các gen biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn sử dụng cho nghiên cứu Gen chuyên biệt hạt phấn là những gen biểu hiện duy nhất ở hạt phấn, dựa trên bản đồ nhiệt (heat map) biểu hiện của gen được thể hiện thông qua màu sắc

2.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

S ử dụng bộ kit bộ kít DNeasy plant mini kit của hãng Qiagene để tách chiết DNA t ổng số từ hạt phấn lúa Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng

d ẫn của nhà sản xuất plant-mini-kit) Các bước tiến hành như sau:

(https://www.qiagene.com/dna/geneomic-dna/dneasy Bao ph ấn lúa được nghiền bằng máy TissueLyserll trong 30 giây

- B ổ sung 400 µl dung dịch AP1 (10mM Tris – HCl pH8.0; 1mM EDTA pH8.0) và 4 µl RNase A M ẫu được trộn đều và ủ ở 65oC trong 10 phút

- Nồi hấp khử trùng

- Máy l¡ tâm lạnh

- Máy điện di

Và các trang thiết bị khác như lò vi sóng, cân điện tử, bình trụ, bình tam giác,

ống eppendorf, đầu côn các loại, pipet, đĩa petri, của phòng thí nghiệm khoa công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Nội dung I: Phân tích trình tự promoter để xác định các yếu tô CRE Dựa trên kết quả phân tích đữ liệu công bố về các gen biểu hiện trên cây lúa, tiễn hành lựa chọn các gen biểu hiện ở hạt phân cho nghiên cứu

2.4.2 Nội dung 2: Thiết kế vector chuyỄn gen

2.4.3 Nội dung 3: Chuyển gen vào cây Arabidopsis

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Nghiên cứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt phắn

Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu microaray database (http://ricexpro.dna.affrc.øo.Jp/)

Sử dụng mẫu hạt phấn lúa đề tiến hành phân tích lựa chọn các gen biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn sử dụng cho nghiên cứu Gen chuyên biệt hạt phấn là những gen biểu hiện duy nhất ở hạt phấn, dựa trên bản đồ nhiệt (heat map) biểu hiện của gen được thể hiện thông qua màu sắc

2.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Sử dụng bộ kít bộ kít DNeasy plant mini kit của hãng Qiagene đề tách chiết DNA tổng số từ hạt phấn lúa Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất (https://www.qiagene.com/dna/geneomic-dna/dneasy- plant-mini-kit) Các bước tiễn hành như sau:

- Bao phần lúa được nghiền bằng máy TissueLyserll trong 30 giây

- Bồ sung 400 kl dung dịch AP1 (10mM Tris —- HCI pH8.0; ImM EDTA pH8.0) và 4 ul RNase A Mẫu được trộn đều và ủ ở 65°C trong 10 phút

- B ổ sung 130 µl AP3, đảo đều sau đó ủ trên đá 5 phút

- Ly tâm m ẫu ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 5 phút

- Chuy ển toàn bộ dịch nổi sang cột lọc và ly tâm ở tốc độ 14,000

- Hòa tan DNA b ằng 100 µl dung dịch TAE để sử dụng cho nghiên cứu

2.5.3 Phương pháp khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR

Vùng promoter n ằm phía 5’ trước mã mở đầu ATG của gen được khuyếch đại từ DNA tổng số bằng phương pháp Gateway PCR với cặp mồi đặc hiệu RMP (B ảng 2.1) theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:

Ph ản ứng PCR được tiến hành theo 2 bước: bước 1, phản ứng PCR được

th ực hiện với 10 chu kỳ ở điều kiện 95oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min s ử dụng

c ặp mồi đặc hiệu có gắn trình tự adapter attB1 và attB2; bước 2, sử dụng 10 µl

- Bồ sung 130 ul AP3, đảo đều sau đó ủ trên đá 5 phút

- Ly tâm mẫu ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 5 phút

- Chuyên toàn bộ dịch nôi sang cột lọc và ly tâm ở tốc độ 14,000

- Hòa tan DNA băng 100 ul dung dịch TAE để sử dụng cho nghiên cứu

2.5.3 Phương pháp khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR

Vùng promoter nằm phía 5` trước mã mở đầu ATG của gen được khuyếch đại từ DNA tổng số bằng phương pháp Gateway PCR với cặp môi đặc hiệu RMP (Bảng 2.1) theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:

Phản ứng PCR được tiến hành theo 2 bước: bước 1, phản ứng PCR được

thực hiện với 10 chu kỳ ở điều kiện 95°C/15s, 55°C/30s và 72°C/2min sử dụng cặp môi đặc hiệu có sẵn trình tự adapter attBI và attB2; bước 2, sử dụng 10 nÌ

s ản phẩm PCR ở bước 1 làm DNA khuơn, thực hiện phản ứng ở 25 chu kỳ theo trình t ự như sau: 5 chu kỳ đầu 94oC/15s, 45oC/30s và 72oC/2min ; 20 chu k ỳ sau

94oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X

cĩ maker chu ẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím

M ẫu DNA thu được cần phải tinh sạch bằng kit tinh sạch HiGene PCR purification c ủa hãng Solgenet để chuẩn bị cho tách dịng

2.5 4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Quá trình tinh s ạch được thực hiện theo HiGene PCR purification của hãng Solgenet g ồm các bước sau:

- B ổ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1: 1 về thể tích

- Chuy ển sang cột lọc li tâm 12000 vịng/phút trong 1 phút ở 4oC, lo ại bỏ dịch

- B ổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 12000 vịng/phút trong 1 phút

- Chuy ển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn

- B ổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vịng/phút trong 1 phút, thu d ịch Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X cĩ marker chu ẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím Bảo

qu ản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC

2.5 5 Phương pháp thiết kế vector tách dịng promoter

S ản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dịng pDONR201 b ằng phương pháp Gateway sử dụng enzyme BP clonase Các

bước tiến hành như sau:

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X

cĩ maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím

Mẫu DNA thu được cần phải tính sạch bằng kit tĩnh sạch HiGene PCR

purification của hãng Solgenet để chuẩn bị cho tách dịng

2.5.4 Phương pháp tỉnh sạch sản phẩm PCR

Quá trình tỉnh sạch được thực hiện theo HiGene PCR purification của

hãng Solgenet gồm các bước sau:

- Bồ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ I: 1 về thẻ tích

- Chuyên sang cột lọc li tâm 12000 vịng/phút trong 1 phút ở 49C, loại bỏ dịch

- Bồ sung 700u1 Washing buffer, li tâm 12000 vịng/phút trong 1 phút

- Chuyên cột lọc sang ơng eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cơn

- Bồ sung 25ul nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vịng/phút trong I

phút, thu dịch Sản phẩm DNA tỉnh sạch được điện đi kiểm tra trên gel àarose

0,8% trong TAE 1X cĩ marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím Bảo quản sản phẩm DNA tỉnh sạch trong tủ -209C

2.5.5 Phương pháp thiết kế vector tách dịng promofer

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dịng

pDONR201 băng phương pháp Gateway sử dụng enzyme BP clonase Các

bước tiến hành như sau:

- B ổ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút

- L ấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -80oC đặt trên đá

- Tr ộn 2 µl DNA vào 100 µl E.coliDH5α

- Đặt trên đá 30 phút

- Shock nhiệt ở 42oC trong 40s

- B ổ sung 900 µl môi trường LB lỏng

- Nuôi l ắc ở 37oC trong 1h

- C ấy trải 100 µl dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có kháng sinh chọn lọc kanamycin

- Nuôi qua đêm ở 37oC

2.5 7 Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp

Để sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp PCR các khu ẩn lạc Lựa chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc có kích thước đồng đều sau khi nuôi qua đêm ở 37oC tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu Phương

- Bồ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37°C trong 10 phút

- Biến nạp vào E.coliDHSz

BH S Hội affö-PCR Product

Hình 2.1 Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nỗi gene và vector tách dòng

2.5.6 Phương pháp biễn nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E.coljDH5z theo phương pháp shock nhiệt ở 429C

- Lấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -80°C đặt trên đá

- Trộn 2 hl DNA vào 100 h[ E.coDHSa

- Đặt trên đá 30 phút

- Shock nhiệt ở 42°C trong 40s

- Bồ sung 900 hl môi trường LB lỏng

- Nuôi lắc ở 37°C trong 1h

- Cây trải 100 ul dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có kháng

sinh chọn lọc kanamycIn

- Nuôi qua đêm ở 379C

2.5.7 Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp

Để sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tô hợp chúng tôi sử dụng phương pháp PCR các khuẩn lạc Lựa chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc có kích thước đồng

đều sau khi nuôi qua đêm ở 37°C tiến hành PCR với cặp môi đặc hiệu Phương

pháp và thành ph ần phản ứng tương tự ở bảng 2.2, trong đó sử dụng enzyme Taq

DNA polymesase và khu ẩn lạc cho phản ứng Phản ứng được thực hiện ở 30-35 chu k ỳ Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và đọc kết quả dựa trên thang marker chuẩn 1kb Lựa chọn khuẩn lạc có kích thước đúng để tiến hành các bước tiếp theo

2.5 8 Phương pháp tách chiết plasmid

Khu ẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 36oC, 200v/phút trên môi trường

LB đặc (10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl, 15g agar) có bổ sung 100mg/l kháng sinh kanamycin để chọn lọc tế bào tái tổ hợp Tiến hành nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng và thu tế bào để tách plasmid

B ảng 2.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid

Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8

Sol II 0,2 M NaOH, SDS 1 %

Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O

Các bước tiến hành tách plasmid:

- L ấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng

- Ly tâm 7000 vòng/phút thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn

c ủa dịch khuẩn

- Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch

- Bổ sung 200 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây

- Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây

- Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống eppendorf m ới

pháp và thành phần phản ứng tương tự ở bảng 2.2, trong đó sử dụng enzyme 7g

DNA polymesase và khuẩn lạc cho phản ứng Phản ứng được thực hiện ở 30-35

chu kỳ Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và đọc kết quả dựa

trên thang marker chuẩn Ikb Lựa chọn khuẩn lạc có kích thước đúng đề tiễn

hành các bước tiếp theo

2.5.8 Phương pháp tách chiết plasmid

Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 36°C, 200v/phút trên môi trường

LB đặc (10g Bacto-tryptone, 5ø yeast extract, 10g NaCIl, 15g agar) có bố sung 100mg/1 kháng sinh kanamycin để chọn lọc tế bào tái tô hợp Tiến hành nuôi

tăng sinh trong môi trường LB lỏng và thu tế bảo để tách plasmid

Bảng 2.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid

Các bước tiễn hành tách plasmid:

- Lấy Iml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng

- Ly tâm 7000 vòng/phút thu tế bảo, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn

của dịch khuẩn

- Bồ sung 100 wI Sol I, voltex dịch

- Bồ sung 200 ul Sol II trộn nhẹ trong 30 giây

- Bồ sung tiếp 1500 n1 Sol III trộn nhẹ trong 30 giây

- Bồ sung 500 kl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi 400 kl trên sang ống eppendorf mới

- Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm

12000 vòng/phút trong 15 phút, lo ại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn

- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn, làm lại hai lần

- Làm khô mẫu trong box 30 phút

- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion

- Bổ sung RNase

- Ủ ở 370C trong 30 phút

- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%

2.5.9 Phương pháp định lượng DNA

Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ

b ằng máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 0,8%

Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuy ển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường

độ thích hợp

Cách ti ến hành

- Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X

- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 50oC

- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel

- Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh

rò r ỉ gel khi đổ Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm lược và để yên cho gel đông lại

- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhấc lược

ra kh ỏi bản gel

- Cho 400 HÏ isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20°C trong 30 phút, ly tâm

12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn

- Cho 500 tl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ

cồn, làm lại hai lần

- Làm khô mẫu trong box 30 phút

- Hòa tan sản phẩm trong 50 ul nước khử ion

- Bồ sung RNase

- Ủ ở37°C trong 30 phút

- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%

2.5.9 Phương pháp định lượng DNA

Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ

bằng máy quang phô hấp phụ và điện di trên gel agarose 0,8%

Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di

chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường

độ thích hợp

Cách tiến hành

- Cân lø agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X

- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoản toàn sau đó đề nguội khoảng 509C

- Đặt khay đồ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đồ gel

- Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh

rò rỉ gel khi đồ Tiến hành đồ phân gel còn lại từ từ, liên tục đề tránh lẫn bọt, cắm

lược và để yên cho gel đông lại

- Khi gel đã đông, cần thận nhắc thanh chăn và đặt gel vào bê điện di theo đúng chiều (-) đến (+), đỗ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhắc lược

ra khỏi bản gel

- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7µl

m ẫu : 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm

2.5.11 Thi ết kế vector biểu hiện GUS

Promoter RMP sau khi tách dòng thành công s ẽ được chuyển vào vector

bi ểu hiện pKGWFS7 có chứa gen chỉ thị GFP/GUS sử dụng enzyme LR clonase Toàn b ộ phản LR được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Invitrogene Trình tự promoter s ẽ được chèn vào vùng ccdB, giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 bằng phương pháp Gateway Các bước tiến hành như sau:

- Bổ sung 0,5 µl proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút

- Gắn bề điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7ul mẫu : 3ul Loading Dye) và tra mẫu vào giếng Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm

vỡ giếng gel

- Đậy nắp máy điện dI, căm điện, bật công tắc máy điện di Điện di với dòng

điện 110V trong thời gian 30 phút

- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyên của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn

- Mở nắp buồng điện di, lẫy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng

2.5.11 Thiết kế vector biểu hiện GUS

Promoter RMP sau khi tách dòng thành công sẽ được chuyên vào vector biểu hiện pKGWES7 có chứa gen chỉ thị GFP/GUS sử dụng enzyme LR clonase Toàn bộ phản LR được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Invitrogene Trình tự promoter sẽ được chèn vào vùng ccdB, giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 bằng phương pháp Gateway Các bước tiễn hành như sau:

- Biến nạp vào E.coliDH5α

-

Hình 2.2 Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR

S ản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào E.coliDH5α bằng phương

pháp shock nhi ệt và sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặt

hi ệu (như trình bày ở mục trên) Tế bào E.coliDH5α tái tổ hợp được tách plasmid

và bi ến nạp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng GV3101 bằng phương

pháp sốc nhiệt ở 37oC để sử dụng cho chuyển gen

- Phân tích y ếu tố CRE và thiết kế vector chuyển gen

Trình t ự promoter được scan bằng phần mềm PLACE (https://www.hsls.pitt.edu/obrc/index.php?page=URL1100876009 ) để xác định các CRE có mặt trên vùng promoter Tiếp đến vùng promoter được khuếch đại

b ằng PCR

S ản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít sau đó được cắt thành từng phần có

độ dài khoảng 300-500 bp bằng enzyme Các đoạn promoter sau đó gắn với gen

- Biến nạp vào E.coiiDH5z

Apr

Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào E.colDH5ø bằng phương pháp shock nhiệt và sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp băng PCR với cặp môi đặt

hiệu (như trình bày ở mục trên) Tế bào E.coiDH5ø tái tổ hợp được tách plasmid

và biến nạp vi khuẩn Agrobacteriumn tumefaciens chủng GV3101 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 37°C đề sử dụng cho chuyên gen

- Phân tích yếu tố CRE và thiết kế vector chuyển gen

(https://www.hsls.pitt.edu/obrc/index.php?page=URLI 100876009) để xác định các CRE có mặt trên vùng promoter Tiếp đến vùng promoter được khuếch đại băng PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít sau đó được cắt thành từng phần có

độ dài khoảng 300-500 bp bằng enzyme Các đoạn promoter sau đó gắn với gen

ch ỉ thị GUS (Hình 2.3) Promoter được đưa vào vector nhân dòng pDONR201

trong E.coliDH5a sau đó được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự gen Promoter sau đó được chuyển sang vector chuyển gen pKGWFS7 bằng phương pháp Getway và chuyển vào trong cây Arabidopsis bằng vi khuẩn Agrobacterium

Hình 2.3 Phương pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE

2.5 12 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

- L ấy tế bào khả biến vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 từ tủ lưu

gi ữ -80oC

- Tr ộn 4 µl DNA plasmid với 100 ul tế bào khả biến Nhúng nhanh vào

Nitơ lỏng

- Chuy ển sang 37oC trong 5 phút

- B ổ sung 900 µl LB lỏng, nuôi lắc ở 28oC, 200 vong/phút, 4hr

- C ấy trải 100 µl dung dịch trên đĩa môi trường LB có kháng sinh chọn lọc

- Nuôi ở 28oC t ừ 3 - 4 ngày

- Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp PCR

2.5.13 Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis

Phương pháp được tiến hành theo Clough (1998) [19]

phương pháp nhúng hoa

chỉ thị GUS (Hình 2.3) Promoter được đưa vào vector nhân dòng pDONR201 trong E.eoDH5z sau đó được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự gen Promoter sau đó được chuyển sang vector chuyển gen pKGWEFS7 bằng phương pháp Getway và chuyển vào trong cây Arzbidopsis bằng vi khuẩn Agrobacterium tumeƒaciens GV3101

—— Promoter _full length GUS F””

— Promoter_del1 GUS

Hình 2.3 Phương pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE

2.5.12 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tummefaciens

- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn 4Agrobacferium chủng GV3101 từ tủ lưu

giữ -80°C

- Trộn 4 ul DNA plasmid với 100 ul tế bào khả biến Nhúng nhanh vào

NItơ lỏng

- Chuyên sang 37°C trong 5 phút

- Bồ sung 900 ul LB lỏng, nuôi lắc ở 28°C, 200 vong/phút, 4hr

- Cây trải 100 ul dung dịch trên đĩa môi trường LB có kháng sinh chọn lọc

- Nuôi ở 28°C từ 3 - 4 ngày

- Sảng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp PCR

2.5.13 Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis

Phương pháp được tiễn hành theo Clough (1998) [19]

2.5.13.1 Tạo dịch huyển phù vi khuẩn Agrobacterium: dung dịch chứa

Agrobacterium (5% sucrose và 500 mỈ it chất hoạt động bê mặt Slwet L-77) Sucrose và chất hoạt động bê mặt rất quan frọng đối với sự thành công của

phương pháp nhúng hoa

- L ấy chủng khuẩn từ tủ lưu giữ và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ch ọn lọc kanamycin 100mg/l đối với chủng A.tumerfaciens

mang vector chuy ển gen, nuôi trong tủ ổn nhiệt 28ºC trong thời gian 48 giờ

- Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 10ml

LB l ỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn kanamycin 50mg/l Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC nuôi qua đêm Hút 1ml d ịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 gi ờ) nuôi lắc 200 vong/phút trong điều kiện 28oC D ịch khuẩn thu được

có OD 260nm t ừ 0,7-1 là đủ điều kiện để biến nạp

Nhúng toàn b ộ cụm hoa của cây Arabidopsis vào trong môi trường có chứa

vi khu ẩn trong 30 giây Cây chuyển gene được tiếp tục nuôi trong điều kiện 25oC 18h chi ếu sáng/ngày đến khi thu hoạch quả

H ạt thu từ cây chuyển gen được chọn lọc trên môi trường kháng sinh kanamycin 50mg/l Cây chuy ển gene kháng kháng sinh được chuyển ra trồng và phân tích

2.5.14 Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter

Phân tích bi ểu hiện gen chỉ thị GUS ở cụm hoa Gen gus A Gen mã hóa

cho sinh t ổng hợp enzyme β-glucuronidase β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho s ự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng

để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc D-glucuronide) Dung d ịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β- glucuronidase s ẽ chuyển sang màu xanh chàm [9]

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Kh ả năng hoạt động của promoter được đánh giá dựa trên biểu hiện của gen

ch ỉ thị GUS sau khi nhuộm bằng X- Gluc theo phương pháp của Jefferson (1987)

- Lấy chủng khuẩn từ tủ lưu giữ và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 100mg/1 đối với chủng /merƒfaciens mang vector chuyền gen, nuôi trong tủ ổn nhiệt 28°C trong thời gian 48 giờ - Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cây vào 10ml

LB lỏng có bồ sung các loại kháng sinh chọn kanamycin 50mg/1 Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28°C nuôi qua đêm Hút Iml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bồ sung kháng sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 vong/phút trong điều kiện 28°C Dịch khuẩn thu được

có OD 260nm từ 0,7-1 là đủ điều kiện để biến nạp

2.5.13.2 Biến nạp gen

Nhúng toàn bộ cụm hoa của cây 4rabiđopsis vào trong môi trường có chứa

vi khuẩn trong 30 giây Cây chuyền gene được tiếp tục nuôi trong điều kiện 25°C 18h chiếu sáng/ngày đến khi thu hoạch quả

2.5.13.3 Chọn lọc cây chuyển gen

Hạt thu từ cây chuyên gen được chọn lọc trên môi trường kháng sinh

kanamycin 50mg/1 Cây chuyên gene kháng kháng sinh được chuyền ra trồng và phân tích

2.5.14 Phương pháp đánh gia hoạt động của promofer

Phân tích biểu hiện gen chỉ thị GỮS ở cụm hoa Gen gus A Gen mã hóa

cho sinh tổng hợp enzyme ÿ-glucuronidase B-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các J-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết ñ-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng

để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Glue (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-J- D-glucuronide) Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme ÿ- ølucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [9]

Khả năng hoạt động của promoter được đánh giá dựa trên biểu hiện của gen chỉ thị GUS sau khi nhuộm bằng X- Gluc theo phương pháp của Jefferson (1987)

1 Ngâm mô trong dung d ịch nhuộm Ống microfuge hoạt động tốt cho các

m ẫu mô nhỏ, nắp ống màu cam hoạt động tốt hơn cho các mẫu mô lớn hơn

2 Hút chân không thâm nh ập nhanh

3 Ủ mô qua đêm ở 37oC

4 Lo ại bỏ dung dịch nhuộm và diệp lục: rửa vài lần 50% ethanol đến khi

nh ận rõ màu xanh lam đặc trưng Ủ khoảng 12 giờ giữa mỗi thay đổi 50% ethanol [33]

S ự có mặt của gen GUS được kiểm tra bằng PCR DNA tổng số được tách

t ừ hạt phấn của 14 cây chuyển gen T1 sử dụng kít DNA Plant Mini Kit (QIAGEN, Đức) với cặp mồi đặc hiệu: GUS-F:

5’- TTCGATAACGTGCTGATGG-3’ và GUS-R:

5’- AATAACGGTTCAGGCACAGCACA-3’

PCR theo chu trình nhi ệt 94oC/2 phút, 30 chu k ỳ (94o C/15 giây, 55o C/ 15 giây, 72o C/1 phút), 72o C/10 phút S ản phẩm PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 2%

1 Ngâm mô trong dung dịch nhuộm Ông microfuge hoạt động tốt cho các mẫu mô nhỏ, nắp ống mảu cam hoạt động tốt hơn cho các mẫu mô lớn hơn

2 Hút chân không thâm nhập nhanh

3 Ủ mô qua đêm ở 379C

4 Loại bỏ dung dịch nhuộm và diệp lục: rửa vải lần 50% ethanol đến khi

nhận rõ màu xanh lam đặc trưng Ủ khoảng 12 giờ giữa mỗi thay đổi 50% ethanol [33]:

Sự có mặt của gen GS được kiểm tra bằng PCR DNA tổng số được tách

từ hạt phấn của 14 cây chuyền gen T1 sử dụng kítDNA Plant Mini Kit (QIAGEN,

Đức) với cặp mỗi đặc hiệu: GUS-FE:

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3 1 Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE

Trình t ự promoter RMP được phân tích dựa trên phần mềm dự đoán Plant

Cis- acting Regulator DNA elements (PLACE) (Higo và cs 1999) D ựa trên kết

qu ả phân tích, vị trí của các yếu tố CRE sẽ được đánh dấu trên trình tự của promoter (ph ụ lục 1) Kết quả cho thấy có rất nhiều yếu tố CRE được phát hiện trên vùng promoter RMP Các CRE có vai trò và chức năng khác nhau được chia thành các nhóm ch ức năng (Bảng 3.1 và 3.2) Trong đó có rất nhiều CRE xuất

hi ện phổ biến trên tất cả các vùng promoter (Bảng 3.1) Trong đó, sáu CRE phổ

bi ến nhất như ACGTATERD1, ARR1AT, CAATBOX1, GATABOX, MYBCORE và DOFCOREZM Tần số xuất hiện của các CRE được thể hiện ở

bi ểu đồ hình 3.1 Trong các promoter, yếu tố ACGTATERD1 xuất hiện với 16

l ần trên vùng promoter RMP5, 12 lần trên RMP1 và RMP3, 8 lần trên RMP 2, RMP4 và RMP8 và 4 l ần trên RM9, RMP10 ARR1AT xuất hiện 26 lần trên RMP2, 24 l ần trên RMP3, 22 lần trên RMP10, RMP5 (21), RMP9 (18), RMP6 (14), RMP7 (13), RMP1 (12), RMP4 (4) H ộp CAATBOX1 xuất hiện 34 lần trên RMP2, 22 l ần trên RMP3, RMP10, RMP1 (18), RMP 5 (16), RMP7 (16), RMP9 (12), RMP6 (11), RMP8 (7), RMP4 (5) H ộp GATA xuất hiện 30 lần trên RMP1, RMP5 (20), các RMP6, 7,9 và RMP10 xu ất hiện từ 15 đến 17 lần Yếu tố MYBCORE xuất hiện 10 lần trên promoter RMP5, 6 lần trên RMP3, 4 và RMP10, 4 l ần trên RMP1, RMP2 và RMP8 Yếu tố DOFCOREZM xuất hiện từ

31 đến 56 lần trên RMP2, RMP5, RMP6 và RMP10, từ 10 đến 25 lần trên RMP3, RMP4, RMP8, RMP9

Ngoài các CRE xu ất hiện với tần số lớn nêu trên, kết quả phân tích phát hiện 11 CRE liên qu an đến tính biểu hiện chuyên biệt ở mô, cơ quan (Bảng 3.2) Trong

đó, một số CRE chuyên biệt hạt phấn như GTGANTG10, POLLEN1LELAT52,

CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE

Trình tự promoter RMP được phân tích dựa trên phần mềm dự đoán Plant Cis-acting Regulator DNA elements (PLACE) (Higo và cs 1999) Dựa trên kết

quả phân tích, vị trí của các yếu tố CRE sẽ được đánh dấu trên trình tự của

promoter (phụ lục 1) Kết quả cho thấy có rất nhiều yếu tố CRE được phát hiện

trên vùng promoter RMP Các CRE có vai trò và chức năng khác nhau được chia

thành các nhóm chức năng (Bảng 3.1 và 3.2) Trong đó có rất nhiều CRE xuất hiện phổ biến trên tất cả các vùng promoter (Bảng 3.1) Trong đó, sáu CRE phổ

biến nhất như ACGTATERDI, ARRIAT, CAATBOXI, GATABOX, MYBCORE và DOFCOREZM Tần số xuất hiện của các CRE được thê hiện ở

biểu đồ hình 3.1 Trong các promoter, yếu tố ACGTATERDI xuất hiện với l6

lần trên vùng promoter RMPS, 12 lần trên RMPI1 và RMP3, § lần trên RMP 2,

RMP4 và RMP§ và 4 lần trên RM9, RMP10 ARRIAT xuất hiện 26 lần trên

RMP2, 24 lần trên RMP3, 22 lần trên RMP10, RMP5 (21), RMP9 (18), RMPó

(14), RMP7 (13), RMPI1 (12), RMP4 (4) Hộp CAATBOXI xuất hiện 34 lần trên RMP2, 22 lần trên RMP3, RMP10, RMPI (18), RMP 5 (16), RMP7 (16), RMP9

(12), RMP6 (11), RMP§ (7), RMP4 (5) Hộp GATA xuất hiện 30 lần trên RMPI,

RMP5 (20), các RMPó, 7,9 và RMP10 xuất hiện từ 15 đến 17 lần Yếu tố

MYBCORE xuất hiện 10 lần trên promoter RMPS, 6 lần trên RMP3, 4 và

RMP10, 4 lần trên RMPI, RMP2 và RMP8 Yếu tố DOFCOREZM xuất hiện từ

31 đến 56 lần trên RMP2, RMP5, RMP6 và RMPI0, từ 10 đến 25 lần trên RMP3,

RMP4, RMPS, RMP9

Ngoài các CRE xuất hiện với tần số lớn nêu trên, kết quả phân tích phát hiện I I

CRE liên quan đến tính biểu hiện chuyên biệt ở mô, cơ quan (Bảng 3.2) Trong

đó, một số CRE chuyên biệt hạt phấn như ƠTGANTGI10, POLLENILELATS52,