Công nghệ protein tái tổ hợp

Recombinant human follicle stimulating hormone rhFSH. Folliclestimulating hormone (FSH): Ở người, được tổng hợp và tiết ra ở tuyến yên trước Ở nữ, Kích thích sự phát triển của nang noãn Ở nam, Đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tinh In vitro fertilization Có trong thành phần quan trọng của thuốc kích trứng ở nữ và kích thích sự sinh tinh ở nam

Recombinant human follicle stimulating

hormone - rhFSH

Recombinant human follicle stimulating

hormone - rhFSH

Nội dung

I Giới thiệu và phân lập gen mã hóa rhFSH

II Lựa chọn dòng tế bào biểu hiện

III Lựa chọn vector biểu hiện

IV Đưa gen đặc tính vào vector biểu hiện

V Chuyển vector vào tế bào CHO-44 và nuôi cấy

VI Tách và tinh chế rhFSH

VII Bảo quản rhFSH

Giới thiệu và PL gen mã hóa rhFSH

được tổng hợp và tiết ra ở tuyến yên trước

 Ở nữ, Kích thích sự phát triển của nang noãn

 Ở nam, Đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tinh

 In vitro fertilization

 Có trong thành phần quan trọng của thuốc kích trứng ở

nữ và kích thích sự sinh tinh ở nam

Giới thiệu và PL gen mã hóa rhFSH

Giới thiệu và PL gen mã hóa rhFSH

 Những gen mã hóa cho 2 tiểu đơn vị α và β

của rhFSH được lấy từ thư viện DNA của tế bào gan thai nhi người

 Gen mã hóa cho tiểu đơn vị α nằm ở  6q14.3

 Gen mã hóa cho tiểu đơn vị β nằm ở  11p13

Lựa chọn dòng tế bào biểu hiện

 Chinese Hamster Ovary (CHO) cell

Lựa chọn vector biểu hiện

Lựa chọn vector biểu hiện

 α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL4  β-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL5

Lựa chọn vector biểu hiện

Đưa α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL4

Đưa α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL4

Đưa α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL4

OLIGO start len tm gc% any_th 3'_thhairpinseq

LEFT PRIMER 1 29 59.22 31.03 0.00 0.00 0.00 ATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTAT

RIGHT PRIMER 351 30 58.45 26.67 0.00 0.00 38.67 TTAAGATTTGTGATAATAACAAGTACTGCA

Not I FW: AATATAGCGGCCGCATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTAT

Hind III RV: TTATATAAGCTTTTAAGATTTGTGATAATAACAAGTACTGCA

GGCCGCATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTATXXXXTGCAGTACTTGTTATTATCACAAATCTTAAA

CGTACCTAATGATGTCTTTTATACGTCGATAXXXXACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTTTCGA

GCTGAGTGATATCC CGCCGG A CAGCTGAGATCT

ACTA TAGGG CGGC CGC ATGGA TT ACTACA GA AA ATA TGCAGCT A T XXX XTGCA GT ACT TGTTATT ATCA CAA ATCTT AA AA GCTT GTCG AC

TGAT ATCCC GCCG G CGT ACCT AAT GATGT CTTT TATACGT CGA TA XXX XACGT CA TGAACAATAA TAGTGTTTAG AA TT TTCGAA CAGCTG

Đưa β-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL5

Đưa β-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL5

Đưa β-FSH cDNA vào pCMV6-XL4FSH cDNA vào pCMV6-FSH cDNA vào pCMV6-XL4XL5

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

LEFT PRIMER 1 25 61.19 40.00 6.00 4.00 ATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCC

RIGHT PRIMER 390 26 62.83 34.62 4.00 2.00 TTATTCTTTCATTTCACCAAAGGAGC

PRODUCT SIZE: 390, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

Not1-FW: GCATATGCGGCCGCATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCC

Xba1-RV: TTGCATTCTAGATTATTCTTTCATTTCACCAAAGGAGC

Khuếch đại vector

Sử dụng E.coli DH5αα

Khuếch đại vector

2 µl pOptivec TOPO + Chemically 

Competent E. coli

Ủ vector/E.coli trên đá 5-FSH cDNA vào pCMV6-XL430 phút

Sốc nhiệt E.coli 30 giây tại 42℃

Chuyển ngay tube lên đá

Thêm 250 µL vào dd S.O.C ở nhiệt độ

phòng

Giữ chặt và lắc tube theo chiều  ngang ở 200 rpm trong 37 trong 1 h ℃

Trải 50 µL dd lên đĩa LB được làm ấm và ủ qua đêm ở 37 ℃

Khuếch đại vector

Chuyển vector vào tế bào CHO-FSH cDNA vào pCMV6-XL4DG44

Chuyển vector vào tế bào CHO-FSH cDNA vào pCMV6-XL4DG44

Cytogenetic appearance of FSH expression vector in metaphase spread of CHO/dhfr- genome White arrows indicate

the integration site of recombinant construct at transfected cells

Nuôi cấy tế bào CHO – DG44

 Điều kiện nuôi cấy

mM MTX

Fullerton, CA), mật độ phù hợp cho nuôi cấy : 2.5 – 4.0 × 10^6 cells/ml

Nuôi cấy tế bào CHO – DG44

Tách và tinh chế rhFSH

Loại bỏ tế bào

(Ly tâm)

Xử lý dịch môi trường nuôi cấy

(Lọc với màng có cut off 10kDa)

Sắc ký trao đổi Anion

Xác định hoạt tính protein

 Xác định khối lượng phân tử

• Kích thước tiểu đơn vị alpha: ~ 14kDa

• Kích thước tiểu đơn vị Beta: ~ 17kDa

Xác định hoạt tính protein

 Xác định monosacharides

Xác định hoạt tính protein

 Xác định Cấu trúc cacbonhydrate

Cấu trúc carbonhydrate của rhFSH là tính heterogeneous

và heavily sialated hơn so với u-FSH cDNA vào pCMV6-XL4hFSH

Xác định hoạt tính protein

 Xác định Vị trí gốc Glycolysation

đơn vị alpha và gốc Asn 7 và 24 trên tiểu đơn vị beta

Xác định hoạt tính protein

 So sánh hoạt tính in Vivo

lượng buồng trứng ở thỏ của tác giả Steelman & Pohley

Xác định hoạt tính protein

 Thử nghiệm lâm sàng

Bảo quản rhFSH

 Nồng độ rhFSH được đo bằng phương pháp

Bradford Assay

Bảo quản rhFSH

Thời gian bảo quản

 Có thể lên tới 24 tháng

THANK YOU

FOR LISTENING